CN109771465B - 一种具有显著抑制hiv/siv作用的中药有效部位组合 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有显著抑制HIV和SIV作用的中药有效部位组合。本发明首先提供了一种具有抗HIV和/或SIV作用的中药组合物，由淫羊藿、贯众和雷丸三种原料制成。另外，本发明还具体地提供了一种由淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位、贯众石油醚萃取部位和雷丸石油醚萃取部位组成的中药有效部位组分。该中药组合物的有效部位之间具有显著的协同增效抑制HIV和SIV的作用，能显著地抑制HIV病毒载量，具有显著而确切的治疗HIV和SIV效果，显著提高了中医药治疗艾滋病的效果；另外，该中药组合物无毒副作用，且使用方便，为HIV感染的治疗提供了一种经济有效的治疗药物，具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

Description

一种具有显著抑制HIV/SIV作用的中药有效部位组合

技术领域

本发明属于生物及中医药技术领域，更具体地，涉及一种具有显著抑制HIV/SIV作用的中药有效部位组合。

背景技术

艾滋病是它的全称获得性免疫缺陷综合征的英文缩写AIDS的译音，它是由艾滋病毒(HIV)引起的一代病毒传染病，是一种全球性疾病，蔓延速度快，死亡率高，造成了广泛的社会和经济问题。自1981年首次发现艾滋病以来，HIV的感染在世界范围内迅速流行。据联合国全球艾滋病流行状况报告，至2002年底，世界上至少有193个国家和地区发现有HIV感染者死亡，且其仍以每天感染15000人的速度快速扩展，其中95％以上的HIV感染者生活在发展中国家。其中，非洲区域艾滋病病情最严重，约占全球感染人数的三分之二。全球化背景下人员流动的增加，艾滋病在我国也有迅速蔓延之势，尤其在两广地区，人们由于不良生活习惯的影响，感染人群近年来呈现不断增长之势。约一个世纪前，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)从黑猩猩传播到人，从而引发了HIV的大流行。研究表明，SIV可引致动物类艾滋病的发生，与HIV存在着密切的同缘关系，在遗传学、抗原性、生物学等方面均类似于HIV。

中医治疗是针对不同身体状况的病人对症下药，达到对机体的整体辩证进行调节的目的。中医治疗艾滋病可以起到稳定或改善免疫系统、改善生存质量的效果，能够为西药抗HIV病毒治疗、提高机体的免疫功能，改善患者的生存质量、减轻抗病毒的毒副作用提供一种新途径。但是，中医治疗对病毒载量影响不明显，这是中医治疗艾滋病效果提高的主要障碍。

以往已有不少机构投入大量人力和财力研究中医药对HIV的抑制作用，这些研究可基本分为两大类，一类是以生物医药机构为主的研究，主要着重于筛选具有抑制HIV作用的中药单体化合物，发现了一些单体化合物具有抑制HIV的作用，如淫羊藿苷等。现有专利申请CN97121020.9和CN97121782.3中应用淫羊藿与其他中药组合制备治疗HIV的药物，但是，淫羊藿与几十种组分进行组合，成本较高，制备工艺复杂，且未用于动物实验或临床试验。另一类是中医临床机构为主的研究，大部分是通过辨证论治及组方用药，进行了很多体外实验，但基本没有抑制HIV的效果；有些进行了临床观察，也基本对HIV病毒载量没有抑制效果。

另外，现有的具有明确抗病毒作用的治疗药物均为化学药物，这些化学药物在抑制HIV和SIV感染的同时，存在副作用大、病毒耐药性日益增加等不足，而且这些药物的治疗费用极高，不能满足社会的需求。因此，亟需提供一种临床上能显著抑制HIV和SIV作用、疗效更好、价格更实惠、使用更方便的艾滋病治疗药物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有HIV和SIV的抗病毒疗法均为化学药物，治疗效果不理想，毒副作用明显的缺点和不足，提供一种具有显著抑制HIV和SIV作用的中药组合物，具有显著而确切的治疗HIV和SIV效果，显著提高中医药治疗艾滋病的效果。

本发明的第一个目的是提供一种具有抗HIV和/或SIV作用的中药组合物。

本发明的第二个目的是提供上述中药组合物在制备抗HIV和/或SIV的产品中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种具有抗HIV和/或SIV作用的中药组合物，由淫羊藿、贯众和雷丸三种原料制成。

本申请发明人经过创造性分析思考，并通过大量实验和测试后认真研究配伍、优化组合后得到，由淫羊藿、贯众和雷丸三种原料制成的中药组合物，可以发挥显著的协同增效配伍效果，能够显著抑制HIV的病毒载量，具有显著而确切的治疗HIV和SIV效果，具有明确的抗艾滋病效果。

淫羊藿是多年生草本植物，味辛性温，擅长补肾壮阳，改善阳萎，下肢无力等不适。贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨，具有祛风活血，补肝肾的功效。雷丸为白蘑科真菌雷丸的干燥菌核，主治消积，杀虫，临床上主治绦虫病、钩虫病等。

优选地，所述淫羊藿、贯众和雷丸的质量比为6～16：21～29：10～20。

更优选地，所述淫羊藿、贯众和雷丸的质量比为10～13：25～28：11～15。

优选地，包括按以下质量份数计算的中药有效部位组分：淫羊藿氯仿萃取部位1～23份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位1～22份、贯众石油醚萃取部位30～135份、雷丸石油醚萃取部位0.1～5份。

更优选地，包括按以下质量份数计算的中药有效部位组分：淫羊藿氯仿萃取部位1.143～21.2份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位1.185～20.8份、贯众石油醚萃取部位33～133份、雷丸石油醚萃取部位0.48～3.87份。

更进一步优选地，包括按以下质量份数计算的中药有效部位组分：淫羊藿氯仿萃取部位11.17～16.17份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位5.99～10.99份、贯众石油醚萃取部位83～103份、雷丸石油醚萃取部位1.175～2.175份。

优选地，所述淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位的制备方法为：

将淫羊藿用酒精回流提取2～3次后，回收酒精；先用石油醚萃取，然后将萃取完石油醚剩余的部分用氯仿萃取，获得氯仿萃取部位，回收氯仿后蒸干，即获得所述淫羊藿氯仿萃取部位；

将去掉氯仿萃取部位剩余的部分用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后蒸干，即获得所述淫羊藿乙酸乙酯萃取部位。

优选地，所述贯众石油醚萃取部位的制备方法为：将贯众用酒精回流提取2～3次后，回收酒精，用石油醚萃取，回收石油醚后蒸干，即获得所述贯众石油醚萃取部位。

优选地，所述雷丸石油醚萃取部位的制备方法为：将雷丸用酒精回流2～3次后，回收酒精，用石油醚萃取，回收石油醚后蒸干，即获得所述雷丸石油醚萃取部位。

优选地，所述酒精的体积分数为70％～80％。

更优选地，所述酒精的体积分数为75％。

另外，上述中药组合物在在制备抗HIV和/或SIV的产品中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述产品为药物或保健品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物，三种中药有效部位之间相互配伍、优化组合，具有显著的协同增效抑制HIV和SIV的作用，能显著抑制HIV的病毒载量，具有显著而确切的治疗HIV和SIV效果，而且该中药组合物无毒副作用，为HIV和SIV的治疗提供了一种经济有效的治疗药物，具有广泛的应用前景和潜在的医用价值。

附图说明

图1是CEM174细胞感染HIV-1模型时，不同剂量浓度的中药组合物对CEM174细胞内HIV RNA相对量的影响。

图2是CEM174细胞感染HIV-1模型时，不同剂量浓度的中药组合物对培养上清中病毒载量(lg10)的影响。

图3是M8166细胞感染HIV-1模型时，不同剂量浓度的中药组合物对M8166细胞内HIV RNA相对量的影响。

图4是M8166细胞感染HIV-1模型时，不同剂量浓度的中药组合物对培养上清中病毒载量(lg10)的影响。

图5是M8166细胞感染HIV-1模型时，中药组合物与单个萃取部位对M8166细胞内HIV RNA相对量的影响。

图6是M8166细胞感染HIV-1模型时，中药组合物与单个萃取部位对培养上清中病毒载量(lg10)的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用的实验材料包括：CEM174细胞、M8166细胞、1640培养基、24孔培养板、胎牛血清(FBS)、HIV-1BK132病毒毒种。

实施例1一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物

一种中药组合物，由按以下质量份数计算的中药有效部位组分组成：淫羊藿氯仿萃取部位11.17份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位10.99份、贯众石油醚萃取部位83份、雷丸石油醚萃取部位2.175份。

上述淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位的制备方法为：将淫羊藿用75％酒精回流提取3次后，回收酒精；先用石油醚萃取，然后将萃取完石油醚剩余的部分用氯仿萃取，获得氯仿萃取部位，回收氯仿后蒸干，即获得所述淫羊藿氯仿萃取部位；然后，将去掉氯仿萃取部位剩余的部分用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后蒸干，即获得淫羊藿乙酸乙酯萃取部位。

上述贯众石油醚萃取部位的制备方法为：将贯众用75％酒精回流提取3次后，回收酒精，用石油醚萃取，回收石油醚后蒸干，即获得贯众石油醚萃取部位。上述雷丸石油醚萃取部位的制备方法为：将雷丸用75％酒精回流3次后，回收酒精，用石油醚萃取，回收石油醚后蒸干，即获得雷丸石油醚萃取部位。

实施例2一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物

一种中药组合物，由按以下质量份数计算的中药有效部位组分组成：淫羊藿氯仿萃取部位16.17份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位5.99份、贯众石油醚萃取部位103份、雷丸石油醚萃取部位1.175份。

上述淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位、贯众石油醚萃取部位和雷丸石油醚萃取部位的制备方法与实施例1相同。

实施例3一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物

一种中药组合物，由按以下质量份数计算的中药有效部位组分组成：淫羊藿氯仿萃取部位1.143份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位20.8份、贯众石油醚萃取部位33份、雷丸石油醚萃取部位3.87份。

上述淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位、贯众石油醚萃取部位和雷丸石油醚萃取部位的制备方法与实施例1相同。

实施例4一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物

一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物，由按以下质量份数计算的中药有效部位组分组成：淫羊藿氯仿萃取部位21.2份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位1.185份、贯众石油醚萃取部位133份、雷丸石油醚萃取部位0.48份。

上述淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位、贯众石油醚萃取部位和雷丸石油醚萃取部位的制备方法与实施例1相同。

实施例5一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物

一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物，由按以下质量份数计算的中药有效部位组分组成：淫羊藿氯仿萃取部位1份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位22份、贯众石油醚萃取部位30份、雷丸石油醚萃取部位5份。

上述淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位、贯众石油醚萃取部位和雷丸石油醚萃取部位的制备方法与实施例1相同。

实施例6一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物

一种具有抗HIV和SIV作用的中药组合物，由按以下质量份数计算的中药有效部位组分组成：淫羊藿氯仿萃取部位23份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位1份、贯众石油醚萃取部位135份、雷丸石油醚萃取部位0.1份。

上述淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位、贯众石油醚萃取部位和雷丸石油醚萃取部位的制备方法与实施例1相同。

实施例7不同中药组合物对CEM174细胞感染HIV的药效实验

1、实验分组

实验设置3组：分别为病毒对照组、阳性药对照组和中药复方组；其中，病毒对照组不加任何药物；阳性药对照组加入AZT药物；中药复方组加入实施例1制备得到的中药组合物，剂量浓度分别为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL。

2、实验方法

(1)用1640培养基和胎牛血清培养CEM174细胞，将CEM174细胞稀释为1×10⁵拷贝/mL，感染10×TCID 50的HIV病毒，接种入24孔培养板中培养，病毒对照组、阳性药对照组和中药复方组分别按照上述的实验分组，将对应剂量浓度的药物分别以100倍的优化有效剂量溶解于二甲基亚砜中；

(2)培养至第3天换液，并再次分别加入与步骤(1)相同剂量浓度的药物，培养至第5天，显微镜下观察细胞病变(CPE)情况，拍照；

(3)收集500μL培养上清，并将CEM174细胞离心弃残留上清后，加入500μL三唑醇(Trizol)收集CEM174细胞；然后按RNA提取试剂操作说明书进行培养上清RNA提取和CEM174细胞RNA提取，逆转录，运用荧光定量PCR技术检测上清中病毒载量和CEM174细胞内HIV RNA的相对量，分析本发明的中药组合物对HIV的抑制效果。

3、实验结果

CEM174细胞感染HIV-1模型时，不同剂量浓度的中药组合物对CEM174细胞内HIVRNA相对量的影响如图1所示，结果显示，本发明中药组合物对CEM174细胞内HIV RNA的有效抑制剂量浓度为10～160μg/mL；CEM174细胞感染HIV-1模型时，不同剂量浓度的中药组合物对培养上清中病毒载量(lg10)的影响如图2所示，结果显示，本发明中药组合物对CEM174细胞培养上清中HIV RNA的有效抑制剂量浓度为20～160μg/mL。

实施例8中药组合物对M8166细胞感染HIV的药效实验

1、实验分组

实验设置3组：分别为病毒对照组、阳性药对照组和中药复方组；其中，病毒对照组不加任何药物；阳性药对照组加入AZT药物；中药复方组加入实施例1制备得到的中药组合物，剂量浓度分别为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL。

2、实验方法

(1)用1640培养基和胎牛血清培养M8166细胞，将M8166细胞稀释为1×10⁵拷贝/mL，感染10×TCID50的HIV病毒，接种入24孔培养板中培养；病毒对照组、阳性药对照组和中药复方组分别按照上述的实验分组，将对应剂量的药物分别以100倍的优化有效剂量浓度溶解于二甲基亚砜中；

(2)培养至第3天换液，并再次分别加入与步骤(1)相同剂量浓度的药物，培养至第5天，显微镜下观察CPE情况，拍照；

(3)收集500μL培养上清，并将M8166细胞离心弃残留上清后，加入500μL Trizol收集M8166细胞；然后按RNA提取试剂操作说明书进行培养上清RNA提取和M8166细胞RNA提取，逆转录，运用荧光定量PCR技术检测上清中病毒载量和M8166细胞内HIV RNA的相对量，分析本发明的中药组合物对HIV的抑制效果。

3、实验结果

M8166细胞感染HIV-1模型时，不同剂量浓度的中药组合物对M8166细胞内HIV RNA相对量的影响如图3所示，结果显示，本发明中药组合物对M8166细胞内HIV RNA的有效抑制剂量浓度为10～160μg/mL；M8166细胞感染HIV-1模型时，不同剂量浓度的中药组合物对培养上清中病毒载量(lg10)的影响如图4所示，结果显示，本发明中药组合物对M8166细胞培养上清中HIV RNA的有效抑制剂量浓度为40～160μg/mL。

实施例9中药组合物的协同药效与单个萃取部位药效的测定

1、实验方法

(1)用1640培养基和胎牛血清培养M8166细胞，将M8166细胞稀释为1×10⁵拷贝/mL，感染10×TCID50的HIV病毒，接种入24孔培养板中培养；

(2)将实施例1制备得到的中药组合物分别以100倍的优化有效剂量溶解于二甲基亚砜中；设置中药组合物中的每个萃取部位加入2个剂量浓度，每个相同的剂量浓度加入3孔中(复孔1、复孔2和复孔3)；其中，淫羊藿氯仿萃取部位剂量浓度为10μg/mL、5μg/mL；淫羊藿乙酸乙酯萃取部位剂量浓度为10μg/mL、5μg/mL；贯众石油醚萃取部位剂量浓度为30μg/mL、15μg/mL；雷丸石油醚萃取部位剂量浓度为1μg/mL、0.5μg/mL；

(3)培养至第3天换液，并再次分别加入与步骤(1)相同剂量浓度中药组合物的四个萃取部位，培养至第5天，显微镜下观察CPE情况，拍照；

(4)收集500μL培养上清，并将M8166细胞离心弃残留上清后，加入500μL三唑醇(Trizol)收集M8166细胞；然后按RNA提取试剂操作说明书进行培养上清RNA提取和M8166细胞RNA提取，运用荧光定量PCR技术检测上清中病毒载量和M8166细胞内HIV RNA的相对量，分析本发明的中药组合物中四个萃取部位的协同药效是否比单个萃取部位药效更好，即中药组合物中的四个萃取部位是否有协同增效抑制HIV的效果。

2、实验结果

本发明的中药组合物对M8166细胞CPE情况的影响如表1所示，可以看出，中药组合物的加入剂量浓度为51μg/mL、25.5μg/mL时，M8166细胞均未发现细胞病变；而分别加入中药组合物中的单个萃取部位时，M8166细胞出现了不同程度的细胞病变，说明本发明的中药组合物中的四个萃取部位具有协同抑制HIV的效果。

表1中药组合物对M8166细胞CPE情况的影响

注：“-”为细胞生长正常，无病变出现；“±”为细胞病变占整个单层细胞的0～10％；“+”为细胞病变约占整个单层细胞的10％～25％；“++”为细胞病变约占整个单层细胞的25％～50％；“+++”为细胞病变约占整个单层细胞的50％～75％；“++++”为细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。

表2各组M8166细胞内HIV RNA相对量和上清中病毒载量对数值(n＝3，x±S)

注：“*”代表：P<0.05，“**”代表：P<0.01。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (5)

1.一种具有抗HIV作用的中药组合物，其特征在于，由按以下质量份数计算的中药有效部位组分组成：淫羊藿氯仿萃取部位11.17～16.17份、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位5.99～10.99份、贯众石油醚萃取部位83～103份、雷丸石油醚萃取部位1.175～2.175份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述淫羊藿氯仿萃取部位、淫羊藿乙酸乙酯萃取部位的制备方法为：将淫羊藿用酒精回流提取2～3次后，回收酒精；先用石油醚萃取，然后将萃取完石油醚剩余的部分用氯仿萃取，获得氯仿萃取部位，回收氯仿后蒸干，即获得所述淫羊藿氯仿萃取部位；

将去掉氯仿萃取部位剩余的部分用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后蒸干，即获得所述淫羊藿乙酸乙酯萃取部位；

其中，所述酒精的体积分数为70％～80％。

3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述贯众石油醚萃取部位的制备方法为：将贯众用酒精回流提取2～3次后，回收酒精，用石油醚萃取，回收石油醚后蒸干，即获得所述贯众石油醚萃取部位；

其中，所述酒精的体积分数为70％～80％。

4.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述雷丸石油醚萃取部位的制备方法为：将雷丸用酒精回流2～3次后，回收酒精，用石油醚萃取，回收石油醚后蒸干，即获得所述雷丸石油醚萃取部位；

其中，所述酒精的体积分数为70％～80％。

5.权利要求1～4任一所述中药组合物在制备抗HIV的药物中的应用。

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