CN102614467A - 用于治疗艾滋病的中药组合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗艾滋病的中药组合物、其制备方法及应用，其中该药物组合物由黄柏500～504重量份、黄芪28～33重量份、黄芩28～32重量份、菟丝子28～33重量份、白术495～505重量份、白花蛇舌草245～255重量份、白头翁330～340重量份、柴胡25～35重量份、蒲公英495～505重量份、防风10～20重量份、甘草12～17重量份、当归330～338重量份、冬虫夏草498～505重量份、莪术498～505重量份、牡丹皮12～20重量份、紫花地丁27～32重量份组成。本发明提供的中药组合物对HIV病毒有抑制作用、对动物及人体免疫功能有明显增强作用。

Description

用于治疗艾滋病的中药组合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及艾滋病治疗领域，特别地，涉及一种用于治疗艾滋病的中药组合物，另一方面本发明还涉及上述中药组合物的制备和应用。

背景技术

艾滋病，是一种人畜共忠的疾病，由″HIV″病毒引起。人体感染该病毒后，人体免疫系统受到攻击。HIV病毒将人体免疫系统中最重要的T4淋巴组织作为攻击目标，大量破坏T4淋巴组织，导致人体出现各种高致命性的内衰竭疾病。这种病毒一旦在一个地域出现就会导致该地区人的长期传染的危险中，破坏了人的免疫平衡，使得人体成为各种疾病的载体。HIV病毒本身并不会引发任何疾病。艾滋病对人类的危险更多的是来自于人体免疫系统被破坏后，人体抵抗能力过低，而感染其它的疾病。这些疾病的复合感染才是将艾滋病忠者推向死亡的真正原因。

自第一个治疗HIV感染/AIDS药物齐多夫定(AZT)于1987年被美国FDA批准上市后，抗AIDS药物的研究发展突飞猛进，目前国外已有16个药物被批准上市。这些药物只能抑制而不能彻底杀灭HIV病毒。而且在使用过程中又会对忠者产生某些副作用，特别是所产生的骨髓抑制，是难以克服的难题。因此临床上急需研制出新的抗HIV药物。此外，这些药物多来自于人工合成，对人工合成的药物进行抗HIV筛选，需要花费惊人的人力、物力和财力。

目前尚无治疗艾滋病的特效药。因此，寻找高活性，无毒或低毒性的纯天然治疗艾滋病和抗癌药物成为新药研究的一项重要课题。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于治疗艾滋病的中药组合物、其制备方法及应用，以解决现有技术中治疗艾滋病药物筛选需要大量人力物力，副作用大的问题。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗艾滋病的中药组合物，由黄柏500～504重量份、黄芪28～33重量份、黄芩28～32重量份、菟丝子28～33重量份、白术495～505重量份、白花蛇舌草245～255重量份、白头翁330重量份～340重量份、柴胡25重量份～35重量份、蒲公英495～505重量份、防风10～20重量份、甘草12～17重量份、当归330～338重量份、冬虫夏草498～505重量份、莪术498～505重量份、牡丹皮12重量份～20重量份、紫花地丁27～32重量份组成。

进一步地，由黄柏502重量份、黄芪30重量份、黄芩30重量份、菟丝子30重量份、白术502重量份、白花蛇舌草250重量份、白头翁334重量份、柴胡30重量份、蒲公英502重量份、防风15重量份、甘草15重量份、当归334重量份、冬虫夏草502重量份、莪术502重量份、牡丹皮15重量份、紫花地丁30重量份组成。

本发明的另一方面还提供了上述方法的制备方法，包括以下步骤：

1)将黄芪、菟丝子、柴胡、防风、甘草、牡丹皮和紫花地丁粉碎成80目细粉；

2)将黄柏、白术、黄芩、白花蛇舌草、白头翁、蒲公英、当归、冬虫夏草和莪术加水进行煎煮步骤，得到主滤液；

3)将主滤液减压浓缩后加入乙醇得到浆状物，浆状物的含醇量为75％，静置24小时，滤过，得到次滤液减压浓缩成稠膏，稠膏的在81～85℃测得相对密度为1.3；

4)混合稠膏和步骤1)中所得细粉，得到中药组合物。

进一步地，煎煮步骤包括第一次煎煮，加生药量5倍量水，煎煮2小时，滤过，得到第一滤液；第二次煎煮，加生药3倍量水，煎煮2小时，滤过，得到第二滤液；第三次煎煮，加生药2倍量水，煎煮1小时，滤过，得到第三滤液，合并第一、第二和第三滤液得到主滤液。

进一步地，还包括向步骤4)中中药组合物中加入辅料；辅料为粘合剂、助流剂、稀释剂、缓释剂和矫味剂所组成的组中的一种或任意种。

进一步地，还包括将组合物制成片剂的步骤：加入组合物总量3％的羧甲基淀粉钠和5％的乳糖，以浓度为10％淀粉浆为粘合剂，制软材，60℃真空干燥，加入3％滑石粉混合均匀，压片，即得片剂。

进一步地，还包括将组合物制成胶囊的步骤：组合物经真空干燥后，得干膏，粉碎干膏后加入乳糖，混匀，与10％的淀粉浆混合，制软材，过20目筛整粒，装罐成胶囊。

进一步地，还包括将组合物制成冲剂的步骤：加入组合物质量200％的蔗糖和125％的糊精，制成颗粒，干燥，混合均匀，封装，即得冲剂。

本发明另一方面还提供了，上述中药组合物在制备治疗艾滋病药物中的应用。

进一步地，中药组合物按2.5g/kg使用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的中药组合物对HIV病毒有抑制作用、对动物及人体免疫功能有明显增强作用。通过改善、调节和平衡人体系统内环境，从整体上以中介的方式促进人体系统免疫发挥，使其发挥自创生、自修复、自调节、自防御、自组织的能力，从而抵御和治疗由艾滋病带来的各类并发症。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面对本发明作进一步详细的说明。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

中医学中无艾滋病病名，根据艾滋病的症状，中医认为本病属温病学范围，按卫气营血与三焦结合脏腑辩证论治。本病病因复杂，多与饮食劳倦所伤、因房室不节、温邪淫毒或吸毒等行为有关，以致正气受损、邪气滞留所致。其主要病机是“正虚邪恶”。“内经”云：“邪之所奏，其气必虚”，“正气内存，邪不可扰”。正气虚即脏腑之气虚，邪毒乘虚而入，留连体内不去，正邪交争而疾病反复缠绵，日久则损及脾肾。病性属体虚感邪，始终表现为“正虚邪恶”局面。通常，温邪之气上犯肺而及胃，伤耗肺胃阴津，先见发热、口干渴，或咳嗽、饮食减退等。“大肠小肠皆属于胃”，小肠主分利、大肠主传导，两腑受损，分利传导失权而见腹泻反复发作，脾主运化水谷，主肌肉，为气血生化之源，病久及脾，脾气受损则运化失权，气血难化，肌肤失养而见形瘦面黄、气短乏力神疲等。上述病症久之伤及于肾，肾为“先天之本，主藏精、主骨、主髓、主水等，肾气受损，则肾精亦亏，骨枯髓减，故见极度消瘦、腰膝酸软、头晕目暗等症。全病程肺、胃、脾、肾之阴受损，阴阳失和而邪气滞留，正邪交争而发热。以上为艾滋病的病机特点，也为艾滋病脾肾两虚、邪毒留羁证之病机。其治则为补益脾肾、清热解毒。

本发明提供的中药组合物能扶正祛邪、活血化瘀、清热解毒、补益脾肾。用于治疗由脾肾两虚、邪毒留羁引起的反复腹泻、发热、形体消瘦，头晕目暗、神疲乏力、腰酸膝软、舌质淡红脉沉细等病症。本发明药物中扶正是指补益脾肾、养益气血，以使CD4+T细胞上升。祛邪是指清热解毒，使HIV病毒的载量下降，控制机会性感染。本发明提供的组合物主治艾滋病、艾滋病相关综合征及艾滋病毒感染，可在HIV感染期、ARC(艾滋病相关综合征)期及A工DS重症期全病程使用。

本发明提供的用于治疗艾滋病的中药组合物由黄柏500～504重量份、黄芪28～33重量份、黄芩28～32重量份、菟丝子28～33重量份、白术495～505重量份、白花蛇舌草245～255重量份、白头翁330重量份～340重量份、柴胡25重量份～35重量份、蒲公英495～505重量份、防风10～20重量份、甘草12～17重量份、当归330～338重量份、冬虫夏草498～505重量份、莪术498～505重量份、牡丹皮12重量份～20重量份、紫花地丁27～32重量份组成。

该组方中君药为黄芪和黄芩。臣药为白术、黄柏、蒲公英、白花蛇舌草、柴胡、防风、冬虫夏草等。佐药为当归、菟丝子、紫花地丁、牡丹皮等。使药为甘草。

黄芪味甘性微温，归脾肺经，有补气、固表、止汗、敛创生肌之功，为五脏气虚之常用药。黄芩味苦性寒，有清上焦热毒之功，善泻肺胃之火。两者合同，一补肺、胃、肾之气，一清肺胃脾之热并解毒，共为君药对本病的病机“正虚邪虚”发挥扶正祛邪的作用。

白术：味古甘性温，归肺脾大肠经，取其健脾益气利湿之力，主要用于肺脾气虚之症。菟丝子、冬虫夏草有补肾阳益肾气之功，以助黄芪补肾气，共达扶正祛邪之效。黄柏味苦性寒，归心、脾、小肠及膀肤经，有清下焦热之功。蒲公英味甘性寒，归心、胃、脾经，有清热解毒散结之功。紫花地丁味苦性寒，归心、小肠经，有清热解毒散结之功。白头翁味苦性寒，归脾胃、大肠经。白花蛇舌草味苦性寒，有清热解毒散结之功。以上几味药皆为清热解毒兼散结之剂，共助黄芪清热解毒散结，征服温热毒邪之症。柴胡味苦性平，有和解退热二疏肝解郁又升举阳气之功，一边助黄芪升举清阳，一边助黄芪清疏少阳之热。防风能祛风解表、胜湿止痛，对艾滋病的风热痒疹(如多形性皮疹)、风寒湿痹(如艾滋病相关未梢神经炎)均有作用。

当归能入心肝脾经，有补血、活血止痛之效，使药达病所。牡丹皮：清血分之邪毒。莪术与白术相配，有开胃消痞之功。

甘草味甘性平，有健脾和中、润肺解毒、调和诸药、使之不争，并能引药以达诸经。按此配合使用能直达艾滋病病灶发挥作用。

进一步地，本发明提供的中药组合物的组方优选为由黄柏502重量份、黄芪30重量份、黄芩30重量份、菟丝子30重量份、白术502重量份、白花蛇舌草250重量份、白头翁334重量份、柴胡30重量份、蒲公英502重量份、防风15重量份、甘草15重量份、当归334重量份、冬虫夏草502重量份、莪术502重量份、牡丹皮15重量份、紫花地丁30重量份组成。此为本发明最优实施例。

本发明的另一方面还提供了上述药物的制备方法，该方法包括以下步骤：

为提高君药中黄芪及其协调发挥作用药物的药效，故将这些药以粉末形式直接入药。其他药物组合物的有效成分主要为水溶性的，因而采用反复三次水提将其提出。之后制备浸膏，以提供有效成分的浓度。以浸膏入药。具体的煎煮步骤包括第一次煎煮，加生药量5倍量水，煎煮2小时，滤过，得到第一滤液；第二次煎煮，加生药3倍量水，煎煮2小时，滤过，得到第二滤液；第三次煎煮，加生药2倍量水，煎煮1小时，滤过，得到第三滤液，合并第一、第二和第三滤液得到滤液。按此方法提取能提高提取效率。

1)称取黄芪、菟丝子、柴胡、防风、甘草、牡丹皮和紫花地丁经粉碎成80目细粉；

2)将黄柏、白术、黄芩、白花蛇舌草、白头翁、蒲公英、当归、冬虫夏草和莪术加水进行煎煮步骤，得到主滤液；

3)取主滤液减压浓缩后加乙醇，使含醇量为75％，静置24小时，滤过，得到次滤液减压浓缩成稠膏，稠膏的相对密度为1.3，该相对密度为在80-85℃下采用常规方法测定；

4)混合稠膏和步骤1)中所得细粉，得到中药组合物。

进一步的还可在步骤4)中加入辅料为粘合剂、助流剂、稀释剂、缓释剂和矫味剂所组成的组中的一种或任意种。填充剂可以为微晶纤维素，硫酸钙，淀粉，羧甲基淀粉那，羟丙基甲基纤维素；黏着剂可以为聚维酮K30，糊精，羟丙纤维素；助流剂可以为滑石粉，微粉硅胶，硬脂酸镁；矫味剂可以为乳糖，香精，蔗糖。

本发明提供的中药组合物通过添加相应的辅料还能制成相应的剂型，优选制成片剂、胶囊或口服液。

片剂的制备方法：加入所述组合物总量3％的羧甲基淀粉钠，5％的乳糖，以浓度为10％淀粉浆为粘合剂，制软材，60℃真空干燥，加入3％滑石粉混合均匀，压片，即得片剂。按此工艺方法制备得到的片剂在生产过程中不会出现粘片等问题。

优选胶囊的制备方法：将上述中药组合物，经真空干燥后，得干膏，粉碎成细粉，加入适量的填充剂混合均匀，以10％淀粉浆制软材，过20目筛整粒，罐装成胶囊。制备胶囊时所用填充剂可以为甘露醇，木糖醇，乳糖，糊精。中药组合物的成分与不同的填充剂混合制得的胶囊吸湿速录、临界相对温度不同，这直接影响了所制得胶囊的质量。优选所用填充剂为乳糖，此时胶囊质量最优。

冲剂的制备：将上述中药混合物，加入200％蔗糖，125％糊精，制成颗粒，混合均匀，干燥，即得。制备冲剂常用的辅料是蔗糖及糊精，将蔗糖与糊精按照一定的比例与中药混合物制备成颗粒，当组合物∶蔗糖∶糊精质量比为1∶2∶1.25时制粒效果良好，无不良苦味。

该中药组合物可制成各类口服常用剂型，如片剂、冲剂、胶囊剂等优选为胶囊剂。胶囊剂中药物为颗粒状，缓释和释放效果较片剂和冲剂为好。

本发明的另一方面还提供了一种上述中药组合物的应用，中药组合物按2.5g/kg使用。按此计量使用效果最优。

实施例

以下实施例中中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

1)称取黄芪、菟丝子、柴胡、防风、甘草、牡丹皮和紫花地丁经粉碎成80目细粉；

2)其余黄柏、白术等药物，加水煎煮三次，得到滤液。煎煮步骤包括第一次煎煮，加生药量5倍量水，煎煮2小时，滤过，得到第一滤液；第二次煎煮，加生药3倍量水，煎煮2小时，滤过，得到第二滤液；第三次煎煮，加生药2倍量水，煎煮1小时，滤过，得到第三滤液，合并第一、第二和第三滤液得到滤液。

3)取滤液减压浓缩后加乙醇，使含醇量为75％，静置24小时，滤过，滤液减压浓缩成稠膏，稠膏的相对密度为1.3(80-85℃下按常规方法测得)；

4)混合稠膏和步骤1)中所得细粉，得到中药组合物。

实施例1

该中药组合物1由黄柏504重量份、黄芪33重量份、黄芩28重量份、菟丝子33重量份、白术505重量份、白花蛇舌草245重量份、白头翁340重量份、柴胡35重量份、蒲公英505重量份、防风20重量份、甘草17重量份、当归338重量份、冬虫夏草505重量份、莪术498重量份、牡丹皮20重量份、紫花地丁32重量份组成。

实施例2

该中药组合物2由黄柏502重量份、黄芪30重量份、黄芩30重量份、菟丝子30重量份、白术502重量份、白花蛇舌草250重量份、白头翁334重量份、柴胡30重量份、蒲公英502重量份、防风15重量份、甘草15重量份、当归334重量份、冬虫夏草502重量份、莪术502重量份、牡丹皮15重量份、紫花地丁30重量份组成。

实施例3

该中药组合物3由黄柏500重量份、黄芪28重量份、黄芩32重量份、菟丝子28重量份、白术495重量份、白花蛇舌草255重量份、白头翁330重量份、柴胡25重量份、蒲公英495重量份、防风10重量份、甘草12重量份、当归330重量份、冬虫夏草498重量份、莪术505重量份、牡丹皮12重量份、紫花地丁27重量份组成。

动物实验

对免疫抑制低下小鼠进行免疫功能影响实验

1.实验材料

1.1实验动物

昆明小鼠，雌雄各半，6-8周龄，18-20克；中国医学科学院实验动物中心提供。

1.2药品及试剂

试剂一：中药组合物1，为淡棕色粉末，4℃下保存，用时以去离子水混悬，煮开15分钟，2层纱布过滤。

试剂二：中药组合物2，为淡棕色粉末，4℃下保存，用时以去离子水混悬，煮开15分钟，2层纱布过滤。

试剂三：中药组合物3，为淡棕色粉末，4℃下保存，用时以去离子水混悬，煮开15分钟，2层纱布过滤。

山地明环饱索注射液：诺华制药，批号：S156000

香菇多糖注射液：金陵药业股份有限公司福州梅峰制药厂，批号：040101，用时以生理盐水稀释。

荧光抗体：Mouse CD3PE(T细胞标志)，Mouse CD4FITC，Lot：；Mouse CD8a Tri-color，Lot：；05020505；Mouse CD19Tri-color(B细胞标志)，Lot：；05010505；anti-Mouse NK cells FITC，Lot：01020904；均为Biole重量份end公司产品。Lysin重量份Solution：BD公司产品，Lot 93，Exp：09.05。

流式细胞仪：Becton Dickson FACScalibur，北京天坛医院检验科。

日本光电6318K三分类血细胞分析仪，中国医学科学院药物研究所安评中心生化检验室。

2.实验方法

将小鼠按体重平均分组，雌雄各半，分组及处理方式如表1所示：

表1.昆明小鼠分组及处理方式

2.1小鼠外周血血常规和淋巴细胞亚群的测定：

于第7天将小鼠称重，摘一只眼球取血，采用EDTA-K3抗凝剂抗凝。准备两组流式细胞测定管，第一组每管加入CD3，CD4，CD8荧光抗体，第二组每管加入CD3，CD19，NK荧光抗体，然后加入20ul抗凝血样品，每管加入80ul生理盐水，混匀，避光标记20分钟，加入O.Sml Lysin重量份Solution使红细胞溶解、1500rpm离心5分钟，PBS洗两次，最后用0.2mlPBS悬浮细胞，用流式细胞仪测定CD3CT细胞)、CD4，CD8以及CD19CB细胞)、NK细胞的相对数量。将剩余的抗凝血进行血常规分析。

3.统计方法

用SPSS 10.0软件进行方差分析以及多组比较的kruskal-Wallis H检验和两两之间比较的Mann-Wliitney U检验。

4.结果显示：

1)使用中药组合物2的实验组小鼠单核细胞绝对值提高至1.62重量份/L；使用中药组合物1的实验组小鼠单核细胞绝对值提高至1.53重量份/L；使用中药组合物3的实验组小鼠单核细胞绝对值提高至1.59重量份/L；空白对照组小鼠单核细胞绝对值为1.32重量份/L；香菇多糖阳性对照组的小鼠单核细胞绝对值为0.96重量份/L；免疫抑制模型组的小鼠单核细胞绝对值为0.79重量份/L。

2)使用中药组合物2的实验组小鼠单核细胞百分比提高至25.88％，使用中药组合物1的实验组小鼠单核细胞百分比提高至22.65％，使用中药组合物3的实验组小鼠单核细胞百分比提高至25.68％，空白对照组小鼠的单核细胞百分比为17.7％；香菇多糖阳性对照组小鼠的单核细胞百分比为21.66％；免疫抑制模型组为13.2％。

本发明提供的中药组合物能从上述两个方面对HIV病毒的活性发挥抑制作用，其中中药组合物2对HIV病毒活性抑制作用更为明显。

对免疫抑制低下小鼠各项生理指标结果列于表2中。

表2中药组合物2对免疫低下小鼠免疫功能的影响

1)受试动物CD4细胞绝对值、CD4细胞百分比、CD4/CD8比值、胸腺指数、单核细胞绝对值等5项与艾滋病相关的重要免疫指标，在服用中药组合物1、2和3(2.5g/kg)剂量组中有胸腺指数、外周白细胞、淋巴细胞、单核细胞超过空白对照组。

2)实验组与阳性对照组相比，在服用中药组合物1、2和3(2.5g/kg)剂量组中CD4细胞绝对值、CD4细胞百分比、CD4/CD8比值、胸腺指数、单核细胞绝对值指标均高于阳性对照组(香菇多糖组)。

3)实验组与免疫抑制模型组相比，在服用中药组合物1、2和3(2.5g/kg)剂量组中，以上CD4细胞绝对值、CD4细胞百分比、CD4/CD8比值、胸腺指数、单核细胞绝对值指标均高于免疫抑制模型组，且有统计学意义。其中，中药组合物1、2、3实验组动物的CD4细胞绝对值均高于模型组120％。

由以上试验结果可知，本发明提供的中药组合物能特异性提高与艾滋病相关免疫功能指标，而且在中低剂量效果更为明显；其中中药组合物2对提高与爱滋病相关免疫功能效果相对于中药组合物1，3更为明显，因此本发明选用中药组合物2作为本发明的优选配方，进行后续的药效学研究及临床研究。

抗艾滋病病毒药效学研究

1.药物

上述实施例2中制得的中药组合物2。

奈韦拉平(nevirapine，NVP)购自南京泽众医化信息研究中心(批号：0301001)，S-y为中国科学院上海有机所提供，齐多夫定(Zidovttdine，AZT)为核着类HIV-1逆转录酶抑制剂，为白色粉末，购自上海迪赛诺化学制药有限公司，批号：040201b。

2.方法

2.1药物配制方法

中药组合物2经双蒸水充分溶解后水煮15分钟，冷却后经2500重量份离心10分钟，取上清做实验样品。细胞培养实验时用细胞培养液配制。

2.2中药组合物2对艾滋病毒I型复制酶的抑制作用

2.2.1中药组合物2对艾滋病毒I型逆转录酶(HIV-1RT)的抑制作用

2.2.1.1.主要试剂

poly(A)(dT)₁₅为Boehrin重量份er Mannheim重量份mbH公司产品³H-dTTP为NEN公司产品；DTT，牛血清白蛋白为天象人公司产品；艾滋病毒1型逆转录酶P66/PS 1为本室制备并纯化；其余均为国产分析纯产品。

2.2.12.实验步骤

将标定浓度的基因工程HIV逆转录酶(p66/51)、不同浓度的药液、反应缓冲液和³H-dTTP加入后，混合，37℃反应30分钟。0℃终止反应。反应液滴加于滤纸片上，冷三氯乙酸洗3次。乙醇脱水后烤干。液闪仪测定pm值。同时设酶对照和空白对照及药物对照，计算IC₅₀。

2.2.2.中药组合物2对艾滋病毒I型整合酶(HIV-1IN)的抑制作用

2.2.2.1.试剂

供体底物和靶底物寡核苷酸为上海生工生物工程公司合成，用PA重量份E纯化。COVALINKNH酶标板为丹麦Nunc公司产品。EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-carbodiimide)为美国Si重量份ma化学公司产品。1一甲基咪噢，为ACROS公司产品。pNPP为Roche公司产品。基因工程HIV-1整合酶由本室制备并纯化。

2.2.2.2.ELISA方法检测药物抑制活性

将供体底物包被试验板，洗板后加入：反应缓冲液、不同浓度药液和标定浓度的基因工程HIV整合酶，37℃反应1小时。加入靶底物，混合，37℃反应1小时。洗板。加入BSA(牛血清蛋白)，室温30分钟。洗板。加入碱性磷酸酶标记的亲和素，室温反应1小时。冼板。加显色底物显色30分钟，加0.1N NaOH终止显色反应。酶标仪405nm测足OD值。同时设酶对照和空日对照，计算IC₅₀。

2.2.3.抑制％和IC₅₀计算方法：

2.2.3.2.Reed&Muench法计算IC₅₀

2.3中药组合物2在MT-4细胞培养内对艾滋病毒1型IIIB病毒株的抑制作用

2.3.1细胞及培养液

2.3.1.1传代人T淋巴细胞1vIT-4，为美国卡罗拉杜大学医学研究中心，本室传代，-196℃保存。

2.3.1.21640培养基(RPMI Medium)，加入10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μ重量份/ml链霉素和卡那霉素及10％L-谷氨酞胺。培养传代人T-淋巴细胞MT-4细胞。

2.3.2病毒

HIV-1IIIB病毒株，为美国Colorad大学传染病系提供，在HIV-1IIIB病毒慢性感染H9细胞株中传代，-196℃液氮保存。

2.3.3主要实验试剂

RPMI Medium 1640(powder，liquid)培养基为美国重量份IBCO公司产品：胎牛血清(Fetal Bovine Serum)为天津市川页生化制品有限公司产品；青霉素、链霉素和卡那霉素为华北制药厂产品；四氮哇蓝(Thiazolyl blue，MTT)，柠檬酸为美国Si重量份ma公司产品：TritonX-100为REBOAB STOCKHOLM公司产品；N，N二甲基甲酞胺(N，N-DimethylFormamide)为北京化工厂产品；HIV-1P24抗原检测试剂盒为荷兰BioMerieux公司产品。

2.3.4主要仪器

2.3.4.1细胞实验在3级生物安全实验室中进行。

2.3.4.2Wellscan MK3酶标仪为北京平利洋科贸有限公司产品；EQU/03-EBC-2B}三级生物安全柜为新加坡ESCO重量份IICRO PTE公司生产；重量份alaxy B二氧化碳保温箱为英国RSBiotech公司生产。

2.3.5MT-4细胞培养方法

将生长的细胞离心，倾去上清液，加培养液，计数细胞液，制备1×10⁵细胞/ml细胞悬液，96孔细胞培养板内每孔加入100μl，二氧化碳孵箱37℃，5％CO₂培养。接种细胞同时或接种后加入病毒感染。

2.3.6中药组合物2在MT-4细胞培养内对细胞毒性试验

将2×10⁵细胞/ml 100μl接种于96孔细胞培养板内，同时分别加3倍稀释的中药组合物2，或阳性药AZT，或NVP 2倍稀释的8个浓度的药液，每个稀释度重复3孔，设细胞对照组。置37℃，5％CO₂和饱和湿度培养箱内培养，每天观察细胞病变。加药后第4天(96小时)后吸弃上清100μl，每孔加10μl 5m重量份/mlMTT染色，37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内继续培养4小时，每孔加入100μl 50％DMF-17％Triton X-100脱色液，37℃过夜，在酶联仪上测定波一长为570nm的OD_570nm值，计算药物半数有毒浓度(CC₅₀)。

2.3.7中药组合物2在细胞培养内对感染的HIV-1病毒的抑制试验(P24抗原测定法)

将MT-4细胞4X 10⁵/ml 50μl接种于96孔细胞塔养板内，加入50μl 1000TCID₅₀的HIV-1实验室病毒株IIIB培养液，同时加最大无毒浓度以下稀释的不同浓度中药组合物2或阳性对照药AZT药液100μl，在37℃、5％CO₂和饱和湿度下培养，观察细胞病变，于第4天(96小时)，吸出上清，按HIV-1P24抗原剂试剂盒提供的操作测定HIV-1P24抗原，测定OD_450nm，计算药物半数有效浓度(EC₅₀)。

2.3.8半数毒性浓度(CC₅₀)和半数有效浓度(EC₅₀)及选择指数(SI)计算方法

2.3.8.1Reed&Muench法计算药物在细胞培养中的CC₅₀。和EC₅₀及SI的方法。

公式如下：

2.3.9药物在细胞培养内对细胞或HIV-1P24抗原抑制百分率计算方法

3.实验结果

中药组合物2在同等条件下对艾滋病毒整合酶的完全抑制率(＜100％率)为300μ重量份/ml；阳性对照物S-Y(非药品)完全抑制率为12μ重量份/ml；两者的倍差为25∶1。中药组合物2是纯天然中药材而阳性对照物为分析纯的单体；中药组合物2的口服量是以克、甚至数十克为单位，而后者的口服量是以毫克为单位；从理论上推算，按照上述数据，以成人平均总血液量5000毫升计算，以300μ重量份/ml浓度计算，只要人体全血内达到1.2克的中药组合物2的浓度(C 1.2重量份/5000ml)，就可以在人外周血内高效抑制艾滋病毒整合酶。当然，人体吸收率和酶活化后的因素未统计出。

说明本发明提供的中药组合物用量少，效果好，能直达病灶。

临床实验

对根据病理学判断忠有艾滋病的忠者100名，均分为2组。一组为治疗组，实验组每天早晚口服中药组合物2各一次，每次20克，连续服药6个月。一组为对照组，对照组为未服用任何药物的忠者。7名治疗组忠者和6名对照组忠者为CD4T细胞数小于200。

用Roche公司的Amplicor HIV Monitor version 1.5.BD公司的流式细胞仪和CD3/4/8Trucount试剂盒，分别在用药前，用药后3和6个月分别测定了所试忠者的病毒载量和CD4T细胞的绝对计数。按照美国CDC和NIH的艾滋病治疗指南的标准，判定对忠者的治疗效果。

用药6个月后，治疗组中3名忠者的CD4T细胞数升高比例大于30％，他们的T细胞数分别从75.107和171个/微升，升高到99，189和347个/微升，而对照组只有1名升高大于30(从108个/微升升至147个/微升)。用药组有3名忠者的病毒载量下降了0.5lo重量份以上，分别从11.0，114.2.30.0万/ml，下降到2.2，20.7和2.1万/ml，而对照组没有忠者下降了0.5lo重量份以上。统计学(X²测验)处理结果表明，两组之间有非常显著的差异(P＜0.01)。此外，治疗组忠者的临床症状(如体重、食欲和并发感染等)有明显改善。这些结果表明，中药组合物2对重症艾滋病忠者(CD4T细胞数小于200)的治疗效果优于CD4T细胞数大于200的患者。

在进一步的扩大实验中，通过医院制剂共对146例HIVIAIDS忠者观察治疗。其中系统治疗观察的41例在服用本品半年，停药时间超过2年后，除一例停药一年后因复吸注射毒品过量而死亡外，其余全部存活，且全部恢复生活、工作能力。

中药组合物2对CD4细胞低于200的重症艾滋病忠者疗效尤为显著。

综上所述：本发明提供的中药组合物对HIV病毒有抑制作用、对动物及人体免疫功能有明显增强作用，是一种高活性，无毒的纯天然中药治疗艾滋病和抗癌药物。它通过改善、调节和平衡人体系统内环境，从整体上以中介的方式促进人体系统免疫发挥，使其发挥自创生、自修复、自调节、自防御、自组织的能力，从而抵御和治疗由艾滋病带来的各类并发症，是目前治疗艾滋病和癌症的一个新的研究方向。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于治疗艾滋病的中药组合物，其特征在于，由黄柏500～504重量份、黄芪28～33重量份、黄芩28～32重量份、菟丝子28～33重量份、白术495～505重量份、白花蛇舌草245～255重量份、白头翁330～340重量份、柴胡25～35重量份、蒲公英495～505重量份、防风10～20重量份、甘草12～17重量份、当归330～338重量份、冬虫夏草498～505重量份、莪术498～505重量份、牡丹皮12～20重量份、紫花地丁27～32重量份组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，由黄柏502重量份、黄芪30重量份、黄芩30重量份、菟丝子30重量份、白术502重量份、白花蛇舌草250重量份、白头翁334重量份、柴胡30重量份、蒲公英502重量份、防风15重量份、甘草15重量份、当归334重量份、冬虫夏草502重量份、莪术502重量份、牡丹皮15重量份、紫花地丁30重量份组成。

3.一种权利要求1或2所述中药组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将黄芪、菟丝子、柴胡、防风、甘草、牡丹皮和紫花地丁粉碎成80目细粉；

2)将黄柏、白术、黄芩、白花蛇舌草、白头翁、蒲公英、当归、冬虫夏草和莪术加水进行煎煮步骤，得到主滤液；

3)将所述主滤液减压浓缩后加入乙醇得到浆状物，所述浆状物的含醇量为75％，静置24小时，滤过，得到次滤液减压浓缩成稠膏，所述稠膏的在81～85℃测得相对密度为1.3；

4)混合所述稠膏和步骤1)中所得所述细粉，得到所述中药组合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述煎煮步骤包括第一次煎煮，加生药量5倍量水，煎煮2小时，滤过，得到第一滤液；第二次煎煮，加生药3倍量水，煎煮2小时，滤过，得到第二滤液；第三次煎煮，加生药2倍量水，煎煮1小时，滤过，得到第三滤液，合并所述第一、第二和第三滤液得到所述主滤液。

5.根据权利要求4述的方法，其特征在于，还包括向步骤4)中所述中药组合物加入辅料；所述辅料为粘合剂、助流剂、稀释剂、缓释剂或矫味剂的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括将所述组合物制成片剂的步骤：

加入所述组合物总量3％的羧甲基淀粉钠和5％的乳糖，以浓度10％的淀粉浆为粘合剂，制软材，60℃真空干燥，加入3％滑石粉混合均匀，压片，即得片剂。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括将所述组合物制成胶囊的步骤：

所述组合物经真空干燥后，得干膏，粉碎所述干膏后加入乳糖，混匀，与10％的淀粉浆混合，制软材，过20目筛整粒，装罐成胶囊。

8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括将所述组合物制成冲剂的步骤：

加入所述组合物质量200％的蔗糖和125％的糊精，制成颗粒，干燥，混合均匀，封装，即得冲剂。

9.一种权利要求1或2所述中药组合物在制备治疗艾滋病药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述中药组合物按2.5g/kg使用。