KR100663688B1 - 면역 억제제 - Google Patents

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Abstract

활성화된 T 세포를 선택적으로 억제함으로써, 자기면역질환, 자기면역질환 및 그와 관련된 질환과 조직손상 또는 감염에 기인한 염증반응, 섬유증 또는 기능부전, 장기이식거부반응, 골수(조혈간세포)이식에 의한 이식조직 대 피이식체 질환, 또는 알러지 질환 치료용으로 매우 유용한 면역억제제가 제공된다.

Description

면역 억제제{IMMUNOSUPPRESSIVE AGENTS}
도 1은 실시예 4의 실험 2의 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 4의 실험 4의 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 4의 실험 5의 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 4의 실험 6의 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 4의 실험 7의 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 5의 실험 2의 결과를 나타낸다.
본 발명은 면역억제제, 특히 활성화된 T 세포의 선택적인 억제제를 활성 성분으로 함유하는 면역억제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 장기이식거부반응, 골수(조혈간세포)이식에 의한 이식조직 대 피이식체 질환, 자기면역질환, 자기면역질환 또는 그와 관련된 질환과 조직손상 또는 감염에 기인한 염증반응, 섬유증 또는 기능부전, 또는 알러지 질환과 같은, 활성화된 T 세포에 의해 유도된 비정상적인 면역반응에 기인한 질병 치료용 치료제에 관한 것이다.
생체의 면역시스템은 박테리아 및 바이러스와 같은 병원성 외래 미생물의 인식 및 제거에 의한 감시 및 방어 메카니즘과 함께 발달되어 왔다. 따라서, 생체는 자신의 세포 또는 조직(자기-항원)을 외래 미생물(비자기-항원)과 구별하고, 자기-항원에 대해서 반응하지 않거나, 또는 반응하였다해도 면역 반응을 나타내지 않는다(면역 관용). 따라서, 생체는 비자기-항원을 즉시 및 효율적으로 제거하도록 후천성 면역을 발달시킨다.
면역 시스템에서, T 세포(T 림프구)는 중요한 역할을 한다. 말초에서 나이브 CD4T 세포는 T 세포 수용체를 통한 항원-제시 세포로부터의 항원신호 및 기타 보조자극(costimulatory) 분자신호 모두를 수용하여 활성화 된다. 그후, 그것들은 IL-2 , 즉, T 세포증식인자를 분비하여 증식한다(Thp). Thp는 ThO 세포로 분화한 후, Th1 세포 또는 Th2 세포로 분리된다. 상기 세포들은 더 증식하고, 다양한 종류의 시토킨을 생산하고 세포변성의 효과를 유도한다.
상기 일련의 면역반응에서 비정상적 반응이 일어날 때, 림프구, 특히 T 세포는 자기-항원에 강력하게 반응하고, 조직손상을 일으킬 수 있다. 이러한 상태를 자기면역질환이라 부른다. 비정상적인 면역반응을 유발하는 원인 중 하나는 바이러스 또는 박테리아에 대한 정상적인 면역반응이 어떠한 종류의 시스템에 의해 자기-항원에 대한 면역반응으로 변화되기 때문이다. 자기면역질환에 의해 유도되는 조직손상 또는 감염은 다양한 종류의 염증반응, 조직 섬유증 또는 기능부전 등을 초래한다.
장기이식 거부반응 또는 골수(조혈 간세포)이식에 의한 이식조직 대 피이식체질환이 정상면역반응이라 할지라도, 이를 억제하는 것이 치료적으로 바람직하다. 상기 면역반응의 메카니즘은 기본적으로 동일하고, 활성화된 T 세포가 반응에서 주요 역할을 담당한다.
최근, 알러지 질환에서 활성화된 T 세포의 역할이 주목받고 있다. 즉, 활성화된 Th2 세포에 의해 주로 생산되는 IL-4 및 IL-5 와 같은 시토킨이 비만 세포 또는 호중구를 활성화시켜 즉각적인 과민증을 야기하고, Th1 세포에 의해 주로 생산되는 인터페론-γ(IFN-γ)가 지연형 과민증을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 자기면역질환, 이식 면역성, 상기에서 언급한 질환에 기인한 만성 활동성 면역 염증반응, 및 알러지 질환 치료용으로, 활성화된 T 세포에 대해 선택적인 억제 활성을 갖는 치료제가 요구되어 왔다.
이러한 상황하에서, T 세포 활성화 메카니즘에서 매개체를 조절하는 치료법이 연구되었다. 그것들 중, 시클로스포린 또는 FK-506, 항시토킨 요법, 항-부착 분자(활성화 관련 분자) 요법, 또는 모노클론 항체를 이용하는 T 세포에 대한 강력한 억제효과가 주목받아 왔다. 그러나, 상기 화합물들은 지금까지 사용된 글루코코르티코이드와 유사하게, 활성화된 T 세포에 대해 충분한 선택성이 없고, 부작용 문제도 여전히 남아 있다.
부수적으로, 자기면역질환은 어떠한 기관에서도 일어날 수 있는 전신성 질환이다. 게다가 장기이식 및 조혈간세포이식이 발달함에따라, 이식 거부반응 문제 및 이식조직 대 피이식체 질환이 증가할 것으로 예상된다. 부가하여, 알러지 질환은 "문명화 질환" 이라 불리고, 질환의 완전한 치유가 어려워 이로 인해 고생하는 환자가 많이 있다.
활성화된 T 세포가 중요한 역할을 하는 질환이 많이 있고, 따라서 그의 치료를 위한 효과적인 치료제 개발이 요구된다. 그럼에도 불구하고, 현재로는 활성화된 T 세포에 기인한 질병 치료용으로, 활성화된 T 세포를 선택적으로 억제하는 그러한 제제가 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 활성화된 T 세포에 대해 선택적인 억제 활성을 갖는, 부작용이 적은 효과적인 면역억제제를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 자기면역질환, 자기면역질환 또는 그와 관련된 질환에서 조직 손상 또는 감염과 함께 나타나는 염증반응, 섬유증, 기능부전, 장기이식 거부반응, 골수(조혈간세포) 이식에 의한 이식조직 대 피이식체 질환, 및 알러지 질환 치료용 치료제를 제공하는 것이다.
따라서, 상기 문제점을 해결하기 위해 본 발명자들은 활성화된 T 세포 내에서 세포소멸(apoptosis)을 선택적으로 유도하는 메카니즘에 의해, 활성화된 T 세포에 대해 선택적인 억제활성을 갖는 화합물을 찾아 내었다. 또한, 본 발명자들은 이러한 화합물들이 활성화된 T 세포에 의해 야기되는 질환의 예방 및 치료에 충분한 활성을 갖는다는 것을 알아내었다.
따라서, 본 발명의 일면은, 활성성분으로서, 활성화된 T 세포의 선택적인 억제제를 함유하는 면역억제제를 제공하는 것이다.
본 발명에서, 활성화된 T 세포는 다양한 종류의 시토킨을 생산 및 분비함으로써 증식한 후, 일련의 면역반응을 야기하는 것들이다.
이와 같이, 본 발명은 선택적인 세포소멸을 유도함으로써, 활성화된 T 세포를 억제하고, 이러한 활성화된 T 세포에 의해 야기되는 비정상적인 면역반응으로부터 발병하는 질병의 예방 및 치료하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 면역억제제의 구체적인 면은 장기이식 거부반응, 골수(조혈간세포) 이식에 의한 이식조직 대 피이식체 질환, 자기면역질환, 자기면역질환 또는 그와 관련된 질환에 의해 조직손상 또는 감염과 함께 야기되는 염증반응, 섬유증, 기능부전 또는 알러지 질환을 치료하는 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 면역억제제에 의해 효과적으로 예방 및 치료되는 자기면역질환으로는 예를 들어 자기면역간염, 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 궤양성 대장염, 다발성 경화증(MS), 경피증, 중증 근무력증, 다발성 근육염/ 피부근염, 하시모토 질환, 자기면역 혈구감소증, Sjogren's 증후군, 맥관염 증후군 또는 전신홍반성낭창 등이 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 알러지 질환으로는 예를 들어, 기관지 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 두드러기, 화분증 등이 있다.
본 발명의 면역억제제는 낮은 부작용으로, 활성화된 T 세포를 선택적으로 억제함으로써 질병을 예방 또는 치료하는 것에 치료학적으로 유용하다.
본 발명의 활성성분으로서의 화합물은, 예를 들어 하기에 기재되는 바와 같이 지연형 과민(DTH)반응을 갖는 쥐 (mouse) 로부터 분리한 활성화된 T 세포에 대해 세포 소멸 유도 활성을 측정하므로써 선택될 수 있다.
본 발명자들의 조사에 기초하여, 하기 화학식(1) 로 표시되는 플라바노이드 또는 크로몬을 발견하였다:
Figure 112004039448680-pat00001
(식중, R 은 수소원자 또는 하나 또는 두개의 히드록시기로 치환될 수 있는 페닐기이고, Rha 는 α-L-람노스 잔기이고, 및 점선은 이중결합의 존재 또는 부재를 나타낸다).
삭제
따라서,본 발명의 또 다른 면은, 활성성분으로서, 화학식 (1)로 표시되는 플라바노이드 또는 크로몬을 함유하는 면역억제제를 제공하는 것이다.
그중, R 이 수소 원자인 화학식 (1)의 크로몬, 또는 R 이 4-히드록시페닐, 3,4-디히드록시페닐, 또는 3,5-디히드록시페닐인 화학식 (1)의 플라바노이드가 바람직하게 사용된다. 보다 구체적으로, 화학식 (1a)의 스미틸빈, 화학식 (1b)의 아스틸빈, 화학식 (1c)의 엔겔레틴 또는 화학식 (1d)의 유크리핀이 보다 바람직하다.
Figure 111999011209519-pat00002
Figure 111999011209519-pat00003
Figure 111999011209519-pat00004
Figure 111999011209519-pat00005
본 발명의 플라바노이드 또는 크로몬 중 일부는 공지 화합물이다; 그러나, 이의 항염증활성만 조사되어 왔고, 비정상적인 면역반응에 대한 이의 개량된 활성은 공지되지 않았다. 화학식 (1a)의 스미틸빈은 본 발명자들에 의해 발견된 신규 화합물이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구현예는 화학식 (1a)의 스미틸빈 자체를 제공하는 것이다.
본 발명의 면역억제제를 지연형 과민(DTH)반응을 갖는 쥐로부터 분리한 활성화된 T 세포의 세포소멸을 유도하는 화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬을 이용하여 보다 상세하게 설명할 것이다.
본 발명의 활성성분인 화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬은 예를 들어 릴리아세아 식물 중 하나인 스밀락스 글라브라 록스(Smilax glabra Roxb.)에서 유래한, 식물 유래 화합물이다. 스밀락스 글라브라 록스의 근경, 즉, 리조마 스밀라시스 글라브라애(Rhizoma smilacis Glabrae)는 만성 피부염, 매독성 피부염, 또는 중국에서 가정용 의약인 수은중독 치료용으로 사용된다.
스미틸빈(1a), 아스틸빈(1b), 엔겔레틴(1c) 및 유크리핀(1d)과 같은 화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬은 각각, 리조마 스밀라시스 글라브라애로부터 적절한 용매로 추출하여 순수한 형태로 수득될 수 있다.
본 발명의 면역억제제는 활성성분으로 순수한 형태의 플라바노이드 또는 크로몬을 포함하는 제제로 제한되지 않는다. 그것은 플라바노이드 또는 크로몬 함유 활성 성분으로서 리조마 스밀라시스 글라브라애 와 같은 식물 추출액을 포함하는 제제가 될 수 있다. 리조마 스밀라시스 글라브라애 추출액(이하에서는 RSG 추출액이라 칭한다)은 동결 건조 분말 형태 또는 액상 형태가 될 수 있다.
추출은 실온 또는 환류하에 식물을 적합한 용매로 침윤하여 수행할 수 있다. 상기 추출 공정에서, 건조 및 분말 식물이 바람직하게 사용되고, 용매는 중간 극성의 유기용매, 저급 알코올, 또는 물이 될 수 있다. 예를 들어, 용매로는 에틸 아세테이트, 클로로포름, 석유 에테르, 메탄올, 에탄올 및 물, 및 그의 혼합물이 될 수 있다. 식물 또는 건조식물분말에 대한 용매의 비는 제한되지 않고, 2 회 내지 5 회의 추출 공정시 식물 중량의 약 5 내지 10 배의 범위내로 변한다. 추출 후, 용매를 적절한 양으로 응축하고, 잔류물을 다양한 종류의 용매를 이용한 분리추출, 크로마토그라피, 이온교환수지 크로마토그라피, 또는 막에 의한 여과로 정제하여 본 발명의 플라바노이드 또는 크로몬을 수득한다. 부가하여, 합성 플라바노이드 또는 크로몬, 또는 임의의 상술한 정제단계에 의해 수득한 추출액이 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 플라바노이드 또는 크로몬이 갖는 활성화된 T 세포에 대한 선택적인 면역 억제 활성은, 지연형 과민(DTH)반응을 갖는 쥐로부터 분리한 활성화된 T 세포에 대한 세포 소멸에 의해 확인된다. 즉, 본 발명의 플라바노이드 또는 크로몬을, 면역적으로 간 손상을 유도한 DTH 반응을 갖는 쥐로부터 분리한 간 비실질 세포(이하에서는 NPC 라 칭한다)와 함께 배양하여 NPC 의 비-부착부분 세포의 사멸을 야기하였다. 겔 아가로스 전기영동의 DNA 단편에서, DNA 래더(ladder) 형태가 나타나고, 세포사멸은 세포소멸로 확인되었다. 화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬에 의한 세포사멸은 비-부착부분(주로 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포로 구성)에서 인식되고, NPC 의 부착부분에서는 인식되지 않는다. 또한, 세포사멸은 정상쥐의 간세포(이하에서는 HC 라 칭한다), NPC 세포 및 비장세포에서는 관찰되지 않는다. 상기 관점으로부터, 본 발명의 화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬은 DTH 반응으로 활성화된 T 세포(주로 NPC 의 비-부착부분으로 이루어짐)를 선택적으로 억제하고, 활성화된 T 세포에 대해 유효한 선택적인 면역 억제 활성을 가진다.
또한, 활성화된 T 세포를 선택적으로 억제하는 것에 의한 손상된 조직에 대한 화학식 (1) 플라바노이드 또는 크로몬의 개선 효과는, DTH 반응으로 유도된 간 손상을 갖는 쥐로부터 분리한 HC 로부터의 알라닌 아미노트란스퍼라제(ALT) 분비 억제에 의해 또한 인지된다.
이와 같이, 활성성분으로 화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬을 함유하는 본 발명의 면역억제제는, 활성화된 T 세포의 선택적인 세포소멸을 유도하고, 결과적으로 상기 활성화된 T 세포를 선택적으로 억제한다. 따라서, 본 면역억제제는 장기이식 거부반응, 골수(조혈간세포)이식에 의한 이식조직 대 피이식체 질환, 자기면역질환, 자기면역질환 또는 그와 관련된 질환에 의해 조직손상 또는 감염과 함께 야기되는 염증반응, 섬유증, 기능부전 또는 알러지 질환과 같은, 활성화된 T 세포에 의해 야기되는 질환 치료용으로 유용하다.
화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬, 또는 그것들을 포함하는 식물추출액을 포함하는 본 발명의 면역억제제의 투여 형태는 특별히 제한되지 않는다. 화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬은 통상적인 부형제를 사용하는 캅셀제, 정제, 주사 용액을 포함하여 다양한 유형의 경구용 제제 또는 비경구 투여 제제로 제조될 수 있다.
예를 들어, 화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬, 또는 추출액 분말을 락토오스, 전분 또는 그의 유도체 또는 셀룰로오스 유도체와 같은 적당한 부형제와 혼합한 후, 젤라틴 캅셀에 충진한다.
또한 정제는, 활성 성분을 상기에서 언급한 부형제와 혼합하고, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산 또는 아라비아 고무 및 물과 같은 결합제를 더 혼합하여, 필요하다면 과립을 수득하여 제조할 수 있다. 그후, 거기에 윤활제로서 탈크 또는 스테아르산을 더 혼합하고, 통상의 정제기로 압축하여 타정한다.
활성 성분을 용액 보강제와 함께 멸균 증류수 또는 멸균 생리 식염수에 용해시키고, 앰플에 충진하여 비경구 경로를 위한 주사 제제 또한 제조할 수 있다. 주사 용액에서, 안정화제 또는 완충제를 사용할 수 있다. 주사용 제제는 정맥투여 또는 점적투여될 수 있다.
삭제
화학식 (1)의 플라바노이드 또는 크로몬을 투여함에 있어, 유효 투여량은 특별히 제한되지 않고, 목적하는 질병, 환자의 상태, 질병의 중증도, 연령, 합병증 유무뿐만 아니라 투여 경로, 제제, 투약 횟수 등과 같은 다양한 종류의 인자에 따라 달라질 수 있다. 경구 투여의 경우, 통상적인 1 일 권유 투여량은 개인 당 하루 1 - 1,000 mg, 바람직하게는 1 - 500 mg 범위 내이고, 비경구 투여의 경우 통상적인 1 일 권유 투여량은 경구 투여량을 기준으로 1/100 내지 1/2 범위 내이다. 투여량은 또한 연령뿐만아니라 환자의 상태에 따라 변할 수 있다.
하기 실시예에서, 활성 성분으로 활성화된 T 세포에 대해 선택적인 억제 활성을 갖는 화합물을 함유하는 본 발명의 면역 억제제를, DTH 반응에 의해 유도된 간 손상을 갖는 쥐를 이용하여, 상기 쥐로부터 분리한 활성화된 T 세포에 대해 세포 소멸 유도 활성을 조사함으로써 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 국한되지 않음을 이해할 것이다.
실시예 1: 리조마 스밀라시스 글라브라애 추출액(RSG 추출액)의 제조
리조마 스밀라시스 글라브라애 건조 분말을 10 배 중량의 증류수로 100 ℃ 에서 각각 1 시간동안 2회 추출하였다. 추출액을 합하여 1,700 g 에서 원심분리하고, 생성된 상청액을 동결 건조하여 분말 형태의 RSG 추출액을 수득하였다: 수율 11 %.
RSG 추출액에서 HPLC 에 의해 측정한 아스틸빈 함량은 0.273 % 였다.
실시예 2: 리조마 스밀라시스 글라브라애 , 플라바노이드 및 크로몬으로부터 추출액의 제조
a. 추출 및 분리
건조 절단 리조마 스밀라시스 글라브라애 6 kg을 환류하에서 2 시간동안 메탄올 30 L 로 추출하고, 여과하여 추출액을 수득하였다. 잔류물을 메탄올 18 L 로 추출하고, 상기와 같은 방법으로 1 회 반복하여 추출액을 수득하였다. 그후, 잔류물을 메탄올 18 L 로 다시 추출하고, 상기와 같은 방법으로 1 회 반복하여 추출액을 수득하였다. 추출액을 합하여 감압하에 농축하여 메탄올 추출액 568 g 을 수득하였다.
상기 메탄올 추출액을 물 1 L 에 현탁시키고, 현탁액을 석유 에테르 1 L 로 3 회 추출하고, 계속해서 에틸 아세테이트 1 L 로 3 회 추출하였다. 석유 에테르 추출액을 합한 후 농축하여 석유 에테르 추출액 23 g 을 수득하고, 또한 에틸 아세테이트 추출액을 합한 후 농축하여 에틸 아세테이트 추출액 80 g 을 각각 수득하였다.
에틸 아세테이트 추출액 70 g 을 실리카겔(1,000 g) 칼럼 크로마토그라피를 행하고, 클로로포름 및 메탄올(19:1 및 4:1) 혼합 용액 각각 2 L 로 용리하여 32. 5 g 의 A 분획과 28 g 의 B 분획을 각각 수득하였다.
A 분획 25 g 에 실리카겔(500 g) 칼럼 크로마토그라피를 더 행하고, 클로로포름 및 메탄올(9:1 및 4:1) 혼합 용액 각각 1 L 로 용리하여 2. 5 g 의 A-1 분획 및 7.5 g 의 A-2 분획을 각각 수득하였다. 그후, A-2 부분 2.0 g 을, 메탄올 - 물(2:3 및 3:2, 각각 200 ml)을 사용하여, Cosmosil 75C18-OPN 칼럼을 사용하는 HPLC로 더 정제하여 화학식 (1-d)의 유크리핀 72 mg 을 수득하였다.
한편, B 분획 28 g 을, 메탄올 - 물(3:7, 1:1 및 7:3)을 사용하여, Cosmosil 75C18-OPN 칼럼을 사용하는 HPLC로 더 정제하여 화학식 (1-b)의 아스틸빈 8.2 g 및 B-2 분획 11.5 g 을 각각 수득하였다. 수득한 B-2 부분을 클로로포름-메탄올(9:1, 500 ml)을 사용하는 실리카겔(350 g) 칼럼 크로마토그라피 및 박층 예비 크로마토그라피(preparative thin layer chromatography)로 더 정제하여 화학식 (1-a)의 스미틸빈 2.6 g 및 화학식 (1-c)의 엔겔레틴 42 mg 을 수득하였다.
하기 표 1은 메탄올 추출액 568 g 으로부터 수득한 플라보노이드 및 크로몬의 양 및 수율을 각각 나타낸다.
스미틸빈(I-a) 아스틸빈(I-b) 엔겔레틴(I-c) 유크리핀(I-d)
양(g) 2.6 8.2 0.042 0.072
수율(%) 0.523 1.650 0.008 0.071
b. 화학 구조 확인(물리적 데이타)
공지 화합물인 아스틸빈, 엔겔레틴 및 유크리핀의 화학 구조는 질량분석 및 NMR 분석으로 확인되었다. 화학식 (Ia)의 스미틸빈은 신규 화합물이므로 상기 화합물의 화학 구조는 하기의 물리적 데이타에 의해 결정되었다.
외양: 무색침상결정(클로로포름-메탄올(9:1) 혼합용액에서 결정화시).
융점: 179-181 ℃.
Figure 111999011209519-pat00006
Figure 111999011209519-pat00007
화학식 (Ia)의 화합물로부터 수득한 산 가수분해 생성물의 Rf 값은 L-람노스 모노히드레이트와 일치하였다.
상기 실시예 1에서 수득한 RSG 추출액, 또는 실시예 2에서 수득한 화합물이 하기 실험에서 이용되었다.
실시예 3: 쥐에서의 간 손상 모델
실험 1: 지연형 과민(DTH) 반응에 의해 유도된 간 손상을 갖는 쥐의 제조, 및 그의 분석.
a. 방법:
6-8 주생 BALB/c 쥐(암컷 및 수컷, 22±2 g)의 복부 피부에 5 일 간격으로 에탄올 중 1 % 피크릴 클로리드 0.1 ml 를 칠하여 2 회 감작시켰다.
두 번째 감작 5 일 후, 각 쥐로부터 혈액 시료를 수집한 후, 올리브 오일 중 0.2 % 피크릴 클로리드 10 ㎕를 쥐의 간에 주사하여 간 손상을 유도하였다. 유도 후 0, 6, 12, 18 및 24 시간 후에, 혈액 시료를 수집하고, 비장세포, HC 및 NPC 를 분리하였다. 혈액을 이용하여 알라닌 아미노트란스페라제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트란스페라제(AST)의 활성을 측정하였다.
비장세포 및 NPC 를 안티-마우스 LFA-1 (림프구 기능 관련 항원-1) 항체와 반응시키고, 및 HC 를 안티-마우스 ICAM-1 (세포간 부착분자-1) 항체와 각각 반응시켰다. 세척후, 세포를 FITC-표식 고우트 안티-랫트 IgG 와 반응시켰다. 그후, 세포를 PBS 로 세척하고, 다시 현탁시켜 FACScan 시스템(Becton Dickinson)을 사용하여 세포표면항원의 발현을 측정하였다.
이에 더하여, HC 를 정상쥐 및 간 손상쥐(각각 0, 6, 12, 18 및 24 시간 후)로부터 분리한 NPC 또는 비장세포와 함께 공배양하였다. 하기 방법으로, 상청액에서 ALT 분비 분석을 수행하였다.
HC (1×105 세포/ml)를 WE 배지(L-글루타민 2 mM, 10 %(v/v) 페이탈-칼프 혈청, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml 를 포함하는 William's Medium E)에 현탁시켰다. 세포를 24-웰 플레이트 상에 시딩(seeding)하고, 5 % (v/v) CO2 와 함께 공기 중에서 5 시간동안 37 ℃ 에서 예비-배양하였다. 예비-배양 후, HC 를 WE 배지로 두번 세척한 후, 웰에 NPC (4×105 세포/ml) 또는 비장세포 (5×106 세포/ml)를 가했다. 배양을 3 시간 계속한 후, 상청액을 수집하여 ALT 활성을 분석하였다.
b. 결과:
파트 1:
혈청 ALT 활성의 변화, 비장세포 및 NPC 상의 LFA-1 발현, 및 HC 상의 ICAM 발현을 관찰했다. 또한, 간 손상쥐에서 간 세포의 조직학적인 변화를 관찰했다.
그 결과, 비장세포 상의 LFA-1 발현은 간 손상 유도 6 시간 후에 피크에 도달했다. 이와 대조적으로, NPC 상의 LFA-1 발현 및 HC 상의 ICAM-1 발현은 간 손상 유도 12 시간 후에 피크에 도달했다. 혈청 ALT 활성은 18 시간 후에 피크에 도달했다.
쥐에서의 조직학적인 변화에 관하여, 간 손상 유도시(0 시간)에는 간 상태는 거의 정상이었다. 그러나, 간 손상 유도 6 시간 후 경미한 염증성 침윤, 12 시간 후 뚜렷한 염증성 침윤, 및 18 시간 후 대량의 간세포 괴사가 관찰되었다.
파트 2:
간 손상 유도 후 HC 에 대해 NPC 및 비장세포에 의한 ALT-분비 활성 변화, 및 HC 를 정상 및 간 손상 쥐로부터 수득한 NPC 또는 비장 세포와 배양한 상청액에서 ALT의 분비 변화를 관찰했다.
그 결과, NPC 의 ALT 분비 활성은 간 손상 유도 12 시간 후에 피크에 도달했다. 비장세포의 경우, 분비 활성은 간 손상 유도 후 6 내지 12 시간동안 피크에서 유지되었다. 간 손상 유도 12 시간 후 NPC 의 활성 수준은 간 손상 유도 12 시간 후의 비장 세포보다 약 12.5 배 강하게 나타났다.
상기 결과로부터, 쥐에서 간 손상을 유도하므로써 활성화된 T 세포를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 쥐에게 5 일 간격으로 복부 피부에 피크릴 클로리드를 칠하여 2 회 감작시키고, 감작 5 일 후, 활성화된 T 세포를 제조하기 위해 피크릴 클로리드(즉, 동일한 항원)를 간 손상 유도용 간에 주사하였다. 특히, NPC 상의 LFA-1 및 HC 상의 ICAM-1 의 발현이 피크릴 클로리드를 간에 주사한 지 12 시간 후에 피크에 도달하고, 따라서 강한 면역반응을 야기했다. 이와 같은 면역반응 동안 혈청 ALT 상승이 피크에 도달하기 때문에, 간 손상이 면역반응에 기인하여 발생하는 것이 확인되었다.
또한, HC 를 NPC 와 배양한 상청액에서 ALT 활성은, 간에 피크릴 클로리드를 주사한 지 12 시간 후의 쥐로부터 분리한 것에서 피크에 도달하였다. 따라서, 활성화된 T 세포의 선택적인 억제 활성을 시험관 내 시스템(in vitro system)으로 조사하기 위해, 지연형 과민(DTH) 반응에 의해 면역학적으로 유도된 간 손상을 갖는 쥐가 바람직하게 사용되었다.
따라서, 피크릴 클로리드로 경피적으로 감작시키고 그후 동일한 항원(피크릴 클로리드)을 간에 더 주사하여 간 손상을 유도한 후 12 시간된 쥐가 하기 실시예에서 사용되었다.
실시예 4: 아스틸빈 및 RSG 추출액의 효과
실험 1: 간 손상 쥐의 제조:
상기 실시예 3에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여, 6-8 주령 BALB/c 쥐(수컷, 22±2 g) 및 6-8 주생 ICR 쥐(수컷, 22±2 g) 의 복부 피부에 5 일 간격으로 에탄올 중 1 % 피크릴 클로리드 0.1 ml 를 칠하여 2 회 감작시켰다. 두 번째 감작 5 일 후, 각 쥐로부터 혈액 시료를 수집한 후, 올리브 오일 중 0.2 % 피크릴 클로리드 10 ㎕를 쥐의 간에 주사하여 간 손상을 유도했다. 주사 12 시간 후, 혈액 시료를 수집하고, 간세포를 분리했다. 통상적인 방법으로 혈액의 ALT 및 AST 활성을 측정했다. 또한, 정상 및 간 손상 쥐로부터 간세포를 분리하고, 2-단계 관류법으로 HC 를 NPC 로부터 분리했다. 그후, 상기 세포를 이용하여 즉시 공-배양 시험 또는 세포소멸 측정을 실시하였다.
부가하여, 비-부착세포로부터 부착세포를 분리하기 위해 NPC 부분을 배양 플레이트에서 3 시간동안 항온배양하였다. 분리된 HC 및 NPC 는 트리판 블루 스트레인으로 측정시 약 90 % 생존가능한 것으로 나타났다.
실험 2 : 세포소멸 측정 번호. 1 (세포소멸 세포의 계수)
a. 방법 :
유도 12 시간 후 간 손상 쥐로부터 HC 및 NPC 를 분리하고, NPC 로부터 분리한 부착세포 및 비-부착세포의 분획을 사용했다.
상기 세포를, 시험 화합물로서 아스틸빈 및 RSG 추출물 5×10-5 g/ml 와 함께 RPMI 1640 배지에서 37 ℃ 에서 1 시간 각각 항온배양하였다. 항온배양 후, 상기 세포를 Hoechst 33342 (Molecular Probes, Inc., USA) 을 이용하여 실온에서 1 분간 착색하였다. RPMI 1640 배지로 3 회 세척 후, 수득한 세포를 인산완충용액(PBS) 중의 2 % 포름알데히드와 혼합하였다. 형광 현미경 하에서, 각각 다른 5 분야에서 총 200 세포를 계수하여 총 개체수 중 세포소멸 세포를 측정하였다.
대조 연구를 위해, 시험화합물 없이 처리한 세포를 항온배양하고, 동일한 방법을 수행하였다.
b. 결과:
간 손상 쥐로부터 수득한 NPC 및 HC 세포소멸에 대한 아스틸빈 및 RSG 추출액의 효과를 도 1에 나타내었다. 도 1 에 나타난 바와 같이, 총 약물-비처리 HC 및 NPC 에서 세포소멸 세포의 비는 각각 약 10 % 및 5 % 이었다. 이와 대조적으로, 아스틸빈 또는 RSG 추출액 5×10-5 g/ml 에서 총 NPC 의경우 세포소멸 세포의 비가 상당히 증가하나, HC 의 경우 증가하지 않았다. NPC 로부터 분리한 비-부착부분에서 세포소멸 세포의 비는 두 약물 중 어느 하나에 의해 증가하는 반면, 부착세포 분획에서는 아무런 영향이 관찰되지 않았다.
실험 3 : 세포소멸 측정 번호. 2: DNA 단편 분석 (겔 아가로스 전기영동)
a. 방법 :
정상쥐 및 유도 12 시간 후 간 손상 쥐로부터 분리한 NPC 를 사용하였다. 상기 세포를, 아스틸빈 또는 RSG 추출물로 처리한 후, 이어서 하기와 같이 겔 아가로스 전기영동을 이용하여 DNA 단편 분석을 수행하였다.
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정상쥐 및 유도 12 시간 후 간 손상 쥐로부터 분리한 NPC 를 단독으로, 또는 아스틸빈 또는 RSG 추출액 5×10-5 g/ml 와 함께, RPMI 1640 배지에서 37 ℃ 에서 1 시간 항온배양하였다. 항온배양 후, 약물로 처리 또는 처리하지 않은 106 만큼의 세포를 세척 및 원심분리하였다. 수득한 침전물을 0.2 % Triton X-100 을 포함하는 리싱 완충 용액 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) 0.6 ml 에 재현탁하고, 빙냉 하에서 10 분간 방치하였다. 20,000 g 에서 원심분리한 후, 수득한 상청액을 동일 부피의 TE-포화 페놀과 혼합하고, 혼합물을 2-3 분간 부드럽게 교반한 후, 다시 원심분리하였다. 수득한 상청액을 클로로포름-이소아밀알코올 (24:1) 용액과 혼합한 후, 혼합물을 20,000 g 에서 다시 원심분리하였다. 수득한 상청액을 - 20 ℃ 에서 0.3 M NaCl 및 70 % 에탄올에 하룻밤 저장하여 DNA 침전물을 수득하였다.
이와 같이 수득한 DNA 침전물을 1 mg/ml RNase A 1 ㎕ 와 함께 37 ℃ 에서 30 분간 항온배양하였다. 상기 용액에 0.02 % 브로모페놀 블루, 0.02 % 크실렌 시아놀 FF, 50 % 글리세롤 및 0.1 % SDS 를 포함하는, 1:10 (v/v) 비율의 로딩 완충 용액을 가했다. 2 % 겔 아가로스에서 75 분 동안 50 V 로 전기영동을 수행하고, 에티듐 브로미드를 이용하여 DNA 를 가시화하였다.
b. 결과:
겔 아가로스 전기영동의 DNA 단편에서, DNA 래더 패턴은 간 손상쥐로부터 분리한 NPC 의 경우, 세포를 아스틸빈 또는 RSG 추출액으로 처리할때 나타났다. 반면, 정상쥐로부터 분리한 NPC 및 비장세포의 경우, 상기 약물로 처리시 DNA 래더 패턴이 나타나지 않았다. 즉, 정상쥐로부터는 NPC 및 비장세포의 세포소멸이 관찰되지 않았다.
DNA 단편 분석 결과로부터, 아스틸빈 처리에 기인하는, 항원 (피크릴 클로리드)투여에 의한 유도 12 시간 후 간 손상쥐로부터 분리한 NPC 세포의 사멸은 세포 소멸로 특징지워졌다. 상기 결과는 정상쥐에서는 Hoechst 33342 착색에 의해 NPC 세포의 사멸을 관찰할 수 없는 상기 실험 2 에서 수득한 결과와 잘 일치하였다.
본 발명자들은 간 세포에서 피크릴 클로리드의 경피감작 후, NPC 세포 조성물에서 많은 변화가 있음을 유동 혈구계산 분석에 의해 알아내었다. 본 발명자들은 또한, 항원투여 전의 비장을 적출한 경우, 간 손상 수준의 지표가 되는 혈청 ALT 수준이 상당히 낮아져 있음을 발견하였다. 따라서, 간 침윤 및 림프구의 국부화는 NPC 조성물의 변화를 야기하고, 이것이 간 손상의 주원인으로 생각된다.
또한, 실시예 3의 실험 결과는 조직학에 있어서의 염증성 침윤 및 시험관내 방법(in vitro)에서의 NPC 의 간 세포 독성이 항원 투여 후 12 시간에서 피크에 도달함을 명백히 나타냈다. 상기 단계에서, NPC 는 47.9 % 의 CD4+ 및 23.2 % 의 CD8+ T 세포를 함유하는 LFA-1 양성 세포 72.6-78 % 를 포함했다. 그와 같은 NPC 를 항-CD4 모노클로날 항체 보체로 처리함으로써 HC 로부터 ALT 분비가 완전히 억제되었다. 그리고, 그와 같은 세포를 항-CD8 항체로 처리함으로써 HC 로부터 ALT 분비가 억제되는 경향이 있었다.
상기에서 언급한 이와 같은 발견 및 선행하는 실시예 4의 결과로부터, 아스틸빈 또는 RSG 추출액은 비-부착 NPC 에 대해서는 세포소멸을 유도하나 부착 NPC 에 대해서는 그렇지 않다는 결론이 나온다. 따라서, 비-부착 NPC 의 주성분인 T 림프구 집단이 아스틸빈 또는 RSG 추출액의 주 타겟으로 생각된다.
또한, 아스틸빈 또는 RSG 추출액은 정상쥐로부터 분리한 HC, NPC 및 비장 세포에 대해 세포소멸을 유도하지 않았다. 상기 결과에 의해, 주로 T 세포를 포함하여 활성화된 면역 세포는 아스틸빈 또는 RSG 추출액에 의해 선택적으로 억제된다는 것이 확인되었다.
실험 4: ALT 분비 분석 (번호.1)
a. 방법:
HC 및 NPC 를 간 손상 유도 12 시간 후 쥐로부터 분리했다. 이와 같이 수득한 HC 를 WE 배지에 현탁시키고, 96-웰 마이크로플레이트 (2×104 세포/0.2ml/웰) 상에 시딩하고, 5 % (v/v) CO2 와 함께 공기 중에서 5 시간동안 37 ℃ 에서 항온배양하였다. 항온배양 후, HC 를 WE 배지로 두번 세척하고, 8×104 NPC 세포와 함께 3 시간 공배양하였다. NPC 를 다양한 농도의 아스틸빈 또는 RSG 추출액과 함께 37 ℃ 에서 1 시간동안 예비-항온배양하였다. 공배양 후 상청액을 수집하여, 통상적인 방법으로 ALT 및 AST 활성을 분석하였다.
b. 결과:
결과를 도 2 에 나타내었다.
NPC 와 함께 3 시간 공배양함으로써 HC 의 ALT 및 AST 레벨이 상당히 상승되었음이 명백하였다. 이와 대조적으로, 아스틸빈 또는 RSG 추출액으로 예비-처리한 NPC 와 함께 공배양함으로써, 아스틸빈에 의해, NPC 의 ALT 분비 활성은 투여량 의존적으로 억제되고, AST 분비 활성 또한 투여량 의존적으로 억제되었다. 5×10-5 g/ml의 아스틸빈은 ALT 분비의 완전한 억제를 야기하였다.
실험 5: ALT 분비 분석 (번호.2)
a. 방법:
HC 및 NPC 를 실험 4에 기재된 것과 동일한 방법으로, 유도 12 시간 후 간 손상 쥐로부터 분리하였다. 이와 같이 수득한 HC 를 WE 배지에 현탁시키고, 96-웰 마이크로플레이트 (2×104 세포/0.2ml/웰) 상에 시딩하고, 5 % (v/v) CO2 와 함께 공기 중에서 5 시간동안 37 ℃ 에서 항온배양하였다. 항온배양 후, HC 를 WE 배지로 두번 세척하고, 5×10-5 g/ml의 아스틸빈 또는 RSG 추출액으로 각각 5, 15, 30, 60 및 120 분동안 예비 처리한 8×104 NPC 세포와 함께 37 ℃ 에서 3 시간 공배양하였다. 공배양 후 상청액을 수집하여, 통상적인 방법으로 ALT 활성을 분석하였다.
b. 결과:
결과를 도 3 에 나타내었다.
아스틸빈 또는 RSG 추출액으로 예비 처리한 NPC 와 함께 공배양함으로써 HC 의 ALT 분비가 시간 의존적으로 억제되었음이 명백하였다. ALT 분비는 NPC 를 30 분 이상 예비 처리함으로써 완전히 억제되었다.
그러나, HC 가 고농도의 아스틸빈 또는 RSG 추출액과 함께 2 시간 이상 예비 처리된 경우, ALT 분비는 변하지 않았다.
실험 6: 약물의 경구투여에 의한 ALT-분비 활성.
a. 방법:
6-8 주령 BALB/c 쥐(수컷, 22±2 g) 또는 6-8 주령 ICR 쥐(수컷, 22±2 g)를 사용하였다. 쥐를 실험 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 피부에 피크릴 클로리드를 칠하여 감작시켰다. 그후, 아스틸빈 100 mg/kg 또는 RSG 추출액 200 mg/kg 을간 손상 유도후 0, 5 및 10 시간에 경구로 각각 3회 투여하였다. 최종 투여 2 시간 후, 혈액 시료를 수집하여, 혈청 ALT 활성을 측정하고, 또한 HC 및 NPC 를 분리한 후 공배양하였다. 상청액에서의 ALT 활성을 혈청 ALT 활성과 비교하였다.
b. 결과:
결과를 그림 4에 나타내었다.
쥐에게 약물을 경구로 투여시, 혈청 ALT 활성 및 HC 에 대한 NPC 의 독성은 약물로 처리하지 않은 대조군 쥐 세포의 경우와 비교하여 상당히 감소되었다.
상기 결과는 실험 4 의 결과와 일치하였다. 요약하면, 간 손상 쥐로부터 수득한 NPC 를 아스틸빈 또는 RSG 추출액으로 예비 처리하고 HC 와 함께 공배양했을 때, 공배양에 의해 수득한 상청액의 ALT 활성은 약물로 처리하지 않은 대조군 쥐 세포의 경우와 비교하여 감소되었고, HC 에 대한 NPC 의 간독성 정도도 상당히 감소되었다.
실험 7: 약물투여 시간에 대한 연구.
a. 방법:
실험 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 간 손상을 유도하였다. 유도상(induction phase; 감작 동안) 및 효과기상(effector phase; 간 손상 유도 후)에 대한 아스틸빈 및 RSG 추출액의 효과를 측정하기 위해, 아스틸빈 (50 및 100 mg/kg) 및 RSG 추출액 (100 및 200 mg/kg)을, 첫번째 감작으로부터 10일 후 하루에 한번, 및 유도 후 0, 5 및 10 시간에 각각 3회 쥐에게 경구투여하였다.
대조 연구를 위해 약물을 투여하지 않은 쥐를 사용하였고, 포지티브 대조 연구를 위해 쥐에게 10 mg/kg 시클로포스파미드(Cy) 를 경피 투여하였다.
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간에 피크릴 클로리드를 주사한 18 시간 후, 혈액 시료를 수집하여, 통상적인 방법으로 혈청 ALT 활성을 측정하였다. 또한 간의 병리조직학적 검사를 수행하였다.
b. 결과:
간 손상 쥐에서 혈청 ALT 활성의 상승에 대한 아스틸빈, RSG 추출액 및 시클로포스파미드(Cy)의 효과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 정상쥐와 비교하여, 대조군쥐에서 현저한 혈청 ALT 활성의 상승이 관찰되었다. 대조군쥐와 비교하여, 효과기상(effector phase) 쥐에서, 아스틸빈 및 RSG 추출액 모두를 고용량으로 투여한 쥐는 혈청 ALT 활성의 상당한 감소를 나타냈고, 저용량으로 투여한 쥐는 혈청 ALT 활성의 감소경향 및 간 손상의 개선을 나타냈다.
이와 대조적으로, 유도상에서 약물을 투여할 때는 간 손상의 개선이 거의 관찰되지 않았다. 시클로포스파미드를 투여한 쥐는 유도상 및 효과기상 모두에서 약물을 투여했을 때 혈청 ALT 활성의 상당한 감소를 나타내었다.
병리조직학적 조사에 있어, 대조군쥐에서의 주요 변화는 염증성 침윤 및 간 세포 응집성 괴사였다. 대부분의 쥐에 있어서, 상기 변화는 ALT 활성의 감소와 함께 개선되었고, 아스틸빈, RSG 추출액 또는 시클로포스파미드의 투여에 의한 간 손상의 개선이 확인되었다.
상기 결과는, 아스틸빈 및 RSG 추출액은 지연형 과민(DTH) 반응의 효과기상 동안 투여시에는 혈청 ALT 및 AST 활성의 상승을 상당히 억제하나, 유도상에서는 그렇지 않다는 것을 명백히 나타낸다. NPC 를 아스틸빈 또는 RSG 추출액으로 예비처리시, ALT 및 AST 분비의 투여량 의존적 억제가 관찰되었고, 아스틸빈이 RSG 추출액 보다 강한 활성을 나타냈다.
또한, 상기 아스틸빈 및 RSG 추출액 양자의 억제 활성은, 5×10-5 g/ml 농도로 NPC 를 30 분 이상 예비 처리함으로써, ALT 분비가 완전히 억제되고 NPC의 기능부전이 완전히 억제됨이 확인되었다. 그러나, 상기 약물이 공배양 전에 HC 를 처리하기 위해 사용될 경우, 아스틸빈도 RSG 추출액도 NPC 의 HC 에대한 세포 독성을 차단하지 못하였다.
따라서, 간 손상의 개선은 주로 활성화된 T 세포를 포함하여 면역세포의 기능을 선택적으로 제거함으로써 수득된다는 것이 확인되었다.
실험 8: 쥐에서 CCl4-유도 간 손상에 대한 간보호의 연구.
a. 방법:
ICR 수컷쥐(각 그룹 당 8마리)를 사용하였다. 아스틸빈 (50 또는 100 mg/kg) 및 RSG 추출액 (100 또는 200 mg/kg) 을 6 일간 경구로 투여하였다. 최종 투여 1 시간 후, 올리브 오일 (0.2 ml/체중 20g) 중의 0.2 % CCl4 를 쥐에 복강 내 주사하였다.
대조연구를 위해 약물투여 없이 단지 CCl4 만 주사한 쥐를 사용하였다. 또한, 포지티브 대조연구를 위해, 쥐에게 비페닐 디메틸 디카르복실레이트(BDD) 150 mg/kg 을 경구투여하였다.
그후, CCl4 투여 20 시간 후, 혈액 시료를 수집하고, 이를 사용하여통상적인 방법으로 혈청 ALT 및 혈청 AST 활성을 측정하였다.
b. 결과:
결과를 표 2에 나타내었다.
군 투여량(mg/kg) ALT(카르멘 단위) AST(카르멘 단위)
정상쥐군 - 244.0 ± 23.4 215.0 ± 23.2
대조군 - 947.5 ± 27.5 669.4 ± 45.4
아스틸빈 50 100 901.6 ± 36.1 921.5 ± 40.2 670.4 ± 21.2 688.2 ± 45.6
RSG 추출액 100 200 920.7 ± 69.2 899.3 ± 37.1 662.9 ± 37.1 638.1 ± 48.2
BDD 150 510.7 ± 27.0* 675.6
* p < 0.01
표 2 는 대조군(CCl4 투여군)에서 ALT 및 AST 활성의 증가가 확연함을 명백히 나타낸다. 그러나, 아스틸빈 및 RSG 추출액 처리군에서는 효과가 관찰되지 않았다. BDD 는 ALT 상승을 상당량 감소시켰다.
삭제
실험 9: CCl4-유도 간 세포 손상에 대한 간보호의 연구.
a. 방법:
상기 실험 8 에서 사용한 정상 쥐로부터 HC 를 분리했다. 세포를 아스틸빈 또는 RSG 추출액으로 2 시간 처리 후, WE 배지 용액으로 2 회 세척하였다. 세척 후, 올리브 오일 중의 0.2 % CCl4 용액 0.1 ml 를 세포에 가하고, 수득한 세포를 1 시간 항온배양하였다. 통상적인 방법으로 상청액에서 ALT 활성을 측정하였다.
b. 결과:
아스틸빈 및 RSG 추출액은 5×10-6 내지 1×10-4 g/ml 농도에서, CCl4 로 처리된 HC 로부터의 ALT 분비에 영향을 미치지 않았다.
상기 결과는, 약물이 CCl4 투여전에 HC 를 처리하기 위해 사용될 경우, 아스틸빈 및 RSG 추출액은 양자 모두 HC 에 대해 CCl4 의 세포독성을 차단하지 못한다는 것을 나타낸다. 또한, 두 약물의 예방적인 6 일간 투여는 양자 모두 쥐에 있어 CCl4-유도 간 손상 개선에 실패했다. 따라서, 상기 결과는, 아스틸빈 및 RSG 추출액은 HC 보호를 통해서라기 보다 주로 활성화된 T 세포를 포함하여 면역세포 기능의 선택적인 억제를 통해 간 손상을 개선함을 제시한다.
실시예 5: 플라바노이드 및 크로몬의 효과
실험 1: 피크릴 클로리드를 이용한 쥐의 간 손상 제조
6-8 주령 BALB/c 쥐를 사용하였다. 실시예 4의 실험 1에 기재된 것과 같은 방법으로 쥐의 복부 피부에 5 일 간격으로 에탄올 중 0.1 % 피크릴 클로리드 0.1 ml 를 칠하여 2 회 감작시켰다. 두 번째 감작 5 일 후, 올리브 오일 중 0.2 % 피크릴 클로리드 10 ㎕를 쥐의 간에 주사하였다. 주사 12 시간 후, HC 및 NPC 를 변형된 2 단계 관류법에 의해 분리하였다. 수득한 세포는 트리판 블루 염색 배재 시험에 의해 약 90 % 생존하고 있는 것으로 확인되었고, 하기 연구용으로 사용되었다.
실험 2 : 세포배양 및 ALT 분비 분석 (NPC 의 예비 처리)
a. 방법 :
HC (2×104 세포/0.2 ml/WE 배지 내의 웰) 를 96-웰 마이크로 플레이트 상에 시딩하고, 37 ℃ 에서 5 % (v/v) CO2 와 함께 공기 중에서 항온배양하였다.
한편, NPC 를 시험화합물과 함께 또는 시험화합물 없이 1 시간 동안 배지에서 항온배양하였다. 시험화합물은 각각 화학식 (1a)의 스미틸빈, 화학식 (1b)의 아스틸빈, 화학식 (1c)의 엔겔레틴, 화학식 (1d)의 유크리핀이었다.
항온배양 5 시간 후, HC 의 각 모노레이어를 배지로 2 회 세척한 후, 상기 시험화합물의 존재 또는 부재하에 예비-처리된 NPC 8×104 세포를 가했다. 3 시간 더 항온배양한 후, 상청액을 수집하고 이를 사용하여 통상적인 방법으로 ALT 활성을 분석하였다.
b. 결과:
결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, HC 와 화합물 비-처리 NPC(대조군)의 공배양 상청액에서 ALT 활성의 현저한 상승이 관찰되었다. 반면, 유사한 구조를 갖는 아스틸빈, 스미틸빈 및 엔겔틴, 플라바노이드는 유사한 억제 강도로 ALT 활성을 투여량-의존적으로 억제하였다. 크로몬인 유크리핀은 보다 강한 억제 효과를 나타냈다.
상기 결과는, 본 발명의 플라바노이드 또는 크로몬은 간-침윤 NPC 의 HC 에 대한 세포독성 즉, 주로 활성화된 T 세포를 그들의 면역기능을 저하시킴으로써 억제한다는 것을 제시한다.
실험 3 : 세포배양 및 ALT 분비 분석 ( HC 의 예비 처리 )
a. 방법 :
WE 배지 중의 HC 를 시험화합물과 함께 또는 시험화합물 없이 1 시간 동안 항온배양하였다. 그후, HC 를 96-웰 마이크로 플레이트 (2×104 세포/0.2 ml/웰) 상에 시딩하고, 37 ℃ 에서 5 % (v/v) CO2 와 함께 공기 중에서 5 시간 항온배양하였다. 5 시간 후, HC 모노레이어를 배지로 2 회 세척한 후, NPC 8×104 세포를 가했다. 계속해서 3 시간 항온배양한 후, 상청액을 수집하여 통상적인 방법으로 ALT 활성을 분석하였다. 시험화합물들은 상기 실험 2 에 기재된 것과 동일한 것들이었다.
b. 결과:
NPC 에 의해 유도된 ALT 분비는 시험화합물이 HC 예비-처리용으로 사용될 때, 시험화합물에 의해 영향받지 않았다.
실험 4: 세포배양 및 ALT 분비 분석(CCl4 에 대한 영향)
a. 방법:
정상쥐로부터 분리한 HC 를 사용하였다. 세포를 시험화합물로 2 시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 2 회 세척하고, 0.1 ml 의 0.2 % CCl4 를 가한 후, 1 시간 항온배양하였다. 수득한 상청액을 수집하여, 통상적인 방법으로 ALT 활성을 측정하였다. 대조 연구를 위해 시험화합물로 비-처리한 HC 를 사용하였다.
시험화합물들은 실험 2 에 기재된 것과 동일한 것들이었다.
b. 결과:
시험화합물, 스미틸빈, 아스틸빈, 엔겔레틴 및 유크리핀 중 어느 것도 5×10-6 내지 1×10-4 g/ml 농도 에서, CCl4 로 손상된 HC 로부터 ALT 분비를 억제시키지 않았다 따라서, 상기 결과는, 상기 화합물들은 기존의 간 보호 제제에서 보여준 것과 같은 간 세포막 안정화와 같은 간 보호 작용을 가지지 않는다는 것을 제시한다. 상기 화합물들의 간 보호 작용은 활성화된 T 세포의 면역기능을 선택적으로 억제한다는 것을 제시한다.
본 발명의 화합물은 활성화된 T 세포에 의해 야기되는 질환의 예방 및 치료에 충분한 활성을 갖는다.

Claims (14)

  1. 활성화된 T 세포에 대해 선택적인 억제 활성을 갖는 면역억제제로서, 하기 화학식 1 로 표시되는 플라바노이드 또는 크로몬을 활성성분으로서 함유하는 면역억제제:
    [화학식 1]
    Figure 112006054171862-pat00024
    [식중, R 은 수소원자 또는 하나 또는 두개의 히드록시기로 치환될 수 있는 페닐기,
    Rha 는 α-L-람노스 잔기, 및
    점선은 이중결합의 존재 또는 부재를 나타낸다].
  2. 청구항 2은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서, 장기이식 거부반응 치료용으로 사용되는 면역억제제.
  3. 청구항 3은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서, 골수(조혈간세포)이식에 의한 이식편대 숙주병 (graft versus host disease) 치료용으로 사용되는 면역억제제.
  4. 제 1 항에 있어서, 자기면역질환 치료용으로 사용되는 면역억제제.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 자기면역질환이 자기면역성 간염, 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 궤양성 대장염, 다발성 경화증(MS), 경피증, 중증 근무력증, 다발성 근염/ 피부근염, 하시모토병, 자기면역성 혈구감소증, 쉐그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 맥관염 증후군 또는 전신성홍반성루푸스인 면역억제제.
  6. 청구항 6은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서, 조직손상 또는 감염을 수반하는 자기면역질환 또는 그와 관련된 질환에 기인한 염증반응, 섬유화 또는 기능장애 치료용으로 사용되는 면역억제제.
  7. 청구항 7은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서, 알레르기 질환 치료용으로 사용되는 면역억제제.
  8. 청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 7 항에 있어서, 상기 알레르기 질환이 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 두드러기, 또는 화분증인 면역억제제.
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서, 화학식 1 에서 R 이 수소원자, 4-히드록시페닐, 3,4-디히드록시페닐, 또는 3,5-디히드록시페닐기인 면역억제제.
  11. 제 1 항에 있어서, 화학식 1 의 플라바노이드 또는 크로몬이, 하기식으로 표시되는 화학식 (1a)의 스미틸빈, 화학식 (1b)의 아스틸빈, 화학식 (1c)의 엔겔레틴 또는 화학식 (1d)의 유크리핀인 면역억제제:
    [화학식 1a]
    Figure 112006054171862-pat00009
    [화학식 1b]
    Figure 112006054171862-pat00010
    [화학식 1c]
    Figure 112006054171862-pat00011
    [화학식 1d]
    Figure 112006054171862-pat00012
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항의 화학식 1 의 플라바노이드 또는 크로몬을 포함하는 식물 추출물을 활성성분으로서 함유하는 면역억제제.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 식물 추출물이 리조마 스밀라시스 글라브라애 (Rhizoma Smilacis Glabrae)추출물인 면역억제제.
  14. 하기 화학식 (1a) 표시되는 스미틸빈:
    [화학식 1a]
    Figure 112004039448680-pat00020
    ,
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