KR100646574B1 - 항암제로 유발되는 독성의 억제제 및 이를 함유하는 항암제조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제로 유발되는 간독성 및 신장독성을 억제할 수 있는 억제제 및 이를 함유하는 항암제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1의 메이스리그난(macelignan) 및 육두구 추출물은 항암제 투여로 발생되는 간독성 및 신장독성을 억제하는 데 뛰어난 효과를 나타낸다.

[화학식 1]

메이스리그난, 육두구, 시스플라틴, 간독성, 신장독성

Description

항암제로 유발되는 독성의 억제제 및 이를 함유하는 항암제 조성물{Suppressant of toxicity induced by cancer chemotherapheutic agent and composition of cancer chemotherapeutic agent containing the same}

도 1은 육두구로부터 메이스리그난(macelignan)을 분리하는 공정도이다.

도 2는 메이스리그난의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 메이스리그난의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 4는 메이스리그난의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 5는 메이스리그난의 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼이다.

도 6은 메이스리그난의 EI-Mass 스펙트럼이다.

도 7은 메이스리그난의 화학구조식이다.

도 8은 시스플라틴 투여에 의해 유발된 혈액 내 ALT 상승에 대한 메이스리그난의 억제효과를 보여주는 그래프이다.

도 9는 시스플라틴 투여에 의해 유발된 혈액 내 AST 상승에 대한 메이스리그난의 억제효과를 측정한 그래프이다

도 10은 시스플라틴에 의해 증가한 p-JNK 단백질 발현 및 메이스리그난의 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 11은 시스플라틴 처리에 따른 p-ERK 단백질 발현 증가와 메이스리그난의 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 12는 시스플라틴 투여에 의한 요소 질소의 증가와 메이스리그난의 억제효과를 측정한 그래프이다.

도 13은 시스플라틴 투여에 의한 크레아티닌의 증가와 메이스리그난의 억제효과를 측정한 그래프이다.

본 발명은 육두구로부터 분리된 항암제 독성 억제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1로 표시되는 메이스리그난(macelignan) 및 육두구 추출물은 항암제인 시스플라틴 투여로 발생되는 간독성 및 신장독성을 억제하는 데 뛰어난 효과를 나타낸다.

[화학식 1]

세계보건기구 산하 기구인 국제암연구소(IARC: International Agency of Research on Cancer)의 자료에 의하면 전 세계적으로 매년 629만 명이 암으로 사망하고 1,010만 명이 새롭게 암에 걸린다고 한다. 우리나라의 경우도 암으로 인한 사망이 사망원인의 1위를 차지하고 있으며 다른 주요 사망원인에 의한 사망은 감소하고 있는 반면 암으로 인한 사망은 지속적으로 증가추세에 있다. 암을 치료하는 방법은 크게 수술요법, 항암화학요법, 방사선 치료 세 가지로 구분된다. 가장 많이 사용되고 있는 치료방법 중 하나인 항암화학용법은 정상세포의 과도한 파괴 없이 암세포를 파괴하는 것이 그 목적이나 사용량이나 민감도에 따라 정상세포에 독성을 유발하는 부작용을 나타낼 수 있다.

대표적인 백금계 항암제인 시스플라틴(cis-diamminedichloroplatinum [II])은 난소암, 폐암, 고환암 등의 치료에 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55:2303-2315, 1985). 그러나 시스플라틴은 약물의 제한된 함량 이상에서 청각상실, 신경독성, 신장독성과 같은 부작용을 나타내며, 고농도 투여 시 간독성이 발생한다는 임상 보고가 있다(Cerosimo R.J., Ann. Pharm., 27:438-441; Cavalli F. et al., Cancer Treat. Rep., 62:2125-2126, 1978). 따라서 항암제 치료로 인한 부작용을 감소시키고 치료 효율을 높이기 위해서는 항암제 투여에 따른 독성을 완화시킬 수 있는 억제제의 개발이 필요하다.

천연물로부터 인간의 질병을 예방·치료할 수 있는 신물질의 탐색은 과거부터 많은 과학자들의 연구대상이 되어왔다. 이와 같은 천연 자원의 개발로 현재 사용되고 있는 의약품의 50% 이상이 천연물로부터 유래되었으며 미국 FDA로부터 승인된 의약품이 120종으로 시장규모는 약 10조 달러에 이르고 있다. 항 독성 활성을 갖는 천연물의 탐색 및 개발도 많이 이루어지고 있으나 실제 치료제로 사용 중이거나 임상시험을 거친 예는 소수에 불과하다(Thabrew M. Ira et al., Phytother. Res., 10:461-467, 1996).

미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)는 열대지방에서 재배되는 다년생 식물로서 메이스(mace)나 육두구(nutmeg)로 알려진 이것의 과실은 오래전부터 향신료로 이용되어 왔다. 메이스리그난은 미리스티카 프라그란스에서 발견되는 대표적인 리그난계 화합물로(Tuchinda P. et al., Phytochemistry, 59:169-173, 2002) 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 카스파제(caspase)-3 활성 증진작용(Park B.Y. et al., Biol. Pharm. Bull., 27:1305-1307, 2004), 항균활성(Chung J.Y., MS thesis, Yonsei University, 2004) 등이 보고되었다. 그러나 메이스리그난의 항 간독성, 신장독성 작용 및 그 용도에 대해서는 연구 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 여러 종류의 천연물을 대상으로 하여 항암제가 유발하는 독성의 억제제를 탐색한 결과, 육두구 추출물로부터 분리·정제된 메이스리그난이 항 간독성 및 신장독성 활성을 나타낸다는 것을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항암제로 유발되는 독성의 억제제 및 이를 함유하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 메이스리그난(macelignan) 및 육두구 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제로 유발된 독성의 억제제를 제공한다.

[화학식 1]

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 있어서 독성을 유발하는 항암제로는 시스플라틴(cis-diamminedichloroplatinum [II]), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 네다플라틴(nedaplatin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 백금계 항암제를 들 수 있다.

본 발명은 육두구 추출물 및 같은 식물로부터 분리·정제된 리그난계 화합물의 신규한 용도를 제공하는 데 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 메이스리그난은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명의 메이스리그난은 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)로부터 분리·정제될 수 있다. 바람직하게는 육두구(nutmeg)나 가종피(aril)로부터 분리·정제될 수 있다. 또한 다른 육두구과 식물인 미리스티카 아르겐티아 워르브(Myristica argentea Warb) 등에서도 분리·정제될 수 있으며(Filleur F. et al., Nat. Prod. Lett., 16:1-7, 2002), 후박나무(Machilus thunbergii)(Park B. Y. et al., Bio. Pharm. Bull., 27:1305-1307, 2004), 레우카스 아스페라(Leucas aspera)에서도 분리·정제될 수 있다(Sadhu S. K. et al., Chem. Pharm. Bull., 51:595-598, 2003).

본 발명의 메이스리그난은 통상의 추출 및 분리방법에 의하여 수득할 수 있는데, 먼저, 건조시킨 육두구를 4배 내지 5배의 추출 용매와 함께 추출장치에 넣고 이틀 동안 방치하여 추출하고 이를 농축기로 농축 및 건조하여 추출물을 얻는다. 본 발명에 있어 분리를 위한 추출 용매로는 물 또는 C1-C6의 유기용매를 사용할 수 있으며 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 메탄올 또는 헥산을 사용할 수 있다. 상기와 같이 얻어진 추출물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 극성에 따른 분획물을 얻고 분리된 특정 분획물을 다시 역상 컬럼 크로마토그래피법 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)법을 통하여 메이스리그난을 분리할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 본 발명의 메이스리그난은 순수하게 분리·정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 기재한 바와 같은 미리스티카 프라그란스의 종자, 과실 또는 가종피 추출물이나 미리스티카 프라그란스의 종자를 압착하여 얻은 오일의 형태로 사용될 수도 있다. 상기 추출물은 상기한 바와 같이 미리스티카 프라그란스를 물 또는 C1-C6의 유기용매로 추출하여 얻을 수 있다. 바람직하게는 미리스티카 프라그란스의 종자, 즉 육두구 추출물일 수 있다.

상기와 같은 분리 공정을 통하여 얻어진 메이스리그난 및 육두구 추출물에 대해 간독성 및 신장독성 해소 실험을 실시한 결과 메이스리그난 및 추출물은 시스플라틴이 야기하는 독성을 유의적으로 억제하였다. 이와 같은 억제효과는 항암제에 의해 생성된 활성산소종이 정상세포에 작용하는 것을 억제하기 때문으로 여겨지며 이는 메이스리그난 및 육두구 추출물이 항암제 투여에 의한 간과 신장 손상 억제제로 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.

대표적인 백금계 항암제인 시스플라틴 투여에 의해 유발된 독성에 대한 메이스리그난 및 육두구 추출물의 독성 억제효과 검증 방법은 다음과 같다.

시스플라틴을 투여한 생쥐와 항암제 투여 전 메이스리그난 및 육두구 추출물을 경구 투여한 생쥐에서 혈액과 간을 샘플링하여 간독성 및 신장독성과 관련된 생화학적 지표(biochemical marker)를 측정하였다. 아미노기 전달효소는 간장에서 활성이 높고 간세포 손상이 유발되었을 때 간에서 유리되어 혈액 내 그 수치가 상승한다. 시스플라틴만을 복강 투여한 생쥐에서 ALT(alaine aminotransferase)와 AST(aspartate aminotransferase)의 수치가 크게 증가하였으며, 메이스리그난을 투여한 군에서는 그 수치가 유의성 있게 감소하였다(도 8,9 참조).

시스플라틴으로 인해 독성이 유발되면 mitogen-activated protein kinase(MAPK)가 활성화되는 것으로 알려져 있다(Diane L. et al., Clin. Cancer Res., 5:1007-1014, 1999; Wang X. et al., J. Biol. Chem., 15:39435-39443, 2000). 특히 생쥐에 시스플라틴을 투여하여 간독성이 유발될 경우 c-Jun N-terminal kinase 1/2(JNK1/2)와 extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)의 활성화된 형태인 p-JNK1/2와 p-ERK1/2의 단백질 발현이 증가하는 것으로 보고되고 있다(Hong K.O. et al., Arch. Toxicol., 79:231-236, 2005). 시스플라틴을 투여하는 경우 간에서의 p-JNK1/2 및 p-ERK1/2의 단백질 발현이 증가함을 확인하였으며, 메이스리그난을 시스플라틴 투여 전 경구 투여함으로써 그 발현정도를 감소시킬 수 있었다(도 10, 11 참조).

신장독성이 유발되면 신장 기능의 저하로 여과되지 못한 요소질소(urea nitrogen)와 크레아티닌(creatinine) 수치가 증가하게 된다. 시스플라틴 투여 전 메이스리그난을 투여하였을 때 시스플라틴만 투여한 그룹에 비해 혈중 요소질소와 크레아티닌 함량이 유의적으로 감소함을 확인하였다(도 12,13 참조).

또한, 메이스리그난을 포함하고 있는 육두구 추출물을 투여한 그룹에서도 혈중 ALT와 AST를 감소시키는 효과를 나타내었으며(표 1 참조), 시스플라틴에 의한 요소 질소 및 크레아티닌 수치의 증가를 유의적으로 억제함을 알 수 있었다(표 2 참조).

이와 같은 결과로부터, 메이스리그난 및 육두구 추출물은 항암제 투여로 인하여 발생하는 간독성, 신장독성과 같은 부작용을 억제하는데 뛰어난 효과를 나타내며, 메이스리그난의 간독성 억제 작용은 MAP kinase signaling pathway의 활성화 억제와 관련이 있음을 알 수 있다.

간독성 및 신장독성 억제 목적으로 임상적으로 투여되는 경우에 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 단위투여형의 약제학적 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 메이스리그난에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 메이스리그난을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 메이스리그난의 투여량은 백금계 항암제의 종류 및 투여량, 투여기간 등에 따라 시스플라틴 총 투여 중량 대비 약 0.01배 내지 10배 중량이 투여되는 것이 바람직하며, 약 0.1배 내지 5배 중량이 투여되는 것이 더욱 바람직하다. 메이스리그난은 항암제 투여 전 또는 후에 단독으로 투여할 수 있으며, 항암제와 혼합하여 항암제 조성물로서 함께 투여할 수도 있다.

본 발명의 메이스리그난을 래트에 경구 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/kg 이상인 것으로 나타났다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들로만 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예의 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 통계적 분석은 ANOVA 분석법(Scheff test)을 사용하여 P value가 0.05 이하이면 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

<실시예 1> 육두구로부터 메이스리그난의 분리 및 정제

<1-1> 메이스리그난의 분리 및 정제

건조 분쇄한 육두구 100 g에 75% 메탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 메탄올 추출물(7 g)을 제조하였으며, 상기 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획하였다. 에틸아세테이트 분획물(4.2 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 헥산과 에틸아세테이트를 10:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜 분획물 Ⅲ(1 g)를 얻었다. 분획물 Ⅲ를 헥산과 에틸아세테이트 20:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 컬럼 크로마토그래피하여 분획물 Ⅲ-B(0.52 g)을 얻었다. 이후, 분획물 Ⅲ-B를 Rp-18 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 80% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획 Ⅲ-B-2(0.5 g)을 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 1에 나타내었다.

<1-2> 구조분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 600 MHz 와 150 MHz(용매: DMSO)에서 측정하였다. 그 결과를 도 2와 도 3에 각각 나타내었다. ¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹H-¹H의 상관관계와 ¹H-¹³C의 상관관계를 측정하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼과 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 4와 도 5에 각각 나타내었다. ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC의 결과를 종합적으로 분석하여 표 1에 나타내었다.

Position	13C-NMR	1H-NMR	1H-1H COSY	1H-13C HMBC
1	135.4
2	109.2	6.72 brs		C-7, C-6, C-4, C-3
3	147.3
4	145.1
5	107.9	6.79 d(7.8)	6.61	C-6, C-4, C-3, C-1
6	121.7	6.61 dd(7.8)	6.79	C-7, C-5, C-4, C-2, C-1
7	38.2	2.23 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.23	C-8, C-6, C-2, C-1 C-9, C-8, C-6, C-2, C-1
8	38.7	1.64 brs	0.75, 2.23, 2.66	C-7
9	16.0	0.75 d(6.3)	1.64	C-8, C-7
1'	132.4
2'	112.9	6.66 brs		C-7', C-6', C-4', C-3'
3'	147.1
4'	144.4
5'	115.2	6.66 d(7.9)	6.53	C-6', C-4', C-3', C-1'
6'	121.0	6.53 d(7.9, 1.1)	6.66	C-7', C-5', C-4', C-2', C-1'
7'	38.0	2.17 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.17	C-8', C-6', C-2', C-1' C-9', C-8', C-6', C-2', C-1'
8'	38.7	1.64 brs	0.75, 2.17, 2.66	C-7'
9'	16.1	0.75 d(6.3)	1.64	C-8', C-7'
OMe	55.5	3.72(s)
O-CH2-O	100.6	5.95 d(4.8)		C-3, C-4

<1-3> 질량분석

상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 EI/MS의 결과를 도 6에 나타내었다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]⁺가 m/z 328에서 관측되어 분자량이 328로 판명되었고, 분자식은 C₂₀H₂₄O₄이었다.

<1-4> 비선광도 측정

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2 20mg을 클로로포름(CHCl₃) 2ml에 녹인 후 Polarimeter(Automatic Polarimeter, APⅢ-589, Rodulph, NJ, USA)로 비선광도([α]_D) 값을 측정한 결과 [α]_D = +4.0 (CHCl₃, c=1.0)으로 나타났다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC, EI/MS 및 [α]_D 에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Woo, W.S. et al., Phytochemistry, 26: 1542-1543, 1987)를 비교 분석하여 동정한 결과, 분리된 단일 물질은 도 7로 표시되는 메이스리그난(macelignan)인 것으로 확인되었다.

<실시예 2> 메이스리그난의 독성 해소 효과

<2-1> 간독성 혈청 생화학적 지표의 측정

실험 군당 10마리의 실험용 ICR 생쥐(수컷, 6주령)를 사용하였다. 생쥐에 상기 실시예 1에서 분리 정제한 메이스리그난(25mg/kg, 50mg/kg, in corn oil)을 4일 동안 경구 투여하였으며 마지막 경구 투여 3시간 후에 PBS 버퍼에 녹인 시스플라틴(45mg/kg)을 복강 주사하였다. 16시간 후에 CO₂ gas로 마취시킨 후 혈액과 간을 샘플링 하였다.

생쥐에서 샘플링한 혈액에서 혈청을 분리하여 혈청 내 aminotransferase 활성을 측정하였다. 간손상시 혈액으로 유리되어 나오는 ALT(alanine aminotransferase)와 AST(aspartate aminotransferase)의 양을 아산제약 키트를 사용하여 라이트만(Reitman)-프랭클(Frankel)의 방법(Reitman et al., Am. J. Cli. Pathol., 28:56-63, 1957)으로 측정하였다. 간략히 설명하면, 혈청을 기질액과 37℃에서 30분 동안 반응시켜 피루빅산(pyruvate)을 생성시킨 후 발색 시약을 넣고 20분후 0.4 N-수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콘오일과 생리식염수만 처리한 그룹을 대조군으로 사용하였다.

도 8과 도 9에 나타낸 바와 같이 메이스리그난을 경구 투여 하였을 경우 ALT, AST 모두 시스플라틴 투여 그룹에 비해 그 수치가 유의적으로 감소하였다. 이는 메이스리그난이 항암제가 유발하는 간독성에 대해 뛰어난 억제효과를 갖는 다는 것을 시사한다.

<2-2> c-Jun N-terminal kinase(JNK) 활성화에 대한 영향 평가

메이스리그난 및 시스플라틴을 투여한 생쥐의 간 조직을 액체 질소하에서 분말화하고 lysis 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1.0% Triton X-100. 0.25% Deoxycholate, 1 mM EDTA, 1mM PMSF)를 가하여 세포를 파쇄하였다. 이렇게 얻어진 균질액을 12000 rpm 15분 동안 원심분리하여 단백질 층을 얻었으며, 웨스턴 블럿(western blot) 방법을 이용하여 MAP kinase 단백질의 발현정도를 측정하였다. 50 μg의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 주입하여 전기영동한 후 nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. Membrane을 blocking solution(5% skim milk, 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 1시간 반응시켜 nonspecific binding을 배제한 후 JNK1/2 및 p-JNK1/2 단백질의 primary antibody를 넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. Blocking solution을 이용하여 10분간 3번 씻어준 후 secondary antibody를 넣고 1시간 반응시키고 위와 같은 방법으로 세척하였다. ECL 용액을 가한 membrane을 X-ray film에 노출시킨 후 단백질 변화량을 확인하였다. 변화량은 image analyzer를 이용하여 광학밀도(optical density)로 산출하였다.

도 10에서 보는 바와 같이, MAP kinase signaling pathway의 하위 kinase 중 하나인 JNK1/2 단백질 발현 수준을 관찰한 결과 활성화 이전의 kinase 단백질 발현에는 시스플라틴과 메이스리그난 투여에 의한 영향이 없는 것으로 나타났다. 그러나 활성형인 인산화 형태의 kinase 발현 정도를 알아본 결과, 시스플라틴을 투여한 그룹에서 p-JNK1/2 단백질 발현이 증가하였으며 메이스리그난 투여에 의하여 활성형 kinase의 발현이 억제됨을 알 수 있다. 이는 시스플라틴의 간독성 작용이 JNK 활성화에 기인하는 것으로 설명할 수 있으며, 메이스리그난이 이러한 시스플라틴의 작용을 억제하여 독성 유발을 저해하는 것을 의미한다.

<2-3> Extracellular signal-regulated kinase(ERK) 활성화에 대한 영향 평가

메이스리그난 및 시스플라틴을 투여한 생쥐의 간 조직을 액체 질소하에서 분말화하고 lysis 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1.0% Triton X-100. 0.25% Deoxycholate, 1 mM EDTA, 1mM PMSF)를 가하여 세포를 파쇄하였다. 이렇게 얻어진 균질액을 12000 rpm 15분 동안 원심분리하여 단백질 층을 얻었으며, 웨스턴 블럿(western blot) 방법을 이용하여 MAP kinase 단백질의 발현정도를 측정하였다. 50 μg의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 주입하여 전기영동한 후 nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. Membrane을 blocking solution(5% skim milk, 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 1시간 반응시켜 nonspecific binding을 배제한 후 ERK1/2 및 p-ERK1/2 단백질의 primary antibody를 넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. Blocking solution을 이용하여 10분간 3번 씻어준 후 secondary antibody를 넣고 1시간 반응시키고 위와 같은 방법으로 세척하였다. ECL 용액을 가한 membrane을 X-ray film에 노출시킨 후 단백질 변화량을 확인하였다. 변화량은 image analyzer를 이용하여 광학밀도(optical density)로 산출하였다.

도 11에 나타낸 것과 같이 MAP kinase signaling pathway의 하위 kinase 중 하나인 ERK1/2 단백질 발현 수준을 관찰한 결과 활성화 이전의 ERK 단백질 발현에는 시스플라틴과 메이스리그난 투여에 의한 영향이 없는 것으로 나타났다. 그러나 활성형인 인산화 형태의 kinase 발현 정도를 알아본 결과, 시스플라틴을 투여한 그룹에서 p-ERK1/2의 단백질 발현이 증가하였으며 메이스리그난 투여에 의하여 활성형 kinase의 발현이 억제됨을 알 수 있다. 이는 시스플라틴의 간독성 작용이 ERK의 활성화와 관련 있다는 것을 나타내며 메이스리그난이 이러한 시스플라틴의 작용을 억제하여 독성 유발을 저해하는 것을 의미한다.

<2-4> 신장독성 혈청 생화학적 지표의 측정

상기 실시예 2-1에서 샘플링한 혈청을 이용하여 요소 질소(urea nitrogen)와 크레아티닌(creatinine) 수치를 측정하였다. 요소 질소의 양은 blood urea nitrogen 측정용 키트를 사용하여 Fawcett 등의 방법으로 정량하였다(Fawcett J.K. et al., J. Clin. Pathol., 13:156-159, 1960). 요소의 가수분해 시 생성되는 암모니아의 양을 발색반응을 통하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 크레아티닌(creatinine)의 함량은 Labbe 등의 방법을 이용하여 크레아티닌 대사물에 alkaline picrate 처리 시 나타나는 노란색 반응물을 500 nm에서 측정하여 정량하였다(Labbe D. et al., Ann. Biol. Clin., 54:285-298, 1996).

도 12과 도 13에 나타낸 바와 같이 시스플라틴을 투여하기 전에 메이스리그난을 4일 동안 투여하였을 때 시스플라틴만 투여한 그룹보다 혈중 요소질소의 함량이 유의적으로 감소하였다. 또한, 시스플라틴을 처리한 그룹에서 크레아티닌 수치가 크게 증가한 반면 메이스리그난을 경구투여 하였을 때 크레아티닌 양이 현저히 감소함을 알 수 있다. 이러한 결과는 메이스리그난이 과량의 시스플라틴 투여에 의한 신장 독성을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다.

<실시예 3> 육두구 주정 추출물의 독성 해소 효과

<3-1> 간독성 혈청 생화학적 지표의 측정

건조 분쇄한 육두구 100 g에 주정 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 주정 추출물(6 g)을 제조하였다. 실험용 ICR 생쥐(수컷, 6주령)에 육두구 주정 추출물(50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, in corn oil)을 4일 동안 경구 투여하였으며 마지막 경구 투여 3시간 후에 PBS 버퍼에 녹인 시스플라틴(45 mg/kg)을 복강 주사하였다. 16시간 후에 CO₂ gas로 마취시킨 후 혈액을 샘플링 하였다.

생쥐에서 샘플링한 혈액에서 혈청을 분리하여 혈청 내 aminotransferase 활성을 측정하였다. 간손상시 혈액으로 유리되어 나오는 ALT(alanine aminotransferase)와 AST(aspartate aminotransferase)의 양을 아산제약 키트를 사용하여 라이트만(Reitman)-프랭클(Frankel)의 방법(Reitman et al., Am. J. Cli. Pathol., 28:56-63, 1957)으로 측정하였다. 간략히 설명하면, 혈청을 기질액과 37℃에서 30분 동안 반응시켜 피루빅산(pyruvate)을 생성시킨 후 발색 시약을 넣고 20분후 0.4 N-수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콘오일과 생리식염수만 처리한 그룹을 대조군으로 사용하였으며 그 결과를 표 2에 나타내었다.

Group	ALT(U/L)	AST(U/L)
대조군	38.2 ± 5.1	148.1 ± 23.2
시스플라틴 투여군(45 mg/kg)	166.4 ± 61.7	348.0 ± 102.5
시스플라틴 + 추출물(50 mg/kg)	152.0 ± 43.5	225.3 ± 23.3*
시스플라틴 + 추출물(100 mg/kg)	135.6 ± 27.8	223.2 ± 68.0*
시스플라틴 + 추출물(200 mg/kg)	122.3 ± 25.0*	203.4 ± 64.3*

*p<0.05

상기 표 2에 나타난 바와 같이 시스플라틴을 복강 주사하기 전 4일 동안 육두구 주정 추출물을 경구 투여한 생쥐에서 혈청 ALT와 AST 수치가 유의적으로 감소하였다. 이는 육두구 추출물이 항암제가 유발하는 간독성에 대해 뛰어난 억제효과를 갖는 다는 것을 의미한다.

<3-2> 신장독성 혈청 생화학적 지표의 측정

상기 실시예 3-1에서 샘플링한 혈청을 이용하여 요소 질소(urea nitrogen)와 크레아티닌(creatinine) 수치를 측정하였다. 요소 질소의 양은 blood urea nitrogen 측정용 키트를 사용하여 Fawcett 등의 방법으로 정량하였다(Fawcett J.K. et al., J. Clin. Pathol., 13:156-159, 1960). 요소의 가수분해 시 생성되는 암모니아의 양을 발색반응을 통하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 크레아티닌(creatinine)의 함량은 Labbe 등의 방법을 이용하여 크레아티닌 대사물에 alkaline picrate 처리 시 나타나는 노란색 반응물을 500 nm에서 측정하여 정량하였다(Labbe D. et al., Ann. Biol. Clin., 54:285-298, 1996). 요소 질소와 크레아티닌 정량 결과를 표 3에 나타내었다.

Group	요소 질소(mg/dl)	크레아티닌(mg/dl)
대조군	22.3 ± 1.5	0.46 ± 0.3
시스플라틴 투여군(45 mg/kg)	148.6 ± 20.5	3.9 ± 1.2
시스플라틴 + 추출물(50 mg/kg)	127.2 ± 18.3	3.8 ± 0.9
시스플라틴 + 추출물(100 mg/kg)	113.8 ± 20.7*	2.4 ± 1.6
시스플라틴 + 추출물(200 mg/kg)	84.6 ± 10.9**	1.1 ± 0.4*

*p<0.05, **p<0.01

상기 표 3에 나타낸 바와 같이 시스플라틴 투여에 의해 요소 질소와 크레아티닌 수치가 크게 상승하였으며 육두구 추출물을 4일 동안 경구 투여한 그룹에서 그 수치가 유의적으로 감소함을 알 수 있다. 이러한 결과는 메이스리그난을 포함한 육두구 추출물이 시스플라틴 투여에 의해 발생한 신장 독성을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다.

육두구로부터 분리된 본 발명의 메이스리그난은 단독 또는 약제적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제 및 주사제 등과 같은 제제형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 하기에 제제예를 예시하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제의 실시예>

<제제예 1> 산제의 제조

실시예 1 화합물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

실시예 1 화합물 100 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조한다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

실시예 1 화합물 100 mg

옥수수 전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

<제제예 1> 주사제의 제조

실시예 1 화합물 100 mg

주사용 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조 방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 전체를 주사용 증류수로 2 ml 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조한다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 메이스리그난 및 육두구 추출물은 항암제 투여에 의해 유발되는 간독성 및 신장독성을 효과적으로 억제하므로, 항암제로 인한 독성의 억제제 및 항암제 조성물로서 사용할 경우 항암제 단독 투여에 의한 부작용을 줄일 수 있다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 메이스리그난(macelignan)을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 항암제로 유발되는 독성의 억제제

   [화학식 1]

   
2. 육두구 추출물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 항암제로 유발되는 독성의 억제제
3. 제1항 및 제2항에 있어서, 상기 항암제로 유발되는 독성은 간독성 또는 신독성인 것을 특징으로 하는 항암제 독성의 억제제.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cis-diamminedichloroplatinum [II]), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 백금계 항암제인 것을 특징으로 하는 독성의 억제제
5. 상기 항암제로 유발되는 독성을 억제하기 위한 유효성분으로 메이스리그난(macelignan)을 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물
6. 상기 함암제로 유발되는 독성을 억제하기 위한 유효성분으로 육두구 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cis-diamminedichloroplatinum [II]), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 백금계 항암제인 것을 특징으로 하는 독성의 억제제

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