KR20100084038A

KR20100084038A - 물오리나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20100084038A
Application number: KR1020090003430A
Authority: KR
Inventors: 김형자; 진창배; 이용섭; 정서윤
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-01-15
Filing date: 2009-01-15
Publication date: 2010-07-23
Also published as: KR101084733B1

Abstract

본 발명은 물오리나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 물오리나무(Alnus hirsuta)의 줄기를 알콜로 추출하여 얻은 알콜 추출물과 이로부터 분리된 화합물들(화학식 1)을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

물오리나무, 간독성 질환, 디아릴헵타노이드 유도체, HepG2 세포

Description

물오리나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물{LIVER CYTOPROTECTIVE COMPOSITION COMPRISING AN EXTRACT FROM THE STEM BARKS OF ALNUS HIRSUTA AND COMPOUNDS ISOLATED THEREFROM}

본 발명은 물오리나무(Alnus hirsuta) 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

간은 인간의 신체 장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로 인체 내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하면서 외부에서 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 생체 내로 들어온 생체 외 물질은 일단 간을 통과하게 되므로 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기 보다 많아 그 만큼 손상될 확률도 매우 높다. 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있을 경우에는 충분히 정상으로 회복되지만, 손상이 지속될 경우에는 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고 간 기능도 저하되는 등 정상 간으로의 회복이 어려운 상태가 된다. 또한, 우리의 몸은 산업화에 따른 공해물질, 유독물질에 항상 노출되어 있어 우리의 간은 끊임없이 해독작용에 시달리 고 있는데 간독성을 유발하는 물질 외에도 정신적 스트레스, 과음, 흡연 등은 간 손상을 가중시켜 인체가 방어 해독 작용을 하지 못해 면역 체계에 이상을 가져와 다른 질병의 원인이 되기도 한다. 간질환은 병이 생기는 원인에 따라 바이러스성 간질환, 알코올성 간질환, 약물독성 간질환, 지방간, 자가 면역성 간질환, 대사성 간질환 및 기타 간질환으로 구분된다. 간 질환은 초기에 자각증상이 없어 상당히 진행되어서야 발견되기 때문에, 우리나라뿐만 아니라 세계적으로도 사망원인의 수위를 차지하고 있으나, 효과적인 치료제 및 진단방법이 없는 실정이다. 이러한 간 질환의 심각성에도 불구하고 아직까지 간 질환의 효과적인 치료방법이 없는 실정이므로 간 조직의 구조 및 기능을 유지하면서 간 손상을 치료 및 예방할 수 있는 약물 개발이 절실히 필요한 상황이다.

현재까지 천연식물에서 추출되어 실제 임상에서 응용되고 있는 간 기능 보호제로서는 실리범 마리아넘(Silybum marianum)이라는 식물에서 추출된 실리빈(silybin), 실리디아민(silydiamine), 실리크리스틴(silycristine) 등의 이성체로 구성된 실리마린(silymarin) 제제가 있다. 이와 같이, 천연물로부터 간질환 치료제를 개발하려는 수많은 노력에도 불구하고 실제로 치료제로 현재 사용 중이거나 임상시험 중인 예는 소수에 불과하다. 이에, 본 발명자들은 간 보호 효과를 가지는 물질을 탐색하여 식품 및 의약품에 활용하기 위한 목적으로 물오리나무의 줄기를 이용한 간 보호 활성을 조사하였다. 물오리나무의 항염증[Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 23, 517, 2000]과 항암 작용[Bae et al., Yakhak Hoechi, 41, 559, 1997; Chang et al., Arch. Pharm. Res., 18, 396, 1995; Joo et al., Arch. Pharm. Res., 25, 457, 2002a; Joo et al., Arch. Pharm. Res., 25, 493, 2002b]에 대한 것은 공지된 바 있으나, 물오리나무에 대한 간 보호 효능에 관한 연구는 알려진 바가 없다.

물오리나무(Alnus hirsuta)는 자작나무과(Betulaceae)의 낙엽교목으로 습기가 많은 산 또는 들에 자생한다. 우리나라에 자생하는 동속식물로는 오리나무(Alnus japonica), 사방오리나무(A. firma), 두메오리나무(A. maximowiczii), 물갬나무(A. hirsute var sibirica) 등이 있다. 물오리나무의 생약명은 적양피(赤楊皮 alnudis cortex)라 하는데, 오리나무 및 동속식물의 수피를 사용하며, 해열, 지혈, 수렴 등의 효능이 있고, 장염, 설사, 외상출혈, 혈변 등에 쓰이는 것으로 알려져 왔다[김제길, 원색 천연 약물 대사전(하권), 남산당, p161, 1984].

이에, 본 발명자들은 다양한 식물을 대상으로 간 보호 물질을 연구하던 중, 물오리나무의 줄기에서 간 보호 효과를 나타내는 물질을 확인하게 되었다. 물오리나무 줄기의 알콜 추출물 및 이 추출물에 함유되어 있는 성분을 수종 분리 동정하여 얻은 화합물들(화학식 1)은 사람의 간암 세포주인 HepG2 세포를 t-BHP로 독성을 유도한 후 세포독성 보호 효과를 검색한 결과 간 보호 작용에 탁월한 효과가 있음을 발견하였고, 간염, 지방간, 간경화 및 간장독성과 같은 간질환에 유용한 소재임을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 물오리나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물들(화학식 1)을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 상기 물오리나무 줄기 추출물로부터 분리된 신규 화합물(화합물 13)을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 물오리나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물들(화학식 1)을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.

상기 화학식 1에서, 상기 X는 =O 또는 OR₂이고, Y는 H 또는 OR₂이고,

는 단일결합 또는 이중결합이고, R₁은 수소 또는 히드록시기이고, R₂는 수소, 탄소수 1~4의 알킬기, 오탄당, 육탄당 또는 오탄당과 육탄당이 결합한 구조이다.

본 발명은 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 물오리나무 줄기의 용매 추출물 및 아세트산에틸 분획에서 분리 정제한 신규 화합물 허수타노시드(hirsutanoside) 를 포함한 화학식 1의 디아릴헵타노이드 유도체들은 t-BHP과 같은 독성물질에 의하여 간독성이 유발되었을 때 간세포 보호 효과가 우수하여 회복능력이 우수하므로 간염, 지방간, 간경화 및 간장독성과 같은 간질환에 예방 및 치료에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 물오리나무의 줄기를 알콜로 추출하여 얻은 간 보호 효과를 갖는 추출물과 이로부터 분리된 디아릴헵타노이드 유도체들(화학식 1)을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화학식 1의 화합물들은 다음의 추출 및 분리방법에 의하여 수득할 수 있다.

잘게 자른 물오리나무의 줄기는 탄소수 1 내지 6개의 저급 알콜 또는 5 ~ 30%의 상기 알콜 용매에 가하여 1 ~ 2 리터/kg로 용량으로 추출한다. 이 알콜 용매를 여과지로 걸러서 얻은 용액을 농축기로 농축 및 건조하여 저급 알콜 추출물을 얻고, 이 알콜 분획물을 물에 가한 후, 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH)을 순차적으로 사용하여 분배하여 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 나머지 남는 물 분획물을 제조한다. 상기에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 세파덱스를 이용하여 조분획을 얻은 후, 실리카겔, 역상 실리카겔 및 세파덱스를 이용하여 하기 화학식 1의 디아릴헵타노이 드 유도체들을 얻을 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 화학식 1에서 바람직한 예로는 다음 화학식 1a, 화학식 1b 및 화학식 1c이다.

상기 화학식 1a에서, R₁은 수소 또는 히드록시기이고, R₂는 수소, 탄소수 1~4의 알킬기, 오탄당 또는 육탄당이다. 더욱 바람직하게는 오탄당은 자일로즈(xylose), 육탄당은 글루코즈(glucose)이다. 가장 바람직하게는, 상기 화학식에서 다음의 치환기를 갖는 화합물에 관한 것이다.

화합물 1. R₁ = OH, R₂ = 자일로즈(xylose)

화합물 3. R₁ = OH, R₂ = 글루코즈(glucose)

화합물 4. R₁ = OH, R₂ = H

화합물 5. R₁ = OH, R₂ = Me

화합물 9. R₁ = H, R₂ = 글루코즈(glucose)

화합물 10. R₁ = H, R₂ = 자일로즈(xylose)

상기 화학식 1b에서, R₁은 수소 또는 히드록시기이다. 더욱 바람직하게는, 상기 화학식에서 다음의 치환기를 갖는 화합물에 관한 것이다.

화합물 2. R₁ = OH

화합물 12. R₁ = H

상기 화학식 1c에서, R₁은 수소 또는 히드록시기이고, R₂는 오탄당, 육탄당 또는 오 탄당과 육탄당이 결합한 구조이다. 더욱 바람직하게는 R₂가 자일로즈(xylose), 글루코즈(glucose)이거나 자일로즈와 글루코즈가 결합한 구조이다. 더욱 바람직하게는, 상기 화학식에서 다음의 치환기를 갖는 화합물에 관한 것이다.

화합물 6. R₁ = OH, R₂ =

화합물 7. R₁ = OH, R₂ =

화합물 8. R₁ = OH, R₂ =

화합물 11. R₁ = H, R₂ =

화합물 13. R₁ = H, R₂ =

상기 에틸아세테이트 분획물을 세파덱스, 실리카겔, 역상 칼럼크로마토그래피(RP-18) 등을 사용하여 화합물들의 분리를 시도한 결과, 오레고닌(oregonin)(화합물 1)(화학식 1a), 허수테논(hirsutenone)(화합물 2)(화학식 1b), 허수타노놀-5-O-β-D-글루코피라노시드(hirsutanonol-5-O-β-D-glucopyranoside)(화합물 3)(화학 식 1a), 허수타노놀(hirsutanonol)(화합물 4)(화학식 1a), 5-O-메틸허수타노놀(5-O-methylhirsutanonol)(화합물 5)(화학식 1a), 루브라노시드 A(rubranoside A)(화합물 6)(화학식 1c), 루브라노시드 B(rubranoside B)(화합물 7)(화학식 1c), 루브라노시드 C(rubranoside C)(화합물 8)(화학식 1c), 플라티필로시드(platyphylloside)(화합물 9)(화학식 1a), 플라티필로놀-5-O-β-D-자일로피라노시드(platyphyllonol-5-O-β-D-xylopyranoside)(화합물 10)(화학식 1a), 아세로시드 VII(acerosideⅦ)(화합물 11)(화학식 1c), 플라티필레논(platyphyllenone)(화합물 12)(화학식 1b), 허수타노시드(hirsutanoside)(화합물 13)(화학식 1c)의 13종 화합물들을 분리할 수 있었다.

특히, 이 화합물 중에서 허수타노시드(화합물 13)는 자연계에서 처음으로 분리 보고하는 화합물이며, 5-O-메틸허수타노놀(화합물 5)과 루브라노시드 C(화합물 8), 플라티필로시드(화합물 9), 플라티필로놀-5-O-β-D-자일로피라노시드(화합물10), 아세로시드 VII(화합물 11), 플라티필레논(화합물 12)은 물오리나무에서 처음으로 분리 보고하는 화합물이다.

상기와 같은 공정을 통하여 얻은 알콜 추출물과 이로부터 분획한 유기용매 분획물 및 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 정제한 화합물들이 사람의 간암 세포주인 HepG2 세포를 t-BHP로 독성을 유도한 후 세포독성 보호 효과를 검색한 결과, 유기용매 분획물에서 간 보호 효과가 우수하게 나타남을 알았으며, 특히 에틸아세테이트 분획물은 저농도에서 세포독성 없이 효과가 우수하게 나타났다(표 1). 효과가 우수하게 나타난 에틸아세테이트 분획물을 다양한 컬럼크로마토그래피를 실 시하여 분리 정제한 순수 화합물들에서도 간 보호 작용에 탁월한 효과가 있음을 발견하였다(표 2). 순수하게 분리된 디아릴헵타노이드 유도체 중에서는 5-O-메틸허수타노놀(화합물 5)이 간세포의 손상을 효과적으로 억제하였으며, 이의 효과는 항산화 물질로 잘 알려진 콰르세틴과 유사한 세포독성 보호 효과를 나타내었다. 그 밖에도 카테콜 골격을 가지고 있는 나머지 화합물에서도 우수한 간 보호 효능을 나타내고 있어서 이들 디아릴헵타노이드 유도체가 물오리나무 줄기의 알콜 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물이 간암 세포주인 HepG2 세포를 t-BHP로 독성을 유도한 간세포의 손상을 억제하는데 중요한 작용을 하는 유효활성성분들임을 밝혔다. 그러므로 본 발명은 5-O-메틸허수타노놀(5)을 비롯한 디아릴헵타노이드 유도체의 혼합물 및 이들이 다량 존재하는 물오리나무 줄기의 알콜 추출물 또는 유기용매 분획물과 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 화합물들이 간 보호 효과가 우수하여 간독성 질환의 예방 및 치료에 유효하다는 사실을 제공하는 것이다. 즉, 상기 추출물과 이로부터 분리된 화합물들은 HepG2 세포의 세포손상을 보호하는 것으로 밝혀져 간독성 질환, 구체적으로는 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암, 간성혼수 등에 대한 예방 및 치료 효과가 있는 것이다.

본 발명의 약학 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캅셀, 새세이 또는 기타 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭서제, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제 등의 경구 투여용 제형으로 제제화할 수 있다. 또한, 주사용 제형으로서 용액 또는 현탁액 등의 형태로 제제화할 수 있고, 경피 투여용 제형으로서 연고제, 크림제, 겔제 또는 로숀제 등의 형태로 제제화할 수도 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 물오리나무 줄기의 알콜 추출물 또는 에틸아세테이트 분획물을 임상적인 목적으로 투여 시에 단일용량 또는 분리용량으로 성인에게 투여될 총 일일용량은 약 200 ㎎ 내지 20 g, 바람직하게는 500 ㎎ 내지 10 g의 범위가 충분할 것이나, 일부 질환에 따라 더 높거나 더 낮은 일일 투여량이 요구될 수 있다. 또한, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물을 임상적으로 투여하여 목적하는 간독성 질환 치료효과를 얻고자 하는 경우에, 물오리나무 줄기의 알콜 추출물, 이로부터 분리된 화합물들을 공지의 간독성질환 치료제 중에서 선택된 1종 이상의 성분과 혼합 하여 동시에 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하겠지만, 본 발명의 기술적 범위가 다음 실시예로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 물오리나무 줄기로부터 유기용매 추출물의 제조

경기도 천마산에서 채집한 물오리나무 줄기를 물로 씻은 후 잘 건조시킨 후5.17 kg을 잘게 잘라서 MeOH(18 ℓ×3)로 실온에서 4 ~ 5일 동안 추출하였다. 이를 여과지로 여과한 용액은 감압 농축기를 이용하여 건조시켜 메탄올 추출물 993.2 g을 얻었다. 이 메탄올 추출물 중에서 515.7 g을 증류수(5.1 ℓ)에 현탁시키고 이어서 디클로로메탄(CH₂Cl₂, 5.1 ℓ×3), 에틸아세테이트(EtOAc, 5.1 ℓ× 3), 부탄올(BuOH, 5.1 ℓ×3)을 순차적으로 사용하여 분배하여 디클로로메탄 분획물(54.48 g), 에틸아세테이트 분획물(227.47 g), 부탄올 분획물(168.63 g), 나머지 남는 물(H₂O) 분획물을 제조하였다.

제조예 2: 물오리나무 줄기의 에틸아세테이트 분획물로부터 간세포 보호성분의 분리

물오리나무 줄기의 알콜 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물 일 부(20.1 g)를 메탄올을 전개용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하여 8개의 소분획(E1 - E8)으로 나누었다. 소분획 E6(4.32 g)을 실리카겔을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 전개용매로는 CH₂Cl₂: MeOH: H₂O(7:1: 0.1)의 혼합용매로부터 메탄올의 양을 증가시켜 CH₂Cl₂:MeOH: H₂O(3: 1: 0.1)의 혼합용매를 사용하여 17개의 소분획(E6a - E6p)을 얻을 수 있었다. 소분획 E6m(1.72 g)는 역상 실리카겔을 이용하여 50% MeOH을 전개용매로 하여 분리를 실시한 결과, 오레고닌(화합물 1)과 루브라노시드 B(화합물 7)를 얻었다. 소분획 E6c(57.5 ㎎)는 분취용 HPLC(LiChrosorb RP-18 250-10, 7 ㎛)를 이용하여 분리를 실시하였다. 사용한 용매는 25~30% 아세토니트릴(CH₃CN)의 전개용매를 사용하여 한 결과 허수테논(화합물 2)과 5-O-메틸허수타노놀(화합물 5)을 얻었다. 소분획 E6o(98.3 ㎎)을 분취용 HPLC(LiChrosorb RP-18 250-10, 7 ㎛)를 이용하여 분리를 실시하였다. 사용한 용매는 40~70% 메탄올을 전개용매로 사용하여 허수타노놀-5-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 3)와 루브라노시드 A(화합물 6)를 얻을 수 있었다. 허수타노놀(화합물 4)은 소분획 E6g(61.7 mg)를 분취용 역상 TLC를 이용하여 45% 메탄올을 전개용매로 하여 순수하게 분리할 수 있었다. 소분획 E6i(241.1 ㎎)는 역상 실리카겔을 이용하여 38% MeOH을 전개용매로 하여 분리를 실시하여 10개의 소분획(E6i1-E6i10)을 얻고 , 이중에서 분획 E6i6은 분취용 HPLC를 이용하여 분리를 하였다. 이동상은 22~30% 아세토니트릴(CH₃CN)의 혼합용매를 사용한 결과, 플라티필레논(화합물 12)을 얻었다. 소분획 E2(1.32 g)는 역상 실리카겔을 이용하여 20~50% MeOH을 전개용매로 하여 분리를 실시하여 10개의 소분획으로 나누고 이 중 6번째 분획(E2f, 247 ㎎)을 50% 메탄올을 이동상으로 사용하고 역상 실리카겔을 이용하여 플라티필로시드(화합물 9)와 플라티필로놀-5-O-β-D-자일로피라노시드(화합물 10)를 얻었다. 소분획 E2j(107.1 ㎎)는 역상 실리카겔을 이용하여 55~70% MeOH을 전개용매로 하여 분리를 실시하여 14개의 소분획(E2j1-E2j14)으로 나누고 이 중 소분획(E2j56, 62.4 ㎎)에서 분취용 역상 TLC 실리카 젤을 이용하여 55% 메탄올을 전개용매로 사용하여 아세로시드 VII(화합물 11)을 순수하게 분리하였다. 또한, 소분획(E2j6, 20.6 ㎎)을 실리카 젤을 이용하여 CH₂Cl₂:MeOH(5:1:)의 혼합용액 이동상으로 하여 신규 화합물인 허수타노시드(화합물 13)를 순수하게 분리하였다. 소분획 E3(4.45 g)은 역상 실리카겔을 이용하여 30~60% MeOH을 전개용매로 하여 분리를 실시하여 12개의 소분획으로 나누고 이 중 10번째 분획(E3j, 17.8 ㎎)에서 실리카 젤을 이용하여 루브라노시드 C(화합물 8)를 순수하게 분리하였다. 이때, 사용한 용매는 CH₂Cl₂:MeOH: H₂O(5:1:0.1)의 혼합용액이다.

화합물 1( 오레고닌 ): 갈색의 화합물, [α]²⁷ _D-20.5˚ (c 0.017, MeOH), FABMS(negative-ion mode): m/z = 477[M-H]^-

화합물 2(허수테논): 갈색의 화합물, CIMS: m/z = 329[M+H]⁺

화합물 3( 허수타노놀 -5- O -β-D- 글루코피라노시드 ): 갈색의 화합물, [α]³³ _D-19.2˚(c 0.023, MeOH), FABMS(negative-ion mode): m/z = 507[M-H]^-

화합물 4( 허수타노놀 ): 갈색의 화합물, [α]²⁸ _D-1.8˚ (c 0.05, MeOH), FABMS(positive-ion mode): m/z = 369[M+H]⁺

화합물 5(5- O - 메틸허수타노놀 ): 갈색의 화합물, [α]²⁸ _D+3.8˚ (c 0.29, MeOH)

EIMS: m/z = 360[M]⁺

화합물 6( 루브라노시드 A): 갈색의 화합물, [α]²⁸ _D-24.5˚(c 0.6, MeOH), FABMS(negative-ion mode): m/z = 493[M-H]^-

화합물 7(루브라노시드 B): 갈색의 화합물, FABMS(negative-ion mode): m/z = 463[M-H]^-

화합물 8(루브라노시드 C): 갈색의 화합물, FABMS(negative-ion mode): m/z = 625[M-H]^-

화합물 9( 플라티필로시드 ): 갈색의 화합물, [α]_D ²⁸ -10.7˚ (c 0.023, MeOH). FABMS(negative-ion mode): m/z = 475[M-H]^-

화합물 10(플라티필로놀-5- O -β-D-자일로피라노시드): 갈색의 화합물, FABMS(negative-ion mode): m/z = 445[M-H]^-

화합물 11( 아세로시드 VII ): 갈색의 화합물, [α]_D ²⁸ -2.6˚ (c 0.34, MeOH); FABMS(negative-ion mode): m/z = 461[M-H]^-

화합물 12(플라티필레논): 노란색의 화합물, GCMS: m/z = 296[M]⁺

화합물 13(허수타노시드): 갈색의 화합물, FABMS(negative-ion mode): m/z = 593[M-H]^-; ¹H-NMR(CD₃OD, 400 MHz):δ1.38(2H, m, H-5), 1.54(4H, m H-4,6), 1.73(2H, m, H-2), 2.49(2H, t, J=7.4 Hz, H-7), 2.57(2H, m, H-1), 3.22( 1H, t, J=11.1 Hz, xyl-5), 3.27-3.35(5H, m, glc-2,3,4,5,xyl-2), 3.48(1H, t, J=8.8 Hz, xyl-3), 3.62(3H, m, H-3, glc-6, xyl-4), 3.89(1H, d, J=11.9 Hz, glc-6), 3.91(1H, dd, J=11.9, 5.4 Hz, xyl-5), 4.26(1H, d, J=7.8 Hz, xyl-1), 4.55(1H, d, J=7.5 Hz, glc-1), 6.66, 6.67(4H, each d, J=8.3 Hz, H-3',5',3",5"), 6.96, 6.97(4H, each d, J=8.3 Hz, H-2',6',2",6"); ¹³C-NMR(CD₃OD, 100 MHz): δ25.3(C-5), 31.5(C-1), 32.8(C-6), 34.7(C-4), 35.7(C-7), 38.0(C-2), 62.5(glc-6), 66.1(xyl-5), 69.8(xyl-4), 71.4(glc-4), 74.1(xyl-2), 75.3(glc-2), 77.6(glc-5), 77.9(glc-3), 79.8(C-3), 87.3(xyl-3), 103.5(xyl-1), 104.9(glc-1), 115.8(C-3',3",5',5"), 130.1(C-2',6',2",6"), 134.5(C-1',1"), 156.0(C-4',4").

[신규 화합물 13의 구조 결정]

이 화합물은 무정형의 분말로 분자량은 FABMS로부터 594임을 알았다. ¹H-NMR에서는 고자장에서 두 개의 벤젠고리에서 기인한 피크가 δ 6.66, 6.67(4H, each d, J=8.3 Hz, H-3',5',3",5"), 6.96, 6.97(4H, each d, J=8.3 Hz, H-2',6',2",6")에서 나타나고 있어 그 피크형태가 파라 치환체로 치환되어 있음을 알 수 있었다. 또한, 당의 아노머 수소가 각각 δ 4.26(1H, d, J=7.8 Hz, xyl-1), 4.55(1H, d, J=7.5 Hz, glc-1)에서 나타나고 있어 당은 2개가 결합하고 있음을 알았으며, 그의 커플링 상수로부터 각각 β형태로 결합하고 있음을 알 수 있었다. 저자장에서의 멀티플렛 피크들은 이 화합물에 지방족 그룹(aliphatic group)들에서 기인한 것임을 예상할 수 있었다. ¹³C-NMR에서는 저자장에서의 탄소들로부터 지방족 탄소가 6개있으며, DEPT로부터 이들 탄소는 2차(secondary) 탄소인 메틸렌 탄소(CH₂)임을 알 수 있었고, δ 79.8(C-3)에서의 산소와 결합한 탄소를 포함하면 이 화합물이 디아릴헵타노이드 유도체임을 짐작하게 하였다. 또한, δ 60 - 87에서의 케미칼 시프트 값으로부터 두 개의 당은 각각 글루코즈와 자일로즈에서 기인한 피크들이며, δ 103.5와 104.9의 피크는 각각 자일로즈와 글루코즈의 아노머(1번) 탄소임을 알 수 있었다. 한편, ¹H-¹H COSY로부터 결합하고 있는 당의 정확한 위치를 파악할 수 있었으며, HMQC로부터 수소와 탄소의 결합을 알 수 있었다. HMBC로부터 두 개의 당의 결합 위치를 확인할 수 있었다. 즉, δ 4.26(1H, d, J=7.8 Hz)에서의 자일로즈 1번 수소에서 기인한 피크가 δ 79.8에서의 3번 탄소와 상관관계가 나타나고, δ 4.55(1H, d, J=7.5 Hz)에서의 글루코즈 1번 수소는 δ 87.3에서의 자일로즈 3번 탄소와 상관관계가 나타나고 있어 자일로즈는 배당체의 3번에 결합하고 있으며, 글루코즈는 자일로즈의 3번에 결합하고 있는 파라-치환체의 디아릴헵타노이드 배당체임을 알 수 있었다. 또한, 이 화합물 3번의 절대적 입체 위치는 화합물 12와 비교하여 결정하였으며 문헌과 일치하는 R-form임을 알 수 있었다. 따라서, 이 화합물은 자연계에서 처음으로 분리된 화합물인 센트롤로볼-3-O-β-D-글루코피라노실-β-D-크실로피라노사이드(centrolobol-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-xylopyranoside)이며, 허수타노시드(13)로 명명하였다.

본 발명에서 물오리나무 줄기의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 나머지 공지의 화합물 1 ~ 12의 구조는 분석 결과, 오레고닌(1), 허수테논(2)(D.-W. Jeong, Kor. J. Pharmacogn., 2000, 31, 28), 허수타노놀-5-O-β-D-글루코피라노시드(3), 허수타노놀(4)(S. Ohta , et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1984, 1635), 5-O-메틸허수타노놀(5)(M. Kuroyanagi, et al., Chem. Pharm. Bull., 2005, 53, 1519), 루브라노시드 A(6), 루브라노시드 B(7), 루브라노시드 C(8)(R. F. Gonzalez-Laredo, et al., Nat. Prod. Lett., 1999, 13, 75), 플라티필로시드(9), 플라티필로놀-5-O-β-D-자일로피라노시드(10)(S. Ohta , et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1984, 1635), 아세로시드 VII(11)(Nagai, M., et al., Chem. Pharm. Bull., 1986, 34, 1056), 플라티필레논(12)(Nomura, M., et al., Phytochemistry 1981, 20, 1097)의 문헌과 잘 일치함을 확인할 수 있었다.

실시예 1: t -BHP에 의한 간세포 손상 회복 효과

물오리나무 줄기로부터 추출한 알콜 추출물 및 에틸아세테이트로 분획물로부터 순수하게 분리 정제한 화합물들은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 각각 10 ㎎/㎖(추출물)과 10 mM(화합물) 농도의 저장용액(stock solution)을 만들었으며, 이를 배지로 희석시켜 알맞은 농도로 사용하였다. 사람 간세포인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 2× 10⁴ cell/well로 분주하여 24시간동안 배양하여 안정화하였다. 배양된 세포에 물오리나무 줄기의 알콜 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들을 농도별로 처리하여 2시간 동안 배양하고, 200 μM의 t-BHP를 처리하여 3시간 동안 독성을 유발하였다. 이와 같이 처리된 세포를 세포독성 및 세포 생존 정도를 알아보기 위하여 MTT 분석법[Hansen M.B. et. al., 1989, J. Immunol. Methods 119:119]을 사용하였다.

MTT가 첨가된 세포를 4시간 동안 배양한 후 시약을 제거하고 각 웰에 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan)을 용해시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. t-BHP 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 하여 독성 처리군 및 시료 처리군의 세포생존율을 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며 3회 반복 실험한 결과를 다음 표 1과 표 2에 각각 나타내었다.

[표 1]

HepG2 세포에서의 t-BHP 유도 독성에 대한 물오리나무 줄기에서 추출한 알콜 추출물 및 이로부터 용매 분획한 분획물에서의 세포독성 보호 효과

상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 200 μM t-BHP를 처리하였을 때 대조군에 비하여 49.4%로 세포생존율이 낮아지는 것을 알 수 있었으며, 이 세포독성은 물오리나무 줄기를 알콜로 추출한 추출물과 이 추출물에서 용매로 분획한 분획물들에 의하여 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. 특히, 고농도에서의 효능은 디클로로메탄 분획물과 부탄올 분획물에서의 세포독성 억제효능이 상당히 우수하였으며, 에틸아세테이트 분획물에서는 저농도에서는 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴과 유사한 보호 효능을 나타내고 있다. 이는 물오리나무 줄기로부터 추출한 용매 추출물들이 독성물질에 의한 간세포 손상 보호 효과가 우수함을 알 수 있었다.

[표 2]

HepG2 세포에서의 t-BHP 유도 독성에 대한 물오리나무 줄기의 에틸아세테이트 분획에서 분리한 순수 화합물에서의 세포독성 보호 효과

(계속)

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 200 μM t-BHP를 처리하여 낮아진 세포생존율이 물오리나무 줄기의 에틸아세테이트 분획물에서 분리 정제한 화합물들에 의하여 농도 의존적으로 증가됨을 알 수 있었다. 특히, 화합물 1 ~ 8에서의 탁월한 세포보호가 나타남을 알 수 있었으며, 물오리나무에서 처음으로 분리된 화합물인 5-O-메틸허수타노놀(화합물 5)은 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴의 보호 효과와 유사한 효능을 나타내고 있다. 따라서, 물오리나무 줄기의 알콜 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물에서의 우수한 간 보호 효과는 이들 화합물들에서 기인한 것임을 알 수 있었으며, 이들 화합물들은 독성에 의한 간세포 보호제로 유용함을 알 수 있었다.

실시예 2: 물오리나무 줄기에서 추출한 용매 분획물과 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 화합물의 t-BHP에 의한 간세포 괴사 억제 효과

세포독성에 의하여 세포가 괴사(necrosis)되면 젖산 탈수소효소(LDH: lactate dehydrogenase)가 유리되는데 이를 세포괴사의 지표로 삼아 그 활성을 측정하였다.

사람 간세포인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 2×10⁴ cell/well로 분주하여 24시간동안 배양하여 안정화하였다. 배양된 세포에 물오리나무 줄기로부터 추출한 알콜 추출물 및 순수 분리된 화합물들을 농도별로 처리하여 2시간 동안 배양하고, 200 μM의 t-BHP를 처리하여 3시간 동안 독성을 유발하였다. 배양이 끝난 세포의 상층액으로부터 유출된 LDH의 양을 키트(Roche)를 이용하여 측정하였 다[Chen Q. et. al., 1997, J. Biol. Chem., 272:14532]. 결과는 3회 반복 실험하여 다음 표 3과 표 4에 각각 나타내었다.

[표 3]

HepG2 세포에서의 t-BHP 유도 독성에 대한 물오리나무 줄기의 용매 분획물에서의 간세포 괴사 억제 효과

상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 200 μM t-BHP를 처리하였을 때 세포손상에 따른 LDH의 유출양이 대조군의 12.96%에 비하여 50.947%로 증가됨을 알 수 있었다. 그러나, 물오리나무 줄기로부터 추출한 알콜 추출물과 이로부터 용매 분획한 용매 분획물들을 처리했을 때는 세포괴사가 억제되어 LHD의 유출양이 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 특히, 디클로메탄 분획과 부탄올 분획에서의 효능이 탁월하게 나타났으며, 에틸아세테이트 분획물에서의 효능은 저농도에서 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴의 억제 효과와 유사한 효능을 나타내고 있다.

이는 물오리나무 줄기로부터 추출한 용매 추출물들이 독성에 의한 간세포 괴사 억제 효과가 우수함을 알 수 있었다.

[표 4]

HepG2 세포에서의 t-BHP 유도 독성에 대한 순수 화합물의 간세포 괴사 억제 효과

(계속)

상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 200 μM t-BHP를 처리하여 증가된 LDH의 유출양이 물오리나무 줄기의 에틸아세테이트 분획물에서 분리 정제한 화합물들에 의하여 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 특히, 화합물 1 ~ 8에서의 유출량 억제 효과가 탁월하게 나타났으며, 5-O-메틸허수타노놀(화합물 5)의 억제 효능은 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴의 괴사 억제 효과와 유사한 효능을 나타내고 있다. 따라서, 물오리나무 줄기의 알콜 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물의 우수한 세포괴사 억제 효과는 이들 화합물들에서 기인한 것임을 알 수 있었으며, 이들 화합물들은 독성에 의한 간세포 괴사를 억제하는데 유용함을 알 수 있었다.

실시예 3: 독성시험

본 발명의 유효성분인 물오리나무 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물 각각에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.

물오리나무 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물 각각을 0.5% 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethly cellulose)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 0, 4, 20, 100, 500 ㎎/㎏이 되도록 경구 투여한 다음 7일간 관찰하였다. 물오리나무 추출물과 에틸아세테이트 분획물로 인하여 사망한 쥐는 없었으며, 이후 7일간 사망하는 쥐는 없었다.

제조예 1 : 정제의 제조

유효성분(물오리나무 추출물) 10 g

락토스 70 g

결정성 셀룰로오스 15 g

마그네슘 스테아레이트 5 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.

제조예 2 : 캡슐제의 제조

유효성분(물오리나무 추출물) 10 g

옥수수 전분 50 g

카르복시 셀룰로오스 40 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 6 번 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

Claims

물오리나무(Alnus hirsuta) 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물.
다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 및 치료용 조성물;

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, 상기 X는 =O 또는 OR₂이고, Y는 H 또는 OR₂이고,
는 단일결합 또는 이중결합이고, R₁은 수소 또는 히드록시기이고, R₂는 수소, 탄소수 1~4의 알킬기, 오탄당, 육탄당 또는 오탄당과 육탄당이 결합한 구조이다.
제 2 항에 있어서,

다음 화학식 1a 내지 1c로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 및 치료용 조성물;

[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]

상기 화학식 1a, 1b 및 1c에서, R₁은 수소 또는 히드록시기이고, R₂는 수소이거나 오탄당, 육탄당 또는 오탄당과 육탄당이 결합한 구조이다.
제 3 항에 있어서, 상기 오탄당은 자일로즈이고, 육탄당은 글루코즈인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 화합물은 물오리나무(Alnus hirsuta) 줄기 추출물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수인 것을 특징으로 하는 조성물.
1) 세절한 물오리나무 줄기를 1 ㎏당 알콜 용매 0.1 내지 10 ℓ를 첨가하고 60 ~ 100 ℃에서 2 ~ 6시간동안 환류하여 추출하는 단계,

2) 상기 추출물을 여과 및 감압 증발시키는 단계, 및

3) 상기 2)의 수득물로부터 에틸아세테이트(EtOAc) 1 내지 5 ℓ로 추출하여 분획물을 얻는 단계

를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 물오리나무로부터 물오리나무 추출물의 제조방법.
제 7 항에 있어서, 상기 1)의 알콜 용매는 탄소수가 1 ~ 4개인 저급 알콜 및 50% 이상의 알콜 수용액으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 1c로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물;

[화학식 1c]

상기 화학식 1c에서, R₁은 수소이고, R₂는
이다.