CN116509921A - 米团花二倍半萜提取物k01在制备治疗脓毒血症的药物中的应用 - Google Patents

米团花二倍半萜提取物k01在制备治疗脓毒血症的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了米团花二倍半萜提取物K01及Leucosceptroid N在制备治疗脓毒血症的药物中的应用，属于生物医药领域。本发明以分布在云南的米团花为原料，对米团花有机溶剂提物相优化提取工艺，进一步经大孔树脂柱分离、浓缩得到二倍半萜提取物K01。在小鼠体内实验中K01和Leucosceptroid N均对脓毒血症引起的多器官损伤表现出保护能力，显示米团花二倍半萜提取物K01与Leucosceptroid N均具有预防或治疗脓毒血症的作用。

Description

米团花二倍半萜提取物K01在制备治疗脓毒血症的药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及米团花二倍半萜提取物K01及其制备方法以及K01与Leucosceptroid N在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用。
背景技术
脓毒血症(Sepsis)被定义为感染引起宿主反应失调导致的器官功能障碍，是一种高度异质性疾病。全世界每年约新增5000万例脓毒血症患者，病死率达1/5，严重危害人类生命健康。即使已出院的脓毒血症患者也会患有各种长期后遗症且具有较高死亡率，给医疗和社会带来重大负担。在病原体入侵宿主后，脓毒血症患者免疫系统中产生“炎症风暴”，破坏宿主免疫系统并使机体偏离稳态。迄今，多个抗脓毒血症相关药物临床试验反复失败，尚未发现用于治疗脓毒血症药物的临床获批。
天然产物由于其作用机制独特、毒副作用小等特点，在免疫系统疾病的治疗中发挥着重要作用。许多中草药来源的天然产物具有显著的抗炎免疫抑制作用，尤其植物萜类化合物的抗炎和免疫抑制活性引人注目，是发现新型天然抗炎和免疫抑制药物的重要来源。米团花(Leucosceptrum canum)为唇形科米团花属的单种属植物，多年生灌木或小乔木，主要分布与喜马拉雅山脉东部、中南半岛北部以及中国西南部。米团花叶和树皮有较高的药用价值，云南民间用于舒筋、止血、消炎，治疗发热、胃痛、外伤出血、闭合性骨折、黄水疮等病症。然而目前尚未见米团花及其二倍半萜类化学成分在预防或治疗脓毒血症方面的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供米团花二倍半萜提取物K01及其制备方法以及K01与Leucosceptroid N在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
米团花二倍半萜提取物K01，其是由下述制备方法所得到的：
(1)将粉碎的米团花叶与有机溶剂混合，提取，收集提取液：所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷和石油醚中的一种或几种；所述提取为冷浸提取或热回流提取，冷浸提取温度为室温、提取时间为24～48h、提取次数为1～5次，热回流提取温度为40～50℃、提取时间为2～6h；
(2)将步骤(1)收集的提取液进行减压蒸馏，浓缩处理得到粗提物，所述浓缩处理通过旋转蒸发方式实现，温度为30～60℃；
(3)将步骤(2)所述粗提物进行D101大孔树脂柱层析，收集95％乙醇洗脱相得到米团花二倍半萜提取物K01：所述D101大孔树脂柱层析的流动相选用蒸馏水和10％～95％乙醇，柱体积为2～4L，上样量为20～50g，流速为1～3BV柱体积/h。
根据所述的米团花二倍半萜提取物K01，所述提取物中化学成分至少包含化合物Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种。
一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和所述的米团花二倍半萜提取物K01。
所述的米团花二倍半萜提取物K01或所述的药物组合物在制备抗炎药物或免疫抑制药物中的应用。
所述的米团花二倍半萜提取物K01或所述的药物组合物在制备促炎细胞因子抑制剂、抗脓毒血症药物中的应用。
本发明提供了一种米团花二倍半萜提取物K01的制备方法，包括以下步骤：
(1)将粉碎的米团花叶与有机溶剂混合，提取，收集提取液；
(2)将步骤(1)收集的提取液进行减压蒸馏，浓缩处理得到粗提物；
(3)将所述粗提物进行D101大孔树脂柱层析，收集95％乙醇洗脱相即得到米团花二倍半萜提取物K01。
作为优选，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷和石油醚中的一种或几种；所述提取为冷浸提取或热回流提取，冷浸提取温度为室温、提取时间为24～48h、提取次数为1～5次，热回流提取温度为40～50℃、提取时间为2～6h。
作为优选，所述浓缩处理通过旋转蒸发方式实现，温度为30～60℃；
作为优选，所述D101大孔树脂柱层析的流动相选用蒸馏水和10％～95％乙醇，柱体积为2～4L，上样量为20～50g，流速为1～3BV/h。
此外，本发明还提供了K01中的二倍半萜特征成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O的制备方法，该方法包括下述步骤：
(1)将粉碎的米团花叶与有机溶剂混合，提取，收集提取液：所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷和石油醚中的一种或几种；所述提取为冷浸提取或热回流提取，冷浸提取温度为室温、提取时间为24～48h、提取次数为1～5次，热回流提取温度为40～50℃、提取时间为2～6h；
(2)将步骤(1)收集的提取液进行减压蒸馏，浓缩处理得到粗提物，所述浓缩处理通过旋转蒸发方式实现，温度为30～60℃；
(3)将步骤(2)所述粗提物进行D101大孔树脂柱层析，收集95％乙醇洗脱相得到米团花二倍半萜提取物K01，所述D101大孔树脂柱层析的流动相选用蒸馏水和10％～95％乙醇，柱体积为2～4L，上样量为20～50g，流速为1～3BV柱体积/h；
(4)将步骤(3)所述的米团花二倍半萜提取物K01进行硅胶柱层析、制备液相色谱分离得到二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O：所述硅胶柱层析的洗脱剂选用体积比为8:1～15:1的石油醚-乙酸乙酯溶液，所述制备液相色谱的流动相选用70％～90％的甲醇-水或乙腈-水，流速为1.5～3.5mL/min。
作为优选，Leucosceptroids A,B,C,G,N和O的制备方法：将米团花二倍半萜提取物K01经硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯(10:1)进行洗脱，得到三个流分Fr.1～Fr.3。Fr.1经制备液相色谱(80％甲醇-水)后得到化合物Leucosceptroids C(tR＝13.8min)和G(tR＝14.6min)。Fr.2经制备液相色谱(85％乙腈-水)后得到化合物Leucosceptroids N(tR＝15.6min)和O(tR＝17.1min)。Fr.3经制备液相色谱(90％甲醇-水)后得到化合物Leucosceptroids A(tR＝15.5min)和B(tR＝18.7min)。
二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O的结构式如下所示：
一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和所述的二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种。
所述的K01中的二倍半萜特征成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O或所述的药物组合物在制备抗炎药物或免疫抑制药物中的应用
所述的K01中的二倍半萜特征成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O或所述的药物组合物在制备促炎细胞因子抑制剂、抗脓毒血症药物中的应用。
本发明对于所述药学上可接受的载体没有特殊限定，采用本领域熟知的药用载体即可，具体如固体、半固体或液体稀释剂，填料或药物制品辅剂中的一种或多种。在本发明中，所述药物组合物的制剂种类优选包括液体制剂、固体制剂、喷剂或雾剂；所述液体制剂优选包括注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂或糖浆剂；所述固体制剂优选包括片剂、胶囊剂、颗粒剂或冲剂。本发明中对于所述药物组合物的制备方法没有特殊限定，采用本领域熟知的制备方法即可。
在本发明中，所述米团花二倍半萜提取物K01及药物组合物(二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种)优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所述单位体重服用量优选为10～5000mg/kg。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
采用本发明技术方案得到的米团花二倍半萜提取物K01及Leucosceptroid N，在小鼠体内实验中，均显著降低脓毒血症小鼠血清中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的含量，明显改善脓毒血症小鼠的肺、肝、肾、脾等多器官损伤，并延长小鼠的存活时间。这为筛选安全、高效的免疫抑制剂提供了候选材料，也为脓毒血症等免疫系统疾病的治疗提供了有效的策略。
附图说明
图1为本发明云南产米团花二倍半萜提取物K01中特征二倍半萜成分结构式；
图2为本发明米团花二倍半萜提取物K01抗小鼠脓毒血症活性；
图3为本发明二倍半萜成分Leucosceptroid N抗小鼠脓毒血症活性。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明米团花二倍半萜提取物K01及其制备方法以及K01与Leucosceptroid N在预防或治疗脓毒血症中的应用，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
具体地，本发明中米团花二倍半萜提取物K01和特征二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O的制备步骤如下：
(1)将采自云南的米团花叶1.0kg阴干粉碎后，过40目筛，收集筛下组分；
(2)在室温下用5L乙醇按1:5的料液比混合，提取24h，期间每8h彻底搅拌一次，提取三次并合并，获得提取液；
(3)将获得的提取液在45℃水浴下进行旋转蒸发浓缩至完全去除乙醇，得到粗提物25g；
(4)D101大孔树脂预处理，包括：
a.用95％乙醇3L将3.5kg D101大孔树脂混匀，倒入层析柱内，酌情添加95％乙醇使柱页面高于树脂层20cm，并浸泡12h；
b.用95％乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液澄清为止；
c.用蒸馏水以2BV/h的流速通过树脂层，至流出液无醇味；
(5)将步骤(3)中粗提物通过预处理后的D101大孔树脂，流动相依次选用蒸馏水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇，进行洗脱，每种流动相洗脱3BV，收集95％乙醇洗脱液；
(6)将95％乙醇洗脱液经45℃水浴旋蒸浓缩并冻干后(8g)，即得米团花二倍半萜提取物K01。
(7)将上述所得到的米团花二倍半萜提取物K01经硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯(10:1)进行洗脱，得到三个流分Fr.1～Fr.3。Fr.1经制备液相色谱(80％甲醇-水)后得到化合物Leucosceptroids C(1.5mg,tR＝13.8min)和G(2.8mg,tR＝14.6min)。Fr.2经制备液相色谱(85％乙腈-水)后得到化合物Leucosceptroids N(9.5mg,tR＝15.6min)和O(3.3mg,tR＝17.1min)。Fr.3经制备液相色谱(90％甲醇-水)后得到化合物Leucosceptroids A(11.0mg,tR＝15.5min)和B(7.6mg,tR＝18.7min)。Leucosceptroids A,B,C,G,N和O的化学结构如图1所示。
实施例2
对米团花二倍半萜提取物K01进行体内抗脓毒血症活性测试：
脂多糖(LPS)诱导脓毒血症小鼠模型的建立及药效学研究：小鼠随机分为正常组、模型组、K01治疗组(2.5g/kg)、K01治疗组(5g/kg)，每组13只小鼠。K01治疗组每天灌胃给药一次，连续三天；正常组和模型组给予等量媒介。在第三天给药K01一小时后，腹腔注射20mg/kg LPS构建脓毒血症模型；正常组给予等量生理盐水。在24h内，每4h观察小鼠存活状态、统计存活率。在第12h时，从每组随机取三只小鼠，采集外周血获得血清，ELISA方法检测小鼠血清中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的含量。制备小鼠肺、肝、肾、脾的组织切片并用H&E染色，观察组织损伤情况。
由图2中A可以看出米团花二倍半萜提取物K01明显延长脓毒血症小鼠的生存时间。图2中B和C实验结果分别表明米团花提取物K01显著降低脓毒血症小鼠外周血血清中的促炎细胞因子IL-6和TNF-α的含量。由图2中D组织切片HE染色看出，米团花二倍半萜提取物K01明显缓解脓毒血症小鼠体内的多器官损伤。这些研究证实米团花二倍半萜提取物K01具有较好的体内抗脓毒血症效果，在临床治疗脓毒血症等免疫系统疾病方面具有良好的应用前景。
实施例3
对米团花二倍半萜成分Leucosceptroid N进行体内抗脓毒血症活性测试：
脂多糖(LPS)诱导脓毒血症小鼠模型的建立及药效学研究：小鼠随机分为正常组、模型组、Leucosceptroid N治疗组(25mg/kg)、Leucosceptroid N治疗组(50mg/kg)，每组13只小鼠。Leucosceptroid N治疗组每天灌胃给药一次，连续三天；正常组和模型组给予等量媒介。在第三天给药Leucosceptroid N一小时后，腹腔注射20mg/kg LPS构建脓毒血症模型；正常组给予等量生理盐水。在24h内，每4h观察小鼠存活状态、统计存活率。在第12h时，从每组随机取三只小鼠，采集外周血获得血清，ELISA方法检测小鼠血清中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的含量。制备小鼠肺、肝、肾、脾的组织切片并用H&E染色，观察组织损伤情况。
由图3中A可以看出米团花二倍半萜提取物Leucosceptroid N明显延长脓毒血症小鼠的生存时间。图3中B和C实验结果分别表明Leucosceptroid N显著降低脓毒血症小鼠外周血血清中的促炎细胞因子IL-6和TNF-α的含量。由图3中D组织切片HE染色看出，Leucosceptroid N明显缓解脓毒血症小鼠体内的多器官损伤。这些研究证实米团花二倍半萜成分Leucosceptroid N具有较好的体内抗脓毒血症效果，在临床治疗脓毒血症等免疫系统疾病方面具有良好的应用前景。
制剂实施例
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述米团花二倍半萜提取物K01或二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
(1)本发明米团花二倍半萜提取物K01或二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种制备成片剂：
片剂原料：取米团花二倍半萜提取物K01或二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；
制备方法：将原料、乳糖和淀粉混合，用丙二醇均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，原料含量为10mg。
(2)本发明米团花二倍半萜提取物K01或二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种制备成胶囊剂：
胶囊剂原料：取米团花二倍半萜提取物K01或二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；
制备方法：将原料与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，原料含量为10mg。
(3)取米团花二倍半萜提取物K01或二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种溶于无菌注射用水中，搅拌至原料溶解，经无菌抽滤漏斗过滤和无菌精滤后分装于安瓿中，然后低温冷冻干燥后无菌熔封，得到药物粉针剂。
(4)将米团花二倍半萜提取物K01或二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种用DMSO溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5～5mg/mL。
(5)将米团花二倍半萜提取物K01或二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种按常规口服液制备方法制成口服液
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.米团花二倍半萜提取物K01，其特征在于，其是由下述制备方法所得到的：
(1)将粉碎的米团花叶与有机溶剂混合，提取，收集提取液：所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷和石油醚中的一种或几种；所述提取为冷浸提取或热回流提取，冷浸提取温度为室温、提取时间为24～48h、提取次数为1～5次，热回流提取温度为40～50℃、提取时间为2～6h；
(2)将步骤(1)收集的提取液进行减压蒸馏，浓缩处理得到粗提物，所述浓缩处理通过旋转蒸发方式实现，温度为30～60℃；
(3)将步骤(2)所述粗提物进行D101大孔树脂柱层析，收集95％乙醇洗脱相得到米团花二倍半萜提取物K01：所述D101大孔树脂柱层析的流动相选用蒸馏水和10％～95％乙醇，柱体积为2～4L，上样量为20～50g，流速为1～3BV柱体积/h。
2.根据权利要求1所述的米团花二倍半萜提取物K01，其特征在于，所述米团花二倍半萜提取物K01中化学成分至少包含化合物Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种。
3.一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和权利要求1所述的米团花二倍半萜提取物K01。
4.权利要求1所述的米团花二倍半萜提取物K01或权利要求3所述的药物组合物在制备抗炎药物或免疫抑制药物中的应用。
5.权利要求1所述的米团花二倍半萜提取物K01或权利要求3所述的药物组合物在制备促炎细胞因子抑制剂、抗脓毒血症药物中的应用。
6.米团花二倍半萜提取物K01的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：
(1)将粉碎的米团花叶与有机溶剂混合，提取，收集提取液：所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷和石油醚中的一种或几种；所述提取为冷浸提取或热回流提取，冷浸提取温度为室温、提取时间为24～48h、提取次数为1～5次，热回流提取温度为40～50℃、提取时间为2～6h；
(2)将步骤(1)收集的提取液进行减压蒸馏，浓缩处理得到粗提物，所述浓缩处理通过旋转蒸发方式实现，温度为30～60℃；
(3)将步骤(2)所述粗提物进行D101大孔树脂柱层析，收集95％乙醇洗脱相得到米团花二倍半萜提取物K01，所述D101大孔树脂柱层析的流动相选用蒸馏水和10％～95％乙醇，柱体积为2～4L，上样量为20～50g，流速为1～3BV柱体积/h。
7.K01中的二倍半萜特征成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
(1)将粉碎的米团花叶与有机溶剂混合，提取，收集提取液：所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷和石油醚中的一种或几种；所述提取为冷浸提取或热回流提取，冷浸提取温度为室温、提取时间为24～48h、提取次数为1～5次，热回流提取温度为40～50℃、提取时间为2～6h；
(2)将步骤(1)收集的提取液进行减压蒸馏，浓缩处理得到粗提物：所述浓缩处理通过旋转蒸发方式实现，温度为30～60℃；
(3)将步骤(2)所述粗提物进行D101大孔树脂柱层析，收集95％乙醇洗脱相得到米团花二倍半萜提取物K01：所述D101大孔树脂柱层析的流动相选用蒸馏水和10％～95％乙醇，柱体积为2～4L，上样量为20～50g，流速为1～3BV柱体积/h；
(4)将步骤(3)所述的米团花二倍半萜提取物K01进行硅胶柱层析、制备液相色谱分离得到二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O：所述硅胶柱层析的洗脱剂选用体积比为8:1～15:1的石油醚-乙酸乙酯溶液，所述制备液相色谱的流动相选用70％～90％的甲醇-水或乙腈-水，流速为1.5～3.5mL/min，
具体采用：将米团花二倍半萜提取物K01经硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯10:1进行洗脱，得到三个流分Fr.1～Fr.3；Fr.1经制备液相色谱，80％甲醇-水后得到化合物Leucosceptroids C和G；Fr.2经制备液相色谱，85％乙腈-水后得到化合物Leucosceptroids N和O；Fr.3经制备液相色谱，90％甲醇-水后得到化合物Leucosceptroids A和B。
8.一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和权利要求7所述的方法得到的二倍半萜成分Leucosceptroids A,B,C,G,N和O中的一种或多种。
9.权利要求7所述的方法得到的或如下结构式所示的K01中的二倍半萜特征成分Leucosceptroids C,G,N,O,A和B或权利要求8所述的药物组合物在制备抗炎药物或免疫抑制药物中的应用，
10.权利要求7所述的方法得到的或如下结构式所示的K01中的二倍半萜特征成分Leucosceptroids C,G,N,O,A和B或权利要求8所述的药物组合物在制备促炎细胞因子抑制剂、抗脓毒血症药物中的应用，
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