WO2012136149A1

WO2012136149A1 - 大戟属植物具有抗hiv潜伏作用的有效部位及其应用

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Publication number: WO2012136149A1
Application number: PCT/CN2012/073601
Authority: WO
Inventors: 朱焕章; 马忠俊
Original assignee: Zhu Huanzhang; Ma Zhongjun
Priority date: 2011-04-07
Filing date: 2012-04-06
Publication date: 2012-10-11
Also published as: CN102727563B; CN102727563A

Description

大戟属植物具有抗 HIV潜伏作用的有效部位及其应用技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种活性中药有效部位及其制备方法，以及在抗 HIV潜伏治疗上的应用。背景技术

获得性免疫缺陷综合征（AIDS)是由 HIV感染引起的一种严重危害人们生命健康的传染性疾病。据冊 0统计全球艾滋病患者已超过 4000万，每年新增患者 500万，而每年死亡约为 300万。

目前，艾滋病临床治疗方法主要是高效抗逆转录病毒疗法（Highly active antiretroviral therapy, HAART)，该疗法不仅有效控制 HIV复制，并且能重建 AIDS患者的免疫功能，为 AIDS的治疗打开了希望之门。

人们曾寄希望于凭借 HAART完全清除体内的 HIV，从而达到彻底治愈 AIDS 的目的。但随后的实践证明，虽然 HAART可以最大限度地抑制患者体内病毒复制，使血浆病毒载量（virus load)降低至现有常规检测方法测不出的水平，但感染者体内仍有病毒持续存在，一旦停止药物治疗，病毒载量又会反弹到治疗前水平 (Ho， D. D. Toward HIV eradication or remission： the tasks ahead. Science, 1998. 280: 1866 - 1867)

HIV难以在体内被完全清除的一个重要原因是 HIV-1能够潜伏在静息的记忆 CD4+T细胞中，该潜伏感染细胞是由一小部分 HIV感染的活化 CD4+T细胞转化而产生的，其整合的前病毒缺乏转录活性，因此不会被免疫系统和抗逆转录酶病毒的药物攻击。尽管感染个体携带潜伏感染细胞数量较少，但衰减率是如此之慢，以至于欲在个体生存期内仅靠 HAART治疗将其彻底清除是不可能的。因此， HIV潜伏感染的静息 CD4 +T细胞是构成机体内病毒储藏库（reservoir) 的主要部分，同时也是目前临床治疗不能彻底清除 HIV的巨大障碍（Finzi, D. et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV- 1， even in patients on effective combination therapy. Nature Med. 1999,5， 512 - 517)。

一般认为， HIV-1 潜伏感染细胞形成的分子机制与整合位点处的染色质状态、抑制性核小体 nuc-1的存在、以乙酰化为代表的表观遗传修饰、宿主转录因子如 NF- K B以及病毒转录活化因子 Tat等因素有关（Co iras , M.， M. R. et al. Understanding HIV- 1 latency provi des clues for the eradicat i on of long-term reservoirs. Nat. Rev. Microb iol . 2009.， 7 : 798—812)。据 it匕机制，研究者提出了清除潜伏病毒储存库的治疗策略，即试图通过药物诱导 HIV 潜伏感染细胞的前病毒表达，使其潜伏病毒再次激活，同时结合高效抗逆转录病毒疗法及在人免疫系统作用下，来杀死激活的潜伏感染的细胞，以此加速病毒储藏库的清除（Richman et al . The Chal l enge of Finding a Cure for HIV Infect ion , Sc i ence , 2009， 1304， 323)。尽管，该策略在临床上已有几个治疗方案，但其结果仍未尽人意，不是激活剂无效，就是虽有效但其毒副作用大。因而，研发安全有效的能消除病毒储藏库的试剂及相应的治疗方案已是当务之急。

中药作为我国所特有的医药资源，以其种类繁多、临床应用广泛、作用温和、副作用少等优点而越来越受到现代医药学的关注。

大戟科大戟属植物在我国有广泛的分布，其中大戟、甘遂、续随子为常用中药，有消肿散结的作用，现代药理研究主要集中于抗肿瘤等方面。

综上所述，本领域迫切需要开发新的、有效诱导 HIV潜伏感染细胞的前病毒表达的方法和药物，从而用于抗 HIV潜伏治疗。发明内容

本发明的目的就是提供一种新的、有效诱导 HIV潜伏感染细胞的前病毒表达的方法和药物，及其在抗 HIV潜伏治疗中的应用。在本发明的第一方面，提供了一种大戟属植物、大戟属植物的中药材或大戟属植物提取物的用途，它们被 (a) 用于制备干预 HIV病毒潜伏的组合物；（b)用于制备治疗艾滋病的药物；（c)用于制备与抗逆转录病毒药物联合使用从而治疗艾滋病的药物。

在另一优选例中，所述的干预 HIV病毒潜伏包括：诱导 HIV病毒潜伏感染细胞中 HIV前病毒表达、和 /或激活潜伏的 HIV病毒。

在另一优选例中，所述的治疗艾滋病包括抗 HIV潜伏治疗。

在另一优选例中，所述的大戟属植物提取物包括大戟属植物的枝、叶、根、和 /或茎的水溶性的和 /或脂溶性的提取物。在另一优选例中，所述的大戟属植物提取物包括大戟属植物的枝、叶、根、和 /或茎的醇提取物。

在另一优选例中，所述的提取物含有选自下组的组分：二萜、鞣质、甾体。在另一优选例中，所述的提取物是通过溶剂提取法、萃取法、和色谱法而获得的并且含有二萜、鞣质和甾体。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物或保健品组合物。

在另一优选例中，所述的药物还包括选自下组的额外组分：抗逆转录病毒的药物或增强免疫力的药物。

在另一优选例中，所述的组合物或药物包括：口服制剂和非口服制剂。

在另一优选例中，所述的制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。

在另一优选例中，所述大戟属植物包括大戟、甘遂、九牛造或续随子。

在本发明的第二方面，提供了一种可用于治疗艾滋病的有效部位，所述的有效部位具有以下特征：

(a) 该有效部位是提取自大戟属植物的枝、叶、根、和 /或茎的水溶性的和 / 或脂溶性的提取物；或提取自大戟属植物的枝、叶、根、和 /或茎的醇提取物；

(b) 该有效部位含有选自下组的组分：二萜、鞣质、体；和

(c) 该有效部位具有诱导 HIV病毒潜伏感染细胞中 HIV前病毒表达、和 /或激活潜伏的 HIV病毒的功能。

在另一优选例中，该有效部位是通过溶剂提取法、萃取法、和色谱法而获得的。

在另一优选例中，所述的有效部位是通过溶剂提取法、萃取法、和色谱法而获得的并且含有二萜、鞣质、和甾体。

在另一优选例中，所述的萃取法用二氯甲垸 /乙酸乙酯进行萃取。

在另一优选例中，所述的提取物具有图 1或图 2所示的图谱。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明第二方面中所述的有效部位和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括选自下组的额外组分：抗逆转录病毒的药物。

在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性诱导 HIV病毒潜伏感染细胞中 HIV 前病毒表达的方法，包括步骤：在大戟属植物提取物存在下，培养所述的

HIV病毒潜伏感染细胞，使得潜伏的 HIV前病毒表达，从而激活潜伏的 HIV病毒。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对被激活的 HIV病毒进行杀灭或抑制。在另一优选例中，所述的大戟属植物提取物的浓度为 0. 01-100微克 /ml，较佳地为 0. 1-10微克 /ml。

在本发明的第五方面，提供了一种预防或治疗艾滋病的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第二方面中所述的有效部位或本发明第三方面中所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物，包括人。

在本发明的第六方面，提供了一种激活潜伏的 HIV病毒的方法，包括步骤：将 HIV病毒潜伏感染细胞与大戟属植物提取物接触，或者给需要的对象施用本发明第二方面中所述的有效部位或本发明第三方面中所述的药物组合物，从而激活潜伏的 HIV病毒。

在本发明的第七方面，提供了一种制备用于治疗艾滋病的药物组合物的方法，包括步骤：将本发明第二方面中所述的有效部位与药学上可接受的载体混合，从而形成药物组合物。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

图 1显示了本发明一个实例中，大戟有效部位的 LC-MS组分分析图，结果表明主要成分为二萜、鞣质、体等。其中包括色谱图（上， A)、负离子流图（中， B)和正离子流图（下， C)。

图 2显示了本发明的一个实例中，甘遂有效部位的 HPLC-ESI-MS分析。其中包括 HPLC-UV图谱（上），检测波长 203 nm。总阳离子流图谱（下），数字标出保留时间。

图 3显示了甘遂有效部位对 HIV潜伏诱导激活荧光显微镜图片，其中 a为荧光照片， b 为同一视野白光照片。为了便于在打印文本上识别，荧光照片经去色处理后，其荧光细胞为白色。具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现大戟属植物或大戟属植物提取物具有抗 HIV潜伏的作用。具体地，本发明人采用独创的活性筛选方法发现具有抗艾滋病作用的中药大戟属植物，并用溶剂提取法、溶剂萃取法、色谱法等工艺，结合活性筛选确定和制备有效部位，制成的大戟属植物有效部位可作为抗艾滋病的活性成分。本发明的有效部位具有干预 HIV潜伏的作用，与抗逆转录病毒药物联合使用，可清除被激活的潜伏感染的细胞，以此加速潜伏病毒储藏库的清除，将为艾滋病的彻底治愈提供新的途径。在此基础上完成了本发明。大戟属植物

如本文所用，术语 "大戟属植物"指大戟科大戟属的植物，为一年生或多年生草木， {Euphorbia pekinensis Rupr. )、甘遂 (A kansui) ^ 续随子 la thyris Linn.、、九牛造（A Α^Ο Ο Μ)等多种种类。大戟的其他名称包括下马仙、邛巨等。甘遂的其他名称包括主田、重泽等。续随子的其他名称包括打鼓子、菩萨豆等。九牛造的其他名称包括五朵云、九牛七等。有效部位及其制法

本文所用，术语 "本发明的提取物" 、 "本发明的有效部位 "和 "本发明的抗 HIV潜伏的有效部位" 可互换使用，都指提取自大戟属植物的、具有诱导 HIV潜伏感染细胞的前病毒表达从而使潜伏病毒激活的作用的提取物。

在本发明中，抗 HIV潜伏的有效部位可用大戟属植物为原料进行提取。此外，虽然抗 HIV潜伏的有效部位可来自于大戟属植物的全草，优选非果部分，其中包括根、茎等部位，但是也可从大戟属植物的地上部分如枝、叶等部位提取。

如本文所用，术语 "提取物" 或 "有效部位" 包括水溶性的和 /或脂溶性的提取物。该术语还包括醇提物、或水提物。此外，还包括有效部位群，即含有脂溶性有效部位和水溶性有效部位的萃取物或其混合物。

经分析，本发明有效部位所含的化学成分至少包括选自下组的物质：二萜、鞣质、体等。可用于制备本发明的大戟属植物提取物的方法没有特别限制。可以用常规方法，以大戟属植物为原料，获得水溶性的和 /或脂溶性的提取物。

在本发明的一个优选例中，有效部位的制备通过溶剂提取法、萃取法、和 / 或色谱法进行。

在本发明中，对于溶剂提取法，其所用的溶剂没有特别限制，代表性的例子包括（但并不限于）：水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或几种溶剂的混合溶剂。提取次数可以是一次或多次。

在本发明中，对于溶剂萃取法，其所用的溶剂没有特别限制，代表性的例子包括（但并不限于）：正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲垸、氯仿、环己垸、石油醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂。萃取次数可以是一次或多次；

在本发明中，对于柱色谱法，其柱色谱没有特别限制，代表性的例子包括 (但并不限于）：活性碳、硅胶、反相硅胶、大孔树脂、葡聚糖凝胶中的一种或几种的组合。

在本发明的一个优选例中，以大戟属植物大戟为原料，以 2-10 倍药材重的 70-99%乙醇（或乙醇水溶液）提取 1-5次，回收乙醇，得到乙醇提取物。乙醇提取物溶于 0. 5-2倍重量的水（优选 50-99 °C的热水），冷却后以乙酸乙酯萃取，经过活性筛选，表明该提取物可有效干扰或干预 HIV病毒潜伏。

对提取物经硅胶柱色谱，以石油醚：乙酸乙酯为洗脱溶剂，除去油脂等化学成分，得到脂溶性的部位，筛选发现具有最强活性，即为有效部位，有效部位经 LC-MS分析，其主要成分为二萜、鞣质、 ^体等。

在本发明的另一个优选例中，以大戟属植物甘遂为原料，以 2-10 倍药材重的水提取 1-5次，浓缩得到水提取物。水提取物溶于 0. 5-2倍重量的水（优选 50-99°C的热水），冷却后水提取物经大孔吸附柱色谱，以乙醇水溶液为洗脱溶剂，以水除去无机盐的水溶性部分，以乙醇洗脱得到乙醇洗脱部位，筛选发现具有最强活性，即为有效部位，有效部位经 LC-MS分析，其主要成分为二萜、鞣质、体等。组合物和施用方法

如本文所用，术语"组合物 "包括（a)治疗和 /或预防艾滋病的组合物，（b) 激活潜伏的 HIV病毒的组合物。此外，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物或保健品组合物。本发明的抗 HIV潜伏的有效部位具有干预 HIV潜伏的作用。因此，当在治疗中施用或给予本发明的抗 HIV潜伏的有效部位时，可促进潜伏的 HIV病毒的表达，进而激活潜伏的 HIV病毒。通常，可将本发明的有效部位配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的有效部位以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约 1微克 -10毫克 /千克体重。

作为预防和抗艾滋病药物，可以制成口服和非口服制剂。口服给药可制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型，所用的赋型剂可以为淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等中的一种或几种。崩解剂可以为马铃薯淀粉、羟甲基纤维素等中的一种或几种。粘合剂可以为阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、糊精等中的一种或几种。口服制剂除上述剂型外，还可以制成乳剂、糖浆剂等。

非口服制剂可以制成注射剂，可以与注射用水、生理盐水、葡萄糖水制成注射剂，也可以在其中加入一定比例的乙醇、丙醇、乙二醇等。

此外，本发明的有效部位还特别适合与其他抗 HIV的药物联用。尤其是本发明的有效部位可与抗逆转录病毒药物联合使用，清除潜伏感染的细胞，从而用于艾滋病的治疗。

作为预防和抗 HIV的有效部位，大戟属植物有效部位的用量可以为成年人每日 0. 1-10000 mg，优选 5-500 mg/天，每日服用 1-3次。儿童的用量和次数需在成人的基础上酌情递减。本发明的主要优点包括：

(a) 发现了一种新的有效抗 HIV潜伏的药材及其提取物，该发现对于新型抗艾滋病药物的开发具有重要意义。 (b) 大戟属植物早已长期广泛使用，是一种安全的低毒副作用的常用中药材。

(C) 制备有效部位的工艺简单实用，获得有效部位在低浓度时即能明显干预 HIV潜伏。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例 1

大戟抗 HIV潜伏作用有效部位的制备

大戟（l kg，粉末或切碎的药材）以 95%乙醇提取回流（8L x 3)，回收乙醇得乙醇提取物（0. 26 kg)。

乙醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后用乙酸乙酯萃取（300 mL x 3) , 得到乙酸乙酯提取物（47 g)。

乙酸乙酯提取物经硅胶柱色谱（2 kg , 柱径： 10. 0 cm) , 以石油醚：乙酸乙酯（100 : 1) (20 L)洗脱除去油脂部分，而后以二氯甲垸：甲醇（1 : 2) (20 L) 洗脱得到有效部位（43. 4 g)。对得到的有效部位进行 LC-MS , 方法如下：

分析色谱条件：

色谱柱为 Zorbax SB-C18 column (5 μ m, 250 mm X 4. 6 mm; Agi lent Technologi es, USA) ; 流动相为 A相 0. 5% 醋酸水， B相 0. 5% 醋酸乙腈。梯度如下： 30 min 内从 25% B相到 40% B相， 30 min-45 min从 40% B相到 50% B相， 45 min- 125 min从 50% B相到 70% B相， 125 min- 130 min从 70% B相到 80% B相。流速为 0. 5 mL/min , 柱温为 25 °C，进样体积 10 μ L, 紫外检测波长 280 nm。质谱条件：

流动相及梯度同色谱条件； ESI 离子源为正负离子检测；毛细管电压为 -15V; 离子喷雾电压为 -4. 5 V；透镜偏置电压为 -30 V；喷雾气和鞘气均为高纯氮气（N₂)，流速为 30 a. u.；辅助气为高纯氮气（N₂)，流速为 10 a. u.；碰撞气为高纯氦气（He) ; MSⁿ碰撞能量为 30%-40%；毛细管温度为 350 °C；质荷比扫描范围为 m/z 100-2000；扫描宽度为 3. 0 Th。

LC-MS结果如图 1所示，其中包括色谱图（上）、负离子流图（中）和正离子流图（下）。结果表明，该有效部位的成分包括二萜、鞣质、体等。实施例 2

甘遂抗 HIV潜伏作用有效部位的制备

甘遂（l kg，粉末或切碎的药材）以水提取（lOL x 2)，浓缩得水提取物（0. 33 kg)。

水提取物溶于 300 mL热水（90°C )，冷却后进行大孔吸附树脂色谱（1 L)，依次用 60%乙醇-水（4 L)、 90%乙醇-水（4 L) , 得到 90%乙醇-水洗脱物（49 g)，为有效部位。对得到的有效部位进行 LC-MS, 方法如下：

分析色谱条件：

色谱柱为 Zorbax SB-C18 column (5 μ m, 250 mm X 4. 6 mm; Agi lent Technologies, USA) ; 流动相为 A相 0. 5% 醋酸水， B相 0. 5% 醋酸乙腈。梯度如下： 30 min 内从 25% B相到 40% B相， 30 min-45 min从 40% B相到 50% B相， 45 min- 125 min从 50% B相到 70% B相， 125 min- 130 min从 70% B相到 80% B相。流速为 0. 5 mL/min, 柱温为 25 °C，进样体积 10 μ L, 紫外检测波长 280 nm。质谱条件：

分析结果如图 2所示。结果表明，该有效部位的成分包括二萜、鞣质、甾体等。实施例 3

有效部位对 HIV潜伏诱导激活的影响

3. 1、方法

C11细胞是一种 HIV潜伏感染细胞模型，是将携带 EGFP报告基因的 HIV-1 的慢病毒感染人 T淋巴细胞系 Jurkat , 通过细胞分选和 HIV 整合检测，而获得的具有 HIV整合但未表达 EGFP的 T淋巴细胞系。 C11细胞是被携带报告基因 GFP 的 HIV 慢病毒感染同时又不表达的 Jurkat稳定株，因而用于筛选激活潜伏感染 HIV-1药物（参见申请号 CN200810038851. X, 发明名称 "一种筛选激活潜伏感染 HIV-1化合物的 T淋巴细胞及其制备方法" 的中国专利申请），保藏号为 CCTCC NO. C200821 o

在本实施例中，按每孔 2 X 10⁴个细胞，将 C11细胞种植于 96孔板，每孔加入 ΙΟΟμΙ含 10%FBS (Gibco)的 1640培养基（Gibco)。 24小时后，加入实施例 2 中制备的甘遂有效部位至终浓度 l g/mL。每个浓度至少 3个复孔，每个实验重复 3次。药物处理细胞 72小时后，在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白 GFP表达情况，并收集细胞进行流式细胞术检测，分析荧光细胞所占比例。

3. 2、结果

以终浓度为 l g/mL的有效部位处理 HIV潜伏感染细胞模型，在药物处理后的 3天，通过对报告基因绿色荧光蛋白 GFP的荧光显微镜观察和流式细胞术检测，分析 HIV潜伏感染细胞的激活效率，从而获得药物作用的剂量效应关系。图 3结果显示， HIV潜伏感染细胞经甘遂有效部位处理后绿色荧光阳性的细胞比例达高达 48%; 未加有效部位处理的 HIV潜伏感染细胞，其荧光阳性的细胞比例仅有不到 1%背景激活。

该实验结果提示，甘遂有效部位对 HIV潜伏感染细胞有极其显著的干预作用。实施例 4

不同浓度的有效部位对 HIV潜伏诱导激活的影响

重复实施例 3，不同点仅在于，用终浓度为 0. 2 g/mL、 0. 5 g/mL、 2 g/mL、或 5 g/mL的甘遂有效部位或替换原终浓度为 l g/mL的甘遂有效部位。

重复实施例 3，不同点仅在于，用终浓度为 0.2 g/mL、 0.5 g/mL、 ^g/mL、

2 g/mL、或 5 g/mL的大戟有效部位或替换原终浓度为 l g/mL的甘遂有效部位。

结果表明，在上述浓度下， HIV潜伏感染细胞经不同甘遂有效部位或大戟有效部位处理后绿色荧光阳性的细胞比例为 22-90%，远高于对照不到 1%的背景激活。这表明，本发明的有效部位对 HIV潜伏感染细胞有显著的干预作用。实施例 5-9

重复实施例 1 的制备过程，不同点仅在于，分别用以下条件替换实施例 1 中的相应条件。

实施例 5

采用甲醇（95%)为提取溶剂；大戟（1 kg, 粉末或切碎的药材）（1 kg)以甲醇提取回流（8Lx3)，回收甲醇得甲醇提取物（0.36 kg)。

甲醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后用乙酸乙酯（300 mLx3)萃取，得到乙酸乙酯提取物（53 g)。

乙酸乙酯提取物经硅胶柱色谱（2 kg, 柱径： 10.0 cm), 以石油醚：乙酸乙酯（100: 1) (20 L)洗脱除去油脂部分，而后以二氯甲垸：甲醇（1: 2) (20 L) 洗脱得到有效部位（35.7g)。实施例 6

大戟（1 kg, 粉末或切碎的药材）（1 kg)以 95%乙醇提取回流（8Lx 3)，回收乙醇得乙醇提取物（0.26 kg)。

乙醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后用正丁醇萃取（300 mL x 4) , 得到正丁醇提取物（109 g)。

正丁醇提取物经硅胶柱色谱（2 kg, 柱径： 10.0 cm), 而后以二氯甲垸：甲醇（1: 2) (20 L) 洗脱得到有效部位（49.7 g)。实施例 7

乙醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后用正丁醇萃取（300 mL x 3) , 得到正丁醇提取物（109 g)。

正丁醇提取物经硅胶柱色谱（2 kg, 柱径： 10.0 cm), 而后以乙酸乙酯：甲醇（1: 2) (20 L) 洗脱得到有效部位（60 g)。实施例 8

正丁醇提取物经硅胶柱色谱（1.5 kg, 柱径： 8.0 cm), 而后以乙酸乙酯：甲醇（1: 2) (15 L) 洗脱得到有效部位（49.7 g)。实施例 9

采用甲醇（90%)为提取溶剂；大戟（1 kg, 粉末或切碎的药材）（1 kg)以甲醇提取回流（8Lx3)，回收甲醇得甲醇提取物（0.36 kg)。

甲醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后用正丁醇（300 mLx3)萃取，得到正丁醇提取物（97.8g)。

正丁醇提取物经硅胶柱色谱（2 kg, 柱径： 10.0 cm), 以乙酸乙酯：甲醇 (1： 2) (10 L) 洗脱得到有效部位（55.3g)。实施例 10-15

重复实施例 2的制备过程，不同点仅在于，分别用以下条件替换实施例 2 中的相应条件。

实施例 10

甘遂（1 kg)以 95%乙醇提取（10Lx2)，浓缩得乙醇提取物（0.29 kg)。乙醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后进行大孔吸附树脂色谱（1 L)，依次用 60% 乙醇-水（4 L)、 90%乙醇-水（4 L)，得到 90%乙醇-水洗脱物（49 g)为有效部位。实施例 11

甘遂（1 kg)以 95%乙醇提取（10Lx3)，浓缩得乙醇提取物（0.31 kg)。乙醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后进行大孔吸附树脂色谱（1.5 L)，依次用 60% 乙醇-水（4 L)、 90%乙醇-水（4 L)，得到 90%乙醇-水洗脱物（50 g)为有效部位。实施例 12

甘遂（1 kg)以 95%乙醇提取（10Lx3)，浓缩得乙醇提取物（0.31 kg)。乙醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后进行大孔吸附树脂色谱（1.5 L)，用 90%乙醇-水（4 L)洗脱，得到 90%乙醇-水洗脱物（61 g)为有效部位。实施例 13

甘遂（1 kg)以 70%乙醇提取（10Lx3)，浓缩得乙醇提取物（0.39 kg)。乙醇提取物溶于 300 mL热水，冷却后进行大孔吸附树脂色谱（1.5 L)，甲醇（8 L) 洗脱，得到甲醇洗脱物（72 g)为有效部位。实施例 14

续随子（1 kg, 粉末或切碎的药材）（1 kg)以 95%乙醇提取回流（8Lx 3)，回收乙醇得乙醇提取物（0.40 kg)。

乙醇提取物溶于 400 mL热水，冷却后用乙酸乙酯萃取（400 mL x 3) , 得到乙酸乙酯提取物（67 g)。

乙酸乙酯提取物经硅胶柱色谱（2 kg, 柱径： 10.0 cm), 以石油醚：乙酸乙酯（100: 1) (10 L)洗脱除去油脂部分，而后以二氯甲垸：甲醇（1: 2) (20 L) 洗脱得到有效部位（69.4 g)。实施例 15

九牛造（1 kg)以水提取（10Lx2)，浓缩得水提取物（0.47 kg)。

水提取物溶于 500 mL热水，冷却后进行大孔吸附树脂色谱（1 L)，先用水除去无机盐等，后用 95%乙醇-水（10 L)洗脱，得到 95%乙醇-水洗脱物（83 g) 为有效部位。实施例 16

重复实施例 3，不同点仅在于，用终浓度为 l( g/mL的实施例 5、 6、 10、 11、 14、 15制备的大戟或甘遂有效部位或替换原终浓度为 l g/mL的甘遂有效部位。结果表明， HIV潜伏感染细胞经上述各有效部位处理后绿色荧光阳性的细胞比例为 35-66%，远高于对照不到 1%的背景激活。这表明，本发明的有效部位对 HIV潜伏感染细胞有显著的干预作用。实施例 17

大戟的醇提取物对 HIV潜伏诱导激活的影响

大戟（0. 5 kg，粉末或切碎的药材）以 95%乙醇提取回流（4L x 3)，回收乙醇得乙醇提取物（0. 14 kg)。

在本实施例中，按每孔 2 X 10⁴个细胞，将 C11细胞种植于 96孔板，每孔加入 ΙΟΟμΙ含 10%FBS (Gibco)的 1640培养基（Gibco)。 24小时后，加入实施例 1 中制备的大戟的醇提取物至终浓度 l( g/mL。每个浓度至少 3个复孔，每个实验重复 3次。药物处理细胞 72小时后，在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白 GFP表达情况，并收集细胞进行流式细胞术检测，分析荧光细胞所占比例。

以终浓度为 l( g/mL的醇提取物处理 HIV潜伏感染细胞模型，在药物处理后的 3天，通过对报告基因绿色荧光蛋白 GFP的荧光显微镜观察和流式细胞术检测，分析 HIV潜伏感染细胞的激活效率，从而获得药物作用的剂量效应关系。结果显示， HIV 潜伏感染细胞经甘遂有效部位处理后绿色荧光阳性的细胞比例达高达 52%; 未加有效部位处理的 HIV潜伏感染细胞，其荧光阳性的细胞比例仅有不到 1%背景激活。

该实验结果提示，大戟醇提取物对 HIV潜伏感染细胞有干预作用。实施例 18

药物组合物

用实施例 1相同方法制备提取物 40g与药用淀粉 100g为原料，不添加任何其他成分，灌制成胶囊，净重每粒 200mg。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1. 一种大戟属植物、大戟属植物的中药材或大戟属植物提取物的用途，其特征在于，（a) 用于制备干预 HIV病毒潜伏的组合物；（b)用于制备治疗艾滋病的药物；或 (c) 用于制备与抗逆转录病毒药物联合使用从而治疗艾滋病的药物。

2. 如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述的大戟属植物提取物包括大戟属植物的枝、叶、根、和 /或茎的水溶性的和 /或脂溶性的提取物。

3. 如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述的大戟属植物提取物包括大戟属植物的枝、叶、根、和 /或茎的醇提取物。

4. 如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述的提取物含有选自下组的组分：二萜、鞣质、甾体。

5. 如权利要求 1-4中任一项所述的用途，其特征在于，所述大戟属植物包括大戟、甘遂、九牛造或续随子。

6. 一种可用于治疗艾滋病的有效部位，其特征在于，所述的有效部位具有以下特征：

(b) 该有效部位含有选自下组的组分：二萜、鞣质、体；和

7. 一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求 6所述的有效部位和药学上可接受的载体。

8. 一种体外非治疗性诱导 HIV病毒潜伏感染细胞中 HIV前病毒表达的方法，其特征在于，包括步骤：在大戟属植物提取物存在下，培养所述的 HIV病毒潜伏感染细胞，使得潜伏的 HIV前病毒表达，从而激活潜伏的 HIV病毒。

9. 一种激活潜伏的 HIV病毒的方法，其特征在于，包括步骤：将 HIV病毒潜伏感染细胞与大戟属植物提取物接触，给需要的对象施用权利要求 6所述的有效部位或权利要求 7所述的药物组合物，从而激活潜伏的 HIV病毒。

10. 一种制备用于治疗艾滋病的药物组合物的方法，其特征在于，包括步骤: 将权利要求 6所述的有效部位与药学上可接受的载体混合，从而形成药物组合物。