KR100619498B1 - 간보호 및 간장질환 치료용 의약 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)로부터 분리된 간독성 예방 및 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1로 표시되는 메이스리그난(macelignan)은 화학·독성물질에 의해 유발되는 간세포 독성을 효과적으로 억제하여 간손상 예방 및 치료를 위한 약학 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

<화학식 1>

상기 화학식 1의 메이스리그난은 독성물질 투여에 따른 세포 증식억제와 세포괴사(necrosis)를 완화시켜주었고, 세포내 활성산소종(reactive oxygen species)의 생성과 지질과산화의 정도를 감소시켰으며 DNA 손상을 회복시키는 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 메이스리그난은 간질환의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

메이스리그난, 미리스티카 프라그란스, 간독성, 간보호약제

Description

간보호 및 간장질환 치료용 의약 조성물{Pharmaceutical Composition for Liver Protection and for Treating Liver Disease}

도 1은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)로부터 메이스리그난(macelignan)을 분리하는 공정도이다.

도 2는 메이스리그난의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 메이스리그난의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 4는 메이스리그난의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 5는 메이스리그난의 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼이다.

도 6은 메이스리그난의 EI-Mass 스펙트럼이다.

도 7은 메이스리그난의 화학구조식이다.

도 8은 독성물질인 터트부틸하이드로퍼옥사이드(tert-butylhydroperoxide; t-BHP)가 유발하는 세포 손상에 대한 메이스리그난의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 t-BHP가 유발하는 세포괴사(necrosis)에 대한 메이스리그난의 억제 효과를 측정한 그래프이다.

도 10은 t-BHP 처리에 따른 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 과다 생성에 대한 메이스리그난 농도별 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 11은 t-BHP 투여에 따른 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 과다 생성에 대한 메이스리그난 처리 시간별 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 12는 t-BHP 투여에 따른 세포의 DNA 손상에 대한 메이스리그난의 예방효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)로부터 분리된 간독성 예방 및 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1로 표시되는 메이스리그난(macelignan)은 화학·독성물질에 의해 유발되는 간세포 독성을 효과적으로 억제하여 간손상 예방 및 치료를 위한 약학 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

<화학식 1>

우리나라의 간장 질환 환자 수는 70년대 후반부터 급격히 증가하는 추세를 보이고 있으며 사인 분류가 가능한 사망자 중 약 9%는 간장 질환에 의해서 사망한다고 한다. 특히 간장 질환은 40대 남성의 사망 원인 중 26%를 차지하여 가장 높은 사망률을 보이고 있다(1996년 사망원인통계연보, 통계청, 서울, pp 20-40).

간은 영양분의 대사 및 저장, 혈류량 조절과 방어, 유해 물질의 해독 등을 담당하는 종합적인 화학공장이라고 할 수 있다. 특히 외부에서 체내로 유입되는 대부분의 약물 및 화학물질은 간에서 대사되며 때문에 간은 이들 물질을 해독할 수 있는 효소 시스템(cytochrome P450)의 활성이 높다. 간세포로 약물 및 화학물질이 유입될 경우 세포의 cytochrome P450 효소는 이러한 화합물을 수용성 유도체로 전환시켜 체외로 쉽게 배설될 수 있게 한다. 그러나 이러한 생체 내 변화(biotransformation)는 유입된 화합물을 보다 반응성이 큰 물질로 전환시켜 오히려 세포를 공격하여 독성을 유발하는 과정으로 진행될 수도 있다(Park B. Kevin et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 45:177-202, 2005). 이와 같은 작용으로 인하여 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)이 과량 생성될 수 있고 반응성이 큰 자유 라디칼(free radical)은 세포내 소기관 및 구성 분자들을 공격하여 산화적 스트레스를 유발하고 세포의 손상 및 질환을 야기할 수 있다. 위와 같은 독특한 대사 작용으로 인하여 간은 약물 및 화학물질에 의한 산화적 스트레스에 노출될 가능성이 큰 기관이다. 현대인들은 불규칙한 식사습관, 스트레스, 과도한 음주와 흡연, 산업화에 따른 공해물질, 유독한 화학물질에의 노출 등으로 인해 간기능이 저하되거나 손상되어 심하면 간염, 간경화, 간암 등의 간질환으로 발전할 높은 가능성을 갖고 있다. 때문에 활성산소종을 제거하고 산화적 스트레스를 억제할 수 있는 식이중의 항산화 물질을 찾으려는 많은 연구가 시도되고 있다.

천연물로부터 인간의 질병을 예방·치료할 수 있는 신물질의 탐색은 과거부터 많은 과학자들의 연구대상이 되어왔다. 이와 같은 천연 자원의 개발로 현재 사용되고 있는 의약품의 50% 이상이 천연물로부터 유래되었으며 미국 FDA로부터 승인된 의약품이 120종으로 시장규모는 약 10조 달러에 이르고 있다. 항 간독성 활성을 갖는 천연물의 탐색 및 개발도 많이 이루어지고 있으나 실제 치료제로 사용중이거나 임상시험을 거친 예는 소수에 불과하다(Thabrew M. Ira et al., Phytother. Res., 10:461-467, 1996).

미리스티카 프라그란스는 열대지방에서 재배되는 다년생 식물로서 메이스(mace)나 육두구(nutmeg)로 알려진 이것의 과실은 오래전부터 향신료로 이용되어 왔다. 메이스리그난은 미리스티카 프라그란스에서 발견되는 대표적인 리그난계 화합물로(Tuchinda P. et al., phytochemistry, 59:169-173, 2002) 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 카스파제(caspase)-3 활성 증진작용(Park B.Y. et al., Biol. Pharm. Bull., 27:1305-1307, 2004), 항균활성(Chung J.Y., MS thesis, Yonsei University, 2004) 등이 보고되었다. 그러나 메이스리그난의 항 간독성 작용 및 그 용도에 대해서는 연구 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 여러 종류의 천연물을 대상으로 하여 간독성을 예방 및 치료할 수 있는 활성 물질을 찾고자 탐색한 결과, 미리스티카 프라그란스로부터 분리된 메이스리그난이 항간독성 활성을 나타낸다는 것을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 분리된 메이스리그난의 간독성 예방 및 치료제로서의 신규 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 메이스리그난 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 분리·정제된 리그난계 화합물의 신규한 용도를 제공하는 데 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 메이스리그난은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명의 항 간독성 활성을 갖는 메이스리그난은 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 미리스티카 프라그란스로부터 분리·정제될 수 있다. 바람직하게는 육두구(nutmeg)나 가종피(aril)로부터 분리·정제될 수 있다. 또한 다른 육두구과 식물인 미리스티카 아르겐티아 워르브(Myristica argentea Warb) 등에서도 분리·정제될 수 있으며(Filleur F. et al., Nat. Prod. Lett., 16:1-7, 2002), 후박나무(Machilus thunbergii)(Park B. Y. et al., Bio. Pharm. Bull., 27:1305-1307, 2004), 레우카스 아스페라(Leucas aspera)에서도 분리·정제될 수 있다(Sadhu S. K. et al., Chem. Pharm. Bull., 51:595-598, 2003).

본 발명의 메이스리그난은 통상의 추출 및 분리방법에 의하여 수득할 수 있는데, 먼저, 건조시킨 미리스티카 프라그란스를 4배 내지 5배의 추출 용매와 함께 추출장치에 넣고 이틀 동안 방치하여 추출하고 이를 농축기로 농축 및 건조하여 추출물을 얻는다. 본 발명에 있어 분리를 위한 추출 용매로는 물 또는 C1-C6의 유기용매를 사용할 수 있으며 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 메탄올 또는 헥산을 사용할 수 있다. 상기와 같이 얻어진 추출물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 극성에 따른 분획물을 얻고 분리된 특정 분획물을 다시 역상 컬럼 크로마토그래피법 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)법을 통하여 메이스리그난을 분리할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같은 분리 공정을 통하여 얻어진 메이스리그난에 대해 간독성 해소 실험을 실시한 결과 메이스리그난은 화학·독성물질이 야기하는 간세포 독성을 유의적으로 억제하였다. 메이스리그난의 항 간독성 작용기작은 약물 및 화학 독성물질에 의한 활성산소종의 과다 생성, 그에 따른 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 활성에 기인하는 것으로 이와 같은 활성은 메이스리그난이 간손상 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.

간기능의 보호 또는 간장질환 치료의 목적으로 임상적으로 투여되는 경우에 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여에 적합한 단위투여형의 약제학적 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 메이스리그난에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 메이스리그난을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 배설 그리고 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다.

본 발명의 메이스리그난을 래트에 경구 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/kg 이상인 것으로 나타났다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들로만 한정되는 것은 아니다. 또한 모든 활성 분석은 모두 3회 이상 반복 수행하였으며 그 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였다.

<실시예 1> 미리스티카 프라그란스로부터 메이스리그난의 분리 및 정제

<1-1> 메이스리그난의 분리 및 정제

건조 분쇄한 육두구 100 g에 75% 메탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 메탄올 추출물(7 g)을 제조하였으며, 상기 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획하였다. 에틸아세테이트 분획물(4.2 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 헥산과 에틸아세테이트를 10:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜 분획물 Ⅲ(1 g)를 얻었다. 분획물 Ⅲ를 헥산과 에틸아세테이트 20:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 컬럼 크로마토그래피하여 분획물 Ⅲ-B(0.52 g)을 얻었다. 이후, 분획물 Ⅲ-B를 Rp-18 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 80% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획 Ⅲ-B-2(0.5 g)을 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 1에 나타내었다.

<1-2> 구조분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 600MHz 와 150MHz(용매: DMSO)에서 측정하였다. 그 결과를 도 2와 도 3에 각각 나타내었다. ¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹H-¹H의 상관관계와 ¹H-¹³C의 상관관계를 측정하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼과 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 4와 도 5에 각각 나타내었다. ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC의 결과를 종합적으로 분석하여 표 1에 나타내었다.

Position	13C-NMR	1H-NMR	1H-1H COSY	1H-13C HMBC
1	135.4
2	109.2	6.72 brs		C-7, C-6, C-4, C-3
3	147.3
4	145.1
5	107.9	6.79 d(7.8)	6.61	C-6, C-4, C-3, C-1
6	121.7	6.61 dd(7.8)	6.79	C-7, C-5, C-4, C-2, C-1
7	38.2	2.23 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.23	C-8, C-6, C-2, C-1 C-9, C-8, C-6, C-2, C-1
8	38.7	1.64 brs	0.75, 2.23, 2.66	C-7
9	16.0	0.75 d(6.3)	1.64	C-8, C-7
1'	132.4
2'	112.9	6.66 brs		C-7', C-6', C-4', C-3'
3'	147.1
4'	144.4
5'	115.2	6.66 d(7.9)	6.53	C-6', C-4', C-3', C-1'
6'	121.0	6.53 d(7.9, 1.1)	6.66	C-7', C-5', C-4', C-2', C-1'
7'	38.0	2.17 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.17	C-8', C-6', C-2', C-1' C-9', C-8', C-6', C-2', C-1'
8'	38.7	1.64 brs	0.75, 2.17, 2.66	C-7'
9'	16.1	0.75 d(6.3)	1.64	C-8', C-7'
OMe	55.5	3.72(s)
O-CH2-O	100.6	5.95 d(4.8)		C-3, C-4

<1-3> 질량분석

상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 EI/MS의 결과를 도 6에 나타내었다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]⁺가 m/z 328에서 관측되어 분자량이 328로 판명되었고, 분자식은 C₂₀H₂₄O₄이었다.

<1-4> 비선광도 측정

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2 20mg을 클로로포름(CHCl₃) 2ml에 녹인 후 Polarimeter(Automatic Polarimeter, APⅢ-589, Rodulph, NJ, USA)로 비선광도([α]_D) 값을 측정한 결과 [α]_D = +4.0 (CHCl₃, c=1.0)으로 나타났다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC, EI/MS 및 [α]_D 에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Woo, W.S. et al., Phytochemistry, 26: 1542-1543, 1987)를 비교 분석하여 동정한 결과, 분리된 단일 물질은 도 7로 표시되는 메이스리그난(macelignan)인 것으로 확인되었다.

<실시예 2> t -BHP에 의한 간세포 손상 회복 효과

메이스리그난은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 100 mM stock solution을 만들었으며 이를 배지로 희석시켜 알맞은 농도로 사용하였다. 사람 간세포인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 1.5 × 10⁵ cells/㎖로 맞추어 분주하여 24 시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 배양된 세포에 메이스리그난 stock solution을 농도별(0.5, 1, 2.5, 5 μM)로 희석하여 처리한 후 30 분 동안 배양하고 t-BHP(150μM)를 투여하여 세포독성을 유발하였다. 위와 같이 처리된 세포를 24 시간 동안 배양한 후 세포 독성 및 세포 생존 정도를 알아보기 위해 엠티티(MTT) 분석법(Hansen M.B. et al., J. Immunol. Methods., 119: 119-203, 1989)을 사용하였다. 각 시료가 투여된 배지를 DPBS로 교체한 후 2 ㎎/㎖로 조제된 엠티티 시약을 첨가해주고 4 시간동안 세포배양기에서 배양하였다. 엠티티 시약을 제거한 후 플레이트의 각 웰에 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan)을 용해시켜 엘라이자(ELISA, enzyme-linked immunoadsorbent assay) 분석기로 570 nm에서 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 하여 독성 처리군 및 메이스리그난 처리군의 세포생존율를 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과 도 8에서 보는 바와 같이, t-BHP를 처리하였을 때 대조군에 비해 60% 정도로 세포 생존율이 낮아지는 것을 알 수 있으며 이와 같은 세포독성은 메이스리그난 투여에 의해 효과적으로 억제됨을 확인하였다. 이는 메이스리그난이 독성물질에 의한 간세포 손상에 대해 우수한 보호효과를 갖는다는 것을 의미한다.

<실시예 3> t -BHP에 의한 간세포 괴사 억제 효과

세포독성, 특히 세포괴사(necrosis)의 지표로서 젖산 탈수소효소(LDH; lactate dehydrogenase)의 활성을 측정하였다. HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 1.5 × 10⁵ cells/㎖로 맞추어 분주하여 24 시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 각 웰에 메이스리그난을 농도별(0.5, 1, 2.5, 5 μM)로 처리하고 30 분후에 t-BHP(150μM)를 첨가하였다. 세포를 24 시간 배양한 후에 배지를 새로운 웰 플레이트에 옮겨 TOX-7 kit(sigma)를 이용하여 배지 내 LDH 활성을 측정하였다. 배지를 제거한 플레이트의 세포는 용해버퍼로 파쇄하고 원심분리하여 상층액을 새로운 플레이트로 옮겼다. 위와 같은 kit을 이용하여 세포 파쇄액의 LDH 활성을 측정하였고, 세포내 LDH에 대한 배지 중의 LDH의 비를 계산하여 세포 괴사의 정도를 나타내었다(Chen Q. et al., J. Biol. Chem., 272:14523-14541, 1997).

도 9의 결과와 같이, 독성물질을 투여했을 때 LDH의 유출이 증가함을 알 수 있으며 메이스리그난을 처리했을 때 이와 같은 LDH의 유출을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 메이스리그난이 세포독성을 완화하여 세포괴사를 저해할 수 있음을 의미한다.

<실시예 4> t -BHP에 의한 지질과산화 억제 효과

산화적 스트레스에 의해 세포의 지질과산화가 진행되어 다가불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)이 분해되면 말론다이알데하이드(malondialdehyde; MDA)라는 물질이 다량 생성되며 MDA의 양을 측정함으로써 세포내 지질과산화의 정도를 판단해 볼 수 있다(Mihara M. et al., Anal. Biochem., 86:271-278, 1978). HepG2 세포를 60파이 디쉬에 분주하여 24 시간 동안 안정화시킨 후에 메이스리그난을 농도별(0.5, 1, 2.5, 5 μM)로 처리하고 30 분 후에 t-BHP(300 μM)를 투여하여 산화적 스트레스를 유발하였다. 3 시간 더 배양한 후에 세포를 PBS로 세척한 후 떼어내어 파쇄하였다. 파쇄된 세포질 용액에 1% 인산(phosphoric acid)과 0.67% TBA(thiobarbituric acid) 시약을 첨가하여 90°C에서 1 시간 동안 가열하여 반응시켰다. 이 혼합액에 부탄올을 첨가하고 원심분리하여 MDA가 녹아져있는 상층(부탄올층)액의 형광도를 측정하였다. 지질과산화의 측정결과는 MDA양을 세포 파쇄액의 단백질 양으로 나누어 환산하였으며 그 수치는 표 2에 나타내었다.

구분		pmol MDA/mg protein
대조군		319.80 ± 8.34
t-BHP		488.62 ± 6.29
t-BHP + 메이스리그난 (μM)	0.5	480.57 ± 4.15
	1	415.05 ± 4.58
	2.5	367.91 ± 7.09
	5	354.29 ± 5.92

상기 표 2에서 보는 바와 같이, t-BHP에 의해 지질과산화가 유발됨을 알 수 있으며, 이러한 산화적 스트레스에 의한 지질과산화는 메이스리그난에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.

<실시예 5> t -BHP에 의한 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 과다 생성 억제 효과

세포내 ROS의 양은 DCFH-DA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate) 시약을 이용하여 측정하였다(Wang H. et al., Free Radic. Biol. Med., 27:612-616, 1999). 이는 DCFH-DA가 세포내 ROS의 작용에 의해 형광을 띠는 DCF(2',7'-dichlorofluorescein)로 산화되는 원리를 이용하는 것이다. 96-웰 플레이트에 HepG2 세포를 1.5 × 10⁵ cells/㎖이 되도록 분주하여 24 시간 배양했다. 첫 번째 군은 t-BHP 150μM을 처리하여 세포내 ROS 생성을 과 유발시켰으며, 두 번째 군은 메이스리그난의 ROS 소거능을 알아보기위해 독성물질 투여 전에 메이스리그난을 농도별(0.5, 1, 2.5, 5 μM)로 처리하였다. 이와 같이 처리된 각 웰에 DCFH-DA 시약을 5 μM이 되도록 투여하여 4 시간 배양 후 형광도를 측정한 결과는 도 10과 같다. 반응 시간에 따른 ROS 생성 억제능을 알아보기 위해 위와 같이 처리된 세포를 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 배양후 각각 형광도를 측정하였으며 그 결과는 도 11에 나타내었다.

t-BHP를 투여하여 ROS 생성을 촉진하였을 때 증가한 형광도는 메이스리그난을 처리함으로써 그 수치가 감소하여 메이스리그난 5 μM을 처리하였을 때 ROS 발생을 50% 정도 낮추는 것을 알 수 있다. 반응시간별 ROS 측정 결과에서도 알 수 있듯이 메이스리그난은 ROS 생성을 효과적으로 억제하였다. 위의 결과는 메이스리그난이 ROS에 의해 발생하는 산화적 스트레스를 예방할 수 있는 항산화제로 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

<실시예 6> t -BHP에 의한 DNA 손상 억제 효과

독성물질이 유발하는 DNA 손상은 코멧 분석(comet assay)을 이용하여 측정하였다(Singh N.P. et al., Exp. Cell Res., 175:184-191, 1988). HepG2 세포를 6-웰 플레이트에 분주하여 24 시간 배양하고 메이스리그난(0.5, 1, 2.5, 5 μM) 및 t-BHP (200 μM)를 처리하여 2 시간 배양한 후 세포를 수집한다. 아가로즈젤(agarose gel)로 코팅된 슬라이드 위에 세포 현탁액을 골고루 분산되게 한 후 커버 글라스로 덮어 냉장고에 보관한다. 젤이 굳으면 커버 글라스를 벗기고 슬라이드를 세포 파쇄액(2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris, 1% Triton X-100)에 1시간동안 담가둔다. 세포 파쇄 후 슬라이드를 전기영동 탱크에 배열하고 전기영동 버퍼(300mM NaOH, 1mM EDTA)를 채워 25V/300mA로 20 분간 전기영동한다. 전기영동이 끝난 후 중성버퍼(0.4M Tris)로 충분히 세척한 후 ethidium bromide로 염색하여 형광현미경에서 관찰하고 소프트웨어를 이용하여 컴퓨터 상에서 분석한다. DNA 손상의 정도는 comet tail의 DNA양을 분석하여 손상의 정도에 따라 다섯 그룹(no damage,<5%; low level damage,5-20%; medium level damage,20-40%; high level damage,40-95%; total damage,>95%)으로 나누어 평가하였다(Anderson D. et al., Mutat. Res., 307:261-271, 1994).

그 결과 도 12에서 보는 것과 같이 독성물질 투여는 세포의 DNA 손상을 촉발하였으며 메이스리그난은 이러한 DNA 손상을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이는 메이스리그난이 간세포 손상을 효과적으로 회복시킬 수 있음을 나타낸다.

<실시예 7> 간독성 해소 효과( in vivo )

생후 6주된 25~30g의 실험용 아이씨알 마우스(ICR mouse)에 메이스리그난을 콘오일(corn oil)에 50, 100, 200 mg/kg으로 녹여 4일 동안 경구 투여하였다. 마지막 메이스리그난 투여 후 3시간이 지난 후에 생리식염수에 희석시킨 t-BHP를 1.8 mmol/kg으로 복강 투여하여 간 손상을 유발시킨 다음, 16시간 후에 쥐를 이산화탄소로 마취 후 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다.

간손상시 혈액으로 유리되어 나오는 알라닌 아미노 트랜스퍼라제(alanine aminotransferase: ALT)와 아스파테이트 아미노 트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase: AST)의 양을 아산제약 키트를 사용하여 라이트만(Reitman)-프랭클(Frankel)의 방법(Reitman et al., Am. J. Cli. Pathol., 28:56-63, 1957)으로 측정하였다. 간략히 설명하면, 심장으로부터 채취한 혈청을 기질액과 37℃에서 30분 동안 반응시켜 피루빅산(pyruvate)을 생성시킨 후 발색 시약을 넣고 20분후 0.4 N-수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콘오일과 생리식염수만 처리한 그룹을 대조군으로 사용하였으며 그 결과를 표 3에 나타내었다.

구분		ALT(U/L)	AST(U/L)
대조군		51 ± 11	161 ± 20
t-BHP		132 ± 24	487 ± 19
t-BHP + 메이스리그난	50 mg/kg	104 ± 17	374 ± 22
	100 mg/kg	88 ± 21	301 ± 38
	200 mg/kg	69 ± 16	244 ± 18

표 3에서 보는 바와 같이, t-BHP 처리군에 비하여 메이스리그난을 처리한 경우 ALT와 AST의 값이 크게 감소한 것을 알 수 있다. 이는 in vivo 실험에서도 메이스리그난의 처리가 간손상의 억제에 효과적으로 작용하고 있다는 것을 의미한다.

<실시예 8> 에탄올 추출물의 간독성 해소 효과

건조 분쇄한 육두구 100 g에 에탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 에탄올 추출물(6 g)을 제조하였다. 상기 제조된 에탄올 추출물을 DMSO에 녹여 5% stock solution을 만들었으며 이를 배지로 희석시켜 알맞은 농도로 사용하였다.

사람 간세포인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 1.5 × 10⁵ cells/㎖로 맞추어 분주하여 24 시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 배양된 세포에 에탄올 추출물 stock solution을 50 ppm으로 희석하여 처리한 후 30 분 동안 배양하고 t-BHP(150μM)를 투여하여 세포독성을 유발하였다. 위와 같이 처리된 세포를 24 시간 동안 배양한 후 세포 독성 및 세포 생존 정도를 알아보기 위해 엠티티(MTT) 분석법(Hansen M.B. et al., J. Immunol. Methods., 119: 119-203, 1989)을 사용하였다. 각 시료가 투여된 배지를 DPBS로 교체한 후 2 ㎎/㎖로 조제된 엠티티 시약을 첨가해주고 4 시간동안 세포배양기에서 배양하였다. 엠티티 시약을 제거한 후 플레이트의 각 웰에 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan)을 용해시켜 엘라이자(ELISA, enzyme-linked immunoadsorbent assay) 분석기로 570 nm에서 측정하였다.

아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포생존율을 100%로 하였을 때 t-BHP 처리군과 에탄올 추출물 처리군의 세포 생존율은 각각 62%와 84%로 나타났다. 이는 육두구의 에탄올 추출물이 독성물질에 의한 간세포 손상에 대해 우수한 보호활성을 갖는 것을 의미한다.

<실시예 9> 헥산 추출물의 간독성 해소 효과

건조 분쇄한 육두구 100 g에 헥산 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 헥산 추출물(14 g)을 제조하였다. 상기 제조된 헥산 추출물을 DMSO에 녹여 5% stock solution을 만들었으며 이를 배지로 희석시켜 알맞은 농도로 사용하였다.

사람 간세포인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 1.5 × 10⁵ cells/㎖로 맞추어 분주하여 24 시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 배양된 세포에 헥산 추출물 stock solution을 50 ppm으로 희석하여 처리한 후 30 분 동안 배양하고 t-BHP(150μM)를 투여하여 세포독성을 유발하였다. 위와 같이 처리된 세포를 24 시간 동안 배양한 후 세포 독성 및 세포 생존 정도를 알아보기 위해 엠티티(MTT) 분석법(Hansen M.B. et al., J. Immunol. Methods., 119: 119-203, 1989)을 사용하였다. 각 시료가 투여된 배지를 DPBS로 교체한 후 2 ㎎/㎖로 조제된 엠티티 시약을 첨가해주고 4 시간동안 세포배양기에서 배양하였다. 엠티티 시약을 제거한 후 플레이트의 각 웰에 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan)을 용해시켜 엘라이자(ELISA, enzyme-linked immunoadsorbent assay) 분석기로 570 nm에서 측정하였다.

아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포생존율을 100%로 하였을 때 t-BHP 처리군과 헥산 추출물 처리군의 세포 생존율은 각각 62%와 76%로 나타났다. 이는 육두구의 헥산 추출물이 독성물질에 의한 간세포 손상에 대해 우수한 보호활성을 갖는 것을 의미한다.

미리스티카 프라그란스로부터 분리된 본 발명의 메이스리그난은 단독 또는 약제적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제 및 주사제 등과 같은 제제형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 하기에 제제예를 예시하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제의 실시예>

<제제예 1> 산제의 제조

실시예 1 화합물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

실시예 1 화합물 100 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조한다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

실시예 1 화합물 100 mg

옥수수 전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

<제제예 1> 주사제의 제조

실시예 1 화합물 100 mg

주사용 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조 방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 전체를 주사용 증류수로 2 ml 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조한다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 메이스리그난은 t-BHP와 같은 독성물질에 의해 간독성이 유발되었을 때 효과적으로 간세포를 회복시킬 수 있으며, 따라서 간질환 예방제 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (2)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 메이스리그난(macelignan)을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 간독성 예방 및 치료용 약학적 조성물

   <화학식 1>

   
2. 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans) 추출물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 간독성 예방 및 치료용 약학적 조성물

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