CN114478700B

CN114478700B - 鸡冠花子中荨麻科类型环肽的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用

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Publication number: CN114478700B
Application number: CN202210162753.7A
Authority: CN
Inventors: 张爱霞; 范君婷; 徐筱雅; 刘尚明; 金阳; 蒋南; 都述虎
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2022-02-22
Filing date: 2022-02-22
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2042-02-22
Also published as: CN114478700A

Abstract

本发明公开了鸡冠花子中荨麻科类型环肽的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。本发明首次从鸡冠花子中提取一种荨麻科环肽类化合物Moroidin，提供了获取该环肽的新植物来源及制备方法。通过体外抗肿瘤实验，首次表明Moroidin对多种恶性肿瘤细胞具有毒性作用和抗增殖作用，并且可使肿瘤细胞阻滞于G2/M期进而诱导肿瘤细胞凋亡，因此具有良好的抗肿瘤活性，对制备治疗肿瘤相关疾病药物具有潜在应用价值。

Description

鸡冠花子中荨麻科类型环肽的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于天然药物化学、药物技术和抗肿瘤化合物领域，具体涉及一种从鸡冠花子中提取荨麻科类型环肽Moroidin的制备方法，以及其作为肿瘤细胞增殖抑制剂的应用和在制备抗肿瘤药物的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的一类重大疾病，发病率和死亡率在逐年攀升。虽然随着科学技术的进步，基因治疗、免疫疗法等新兴治疗方法进入临床实践，但迄今为止，化学药物仍然是治疗恶性肿瘤的重要手段。抗肿瘤药物来源广泛，源于植物的天然产物因其结构多样、疗效确切而成为抗肿瘤药物的重要来源。紫杉醇类、喜树碱类、长春花碱类及三尖杉酯碱类等植物来源的抗肿瘤药物，已经在恶性肿瘤治疗方面取得了良好的临床效果。因此，从植物来源的天然产物中寻找高效、低毒的抗肿瘤活性先导化合物，是抗肿瘤药物研发的重要策略和热点。

植物环肽是指高等植物中主要由氨基酸肽键形成的环状含氮化合物。目前发现的植物环肽主要是由2至37个L-构型编码或非编码氨基酸残基组成。其中荨麻科类型环肽是一类比较少见且骨架新颖的双环杂环肽，分子中有两处不寻常的非肽键连接形成双环，其一为β^S-Leu²(C-β)和Trp⁵(C-6)之间的C-C键连接，其二为Trp⁵(C-2)和His⁸(N-1)之间的C-N键连接。首个发现的荨麻科类型环肽Moroidin是1986年由英国学者Leung等从澳大利亚荨麻科(Urticaceae)有毒灌木laportea moroides的枝叶中分离得到，之后2000年日本学者Morita等从苋科(Amaranthaceae)青葙属(Celosia)中药青葙 (Celosia argentea.L)的干燥成熟种子中也分离得到的。Moroidin是由8 个氨基酸组成的荨麻科类型环肽，有着独特的β^s-Leu²-Trp⁵(C-C连接)和Trp⁵-His⁸(C-N连接)的双环杂环八肽骨架。由于在无细胞的实验中， Moroidin可抑制纯化的微管蛋白聚合而被推测具有抗有丝分裂活性[Antimitoticactivity of moroidin,a bicyclic peptide from the seeds of Celosiaargentea.Bioorg Med Chem Lett.2000Mar 6；10(5):469-71.]。微管是一种动态的细丝状细胞骨架蛋白，在细胞有丝分裂中起着关键作用，是抗肿瘤药物研究与开发最重要和最为成功的靶点之一。对微管抑制剂进行表征，主要通过使用体外纯化的微管蛋白和细胞毒性测定进行分析。由于受到药物穿过细胞膜能力、与靶位点亲和能力及细胞内环境的影响，药物对纯化微管蛋白的影响和其对细胞活力之间的关系并不总是直接相关的，即：药物对体外微管蛋白聚合的抑制作用并不能完全预测它们的相对细胞毒性[Characterization ofMicrotubule Destabilizing Drugs:A Quantitative Cell-Based Assay That Bridgesthe Gap between Tubulin Based-and Cytotoxicity Assays.Cancers(Basel).2021Oct18；13(20):5226.]。因此，虽然已知Moroidin可抑制纯化微管蛋白聚合，但22年过去了，尚未见 Moroidin对肿瘤细胞的作用报道，该环肽是否具有抗肿瘤活性也不清楚。

此外，由于Moroidin具有极为独特的β^s-Leu²-Trp⁵(C-C连接)和Trp⁵- His⁸(C-N连接)的双环杂环八肽骨架，目前尚无法通过化学方法合成。鸡冠花子为中药青葙子同属植物鸡冠花(Celosia cristata L.)的干燥成熟种子。鸡冠花资源广泛，遍及全国，野生或栽培均有。鸡冠花其花、茎叶、种子均可入药，为收敛剂，具有收敛止血，止带，止涩等功效。近来药理研究证实鸡冠花子具有抗衰老、治疗骨质疏松和提高机体免疫力等作用。迄今发现鸡冠花子的生物活性成分包括黄酮类、甾醇类、皂苷类、酚类和多糖类等。现有技术中未见从鸡冠花子中分离获得荨麻科类型环肽Moroidin的报道，也未见Moroidin 抗肿瘤作用及其相关作用机制的报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一种自鸡冠花子中提取荨麻科类型环肽Moroidin的制备方法。本发明的目的还在于提供以荨麻科类型环肽Moroidin为有效成分的药物组合物，该类型化合物作为肿瘤细胞增殖抑制剂，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

本发明所述的荨麻科类型环肽Moroidin(1)的制备方法，取干燥的鸡冠花子，经粉碎后用10倍体积量的70％乙醇加热回流提取，经提取减压浓缩后得到总浸膏。将总浸膏混悬于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；取正丁醇部位(Fr.B)经D101大孔吸附树脂柱层析，用甲醇/水系统(10:90， 30:70，50:50，70:30，90:10，0:100，v/v)梯度洗脱，其中甲醇/水系统50％部分(简称Fr.B-50％)利用环肽TLC检测方法鉴定含有环肽，并根据环肽点的不同合并为七个组分Fr.B-50％-1–Fr.B-50％-7，以下的每一过程都须结合环肽TLC检测方法来指导纯化分离。对其中Fr.B-50％-4经硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇/水/三乙胺系统(9:1:0.5:0.005→6:4:1:0.005，v/v)梯度洗脱，分离得到五个组分(Fr.B-50％-4-1–Fr.B-50％-4-5)。其中组分Fr.B-50％-4- 3再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇/水系统(1:1，v/v)等度洗脱，得到三个组分(Fr.B-50％-4-3-1–Fr.B-50％-4-3-3)。其中组分Fr.B-50％-4-3- 1再经ODS HPLC半制备柱纯化，甲醇/4‰三氟乙酸(30:70，v/v)为流动相，得到荨麻科类型环肽Moroidin(1)。

以荨麻科类型环肽Moroidin或其药理学上容许的盐为有效成分的肿瘤细胞增殖抑制剂。

荨麻科类型环肽Moroidin或其药理学上容许的盐在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。

荨麻科类型环肽Moroidin或其药理学上容许的盐在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

上述Moroidin可以为任何药物治疗学上可接受的剂型，其使用量为任何药物治疗学上可接受的剂量。

本发明所述的药理学上容许的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属或者碱性氨基酸形成的盐。

进一步的，本发明的所述荨麻科类型环肽Moroidin或其药理学上容许的盐，可以列举例如与盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸，或者马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸等有机酸，锂、钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属，赖氨酸等碱性氨基酸形成的盐。

上述治疗抗肿瘤的药物，可以由荨麻科类型环肽Moroidin或其药理学上容许的盐，与药学上可接受的载体组合后制备而成。制备的药物剂型可以为片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等。由于Moroidin可从苋科鸡冠花子中提取分离，而片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识。因此，由荨麻科类型环肽Moroidin 或其药理学上容许的盐与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员实现。

上文中所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

上述药物中，优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分荨麻科类型环肽Moroidin或其药理学上容许的盐，最优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明所述药物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选 0.1～5mg/kg体重，可以一次或多次施用。

有益效果：

本发明首次从鸡冠花子中分离提取出一种荨麻科类型环肽Moroidin，提供了获取该类型环肽的一个新植物来源以及制备方法。

本发明首次揭示荨麻科类型环肽Moroidin或其药理学上容许的盐是一种肿瘤细胞增殖抑制剂，可用于制备抗肿瘤药物的应用。通过体外抗肿瘤实验，表明本发明提供的Moroidin(1)对多种恶性肿瘤细胞具有毒性作用和抗增殖作用，并且可使肿瘤细胞阻滞于G2/M期进而诱导肿瘤细胞凋亡，因此具有良好的抗肿瘤活性，对制备治疗肿瘤相关疾病药物具有潜在应用价值。本发明所述的荨麻科类型环肽类化合物为天然化合物，其剂型和用药方式多样化，具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1为本发明的荨麻科类型环肽Moroidin(1)的制备方法流程图。

图2为实施例1制备所得鸡冠花子中荨麻科类型环肽Moroidin(1)的化学结构(A)和单晶结构(B)。

图3为本发明的荨麻科类型环肽Moroidin(1)对多种恶性肿瘤细胞的毒性作用。

图4为本发明的荨麻科类型环肽Moroidin(1)对人肺癌细胞A549和乳腺癌MCF-7增殖抑制作用。

图5为本发明的荨麻科类型环肽Moroidin(1)对人肺癌细胞A549细胞周期和细胞凋亡的影响。

图6为本发明的荨麻科类型环肽Moroidin(1)对人肺癌细胞A549凋亡相关分子表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图，用具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明，根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范围。

实施例1荨麻科类型环肽Moroidin(1)的制备方法(流程图见图1所示)。

取干燥的鸡冠花子(30kg)，经粉碎后用10倍体积量的70％乙醇加热回流提取，共提取三次(30L×3)，每次3小时，合并提取液，经减压浓缩后得到总浸膏(1.05kg)。将总浸膏混悬于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇连续萃取，等体积萃取三次，回收溶剂得到石油醚部位(33g)、乙酸乙酯部位 (60g)、正丁醇部位(Fr.BuOH，简称Fr.B，413g)以及萃取后水部位。

正丁醇部位(Fr.B，413g)经D101大孔吸附树脂柱层析，用甲醇/水系统 (10:90，30:70，50:50，70:30，90:10，0:100，v/v)梯度洗脱，其中甲醇/ 水系统50％部分(简称Fr.B-50％)利用环肽TLC检测方法鉴定含有环肽，并根据环肽点的不同合并为七个组分Fr.B-50％-1–Fr.B-50％-7，以下的每一过程都须结合环肽TLC检测方法来指导纯化分离。对其中Fr.B-50％-4(25.4g) 经硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇/水/三乙胺系统(9:1:0.5:0.005→6:4:1:0.005，v/v)梯度洗脱，分离得到五个组分(Fr.B-50％-4-1–Fr.B- 50％-4-5)。其中组分Fr.B-50％-4-3(330mg)再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇/水系统(1:1，v/v)等度洗脱，得到三个组分(Fr.B-50％-4-3-1– Fr.B-50％-4-3-3)。其中组分Fr.B-50％-4-3-1(120mg)再经ODS HPLC半制备柱纯化，甲醇/4‰三氟乙酸(30:70，v/v)为流动相，得到荨麻科类型环肽 Moroidin(1)(50mg)。

制备所得鸡冠花子中荨麻科类型环肽Moroidin的化学结构和单晶结构如图 2(分别为2A和2B)所示。

制备所得化合物Moroidin的结构鉴定数据如下：

Moroidin(1)：白色无定型粉末；分子式为C₄₇H₆₆N₁₄O₁₀；NW＝986；-57.5°(c0.40,50％MeOH)；UV(MeOH)λ_max 219nm,284nm；IRν_max 3394, 2961,2360,2342,1659,1650,1562,1519,1385,1264,1079,922cm^-1；¹H and ¹³C NMR data(DMSO-d₆,600MHz/150MHz)(+)-ESI-MS m/z 987.5 [M+H]⁺,(-)-ESI-MS m/z 985.3[M-H]^-,1021.3[M+Cl]^-；(+)-HR-ESI-MSm/z 987.5144[M+H]⁺(Calcd.for C₄₇H₆₇N₁₄O₁₀,987.5165),(+)-HR-ESI-MS m/z 1009.4961[M+Na]⁺(Calcd.For C₄₇H₆₆N₁₄O₁₀Na,1009.4984)。

表1荨麻科类型环肽Moroidin的¹H和¹³C的NMR数据

数值以ppm表示，偶合常数(J)以Hz表示。

实施例2制备所得的荨麻科类型环肽Moroidin对肿瘤细胞的细胞毒性作用

实验方法：采用噻唑蓝(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，MTT)实验，植物环肽Moroidin(浓度梯度为5μΜ、10μΜ、20 μΜ、40μΜ、80μΜ)处理肺癌细胞A549、H1299，乳腺癌细胞MCF7，胶质瘤细胞U87、U251，以及结直肠癌细胞HCT116，分析植物环肽Moroidin的体外抗肿瘤活性。具体步骤为：(1)细胞分种：取对数生长期状态良好的肿瘤细胞接种于96孔板中，接种浓度为5000个细胞/孔，置于常规细胞培养箱中培养 12h。(2)给药：弃去培养基，实验组分别给予不同浓度的植物环肽Moroidin (5μΜ、10μΜ、20μΜ、40μΜ、80μΜ)，每个浓度设置5个复孔。以不加任何药物的培养基作为空白对照，以含DMSO的培养基作为溶剂对照。 (3)酶标仪检测：分别培养24、48、72h后，每孔加入含MTT 20μL的培养基。相对存活率：相对存活率＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％。

实验结果：实验结果显示(见附图3)荨麻科类型环肽Moroidin对多种人类恶性肿瘤细胞，包括肺癌细胞A549、H1299；乳腺癌细胞MCF7；胶质瘤细胞 U87、U251以及结直肠癌细胞HCT116具有毒性作用，IC50为2.52～21.12 μΜ。尤其是肺癌A549细胞，IC50为2.52μΜ。

实施例3荨麻科类型环肽Moroidin对肿瘤细胞长期增殖的影响

实验方法：本发明的植物环肽Moroidin以不同的浓度作用于肺癌细胞 A549以及乳腺癌细胞MCF7，通过克隆形成实验检测肿瘤细胞的长期生长情况。

取对数生长期的肿瘤细胞均匀接种于6孔板中，每皿500个细胞。细胞贴壁后给予不同浓度Moroidin处理7-10天，细胞集落用0.1％结晶紫溶液染色2 分钟。用PBS洗脱背景色，然后拍照。使用Image Tool软件计算克隆数，用以下公式计算克隆率:克隆率＝(形成克隆数/所种细胞数)×100％

实验结果：如附图4显示，随着植物环肽Moroidin给药浓度的增加，A549 细胞的克隆形成数量明显降低，说明植物环肽Moroidin具有抑制肿瘤细胞长期增殖的作用。

实施例4荨麻科类型环肽Moroidin对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响

实验方法：本发明的植物环肽Moroidin以不同的浓度(5μΜ、10 μΜ、20μΜ)作用于肺癌细胞A549，通过Annexin V/PI双染流式细胞术检测A549肺癌细胞的凋亡率及细胞周期的改变。

取对数生长期的A549细胞分种于培养皿中，每皿细胞数为3×10⁵个，培养12h后，弃去培养基，分别加入不同浓度(5μΜ、10μΜ、20μΜ)的植物环肽Moroidin处理48h，以含DMSO的培养基作为溶剂对照。弃去培养皿中的培养基，用PBS洗涤细胞2次，加入不含EDTA的胰酶消化3min后,用含血清培养基中止,收集细胞于离心管，1000rpm离心5min，弃去上清。加入 PBS后，1000rpm离心3min,弃去上清。PBS洗涤两次，离心后收集细胞沉淀，通过流式细胞仪分别进行细胞凋亡和细胞周期相关检测。

实验结果：流式细胞术结果显示(表2、图5)，植物环肽Moroidin对肺癌细胞A549细胞周期产生明显的阻滞作用，能够将肺癌细胞A549细胞分裂时期阻滞于G2/M期。如图3所示，经Moroidin处理48h后，肺癌细胞A549的凋亡率显著增加，并呈现Moroidin浓度依赖性。说明植物环肽Moroidin能够造成肿瘤细胞中G2/M期阻滞并具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。

表2.植物环肽Moroidin对肿瘤细胞周期的影响(mean±SD)(n＝3)

**P<0.01，***P<0.001，vs.Vehicle(DMSO)

实施例5本发明中的荨麻科类型环肽Moroidin对肿瘤细胞凋亡相关分子表达的影响。

实验方法：本发明的植物环肽Moroidin以不同的浓度(5μΜ、10μΜ、 20μΜ)作用于肺癌细胞A549，采用蛋白质印记技术(Western blotting)研究肺癌细胞A549中凋亡相关分子Caspase-3、Bcl-2、Bax和Caspase-9表达水平的影响。收集经不同浓度(0、5、10、20μM)植物环肽Moroidin处理48h 后的肺癌细胞A549沉淀，经RIPA裂解液裂解后，离心取上清制备蛋白样品。样品经过电泳、转膜后，用5％的脱脂奶粉室温下封闭1.5h。分别加入Caspase-3(Abcam,1:3000)、Caspase-9(Proteintech,1:1000)、Bcl-2(Proteintech,1:1000)、Bax(Proteintech,1:4000)抗体，4℃孵育过夜。弃去一抗，TBST洗膜四次，加入与一抗相对应的二抗，室温孵育1.5h。TBST 洗膜4次，加入ECL化学发光底物，使用凝胶成像仪曝光成像。用Image J软件对免疫印迹条带进行灰度分析。

实验结果：结果显示(见附图6)，同对照组相比较，经Moroidin处理48 h后，肺癌细胞A549内Caspase-3、Caspase-9、Bax的表达明显升高，而Bcl- 2的表达则明显降低，且这种变化趋势呈现浓度依赖性，说明植物环肽 Moroidin具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。

实施例6

实施例1所得荨麻科类型环肽Moroidin(1)，加入4％的硫酸乙醇溶液，pH ＝4，过滤，干燥，制成硫酸盐化合物。

实施例7

实施例1所得化合物1，加入4％的盐酸溶液，pH＝4，过滤，干燥，制成盐酸盐化合物。

实施例8

实施例1所得化合物1，加入4％的酒石酸溶液，pH＝4，过滤，干燥，制成酒石酸盐化合物。

实施例9

实施例1所得化合物1，加入4％的柠檬酸溶液，pH＝4，过滤，干燥，制成柠檬酸盐化合物。

实施例10

片剂：实施例1所得化合物1或实施例6-9所得的盐10mg，乳糖180 mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物1或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重 250mg，化合物含量为10mg。

实施例11

安瓿剂：实施例1所得化合物1或实施例6-9所得的盐2mg，氯化钠10 mg。

制备方法：将化合物1或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例12

注射用冻干剂：实施例1所得化合物1或实施例6-9所得的盐10mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30分钟除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物1或其盐，超声处理使溶解，用1N盐酸调节pH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例13

胶囊剂：实施例1所得化合物1或实施例6-9所得的盐10mg，乳糖187 mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物1或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims

1.式(1)所示的荨麻科类型环肽化合物Moroidin作为有效成分在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用，所述的肿瘤为肺癌或乳腺癌；

2.式(1)所示的荨麻科类型环肽化合物Moroidin在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为肺癌或乳腺癌；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述荨麻科类型环肽Moroidin提取自苋科青葙属植物鸡冠花的干燥成熟种子中。

4.权利要求1中所述的式(1)所示的荨麻科类型环肽Moroidin的提取制备方法，其特征在于，所述的环肽Moroidin通过以下方法制备得到：

取干燥的鸡冠花子，经粉碎后用10倍体积量的70％乙醇加热回流提取，提取液经减压浓缩后得到总浸膏，将总浸膏混悬于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇连续萃取；取正丁醇部位经D101大孔吸附树脂柱层析，用甲醇/水系统体积比为10:90，30:70，50:50，70:30，90:10，0:100梯度洗脱，其中甲醇/水系统50％部分利用环肽TLC检测方法鉴定含有环肽，并根据环肽点的不同合并为七个组分Fr.B-50％-1–Fr.B-50％-7，以下的每一过程都须结合环肽TLC检测方法来指导纯化分离，对其中Fr.B-50％-4经硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇/水/三乙胺系统体积比为9:1:0.5:0.005→6:4:1:0.005进行梯度洗脱，分离得到五个组分Fr.B-50％-4-1–Fr.B-50％-4-5，其中组分Fr.B-50％-4-3再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，体积比为1:1的甲醇/水系统等度洗脱，得到三个组分Fr.B-50％-4-3-1–Fr.B-50％-4-3-3，其中组分Fr.B-50％-4-3-1再经ODS HPLC半制备柱纯化，用体积比为30:70的甲醇/4‰三氟乙酸为流动相，得到荨麻科类型环肽Moroidin。