CN102724990A - 药用植物的提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明描述了传统中药植物番荔枝科毛叶鹰爪花、番荔枝科喙果皂帽花、大戟科剑叶三宝木和龙脑香科青梅的提取物。本发明描述了包含所述提取物的药物组合物和对HIV感染的治疗。

Description

药用植物的提取物及其应用

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C§119(e)，本申请要求保护于2009年7月29日提交的题为“药用植物的提取物及其应用”的美国专利申请序号61/229,426的优先权。所述申请全部的公开内容通过引用结合到本申请中。

技术领域

本发明涉及包含中药植物提取物的组合物、用于制备中药植物提取物的方法及其在治疗HIV感染中的应用。

背景和概要

高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是现行的HIV/AIDS治疗方式。尽管HAART很有效地抑制HIV-1复制和降低HIV/AIDS患者的死亡率这一事实，但HAART不能根治HIV/AIDS已日益清晰。HAART方案的昂贵的费用阻碍了它传送给全世界超过90％的HIV/AIDS群体。这个事实强调了开发便宜的抗HIV/AIDS替代疗法的迫切需求。抗HIV-1疫苗和杀微生物剂最近的临床试验失败进一步表明此需求。本文描述的是传统中药草本植物的提取物组的抗HIV活性及其抗HIV-1复制的活性，所述植物自中国海南岛获得，海南岛是一个生物多样的热带/亚热带岛屿。

1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)引发获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。在全身水平，HIV-1初次感染始于其与上皮树突细胞的初接触，接着是其感染这些细胞和/或传送到淋巴结中的CD4+T细胞。接着是HIV-1的快速病毒复制和进一步传播到其它淋巴样器官中，临床上称为病毒血症，此时HIV-1感染的个体呈现出由发热、头痛等表明的流感样疾病。临床症状的严重程度和持续时间在个体间不同。抗HIV-1抗体通常在感染后3-6星期出现，同时活化CD4+T细胞开始减少。在数周或数月之内，外周血中的CD4+T细胞数和HIV-1病毒水平(病毒载量)稳定，并建立慢性无症状的潜伏性感染。在疾病晚期将活化潜伏感染的细胞，而且临床表现变得有症状，典型地表现出疲劳、体重减轻以及发热。HIV-1复制和CD4+T细胞减少在有症状阶段加速，这使HIV-1感染的对象易于受各种机会性感染，例如假丝酵母、肺囊虫(Pneumocystis)、弓形体和分枝杆菌(mycobacteria)。CD4+T细胞计数低于200/μl和机会性感染是AIDS患者的两个重要的特征。在缺乏医学干预的情况下，CD4+T细胞减少和免疫系统的破坏会持续，最终导致死亡。

CD4+T淋巴细胞是HIV-1感染的天然靶标。在细胞水平，HIV-1的生命周期始于HIV-1 gp120与表达于HIV-1靶细胞表面的细胞受体CD4及趋化因子受体CCR5或CXCR4结合，接着是gp41的构象变化，其又导致病毒-细胞膜融合和病毒核心(核壳体)进入细胞质。病毒体核心经历脱壳，病毒编码的酶逆转录酶(RT)将病毒的RNA基因组转化成前病毒DNA。所述DNA进入细胞核并通过第二种病毒编码的酶整合酶(IN)共价整合到宿主细胞的基因组中。所述整合的病毒DNA作为用于病毒转录和合成子代病毒的各种组分的模板。子代病毒在质膜上装配及通过质膜出芽。结果，所述子代病毒被一层膜包裹，所述膜亦包埋病毒包膜糖蛋白。伴随着出芽，第三种病毒编码的酶蛋白酶(PR)将核心蛋白加工成它们的最终形式，病毒体经历被称为成熟的形态变化。该最后一步为所述子代病毒的下一轮感染作准备。

抗HIV-1疗法的开发已与在对HIV-1感染和发病机理的基本理解上取得的进展并行。抗HIV-1治疗开发的主要靶标是两种病毒编码的酶：逆转录酶(RT)和HIV蛋白酶(PR)。食品及药物管理局(FDA)已批准总共21种抗HIV-1药物，这些药物大部分是HIV-1 RT和PR的抑制剂。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)，即多种抗HIV-1药物的联合，有效地抑制病毒复制并已引起所述疾病死亡率的显著下降、HIV/AIDS患者寿命的延长以及这些患者生命质量的改善。然而，诸如病毒储藏库、药物抗性、高剂量和高频率以及高昂的成本等问题已引起HIV/AIDS患者管理的重要危机，尤其是在有最大需求的发展中国家中。HAART不能完全解决问题已显而易见。同时，已将相对较少数的抗HIV-1疗法发展到靶向包括进入、融合和整合在内的HIV-1生命周期的其它阶段。另一方面，最近关于抗HIV-1疫苗和杀微生物剂的试验已表明一些当前的疫苗和杀微生物剂策略不但不能预防反而实际上增加了HIV-1感染和传播的风险。因此，亟需另外的和替代的抗HIV-1治疗策略，以抑制此病毒破坏受感染个体的免疫系统以及向他人传播。

所有当前FDA批准的抗HIV药物均是化学合成的。这些药物的开发包括长周期的研究、设计和最优化，因此这些药物是非常昂贵的。这些药物中的许多是宿主代谢组分的结构类似物；因此，副作用和不黏附问题常常限制这些药物的使用。相反，天然起源的药物(例如草药)常常具有更短的开发周期而且可相对便宜。此外，自然起源的药疗法的毒性较不常是问题。最近的研究表明那些在进行抗HIV药疗法的人中多于三分之二亦在进行替代疗法，包括将近25％在进行源自植物性药材和中草药的那些替代疗法。因为其对于使抗HIV疗法对包括发展中国家和欠发达国家的那些在内的所有HIV/AIDS受累个体而言最终负担得起及可获得的贡献，无疑地有需要进一步研究及开发此抗HIV的替代疗法。

已进行一些努力以鉴定在临床环境下抵抗HIV/AIDS的天然药物。许多天然产物，包括得自微生物、海洋生物和植物的那些，已显示具有抗HIV-1活性，据认为这些天然产物在HIV-1生命周期的各个阶段抑制HIV-1复制。目前，已从海洋生物中分离的多于150种天然产物显示有希望的抗HIV-1活性。一个实例是蓝藻抗病毒蛋白N，一种最初从蓝藻类细菌(蓝-绿藻)椭孢念珠藻(Nostoc ellipsosporum)中分离的11KDa的抗HIV-1蛋白。据认为，蓝藻抗病毒蛋白N通过与HIV-1 gp120结合来抑制HIV-1复制，因此其使病毒失活和阻断病毒与细胞膜的融合。此蛋白目前正在进行用作抗HIV-1杀微生物剂的II期临床试验。

传统中药(Traditional Chinese Medicine，TCM)有非常悠久的历史。它们已用于治疗多种人类疾病而且中国政府视之为国家文化宝藏。TCM的发展和标准化最近已提议为中华人民共和国下一个5-10年的顶尖生物医药研究重点。关于TCM的抗HIV活性和机理的研究是非常有限的并预期加速。目前，HIV-1抑制性TCM据报道包括黄岑(Scutellaria baicalensisGeorgi)、夏枯草(Prunella vulgaris)、牡丹(Paeonia Suffruticosa)、虎杖(Rhizoma Polygoni Cuspidati)、三七(Radix Notoginseng)、槲寄生(RamulusVisci)和金疮小草(Ajuga Decumbens Thumb)。

在本发明的一个实施方案中，描述了用于制备包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物的方法，所述方法包括从植物材料中获取活性级分的步骤，所述植物材料获自大戟科(Euphorbiaceae)剑叶三宝木(Trigonostema xyphophylloides)、龙脑香科(Dipterocarpaceae)青梅(Vaticaastrotricha)、番荔枝科(Annonaceae)毛叶鹰爪花(Artabotrys pilosus)或番荔枝科喙果皂帽花(Dasymaschalon rostratum)。

在另一个实施方案中，描述了用于制备包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物的方法，所述方法包括从获自大戟科剑叶三宝木或龙脑香科青梅的植物材料中获取活性级分的步骤。

在另一个实施方案中，描述了用于制备包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

a)干燥获自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料；

b)研磨所述经干燥的植物材料；以及

c)用第一提取剂提取所述经研磨的植物材料以产生包含活性级分的植物提取物。

在另一个实施方案中，描述了前述实施方案的方法，其还包括下述步骤：d)除去基本上所有的第一提取剂以产生第一剩余物；以及e)用第二提取剂提取第一剩余物以产生包含活性级分的第二提取物。

在另一个实施方案中，描述了用于制备包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

a)干燥获自大戟科剑叶三宝木或龙脑香科青梅的植物材料；

b)研磨所述经干燥的植物材料；以及

c)用第一提取剂提取所述经研磨的植物材料以产生包含活性级分的植物提取物。

在另一个实施方案中，描述了由前述方法实施方案的任一个产生的药物组合物。

在另一个实施方案中，描述了治疗需要缓解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的任一前述实施方案所描述的药物组合物的步骤。

在另一个实施方案中，描述了可用于治疗HIV感染的活性级分，其通过以下方法从包含至少一种选自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花和番荔枝科喙果皂帽花的植物的一个或多个植物部分的植物材料中得到，所述方法包括用第一提取剂提取所述植物材料的步骤。

在另一个实施方案中，描述了用于制备可用于治疗HIV感染的活性级分的方法，其中所述方法包括用第一提取剂提取来自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步骤。

在另一个实施方案中，一种包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物，其中通过包括用第一提取剂提取来自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步骤的方法制备所述活性级分。

一种用于治疗需要缓解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的任一种本文描述的活性级分或者药物组合物的步骤。

附图简述

图1A：来自TXE和VAD的提取物对HIV复制的作用。将Jurkat细胞用HIV-1 HXB2感染，然后在感染24小时后暴露于所述提取物。每隔一天加入新鲜提取物。同时，收集培养上清液用于RT活性测定。DMSO为所述提取物的溶剂，并将其包括为阴性对照，而包括AZT作为阳性对照。另外，也包括没有HIV感染的Jurkat细胞[对照，(-HIV)]和有HIV感染但没有任何处理的Jurkat细胞[对照，(+HIV)]。a)对照(没有HIV感染)，b)阴性对照(HIV感染，没有处理)，c)DMSO(1％)，d)DMSO(0.1％)，e)DMSO(0.01％)，f)AZT(10μM)，g)AZT(1μM)，h)TXE(100μg/ml)，i)TXE(10μg/ml)，j)TXE(1μg/ml)，k)VAD(100μg/ml)，l)VAD(10μg/ml)，m)AD(1μg/ml)。这些数据是三次独立实验的代表。

图1B：来自TXE和VAD的提取物对细胞存活的作用。将Jurkat细胞用HIV-1 HXB2感染，然后在感染24小时后暴露于所述提取物。每隔一天加入新鲜提取物。用台盼蓝染料染细胞的等分试样并计数活细胞。DMSO为所述提取物的溶剂，并将其包括为阴性对照，而包括AZT作为阳性对照。另外，也包括没有HIV感染的Jurkat细胞[对照，(-HIV)]和有HIV感染但没有任何处理的Jurkat细胞[对照，(+HIV)]，a)对照(没有HIV感染)，b)阴性对照(HIV感染，没有处理)，c)DMSO(1％)，d)DMSO(0.1％)，e)DMSO(0.01％)，f)AZT(10μM)，g)AZT(1μM)，h)TXE(100μg/ml)，i)TXE(10μg/ml)，j)TXE(1μg/ml)，k)VAD(100μg/ml)，l)VAD(10μg/ml)，m)AD(1μg/ml)。这些数据是三次独立实验的代表。

图2：所述提取物对细胞增殖和细胞存活的作用。如所示将Jurkat细胞暴露于所述提取物达不同时间长度。每隔一天加入新鲜提取物。将没有任何处理的细胞、用DMSO或AZT处理的细胞包括为对照。使用台盼蓝染料染色测定活细胞。这些数据是三次独立实验的代表。

图3：所述提取物对受HIV-1感染的Jurkat细胞中的合胞体形成的作用。将Jurkat细胞用HIV-1感染，然后暴露于10μg/mL提取物、0.1％DMSO或5μM AZT。在2星期感染的过程中在光学显微镜下从来自一式三份样品的每一份的4个随机视野中计数每一种这些处理中的合胞体。数据表示感染后第7天的合胞体的数量，在第7天时在没有接受处理(未处理)或接受DMSO处理的感染中记录到合胞体的最大数量。包括没有HIV-1感染的Jurkat细胞作为对照(模拟的)。数据为三次重复实验的平均值±SEM。

图4：所述提取物对RT活性的直接作用。在存在10μg/mL提取物的情况下测定HIV-1病毒体的RT活性。包括AZT-TP(5μM)作为阳性对照。将DMSO(0.1％)和磷酸缓冲盐水(PBS)包括分别作为提取物和AZT的溶剂对照。也将没有任何输入HIV-1病毒体的RT反应包括作为测定对照。数据为三次重复实验的平均值±SEM。

图5：所述提取物对HIV-1进入的作用。用10μg/mL浓度的TXE(图A)或VAD(图B)处理U87.CD4.CXCR4细胞30分钟，然后用HIV-Luc病毒感染2小时，所述HIV-Luc病毒用T向性HIV-1 HXB2包膜(HXB2)假型包装(pseudotyped)或没有包膜(-)。感染48小时后收获细胞用于Luc活性测定。包括用VSV-G包膜(VSV-G)假型包装的HIV-Lus病毒作为对照。也包括DMSO(0.1％)作为提取物的溶剂对照。数据是三次重复实验的平均值±SEM。

图6：所述提取物对HIV-1和HIV-1基因表达的作用。图A：用10μg/mL提取物孵育T向性HIV-1 HXB2包膜(HXB2)假型包装的HIV-Luc病毒2小时，然后用于感染U87.CD4.CXCR4细胞。感染48小时后收获48小时的细胞用于Luc活性测定。包括用热灭活的HIV-Luc/HXB2病毒(Δ病毒)的感染作为对照。图B：用T向性HIV-1 HXB2包膜(HXB2)假型包装的或没有包膜(-)的HIV-Luc病毒感染U87.CD4.CXCR4细胞2小时，然后通过用新鲜培养基反复洗涤除去剩余的输入病毒。然后，在所述提取物(10μg/mL)存在的情况下培养受感染细胞48小时，然后收获用于Luc活性测定。也包括DMSO(0.1％)作为所述提取物的溶剂对照，并包括0.5μM AZT作为阳性对照。数据是三次重复实验的平均值±SEM。

图7：所述提取物对初级HIV-1分离群89.6的作用。图A：首先用10μg/mL提取物处理U87.CD4.CXCR4和U87.CD4.CCR5细胞，然后用由89.6包膜假型包装的HIV-Luc病毒感染。包括无包膜的HIV-Luc病毒的感染作为模拟感染对照。图B：首先，用10μg/mL提取物孵育89.6包膜假型包装的HIV-Lus病毒，然后将其用于感染U87.CD4.CXCR4细胞和U87.CD4.CCR5细胞。包括用热灭活的HIV-Luc/89.6病毒(Δ病毒)的感染作为对照。图C：将U87.CD4.CXCR4和U87.CD4.CCR5首先用由89.6包膜假型包装的HIV-Luc病毒感染，然后用10μg/mL提取物或者5μMAZT处理。A-C：对于U87.CD4.CXCR4细胞为空心柱；对于U87.CD4.CCR5细胞为实心柱。图D：用10μg/mL提取物或者5μM AZT-TP直接处理用89.6包膜假型包装的HIV-Luc病毒，确定RT活性。数据是三次重复实验的平均值±SEM。

图8：TXE提取物和VAD提取物的抗HIV组分。将Jurkat细胞用HIV-1 HXB2感染，然后在感染24小时后暴露于10μg/mL TXE(图A)、VAD(图B)或其来自石油醚(PE)、氯仿(CF)、醋酸乙酯(EA)和正丁醇(BT)的分配亚级分的每一种。每隔一天加入新鲜提取物或者亚级分。同时，收集培养上清液用于RT活性测定，并且用台盼蓝染料染细胞的等分试样以及计数活细胞。DMSO是所述提取物和亚级分的溶剂，将其包括作为溶媒对照。呈现来自在病毒复制高峰的第9天收集的上清液的RT数据。提取物及其亚级分不显示对所述细胞明显的细胞毒性作用。数据是三次重复实验的平均值±SEM。

图9：提取物对HIV-1复制的作用。用相当于10,000cpm RT活性的HIV-1 HXB2感染一百万个Jurkat细胞24小时，然后每隔一天用10μg/mL新鲜提取物处理，所述新鲜提取物来自番荔枝科毛叶鹰爪花的叶、茎和根，a)AAP-叶提取物(AAP-l)、b)AAP-茎提取物(AAP-s)和c)AAP-根提取物(AAP-r)；以及番荔枝科喙果皂帽花的根，d)ADR-根(ADR-r)提取物。在标明的时间点收集细胞培养上清液用于RT活性测定。所有的提取物均溶于DMSO，以及将DMSO用作溶媒对照(e)。也包括模拟感染的Jurkat细胞(g)和不经任何处理的HIV感染的细胞作为对照(f)。这些数据是三次独立实验的代表。

图10：提取物a)AAP-l、b)AAP-s、c)AAP-r、d)ADR-r、e)和对照DMSO对Jurkat细胞存活的作用。感染Jurkat细胞并按照图9处理。在每一个时间点，将细胞等分试样收集、用台盼蓝染料染色，然后针对细胞存活力计数。这些数据是三次独立实验的代表。条目f)表示不经处理的模拟感染的细胞，条目g)表示未受感染的细胞。

图11：提取物对HIV-1长末端重复序列(LTR)启动子活性的作用。用10μg/mL各种提取物处理CD4+T淋巴细胞CEM 3天(图A)和7天(图B)，CEM在HIV-1 LTR启动子调控下稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)。然后，收集所述细胞用于通过流式细胞术测量GFP表达。数据是GFP表达水平的几何平均值以及是三次重复实验的平均值±SEM。

图12：提取物对HIV-1 RT活性的作用。用10μg/mL各种提取物孵育经纯化的HIV-1病毒体用于RT活性测定。包括RT抑制剂AZT(5μM)作为阳性对照，而DMSO用作提取物的溶媒对照。也包括没有任何处理的样品(模拟的)。

图13：提取物对HIV-1进入的作用。图A：将U87.CD4.CXCR4细胞用10μg/mL各种提取物处理1小时，然后用由T向性HIV-1 HXB2包膜假型包装的HIV-Luc病毒感染。图B：用U87.CD4.CCR5细胞以及M向性HIV-1 YU-2包膜假型包装的HIV-Luc病毒进行类似实验。包括用VSV-G包膜假型包装的和无包膜的HIV-Luc病毒分别作为阳性感染对照和阴性感染对照(数据未显示)。数据是三次重复实验的平均值±SEM。

图14：提取物对HIV-1感染性的作用。首先在37℃下用10μg/mL各种提取物孵育用HXB2包膜(图A)或YU-2包膜(图B)假型包装的HIV-Luc病毒2小时。通过离心回收所述病毒，然后用于感染U87.CD4.CXCR4细胞(对于HXB2)或U87.CD4.CCR5细胞(对于YU-2)。感染48小时后将所述细胞收获用于萤光素酶报道基因测定。数据是三次重复实验的平均值±SEM。

图15：提取物对HIV-1进入后的作用。首先用由HXB包膜(图A)或YU-2包膜(图B)假型包装的HIV-Luc假型病毒感染U87.CD4.CXCR4细胞和U87.CD4.CCR5细胞。接着改变培养基，将细胞用10μg/mL各种提取物处理48小时，然后收获用于萤火素酶报道基因测定。数据是三次重复实验的平均值±SEM。

详述

传统中药(TCM)回溯至2000到3000年前。草药是TCM的主要成分。据估计超过600种不同的草药已用于治疗多种人类疾病包括那些由病毒感染引起的疾病。海南岛是中国离岸的第二大岛，其位于南海和大约北纬18°的热带。有大约4,200种植物品种，其中630种列为该岛屿的特产，而且一些濒临灭绝。本文描述的是对12种草药植物的选择，中国海南岛上的当地华人已将所述草药植物用于治疗各种人类疾病(表1)；用乙醇对这些植物的提取；以及对提取物的抗HIV活性的测试。用复制型T向性HIV-1毒株HXB2感染CD4+T淋巴细胞Jurkat，然后在2周的过程中在存在浓度为1、10、100μg/mL的植物提取物的情况下监控HIV-1复制。这些实验中包括所述提取物的溶剂DMSO和HIV-1 RT的抑制剂AZT。该初始测试重复三次。与未处理的对照或DMSO处理相比，这17种提取物中的6种：来自大戟科剑叶三宝木(TXE)的茎、来自龙脑香科青梅(VAD)的茎、来自番荔枝科毛叶鹰爪花的叶(AAP-l)、来自番荔枝科毛叶鹰爪花的茎(AAP-s)、来自番荔枝科毛叶鹰爪花的根(AAP-r)以及来自番荔枝科喙果皂帽花的根(ADR-r)，显示在10μg/mL或更高的浓度下在感染后第9天(dpi)抑制HIV-1复制(图1A和图10)。处理的对照AZT抑制HIV-1复制。1μg/mL提取物VAD和TXE显示几乎对HIV-1复制无作用，但在10μg/mL或更高浓度下则显示剂量依赖的抗HIV活性。在整个实验全程通过台盼蓝染料染色监控所有处理的细胞存活。与没有处理的对照相比，TXE和VAD处理均显示类似于DMSO处理的细胞以及没有处理的对照的细胞生长动力学(图1B)。在HIV-1感染的细胞中活细胞数量的减少可能由感染引起的细胞死亡所导致，因为细胞数量因AZT处理而开始恢复直至处理结束。这些结果提供了TXE和VAD抑制HIV-1复制的最初证据。

来自大戟科剑叶三宝木(TXE)和龙脑香科青梅(VAD)的提取物抑制CD4+T细胞中的HIV-1复制以及合胞体形成，并对宿主细胞增殖和存活具有很少的不利作用。TXE和VAD不显示对HIV-1 RT酶活性的任何直接的抑制作用。为确定抑制机制，使用单轮用T向性或M向性HIV-1包膜假型包装的HIV-萤光素酶报道基因病毒系统(HIV-Luc)感染靶细胞。使用这些提取物预处理病毒对HIV-Luc病毒的感染性的作用很小，这些提取物对HIV-Luc感染的细胞的处理不引起Luc基因表达的任何显著改变。不受限于理论，据认为这些结果表明这些提取物通过阻断HIV-1与靶细胞的相互作用(即gp120和CD4/CCR5之间的相互作用或者gp120和CD4/CXCR4之间的相互作用)来阻断HIV-1复制。

为确定和建立提取物的无毒使用浓度，在无HIV-1感染的情况下测定这些提取物对细胞存活和细胞生长动力学的作用。用1、10和100μg/mL的TXE或VAD处理Jurkat细胞，以及每隔一天加入新鲜的提取物并监控细胞存活和细胞生长。在这些实验中包括DMSO和AZT作为对照。亦包括没有任何处理的Jurkat细胞作为对照。在没有接受处理的细胞、接受AZT(10μM)的细胞以及接受10μg/mL TXE和VAD的细胞及接受其对应的DMSO浓度(即0.1％)的细胞之间，细胞的存活和生长动力学似乎难以区别(图2)。在1μg/mL和100μg/mL的TXE和VAD以及它们各自的溶剂DMSO浓度1％和0.01％之间得到类似的结果(数据未显示)，这表明TXE和VAD在高达100μg/ml的浓度下是无毒的。基于这些结果，选择10μg/mL浓度的TXE和VAD提取物用于以下所有的机理研究。

体外CD4+T细胞的生产性HIV-1感染特征在于形成多核巨细胞(所谓的合胞体)，其可能导致HIV-1感染的受试者中CD4+T细胞的耗竭。描述了这两种提取物对合胞体形成的作用。将Jurkat细胞感染，用10μg/mL TXE或VAD处理，并在2周的过程中监控合胞体形成。包括AZT(5μM)和DMSO(0.1％)处理作为对照。没有感染的和HIV-1感染的Jurkat细胞也存在，作为对照。在感染后第7天合胞体的数量达到最大值。与没有处理的和经DMSO处理的HIV-1感染的Jurkat细胞相比，TXE、VAD和AZT的处理均显示合胞体数量的减少(图3)。在不接受HIV-1感染的Jurkat细胞中有很少合胞体。这些结果与这些提取物对HIV-1复制的抑制作用(图1A)一致。

HIV-1是逆转录病毒家族的一个成员。这些病毒的重要特征是这些病毒复制涉及它们的RNA病毒基因组向前病毒DNA的转变，其由称为逆转录酶(RT)的独有的病毒编码酶催化。在这里描述的是在存在和缺少提取物的情况下HIV-1病毒体的RT酶活性的比较。裂解HIV-1病毒体以释放RT，并在TXE和VAD(10μg/mL)存在的情况下进行RT活性测定。在这些实验中，包括RT抑制物AZT(5μM)作为对照。另外，包括PBS和DMSO(0.1％)分别作为AZT以及TXE和VAD的溶剂对照。使用不含任何HIV-1病毒体的RT反应作为测定的空白对照。与预期一样，AZT有效抑制HIV-1 RT的活性。然而，在RT反应中包含TXE和VAD并未显示在RT活性上与PBS对照和DMSO对照的任何显著性差异(图4)。不受限于理论，据认为，这些结果表明TXE和VAD诱导的HIV-1复制的抑制并非因为它们对RT活性的作用，而是因为它们对HIV生命周期的其他阶段的作用。AAP的叶提取物(AAP-l)和AAP的茎提取物(AAP-s)表现出对RT活性的某种抑制(图12)。

HIV-1感染始于HIV-1包膜gp120与HIV-1靶细胞细胞表面上的CD4和趋化因子共同受体CCR5(对于M向性毒株)或CXCR4(对于T向性毒株)的结合。在这里描述的是提取物对HIV-1进入细胞的作用。复制缺陷型HIV-Luc报道基因系统灭活了HIV-1 env基因，并用萤火虫萤光素酶(Luc)基因替代了HIV-1 nef。这样的设计允许反式互补任何病毒包膜蛋白包括HIV-1包膜蛋白以及单轮病毒感染通过灵敏的Luc活性测定准确测定HIV-1的进入。制备用T向性HIV-1 HXB2包膜假型包装的HIV-Luc报道基因病毒。为测定这些提取物对HIV-1进入的作用，用10μg/mL的这些提取物预孵育U87.CD4.CXCR4细胞，然后用这些病毒感染这些细胞。测定这些细胞的Luc活性。在这些实验中也制备了用血管口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型包装的HIV-Luc报道基因病毒或没有任何病毒包膜的HIV-Luc病毒，所述病毒分别为阳性对照和阴性对照。包括DMSO(0.1％)作为这些提取物的溶剂对照。与DMSO对照相比，用TXE预孵育U87.CD4.CXCR4几乎完全阻断用HIV-1 HXB2包膜假型包装的HIV-Luc的感染，但对用VSV-G假型包装的HIV-Luc没有作用(图5，图A)。使用VAD提取物得到类似的结果(图5，图B)。提取物AAP-l、AAP-s、AAP-r和ADR-r显示抑制用HIV-1 HXB2包膜假型包装的HIV-Luc对U87.CD4.CXCR4细胞的感染(图13，图A)，以及抑制M向性HIV-1 YU-2包膜假型包装的HIV-Luc病毒对U87.CD4.CCR5细胞的感染。不受限于理论，这些结果表明AAP-l、AAP-s、AAP-r、ADR-r、TXE和VAD通过阻断HIV-1进入靶细胞而抑制HIV-1复制。

在此描述的是改良的实验方案，其使用相同的复制缺陷型单轮HIV-Luc报道基因系统以进一步确定TXE和VAD在进入阶段抑制HIV-1复制，以测定TXE和VAD是否直接灭活HIV-1或对HIV-1生命周期的其它阶段有任何作用。首先在37℃下用10μg/ml TXE、VAD或0.1％DMSO孵育相同量的用HXB2包膜假型包装的HIV-Luc病毒2小时。通过离心回收所述病毒，然后用于感染U87.CD4.CXCR4细胞。将所述细胞培养48小时，然后收获用于Luc活性测定。Luc活性显示在DMSO处理对照和TXE或VAD处理之间在病毒感染性方面没有明显的差异，而热灭活的病毒具有很少感染性(图6，图A)。在37℃下用HIV-1 HXB2包膜假型包装的HIV-Luc病毒感染U87.CD4.CXCR4细胞2小时。通过用新鲜的培养基反复洗涤除去剩余的输入病毒，然后在这些TXE或VAD提取物(10μg/mL)或5μM AZT存在的情况下培养这些细胞48小时。针对Luc活性测定测定所述细胞。与AZT对照相比，TXE和VAD处理HIV感染的细胞的Luc活性方面不显示与DMSO处理的任何差异(图6，图B)。不受限于理论，据认为，总之，这些结果显示所观察到的TRX和VAD对HIV-1复制的抑制并不归因于这些提取物对HIV-1的灭活或在进入后阶段的阻断，这进一步支持TRE和VAD在病毒生命周期的进入阶段抑制HIV-1复制的可能性。用HXB2假型包装的HIV-Luc病毒或用YU-2假型包装的HIV-Luc病毒与AAP-l、AAP-s、AAP-r或ADR-r的孵育，并不抑制经处理的病毒分别感染U87.CD4.CXCR4或U87.CD4.CCR5细胞的能力(图14，图A和图B)。

在此描述的是使用双向性初级HIV-1分离群89.6[Doranz BJ，等，Cell 1996，85：1149-1158]进行的类似实验，以研究TXE和VAD是否也能够阻断该病毒进入其靶细胞。用10μg/mL TXE或VAD处理U87.CD4.CXCR4和U87.CD4.CCR5细胞，然后用HIV-1 89.6包膜假型包装的HIV-Luc病毒感染所述细胞。与DMSO处理对照相比，TXE和VAD处理都显示在U87.CD4.CXCR4和U87.CD4.CCR5细胞二者中明显较低的Luc活性(图7，图A)，这表示它们阻断HIV-1 89.6感染。如所述确定所述提取物对HIV-1 89.6自身以及在进入后阶段的作用。类似于HXB2病毒，当89.6病毒在感染之前暴露于所述提取物时，其感染性上不显示任何改变(图7，图B)。同样，当89.6感染发生在所述提取物处理之前时，89.6病毒在它们进入后的复制中不显示任何改变(图7，图C)。此外，这些提取物对HIV-1 89.6病毒的RT酶活性不具有任何直接的抑制作用(图7，图D)。不受限于理论，相信这些数据证明了TXE和VAD均具有阻断初级HIV-1分离群89.6进入的类似活性。

接下来，使用不同的疏水性和极性的有机溶剂把这两种提取物分成4种亚级分，这些有机溶剂即石油醚(PE)、氯仿(CF)、醋酸乙酯(EA)和正丁醇(BT)。在此描述的是，这些亚级分对HIV-1复制的作用。如上所示，TXE处理以明显的方式抑制HIV-1复制(图8，图A)。与DMSO处理的对照相比，用CF亚级分和BU亚级分处理的细胞中HIV复制较低，而用其PE亚级分和EA亚级分处理的细胞中HIV复制显示很少改变。相反，VAD提取物的PE亚级分、CF亚级分和EA亚级分具有比DMSO对照低的HIV-1复制，而其BT亚级分没有显示出抗HIV活性(图8，图B)。自单轮感染测定得到类似的结果(数据没有显示)。这些结果表明，活性抗HIV组分可进一步从TXE和VAD提取物中分离，并可在这两种提取物中不同。

使用良好建立的HIV-1复制系统针对其抗HIV活性筛选传统中药草本植物的提取物(表1)。来自大戟科剑叶三宝木(TXE)的茎和龙脑香科青梅(VAD)的茎的提取物抑制HIV-1复制，而不明显影响细胞增殖和细胞存活(图1和图2)。这两种提取物防止HIV感染的细胞形成合胞体的发现进一步确证它们的抑制作用(图3)。检测不到这些提取物对HIV-1 RT酶活性的作用(图4)。不受限于理论，据认为本文描述的观察结果表明，这些提取物有效地阻断HIV-1进入其靶细胞(图5)。这些提取物几乎不作用于进入后的HIV-1基因表达(图6)。利用CXCR4和CCR5两者用于进入细胞，使用显示双向性的初级分离群HIV-1 89.6得到类似的结果，HIV-1 89.6(图7)。总之，这些研究揭示这两种植物提取物的抗HIV活性，并表明它们的抗HIV活性因干扰HIV-1进入引起。

AAP-l、AAP-s、AAP-r、ADR-r、TXE和VAD提取物具有有效的针对T和M向性HIV-1分离群两者的HIV-1复制和进入的抑制活性。

在本发明的一个实施方案中，一种用于制备包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物的方法，所述方法包括从植物材料中获取活性级分的步骤，所述植物材料获自大戟科剑叶三宝木或龙脑香科青梅。

在本发明的另一个实施方案中，一种用于制备包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物的方法，所述方法包括从植物材料中获取活性级分的步骤，所述植物材料获自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花。

在另一个实施方案中，描述了用于制备包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

a)干燥获自大戟科剑叶三宝木或龙脑香科青梅的植物材料；

b)研磨所述经干燥的植物材料；以及

c)用第一提取剂提取所述经研磨的植物材料以产生包含活性级分的植物提取物。在另一个实施方案中，描述了用于制备包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

a)干燥获自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料；

b)研磨所述经干燥的植物材料；以及

c)用第一提取剂提取所述经研磨的植物材料以产生包含活性级分的植物提取物。在另一个实施方案中，描述了前述实施方案的任一个所描述的方法，其中所述植物是大戟科剑叶三宝木。在另一个实施方案中，描述了上述方法，其中所述植物是龙脑香科青梅。在另一个实施方案中，描述了上述方法，其中所述植物是番荔枝科毛叶鹰爪花。在另一个实施方案中，描述了上述方法，其中所述植物是番荔枝科喙果皂帽花。在另一个实施方案中，所述植物材料是叶材料。在另一个实施方案中，所述植物材料是茎材料。在备选实施方案中，所述植物材料是根材料。在又一个实施方案中，描述了前述实施方案中任一个的方法，其中第一提取剂是极性或非极性溶剂或它们的混合物。在另一个实施方案中，描述了前述实施方案中的任一个方法，其中第一提取剂是乙醇和水的混合物。在一些说明性的实施方案中，混合物为约70％-约80％乙醇∶约30％-约20％水，或混合物为约75％乙醇∶约25％水。

在另一个实施方案中，描述了前述实施方案中的任一个的方法，其中提取在约80℃下进行。

在另一个实施方案中，描述了前述实施方案中的任一个的方法，其还包括以下步骤：d)除去基本上所有的第一提取剂以产生第一剩余物；以及e)用第二提取剂提取第一剩余物以产生包含活性级分的第二提取物。

在另一个实施方案中，描述了前述实施方案的方法，其中第二提取剂是极性溶剂、非极性溶剂或它们的组合，即石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它们的组合等。

在另一个实施方案中，描述了由前述实施方案中的任一个的方法产生的药物组合物。在另一个实施方案中，描述了前述实施方案的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或它们的组合。

在另一个实施方案中，描述了治疗需要缓解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的前述实施方案之一中所描述的药物组合物。在另一个实施方案中，描述了预防HIV感染的方法，所述方法包括给予前述实施方案的任一个中描述的药物组合物的步骤。

在下述条款中也描述了本发明的实施方案。

1.一种可用于治疗HIV感染的活性级分，其通过以下方法从包含至少一种选自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花和番荔枝科喙果皂帽花的植物的一个或多个植物部分的植物材料中获得，所述方法包括用第一提取剂提取所述植物材料的步骤。

2.条款1的活性级分，其中所述方法还包括干燥所述植物材料和研磨所述植物材料的步骤，其中所述干燥步骤在所述提取步骤之前。

3.条款1或2的活性级分，其中第一提取剂包含极性或非极性溶剂或它们的混合物。

4.条款1-3中任一项的活性级分，其中第一提取剂包含乙醇和水的混合物。

5.条款1-4中任一项的活性级分，其中所述提取剂包含70％-95％乙醇和30％-5％水的混合物。

6.条款1-5中任一项的活性级分，其中所述提取在75℃-85℃的温度下进行。

7.呈浓缩物形式的条款1-6中任一项的活性级分，其中所述方法还包括通过蒸发除去第一提取剂的步骤。

8.通过以下方法获得的第二活性级分，所述方法包括用第二提取剂提取条款1-7中任一项的浓缩物的步骤。

9.条款1-8中任一项的第二活性级分，其中第二提取剂是极性溶剂、非极性溶剂或它们的组合。

10.条款1-9中任一项的第二活性级分，其中第二提取剂是石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它们的组合。

11.条款1-10中任一项的活性级分，其中所述植物是大戟科剑叶三宝木。

12.条款1-11中任一项的活性级分，其中所述植物是龙脑香科青梅。

13.条款1-12中任一项的活性级分，其中所述植物是番荔枝科毛叶鹰爪花。

14.条款1-13中任一项的活性级分，其中所述植物是番荔枝科喙果皂帽花。

15.条款1-14中任一项的活性级分，其中所述植物部分为根。

16.条款1-15中任一项的活性级分，其中所述植物部分为茎。

17.条款1-16中任一项的活性级分，其中所述植物部分为叶。

18.一种用于制备可用于治疗HIV感染的活性级分的方法，其中所述方法包括用第一提取剂提取来自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步骤。

19.条款18的方法，其中所述方法还包括干燥所述植物材料的步骤，其中所述干燥步骤在所述提取步骤之前。

20.条款18或19的方法，其中所述方法还包括研磨所述植物材料的步骤。

21.条款18-20中任一项的方法，其中第一提取剂包含极性或非极性溶剂或它们的组合。

22.条款18-21中任一项的方法，其中第一提取剂包含乙醇和水的混合物。

23.条款18-22中任一项的方法，其中所述提取剂包含70％-95％乙醇和30％-5％水的混合物。

24.条款18-23中任一项的方法，其中所述提取在75℃-85℃的温度下进行。

25.条款18-24中任一项的方法，其中所述方法还包括通过蒸发除去第一提取剂以产生浓缩物的步骤。

26.条款18-25中任一项的方法，其中所述方法还包括用第二提取剂提取所述浓缩物的步骤。

27.条款18-26中任一项的方法，其中第二提取剂是极性溶剂、非极性溶剂或它们的组合。

28.条款18-27中任一项的方法，其中第二提取剂是石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它们的组合。

29.条款18-28中任一项的方法，其中所述植物材料来自大戟科剑叶三宝木。

30.条款18-29中任一项的方法，其中所述植物材料来自龙脑香科青梅。

31.条款18-30中任一项的方法，其中所述植物材料来自番荔枝科毛叶鹰爪花。

32.条款18-31中任一项的方法，其中所述植物材料来自番荔枝科喙果皂帽花。

33.条款18-32中任一项的方法，其中所述植物材料包括选自根、茎、叶、种子和花的植物部分。

34.一种包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物，其中所述活性级分通过以下方法制备，所述方法包括用第一提取剂提取来自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步骤。

35.条款34的组合物，其中所述方法还包括干燥所述植物材料的步骤，其中所述干燥步骤在所述提取步骤之前。

36.条款34或35的组合物，其中所述方法还包括研磨所述植物材料的步骤。

37.条款34-36中任一项的组合物，其中第一提取剂包含极性或非极性溶剂或它们的混合物。

38.条款34-37中任一项的组合物，其中第一提取剂包含乙醇和水的混合物。

39.条款34-38中任一项的组合物，其中所述提取剂包含70％-95％乙醇和30％-5％水的混合物。

40.条款34-39中任一项的组合物，其中所述提取是在75℃-85℃温度下进行的。

41.条款34-40中任一项的组合物，其中所述方法还包括通过蒸发除去第一提取剂以产生浓缩物的步骤。

42.条款34-41中任一项的组合物，其中所述方法还包括用第二提取剂提取所述浓缩物的步骤。

43.条款34-42中任一项的组合物，其中第二提取剂是极性溶剂、非极性溶剂或它们的组合。

44.条款34-43中任一项的组合物，其中第二提取剂是石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它们的组合。

45.条款34-44中任一项的组合物，其中所述植物来自龙脑香科青梅。

46.条款34-45中任一项的组合物，其中所述植物材料来自番荔枝科毛叶鹰爪花。

47.条款34-46中任一项的组合物，其中所述植物材料来自番荔枝科喙果皂帽花。

48.条款34-47中任一项的组合物，其中所述植物材料包括选自根、茎、叶、种子和花的植物部分。

49.一种用于治疗需要缓解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的前述条款中任一项的活性级分或前述条款中任一项的药物组合物的步骤。

在备选实施方案中，可将所述活性级分配制用于口服给药、直肠给药、阴道给药、胃肠外给药(包括皮下给药、肌内给药、静脉内给药和鞘内给药)以及口服给药。

本文所用的术语“活性级分”通常是指包含显示抗HIV活性的药理学活性剂(不论是组分、组分的组合、生物代谢物、它们的衍生物还是上述的组合)的级分或提取物。应理解的是，所述抗HIV活性可归因于单一组分、组分的组合或者其生物代谢物或衍生物。

应理解的是，当从植物的部分(例如茎、叶、根、花、种子等)中制备提取物时，某种量的来自植物的一个或多个其它部分的植物材料可与目标植物部分相混合。应理解的是，在从植物中获得活性级分之前可进行一个或多个以下步骤：培育植物、收获植物或收集植物或收集植物部分或者清洗植物材料以除去外来的材料。

应理解的是，研磨植物材料的步骤可在提取步骤之前或者在提取步骤期间进行。

本文所用的术语“除去基本上所有的”通常是指除去不少于90％，或不少于95％，或不少于98％，或不少于99％，或不少于99.5％的所除去的材料。

在另一个实施方案中，描述了制备提取物的常规方法，所述方法基于使用提取剂处理植物材料以获得未加工的或初始的提取物，其在除去细料的任选处理(例如，通过沉降或过滤)之后，包含所述提取剂和可溶于所述提取剂中的植物成分。在另一个实施方案中，描述了包含极性或非极性溶剂或其组合的提取剂。可用作提取剂的溶剂的说明性实例是水、醇(例如，甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇，等等)、乙腈、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸正丁酯、醋酸异丙酯等、戊烷、石油醚、己烷、庚烷、甲苯、二氯甲烷、氯仿、醋酸、四氢呋喃、乙醚、叔丁基甲基醚等等，或它们的组合。在另一个实施方案中，所述提取剂包含乙醇和水的混合物。

本文所用的术语“提取物”在无进一步说明的情况下，通常是指使用或不使用提取剂的提取产物的任何形式，与物理形式(即粘性的、糊状的或固体)无关。可在从约-30℃至约所述提取剂沸点的任何温度范围下进行本文所述的提取。应理解的是，可在改良的压力下进行所述提取以提高或降低所述提取剂的沸点。

在另一个实施方案中，然后通过部分地蒸发提取剂浓缩初级提取物以除去其挥发性更高的组分，从而形成所谓的浓缩提取物，其典型地包含5-50％体积的剩余溶剂(例如，水)。在进一步除去溶剂后，获得基本上不含用于提取所述植物材料的溶剂的固体、糊状或液体材料。然后该产物(也称为“提取物”或“活性级分”)可像这样使用，或任选加入辅料、添加剂、包衣组分、稀释剂、赋形剂等等而加工以制备具体的应用形式。

本文所描述的活性级分也可直接给予至血流、肌肉或内脏内。这样的胃肠外给药的适合的途径包括静脉内的、动脉内、腹膜内的、尿道内的、胸骨内的、肌内的以及皮下的递送。用于胃肠外给药的合适的手段包括针(包括显微针)注射器、无针注射器以及输注技术。

胃肠外制剂典型地为水溶液，所述水溶液可包含赋形剂(例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH 3-9))，但是就某些应用而言，它们可更适合地配制为无菌的非水溶液或为干燥的形式以与合适的溶媒(例如无菌无热原的水)联用。

使用本领域技术人员所熟知的标准药学技术可容易地实现在无菌条件下胃肠外制剂的制备(例如，通过冷冻干燥)。

可通过使用合适的配制技术(例如掺入增溶剂)增加在胃肠外制剂的制备中所用的活性级分的溶解性。

可将用于胃肠外给药的制剂配制成立即释放和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、控释制剂、靶向释放制剂和程序释放制剂。因此，可将活性级分配制为固体、半固体或触变性液体，以作为提供活性级分的修饰释放的植埋库给药。这样的制剂的实例包括药物包被的支架和dl-乳酸-乙醇酸共聚物(PGLA)微球体。

包含活性级分的药物组合物可呈适合口服使用的形式，例如，作为片剂、含片、锭剂、水性混悬剂或油性混悬剂、可分散散剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊或者糖浆剂或酏剂。可根据本领域所知的任何用于制备药物组合物的方法制备预期用于口服使用的组合物，这样的组合物可包含一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的物质以提供药学上优美和可口的制剂。

用于口服使用的制剂包括片剂，所述片剂包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性级分。这些赋形剂可为，例如，惰性稀释剂(例如碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、成粒剂和崩解剂(例如，玉米淀粉或藻酸)、粘合剂(例如，淀粉、明胶或者阿拉伯胶)以及润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石)。所述片剂可为无包衣的或可将其通过已知技术包衣以延迟在胃肠道的崩解和吸收，因此提供在较长时间内的持续作用。例如，可使用延时材料(例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)。

用于口服使用的制剂也可提供为硬明胶胶囊，其中活性级分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合；或提供为软明胶胶囊，其中活性级分与水或油介质(例如花生油、液态石蜡或橄榄油)混合。

水性混悬剂通常包含与适当赋形剂混合的活性材料。这样的赋形剂是助悬剂(例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯树胶)；分散剂或润湿剂，其可为天然存在的磷脂，例如，卵磷脂；氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)；氧化乙烯与长链脂族醇的的缩合产物(例如，十七烷乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))；氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)；或氧化乙烯与衍生脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。所述水性混悬剂也可包含一种或多种防腐剂(例如乙基、正丙基或对羟基苯甲酸酯)；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；以及一种或多种甜味剂(例如蔗糖或糖精)。

可通过在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液态石蜡)中悬浮活性级分来配制油性混悬剂。所述油性混悬剂可包含增稠剂(例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇)。可加入甜味剂(例如上文提出的那些)以及调味剂以提供可口的口服制剂。可通过加入抗氧化剂(例如抗坏血酸)保存这些组合物。

适用于通过加入水制备水性混悬剂的可分散散剂和颗粒剂，提供与分散剂或润湿剂、助悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性级分。上文已提及的那些例示了合适的分散剂或润湿剂以及助悬剂。也可存在其它赋形剂(例如甜味剂、调味剂和着色剂)。

本文所描述的活性级分的药物组合物也可呈水包油乳剂的形式。油相可为植物油(例如橄榄油或花生油)或矿物油(例如液态石蜡)或这些的混合物。合适的乳化剂可为天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或西黄蓍胶)；天然存在的磷脂(例如大豆卵磷脂)；以及酯类，包括衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯(例如，山梨糖醇酐单油酸酯)以及所述偏酯与氧化乙烯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。所述乳剂也可包含甜味剂和调味剂。

可用甜味剂(例如甘油、山梨糖醇或蔗糖)配制糖浆剂和酏剂。这样的制剂也可包含缓和剂、防腐剂、调味剂和着色剂。药物组合物可呈无菌可注射水性或油性混悬剂的形式。可根据已知的技术使用已在上文提及的那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂配制该混悬剂。无菌可注射的制剂可为在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液剂或混悬剂。在可使用的可接受的溶媒和溶剂中的是水、1，3-丁二醇、林格氏溶液和等张氯化钠溶液。另外，无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，包括合成的甘油一酸酯或甘油二酯在内的任何温和的不挥发油均可使用。脂肪酸(例如油酸)也在可注射制剂(injectibles)的制备中具有应用。

本文所描述的活性级分也可以栓剂、阴道栓剂或灌肠剂的形式给予用于直肠或阴道给药。可通过将药物和合适的非刺激性赋形剂(例如可可油和聚乙二醇)混合来制备这些组合物，所述赋形剂在常温下为固体而在直肠或阴道温度下为液体，因而融化以释放所述药物。可将用于直肠给药/阴道给药的制剂配制为立即释放和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、控释制剂、靶向释放制剂和程序释放制剂。

本文所用的术语“处理”包括治愈性、姑息和预防性处理。

亦应理解的是，在前述实施方案中，本发明的某些方面是以备选提供。本领域的技术人员亦容易地意识到，当成员以常见方式(例如以Markush组)分组在一起时，本发明不仅包括作为整体罗列的整个组，而且还单独地包括该组中的每一个成员以及还包括主组的所有可能的亚组。因此，对于所有目的，本发明不仅包括主组，而且还包括缺少一个或多个组成员的主组。本发明也设想明确排除所要求保护的发明中的任何组成员中的一个或多个。

实施例和方法

实施例1

植物提取物的制备。所有的植物均在中华人民共和国(中国)的海南岛的国家热带森林公园(包括尖峰岭、霸王岭或者吊罗山(表1))采集。中国海口的海南师范大学生物学系的一位植物分类学者钟琼芯教授确认了这些植物的学名和分类。这些植物的样品保存在中国海口的海南省热带药用植物化学重点实验室。首先将植物样品风干、研磨并持续在加压烘箱中于40℃和0.08MPa下干燥。然后将经干燥和研磨的材料在80℃下75％乙醇中进行3轮回流提取。然后将乙醇提取物在55℃下在旋转减压真空蒸发仪中浓缩成为软膏。进一步将所述软膏冻干成为最终形式粉末并保存在干燥器中。将所述粉末在室温下轻微振荡过夜以100mg/mL的浓度溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。然后，通过以3,000rpm离心10分钟，接着通过0.4μm注射器式滤器过滤，来除去混合物中任何残余的不溶物。在所有实验中均使用经澄清的混合物。

表1.针对制备用于抗HIV筛选的提取物选择的热带植物

实施例2

细胞、HIV-1 HXBc2病毒和化学药品。Jurkat细胞购自美国组织培养物保藏所(American Tissue Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)并在RPMI 1640培养基中培养，所述培养基补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/mL硫酸链霉素。分别表达CD4/CXCR4和CD4/CCR5的U87.CD4.CXCR4和U87.CD4.CCR5细胞获自NIH AIDS试剂程序[Bjorndal A，等，J Virol 1997，71：7478-7487；前述文献的公开内容通过引用以其整体结合于本文。另外，本文引用的每一种出版物的全部公开内容也通过引用结合于本文]，将该细胞在DMEM培养基中培养，所述培养基补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素以及100μg/mL硫酸链霉素。通过DEAE-葡聚糖方法将T-向性HIV-1毒株HXBc2的前病毒DNA转染进入Jurkat细胞以产生病毒接种物。HIV-1 HXBc2表达HIV-1Eli毒株nef以及所有其它的HXB2基因。除非另有说明，否则所有的化学药品均来自Sigma(St.Louis，MO)。

实施例3

HIV-1复制测定。用相当于10,000cpm RT活性的HIV-1感染1ml培养基中的一百万个Jurkat细胞。感染24小时后，用所示浓度的植物提取物或同等浓度的DMSO溶剂处理细胞。每隔一天加入新鲜提取物和DMSO。同时，收集培养上清液用于RT活性测定。简而言之，收集1ml的培养上清液，并通过在1,000g下离心5分钟澄清该上清液以除去任何细胞和细胞碎片，接着通过0.2μm的注射器式滤器过滤经澄清的上清液。通过在12,000g下离心1小时将所述上清液中的病毒体沉淀，如所述[Li J，等，J Virol 2002，76：4526-4535；Liu Y，等，J Biol Chem 2004]测定RT活性。

实施例4

细胞毒性和合胞体形成。使用台盼蓝排除法测定植物提取物的细胞毒性。简而言之，将在存在或不存在HIV-1感染的情况下暴露于植物提取物达不同时间长度的Jurkat细胞，在0.2％台盼蓝染料中染色，然后在光学显微镜下计数活细胞。在HIV-1感染过程中，通过光学显微镜从来自一式三份样品的每一份的4个随机视野中计数HIV-1感染的Jurkat细胞的合胞体形成。

实施例5

HIV-1假型包装病毒的制备和感染。如前述[He J，等，Nature 1997，385：645-649；Li J，等，J Virol 2002，76：8374-8382]制备不同包膜蛋白假型包装的HIV-1病毒。简而言之，通过磷酸钙沉淀法用20μg的HIV-Luc质粒以及4μg的pHXB2-env、p89.6-env、pVSV-G或pcDNA3转染293T细胞(2×10⁶细胞/10-cm平板)。在改变培养基48小时后将细胞培养上清液收集、过滤并存作病毒储液。对于感染，使用相当于2000cpm RT活性的假型包装病毒感染靶细胞。感染2小时之后，通过用新鲜培养基多次洗涤将剩余的病毒从所述细胞中除去。将细胞继续孵育48小时，然后收获用于如所述[He J，1997；Li J，2002]的Luc活性测定。

实施例6

TXE和VAD的粗提取物的分级分离。将以上获得的TXE和VAD提取物悬浮于1.5L水中并使用石油醚(PE)(4x1.5L)、氯仿(CF)(5x1.5L)、醋酸乙酯(EA)(5x1.5L)和正丁醇(BT)(5x1.5L)连续分配以获得各自的亚级分。在减压下从这些亚级分中除去过量的溶剂以产生软膏。将所述软膏冻干作粉末形式。将这些亚级分通过在振荡器上振荡过夜以100mg/mL的浓度溶解在DMSO中，并如上所述通过低速离心接着通过注射式滤器过滤来除去不溶物。

实施例7

数据分析。所有值均表示为平均值±SEM，或代表至少三次独立实验。使用双尾斯氏t检验(two-tailed Student′s t-test)进行组间比较。p值＜0.05被认为统计学上显著(^*)，而p＜0.01被认为高度显著(^**)。

尽管上文已描述和/或例示本发明的某些实施方案，但预期其相当大的变化和修改是可能的。因此，本发明不限于本文所描述和/或例示的特定实施方案。

Claims (49)

1.一种可用于治疗HIV感染的活性级分，其通过以下方法从包含至少一种选自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花和番荔枝科喙果皂帽花的植物的一个或多个植物部分的植物材料中获得，所述方法包括用第一提取剂提取所述植物材料的步骤。

2.权利要求1的活性级分，其中所述方法还包括干燥所述植物材料和研磨所述植物材料的步骤，其中所述干燥步骤在所述提取步骤之前。

3.权利要求2的活性级分，其中第一提取剂包含极性或非极性溶剂或它们的混合物。

4.权利要求2的活性级分，其中第一提取剂包含乙醇和水的混合物。

5.权利要求2的活性级分，其中所述提取剂包含70％-95％乙醇和30％-5％水的混合物。

6.权利要求2的活性级分，其中所述提取在75℃-85℃的温度下进行。

7.呈浓缩物形式的权利要求2的活性级分，其中所述方法还包括通过蒸发除去第一提取剂的步骤。

8.一种通过以下方法获得的第二活性级分，所述方法包括用第二提取剂提取权利要求7的浓缩物的步骤。

9.权利要求8的第二活性级分，其中第二提取剂是极性溶剂、非极性溶剂或它们的组合。

10.权利要求8的第二活性级分，其中第二提取剂为石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它们的组合。

11.权利要求1-10中任一项的活性级分，其中所述植物为大戟科剑叶三宝木。

12.权利要求1-10中任一项的活性级分，其中所述植物为龙脑香科青梅。

13.权利要求1-10中任一项的活性级分，其中所述植物为番荔枝科毛叶鹰爪花。

14.权利要求1-10中任一项的活性级分，其中所述植物为番荔枝科喙果皂帽花。

15.权利要求1-10中任一项的活性级分，其中所述植物部分为根。

16.权利要求1-10中任一项的活性级分，其中所述植物部分为茎。

17.权利要求1-10中任一项的活性级分，其中所述植物部分为叶。

18.一种用于制备可用于治疗HIV感染的活性级分的方法，其中所述方法包括用第一提取剂提取来自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步骤。

19.权利要求18的方法，其中所述方法还包括干燥所述植物材料的步骤，其中所述干燥步骤在所述提取步骤之前。

20.权利要求19的方法，其中所述方法还包括研磨所述植物材料的步骤。

21.权利要求20的方法，其中第一提取剂包含极性或非极性溶剂或它们混合物。

22.权利要求20的方法，其中第一提取剂包含乙醇和水的混合物。

23.权利要求20的方法，其中所述提取剂包含70％-95％乙醇和30％-5％水的混合物。

24.权利要求20的方法，其中所述提取在75℃-85℃的温度下进行。

25.权利要求20的方法，其中所述方法还包括通过蒸发除去第一提取剂以产生浓缩物的步骤。

26.权利要求25的方法，其中所述方法还包括用第二提取剂提取所述浓缩物的步骤。

27.权利要求26的方法，其中第二提取剂为极性溶剂、非极性溶剂或它们的组合。

28.权利要求26的方法，其中第二提取剂为石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它们的组合。

29.权利要求18-28中任一项的方法，其中所述植物材料来自大戟科剑叶三宝木。

30.权利要求18-28中任一项的方法，其中所述植物材料来自龙脑香科青梅。

31.权利要求18-28中任一项的方法，其中所述植物材料来自番荔枝科毛叶鹰爪花。

32.权利要求18-28中任一项的方法，其中所述植物材料来自番荔枝科喙果皂帽花。

33.权利要求18-28中任一项的方法，其中所述植物材料包括选自根、茎、叶、种子和花的植物部分。

34.一种包含活性级分的可用于治疗HIV感染的药物组合物，其中所述活性级分通过以下方法制备，所述方法包括用第一提取剂提取来自大戟科剑叶三宝木、龙脑香科青梅、番荔枝科毛叶鹰爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步骤。

35.权利要求34的组合物，其中所述方法还包括干燥所述植物材料的步骤，其中所述干燥步骤在所述提取步骤之前。

36.权利要求35的组合物，其中所述方法还包括研磨所述植物材料的步骤。

37.权利要求36的组合物，其中第一提取剂包含极性或非极性溶剂或它们的混合物。

38.权利要求36的组合物，其中第一提取剂包含乙醇和水的混合物。

39.权利要求36的组合物，其中所述提取剂包含70％-95％乙醇和30％-5％水的混合物。

40.权利要求36的组合物，其中所述提取在75℃-85℃的温度下进行。

41.权利要求36的组合物，其中所述方法还包括通过蒸发除去第一提取剂以产生浓缩物的步骤。

42.权利要求41的组合物，其中所述方法还包括用第二提取剂提取所述浓缩物的步骤。

43.权利要求42的组合物，其中第二提取剂为极性溶剂、非极性溶剂或它们的组合。

44.权利要求42的组合物，其中第二提取剂为石油醚、二氯甲烷、醋酸乙烷、正丁醇或它们的组合。

45.权利要求34-44中任一项的组合物，其中所述植物材料来自龙脑香科青梅。

46.权利要求34-44中任一项的组合物，其中所述植物材料来自番荔枝科毛叶鹰爪花。

47.权利要求34-44中任一项的组合物，其中所述植物材料来自番荔枝科喙果皂帽花。

48.权利要求34-44中任一项的组合物，其中所述植物材料包括选自根、茎、叶、种子和花的植物部分。

49.一种用于治疗需要缓解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的权利要求1-10中任一项的活性级分或权利要求34-48中任一项的药物组合物的步骤。

Images