CN109336891B

CN109336891B - 5-（呋喃-2’-羰基）-2,3-二氢-1h-吡咯嗪-7-羧酸及其衍生物

Info

Publication number: CN109336891B
Application number: CN201811407790.XA
Authority: CN
Inventors: 孙敬勇; 孙皓熠; 杜成林; 牟艳玲; 潘腾; 邓琦; 段希萌
Original assignee: Institute Of Materia Medica Shandong Academy Of Medical Sciences (shandong Anti-Aging Research Center Shandong New Technology Pharmaceutical Research Institute)
Current assignee: Institute Of Materia Medica Shandong Academy Of Medical Sciences (shandong Anti-Aging Research Center Shandong New Technology Pharmaceutical Research Institute)
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2038-11-23
Also published as: CN109336891A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物，及其酯或盐的水合物：本发明还涉及这些化合物的制备方法，含有这些化合物的药物组合物，以及这些化合物在用于制备治疗肿瘤药物以及防治因NO在体内过度释放诱发的疾病中的用途。式（I）.

。

Description

5-（呋喃-2’-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸及其衍生物

技术领域

本发明本发明属于医药技术领域，具体涉及5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸及其衍生物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物，这些化合物的制备方法，含有这些化合物的药物组合物及其应用。

背景技术

炎症涉及诸多疾病，现代生命科学的研究有证据表明：长期慢性炎症可能是某些重大疾病，例如肿瘤、心脏病的发病基础。现有上市的抗炎药物，包括甾体激素和非甾体抗炎药（NSAI）均以缓解症状，即治表为目的。这些药物均能有效的减少患者的痛苦，但却不能延缓或改善患者的病理进程，特别是与炎症密切相关的自身免疫病，如风湿性关节炎、类风湿以及过敏性关节炎等，尚无治本的药物上市。

肿瘤与慢性炎症密切相关。随着工业化、城市化进程的加快，全国因癌症死亡的人数逐年上升，癌症已成为全球性的公共卫生问题。自然界中植物资源丰富，是研究抗肿瘤新药的重要来源。在传统清热解毒、祛风除湿的中药中可能寻找到作用于前炎症因子的小分子先导化合物，如何在传统中医药中寻找新的活性成分，开发新一代的抗炎和抗肿瘤先导物，是亟待研究的课题。

石榴为石榴科石榴属植物，原产中亚地区，后引种进入中国。中国药典收载的石榴的果皮入药，具有涩肠止泻、止血、驱虫的功效。用于久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、白带、虫积腹痛的治疗。根据目前的研究报道，石榴中的化学成分以鞣质类、生物碱、有机酸和黄酮类为主。石榴中生物碱类化合物主要含吡咯咯烷类生物碱和哌啶类生物碱。哌啶类生物碱包括石榴碱、N-甲基石榴碱、伪石榴碱、N-乙酰石榴碱、降伪石榴碱、古豆碱、降古豆碱等生物碱类化合物。石榴的不同部位所含哌啶类生物碱的种类有所差异，部分生物碱如石榴碱、伪石榴碱、N-甲基石榴碱主要存在于茎皮中，前者还是茎皮中主要的生物碱。目前报道的石榴中的吡咯烷类生物碱主要有古豆碱和降古豆碱，二者主要存在于根皮中，吡咯类结构生物碱在天然产物中具有多种生理活性以及潜在的应用价值而因人注目。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物及其衍生物。

本发明进一步的技术任务是提供含有该化合物的药物化合物。

本发明再进一步的技术任务是提供上述化合物的应用。

通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物。

式（I）。

其中，R₁代表氢原子或氧原子或羟基或乙酰氧基；

R₂代表氢原子或氧原子或羟基或乙酰氧基。

更进一步优选的化合物如下：5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸，简称化合物（1），或其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物。化合物（1）结构式如下:

化合物（1）。

更进一步优选的化合物如下：5-（呋喃-2'-羰基）-1-氧代-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸，简称化合物（2），或其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物。化合物（2）结构式如下:

化合物（2）。

更进一步优选的化合物如下：（R）5-（呋喃-2'-羰基）-1-羟基-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸，简称化合物（3），或其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物。化合物（3）结构式如下:

化合物（3）。

更进一步优选的化合物如下：（R）5-（呋喃-2'-羰基）-1-乙酰氧基-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸，简称化合物（4），或其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物。化合物（4）结构式如下:

化合物（4）。

更进一步优选的化合物如下：（S）5-（呋喃-2'-羰基）-1-羟基-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸，简称化合物（5），或其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物。化合物（5）结构式如下:

化合物（5）。

更进一步优选的化合物如下：（S）5-（呋喃-2'-羰基）-1-乙酰氧基-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸，简称化合物（6），或其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物。化合物（6）结构式如下:

化合物（6）。

本发明上述任一化合物药学上可接受的盐为有机酸盐、无机酸盐、有机碱盐或无机碱盐，其中有机酸包括乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸；无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸；有机碱包括葡甲胺、氨基葡萄糖；无机碱包括钠、钾、钡、钙、镁、锌、锂的碱性化合物。

本发明要求保护的化合物易水解的酯，包括烷酰氧烷基酯，例如乙酰氧甲酯、丙酰氧甲酯、丁酰氧甲酯、异丙基甲酰氧甲酯、叔丁基甲酰氧甲酯、新戊基甲酰氧甲酯、异丁基甲酰氧酯、新戊乙酰氧甲酯、辛酰氧甲酯、癸酰氧甲酯等；烷氧羰氧基烷基酯，例如甲氧基甲酰氧甲酯、乙氧基甲酰氧甲酯、异丙氧基甲酰氧-1-乙酯、己氧基甲酰氧-1-乙酯、辛氧基甲酰氧-1-乙酯、癸氧基甲酰氧-1-乙酯、十二烷氧基甲酰氧-1-乙酯等；烷氧基甲酯，例如甲氧甲酯、1-异丙氧甲酯等；烷酰氨基甲酯，例如甲酰氨基甲酯、乙酰氨基甲酯等；环烷酰氧烷基酯，例如环己烷基甲酰氧甲酯、环己烷基甲酰氧-1-乙酯、1-甲基-环己烷基甲酰氧-1-乙酯、4-甲基-环己烷基甲酰氧甲酯等；环烷氧基酰氧烷基酯，例如环戊烷氧基甲酰氧-1-乙酯、环己烷氧基甲酰氧-1-乙酯等；(5-甲基-2-氧代-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基酯，2-[(2-甲基丙氧基)羰基]-2-戊烯酯等。优选为丙酰氧甲基酯、丁酰氧甲基酯、叔丁基甲酰氧甲基酯、异丙氧甲酰氧甲基酯、异丙氧甲酰氧-1-乙基酯、环己烷氧甲酰氧-1-乙基酯、(5-甲基-2-氧代-1，3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基酯等。

通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯可以是水合物形式。水合作用可以在制备过程中完成或者可以利用原始无水产物的吸湿性逐渐进行。

本发明进一步要求保护包括上面所述的任一化合物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、或其酯或盐的水合物与其它药用活性成分的药物组合物。

本发明进一步要求保护包括上面所述的任一化合物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、或其酯或盐的水合物与一种或多种药用载体和/或稀释剂的药物组合物，为临床上或药学上可接受的任一剂型，优选为口服制剂或注射剂。其中含有生理有效量的通式(I)所示的化合物0.01g～10g，可以为0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.04g、0.05g、0.1g、0.125g、0.2g、0.25g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.75g、1g、1.25g、1.5g、1.75g、2g、2.5g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g等。

本发明任一化合物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、或其酯或盐的水合物，可以口服或肠胃外给药等方式施用于需要这种治疗的患者。

用于肠胃外给药时，可制成注射剂。注射剂系指药物制成的供注入体内的溶液、乳液或混悬液及供临用前配制或稀释成溶液或混悬液的粉末或浓溶液的无菌制剂，注射剂可分为注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。注射液系指药物制成的供注射入体内用的无菌溶液型注射液、乳液型注射液或混悬型注射液，可用于肌内注射、静脉注射、静脉滴注等；其规格有1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、250ml、500ml等，其中供静脉滴注用的大体积(一般不小于100ml)注射液也称静脉输液。注射用无菌粉末系指药物制成的供临用前用适宜的无菌溶液配制成澄清溶液或均匀混悬液的无菌粉末或无菌块状物，可用适宜的注射用溶剂配制后注射，也可用静脉输液配制后静脉滴注；无菌粉末用溶媒结晶法、喷雾干燥法或冷冻干燥法等制得。注射用浓溶液系指药物制成的供临用前稀释供静脉滴注用的无菌浓溶液。

制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，可选用水性溶剂或非水性溶剂。最常用的水性溶剂为注射用水，也可用0.9％氯化钠溶液或其他适宜的水溶液；常用的非水性溶剂为植物油，主要为供注射用大豆油，其他还有乙醇、丙二醇、聚乙二醇等的水溶液。配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、填充剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。常用的渗透压调节剂包括氯化钠、葡萄糖、氯化钾、氯化镁、氯化钙、山梨醇等，优选氯化钠或葡萄糖；常用的pH值调节剂包括醋酸-醋酸钠、乳酸、枸橼酸-枸橼酸钠、碳酸氢钠-碳酸钠等；常用的增溶剂包括聚山梨酯80、丙二醇、卵磷脂、聚氧乙烯蓖麻油等；常用的填充剂包括乳糖、甘露醇、山梨醇、右旋糖酐等；常用的抗氧剂有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等；常用抑菌剂为苯酚、甲酚、三氯叔丁醇等。注射剂常用容器有玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料安瓿、塑料瓶等。

用于口服时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。片剂系指药物与适宜的辅料混匀压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂，以口服普通片为主，另有含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡腾片、缓释片、控释片与肠溶片等。胶囊剂系指药物或加有辅料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂，依据其溶解与释放特性，可分为硬胶囊(通称为胶囊)、软胶囊(胶丸)、缓释胶囊、控释胶囊和肠溶胶囊等。丸剂系指药物与适宜的料均匀混合，以适当方法制成的球状或类球状固体制剂，包括滴丸、糖丸、小丸等。颗粒剂系指药物与适宜的辅料制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂，可分为可溶颗粒(通称为颗粒)、混悬颗粒、泡腾颗粒、肠溶颗粒、缓释颗粒和控释颗粒等。口服溶液剂系指药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液体制剂。口服混悬剂系指难溶性固体药物，分散在液体介质中，制成供口服的混悬液体制剂，也包括干混悬剂或浓混悬液。糖浆剂系指含有药物的浓蔗糖水溶液。

制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。常用填充剂包括淀粉、糖粉、磷酸钙、硫酸钙二水物、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；常用粘合剂包括羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、胶化淀粉等；常用崩解剂包括干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；常用润滑剂包括硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。

本发明要求保护的化合物的制备方法为：以石榴皮为原料，用溶剂提取后，经层析纯化或大孔树脂纯化即可以提取得到式I表示的化合物。

上述化合物的制备方法主要包括以下步骤：

（1）石榴皮干燥粉碎后用溶剂提取，提取液浓缩得到浸膏，即得粗提物，所述溶剂为水、醇类或水醇混合物，其中醇为C1-C4的短链醇；

（2）浸膏以水混悬后，用有机溶剂萃取，萃取后萃取液部位经硅胶柱层析（氯仿-甲醇）、凝胶柱层析（甲醇）纯化，薄层监控，合并相同流分，得到结构式I表示的化合物。

所述有机溶剂为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇中的任何一种，任何两种或两种以上的组合配合使用。

申请人发现本发明要求保护的化合物在抗癌方面具有显著效果，在实验中也显示出较强的抗癌作用。

本发明要求保护的化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明要求保护的化合物在制备治疗肺腺癌、胃腺癌、结肠癌药物中的应用。

本发明要求保护的化合物在制备抑制人肺腺癌H460细胞增殖药物中的应用。

本发明要求保护的化合物在制备抑制人胃腺癌SGC-7901细胞增殖药物中的应用。

本发明要求保护的化合物在制备抑制人胃腺癌人结肠癌SW-620细胞增殖药物中的应用。

本发明要求保护的化合物在制备抑制人胃腺癌人结肠癌COL0205细胞增殖药物中的应用。

本发明要求保护的化合物在制备防治因NO在体内过度释放诱发的疾病药物中的应用。

本发明要求保护的化合物的具有以下优点：

(1)本发明提供了一种新的5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯、其水合物、及其酯或盐的水合物，该化合物提取自石榴皮中，为传统中医药中寻找新的活性成分，开发新一代的抗炎和抗肿瘤先导物提供了思路。

(2) 发现本发明要求保护的化合物在抗癌方面具有显著效果，在实验中也显示出较强的抗癌作用。5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物对H460（人肺腺癌）、SGC-7901(人胃腺癌)、SW-620（人结肠癌）和COLO205（人结肠癌）作用48h后，发现该化合物对上述4种肿瘤细胞均有一定的细胞毒作用。

(3)槲皮素抑制NO释放的IC₅₀为21.3μg/ml，5（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸抑制NO释放的IC₅₀为5.6μg/ml，明显强于槲皮素。

附图说明

图1为实施例1制备得到的产物的UV图谱。

图2为实施例1制备得到的产物的ESI-MS图谱。

图3为实施例1制备得到的产物的HRESI-MS图谱。

图4为实施例1制备得到的产物的¹H-NMR图谱。

图5为实施例1制备得到的产物的¹³C-NMR图谱。

图6为实施例1制备得到的产物的HSQC图谱。

图7为实施例1制备得到的产物的HMBC图谱。

图8为实施例1制备得到的产物的单晶衍射图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

实施例1

1、提取与分离

石榴皮自然干燥后粉碎，取4kg于提取器中用甲醇提取，提取液减压浓缩得甲醇浸膏800g，将甲醇浸膏用水溶解，然后依次用石油醚（60℃～90℃）、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚萃取物22g，二氯甲烷萃取物50g，乙酸乙酯萃取物32g，正丁醇萃取物150g。二氯甲烷部位经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇（100：0～50：50）梯度洗脱，每一流分约500mL，共收集100个流份，将各流分浓缩，进行TLC检测，合并相同流分，并将含有目标化合物的流份继续重复上述方法进行硅胶柱层析，合并相同流分，经过SephadexLH-20柱色谱（二氯甲烷：甲醇=50：50）反复洗脱，最终用制备HPLC进行分离，得到目标化合物（20.4mg）。

从二氯甲烷部位中得到该化合物（本发明结构式I表示的化合物）。

2、化合物的结构鉴定：

5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物（结构化合物（1）表示的化合物）：淡黄色粉末，m.p.159～161℃。HRFAB-MS给出准分子离子峰m/z为246.0761[M+H]⁺(calcd for C₁₃H₁₂NO₄246.0766)，确定其分子式为C₁₃H₁₁NO₄。IR示有烯烃的C-H伸缩振动峰(3140cm^-1和3124cm^-1)、羧酸的O-H伸缩振动峰(3000~2500cm^-1)、共轭羧羰基和共轭酮羰基伸缩振动峰(1614cm^-1和1568cm^-1)。在¹H-NMR和¹³C-NMR图谱上，给出了三个亚甲基信号δ3.13(2H,t,7.2)，26.2；2.61(2H,m,7.2)，27.1和4.43(2H,t,7.2)，50.2，四个芳香质子信号δ7.82（1H，s），125.7；7.80（1H,d,1.2），147.5；6.66（1H,dd,3.6,1.2），113.0和7.35(1H,d,3.6)，118.8；和两个羰基信号δ172.1，167.5，结合生源关系推测该化合物可能为吡咯嗪类化合物。

上述归属经HMBC实验证实，H-1和C-2(δ27.1)、C-3(δ50.2)有远程偶合，H-2和C-1(δ26.2)、C-3有远程偶合，H-3和C-1、C-2有远程偶合，得知该化合物含有-CH₂CH₂CH₂-片断。H-5'和C-4'(δ113.0)、C-3'(δ118.8)有远程偶合；H-3'、H-4'均和C-5'(δ147.5)、C-2'(δ153.5)有远程偶合；H-6和C-5(δ126.7)、C-7(δ110.5)、C-8(δ152.2)有远程偶合。综上所述，化合物的结构鉴定为5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸，该化合物为一新化合物。¹H、¹³C-NMR数据见表1。

实施例1制备得到的产物的UV图谱见图1。实施例1制备得到的产物的ESI-MS图谱见图2。实施例1制备得到的产物的HRESI-MS图谱见图3。实施例1制备得到的产物的¹H-NMR图谱见图4。实施例1制备得到的产物的¹³C-NMR图谱见图5。实施例1制备得到的产物的HSQC图谱见图6。实施例1制备得到的产物的HMBC图谱见图7。实施例1制备得到的产物的单晶衍射图见图8。

实施例2 对4种人癌细胞的体外细胞毒作用观察

本发明涉及一种5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物在制备治疗肿瘤药物方面的应用。通过下面试验说明本发明化合物的细胞毒活性。

1.1样品

实施例1中所得到的5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物，用二甲基亚砜（DMSO，终浓度0.8%）溶解，用含15%小牛血清RPMI1640培养基配成1mg/ml备用，用时稀释成所需浓度。选择注射用顺铂作为阳性对照。

1.2细胞系与试剂

本实验采用4种人癌细胞株，其中包括：H460（人肺腺癌）、SGC-7901(人胃腺癌)、SW-620（人结肠癌）和COLO205（人结肠癌）细胞系，上述细胞株均购于中国科学院细胞库，由山东省医学科学院药物研究所药理室传代保存。DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司。小牛血清、非必需氨基酸购自Hyclone公司。胰蛋白酶、MTT试剂购自Sigma公司。

1.3实验方法

采用常规MTT法，4种肿瘤细胞均用含10%小牛血清培养液于37℃，5%CO₂及饱和湿度条件下培养。取对数生长期状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化后计数，调整细胞数为1×10⁵/ml接种于96孔板内，每孔0.1ml，置CO₂孵箱内培养24h后加样品。作用于上述4种细胞，样品最高剂量组药物浓度均为50ug/ml，按5倍依次稀释至0.08ug/ml，共5个剂量组。每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔、DMSO（0.8%）阴性对照孔和顺铂阳性对照孔。在37℃二氧化碳培养箱内培养48h后，终止培养。每孔加入10ml0.5%MTT置CO₂孵箱内，4h后取出倾去孔内液体加入DMSO（0.2ml/孔），充分振荡，使蓝紫色甲臜溶解，于多功能标记分析仪于560nm波长处记录吸光度（OD）值，采用不同浓度受试药物3复孔OD值计算细胞的抑制率及IC₅₀。

细胞抑制率（%）=（阴性对照组OD值－受试物组OD值）/阴性对照组OD值×100%。

1.4实验结果

5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物对H460（人肺腺癌）、SGC-7901(人胃腺癌)、SW-620（人结肠癌）和COLO205（人结肠癌）作用48h后，发现该化合物对上述4种肿瘤细胞均有一定的细胞毒作用。

根据上述研究，5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物体外对肿瘤细胞具有一定的细胞毒活性，可用于制备抗肿瘤药物。

试验实施例3 对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放NO的抑制活性

本发明涉及一种5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物在在防治因NO在体内过度释放诱发的疾病中的应用，通过下面试验说明本发明化合物体外抑制NO释放的活性。

1.1样品

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、MTT购自Sigma公司；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中科院细胞库(ATCC)；RPMI1640培养液、青霉素、链霉素、胎牛血清购自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯。选择槲皮素作为阳性对照。

实施例1中所得到的5-（呋喃-2'-羰基）-2,3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸化合物测试样品和槲皮素用二甲基亚砜溶解并稀释至合适浓度，-20℃保存备用。

1.2小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养：

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养于含10%热灭活（56℃，30min）胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素钠、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，37℃、5%CO₂的恒温培养箱中孵育生长。

1.3NO释放量的测定：

由于NO极不稳定，在细胞培养上清液内很快代谢成亚硝酸基（NO₂ ^-），采用Griess法测定样品中NO₂ ^-的浓度作为衡量NO水平的指标。Griess试剂A：0.1%N-萘乙二胺盐酸盐水溶液；Griess试剂B：1%对氨基苯磺酰胺的5%H₃PO₄水溶液，使用前等体积混合试剂A和B。用RPMI1640培养液将小鼠巨噬细胞RAW264.7稀释至5×10⁵cells/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO₂培养箱中培养1h后，每孔加入LPS(终浓度1μg/mL)和不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组（不加入被测试样品）、空白对照组（等体积DMSO）和槲皮素阳性对照组，每个样品4个平行孔。在37℃、CO₂恒温培养箱中培养24h后吸取培养液上清100μL至酶标板中，加入等体积的Griess试剂，室温反应10min后测定540nm处的吸光值。用浓度分别为1、5、10、50µmol/L的NaNO₂绘制标准曲线，根据NaNO₂标准曲线计算细胞培养上清液中NO₂ ^-的浓度以及对NO释放的抑制率，抑制率计算公式为：

用此方法测定槲皮素抑制NO释放的IC₅₀为21.3μg/ml，5（呋喃-2-羰基）-2-3-二氢-1H-吡咯嗪-7-羧酸抑制NO释放的IC₅₀为5.6μg/ml，明显强于槲皮素。

1.4结论

由上述结果可以看出，本发明具有化合物（1）结构的化合物，具有抑制NO释放的活性，能够防治NO在体内过度释放诱发的疾病。

实施例4含有发明结构化合物表示的化合物各剂型药物的制备

制剂实验例1片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（1）2mg、乳糖50mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮15mg。

所述片剂的制备方法可以按照常规片剂的制备方法来制备。

制剂实验例2片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分

化合物（2）2mg、乳糖50mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮15mg。

所述片剂的制备方法可以按照常规片剂的制备方法来制备。

制剂实验例3片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（3）2mg、乳糖50mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮15mg。

所述片剂的制备方法可以按照常规片剂的制备方法来制备。

制剂实验例4片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（4）2mg、乳糖50mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮15mg。

所述片剂的制备方法可以按照常规片剂的制备方法来制备。

制剂实验例5片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（5）2mg、乳糖50mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮15mg。

所述片剂的制备方法可以按照常规片剂的制备方法来制备。

制剂实验例6片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（6）2mg、乳糖50mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮15mg。

所述片剂的制备方法可以按照常规片剂的制备方法来制备。

制剂实验例7片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（1）0.5mg、化合物（2）0.5mg、化合物（3）表示的化合物0.5mg、化合物（4）0.5mg、乳糖50mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮15mg。

所述片剂的制备方法可以按照常规片剂的制备方法来制备。

制剂实验例8 胶囊

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（1）3mg、乳糖60mg、玉米淀粉20mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮10mg。

所述胶囊剂的制备方法可以按照常规胶囊剂的制备方法来制备。

制剂实验例9 胶囊

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（2）3mg、乳糖60mg、玉米淀粉20mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮10mg。

制剂实验例10 胶囊

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（3）4mg、乳糖60mg、玉米淀粉20mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮10mg。

制剂实验例11 胶囊

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（4）4mg、乳糖60mg、玉米淀粉20mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮10mg。

制剂实验例12 胶囊

化合物（5）4mg、乳糖60mg、玉米淀粉20mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮10mg。

制剂实验例13 胶囊

化合物（6）4mg、乳糖60mg、玉米淀粉20mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮10mg。

制剂实验例14 胶囊

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有以下成分：

化合物（1）表示化合物1mg、化合物（2）1mg、化合物（3）1mg、化合物（4）表示化合物1mg、乳糖60mg、玉米淀粉20mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮10mg。

制剂实验例15 本发明化合物无菌粉针的制备

处方：

化合物1或其衍生物中的任意一种 10-10000g（以化合物计）

共制备1000支

制备工艺：将制备所用的抗生素玻璃瓶、胶塞等进行无菌处理；按处方称取原料(折算后投料)，将无菌粉末置于分装机中分装，随时检测装量；加塞，压盖，成品全检，包装入库。

Claims

1.通式(I)所示的化合物,

式（I）

其中，R1代表氢原子；

R2代表氢原子。

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，该化合物以石榴皮为原料，用溶剂提取后，经层析纯化或大孔树脂纯化制得目标产物。

3.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂为水、醇类或水醇混合物，其中醇为C1-C4的短链醇。

4.权利要求1所述的化合物在制备治因NO在体内过度释放诱发的疾病药物中的应用。