KR101202913B1

KR101202913B1 - 식물 추출물 및 그의 치료 용도

Info

Publication number: KR101202913B1
Application number: KR1020097024924A
Authority: KR
Inventors: 마티아스 하인리히 크루터
Original assignee: 인사이니언 홀딩스 리미티드
Priority date: 2007-06-01
Filing date: 2008-06-02
Publication date: 2012-11-19
Also published as: ATE544458T1; RU2009148321A; RU2438692C2; US8591966B2; JP5478486B2; ZA200907899B; ES2378912T3; IL202440A0; TW200916111A; EP2150263B1; EP2150263A1; AU2008256536B2; AR066822A1; AU2008256536A1; CA2688410A1; CA2688410C; GB0710536D0; CN101687001A; IL202440A; WO2008146009A1

Abstract

본 발명의 카모마일 꽃의 수성 추출물을 포함하는 조성물은 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료에 유용하다.

카모마일 꽃 추출물, 증식성 상태, 염증성 상태

Description

식물 추출물 및 그의 치료 용도 {PLANT EXTRACT AND ITS THERAPEUTIC USE}

본 발명은 식물 추출물 및 그의 치료 용도, 즉 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료용 카모마일 꽃의 수성 추출물을 포함하는 조성물, 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료용 의약의 제조를 위한 상기 조성물의 용도, 및 유효량의 상기 조성물을 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료가 필요한 인간 또는 동물 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료를 위한 카모마일 꽃의 수성 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 카모마일 꽃은 플로레스 투비포르미스 (Flores tubiformis)이다. 추가적으로, 본 발명은 상태가 암, 바람직하게는 교모세포종 (glioblastoma) 또는 폐암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는, 상기 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 염증성 상태, 보다 바람직하게는 크론 질환 (Morbus Chron), 가장 바람직하게는 다발성 경화증의 치료용 의약의 제조를 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

여러 식물의 치료 특성은 옛부터 알려져 왔다. 그러나, 오늘날에도 유효 성분의 성질 및 그의 특성은 연구되어온 식물에서 조차도 거의 이해되지 못하고 있는 데, 이는 일반적으로 제약 발전이 상대적으로 예측가능한 특성을 갖는 것으로 생각되며 합성을 제어할 수 있는 소분자에 촛점을 맞추고 있기 때문이다.

문헌 [Uteshev et al, Eksp. Klin. Farmakol. (1999 Nov-Dec) 62(6):52-5]은 공기 및 침지 냉각 동안 저먼 카모마일 (German chamomile; 마트리카리아 카모마일 (Matricaria chamomilla))로부터 얻어진 헤테로폴리사카라이드의 면역조절 활성을 기재한다. 문헌 [Laskova and Uteshev, Antibiot. Khimioter. (1992 Jun) 37(6):15-8]은 카모마일 꽃으로부터 단리된 헤테로폴리사카라이드의 면역조절 작용을 기재한다. 수계 추출물을 경구 또는 복강내 주사에 의해 투여하였다. 상기 문헌의 저자들은 임의의 치료 용도를 제안하지 않았으며, 대신 자극 효과가 투여 요법에 따르며 주로 시험된 래트의 냉각 방법 및 정도에 따른다고 보고하였다.

WO2005/070440은 차 우려낸 물 (tea infusion)로서 투여되는 특정 양의 건조 및 분쇄된 카모마일 꽃, 아니스 (anis) 열매, 블랙 시드 (black seed) 등을 포함하는, 알레르기성 천식 또는 만성 기관지성 천식의 치료용 허브 조성의 용도에 관한 것이다.

WO03/101479는 통상적으로 근육내 주사에 의해 함께 주어지는 여러 성분을 포함하는 조성물의 유용한 치료 특성을 기재한다. 사용되는 조성물은 비록 치료 활성이 그에 속하지는 않지만 주사 자체의 불쾌한 작용을 완화시킬 수 있는 항-자극제로서 기재되는 카모마일 추출물을 포함한다.

WO2007/057651은 카모마일로부터 내독소를 제거하기 위한 방법을 개시한다.

<발명의 개요>

놀랍게도, 바람직하게는 증기 증류에 의해 얻어지는, 꽃 머리 (flower head)로부터 얻어진 카모마일 추출물이 유용한 치료적 특성을 갖는다고 이제 밝혀졌다. 이러한 수성 추출물은 카모마일 꽃 머리의 휘발성 성분으로 구성되는 것으로 알려져 있으며, 문헌 [European Pharmacopeia (Matricariae aetheroleum PhEur 5, corrected.5.1)]에 기재되어 있다.

특히, 상기 추출물은 인간 암 세포에서 DNA 합성을 감소시킬 수 있으며, 류코트리엔 및 IL-6 (인터류킨 6)의 생성을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 보다 놀랍게도, 휘발성 오일의 류코트리엔 합성의 억제가 블랙 쿠민 (black cumin; 니겔라 사티바 (Nigella sativa)) 시드 오일의 존재 하에 상승적으로 강화된다고 밝혀졌다.

특히, 그 자체에 의해 성장 인자로서 인터류킨 6을 생성하는 것으로 알려진 암 세포, 및 그 자체에 의해 류코트리엔을 생성하는 것으로 알려진 암 세포가 민감성이 되는 것으로 밝혀졌다. 카모마일 단독의 휘발성 오일, 및 블랙 쿠민 시드 오일과의 조합물은 예를 들어 염증, 면역질환 (immunopathy) 및 암의 치료에서 예상치 못했던 항-염증 및 항암 특성을 갖는 것으로 추론될 수 있다.

따라서, 본 발명은 아래 사항에 관한 것이다:

(1) 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료를 위한, 카모마일 꽃의 수성 추출물을 포함하는 조성물;

(2) (1)에 있어서, 수성 추출물이 휘발성 오일이며, 바람직하게는 감압 하에, 카모마일 꽃의 수증기 증류를 포함하는 추출 방법에 의해 얻을 수 있는 조성 물;

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 카모마일 꽃이 플로레스 투비포르미스인 조성물;

(4) (2) 또는 (3)에 있어서, 증기 증류가 질소 분위기 하에 수행되며, 상기 방법이

(i) 쿠마린과의 복합체를 형성하는 가교된 포비돈과 조성물을 접촉시키는 단계;

(ii) 단계 (i)에서 형성된 가교된 포비돈 및 쿠마린의 복합체를 제거하는 단계;

(iii) 단계 (ii)로부터 얻어진 조성물을 무수 황산나트륨과 접촉시켜 물 잔류물을 제거하는 단계; 및

(iv) 단계 (iii)에서 얻어진 조성물로부터 황산나트륨을 분리하는 단계

를 더 포함하는 것인 조성물;

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 블랙 쿠민 오일을 추가로 포함하는 조성물;

(6) (5)에 있어서, 블랙 쿠민 오일이

(i) 페놀계 화합물과의 복합체를 형성하는 가교된 포피돈과 블랙 쿠민 오일을 접촉시키는 단계;

(ii) 단계 (i)에서 형성된 크로스포비돈 및 페놀계 화합물의 복합체를 제거하는 단계;

(iii) 단계 (ii)로부터 얻어진 블랙 쿠민 오일을 무수 황산나트륨과 접촉시켜 물 잔류물을 제거하는 단계; 및

(iv) 단계 (iii)에서 얻어진 블랙 쿠민 오일로부터 황산나트륨을 분리하는 단계

를 포함하는 정제 방법에 의해 얻을 수 있는 정제된 블랙 쿠민 오일인 조성물;

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상태가 바람직하게는 크론 질환 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증성 상태인 것을 특징으로 하는 조성물;

(8) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상태가 바람직하게는 교모세포종, 폐암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 조성물;

(9) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 염증성 상태가 바람직하게는 인터류킨 6에 의해 촉발된, 보다 바람직하게는 류코트리엔에 의해 촉발된, 가장 바람직하게는 인터류킨 6 및/또는 류코트리엔의 존재에 의존성인 자가면역질환에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 조성물;

(10) (1) 내지 (6) 및 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상태가 바람직하게는 인터류킨 6에 의해 촉발된, 보다 바람직하게는 류코트리엔에 의해 촉발된, 가장 바람직하게는 인터류킨 6 및/또는 류코트리엔의 존재에 의존성인 증식성 장애에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 조성물;

(11) 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료용 의약의 제조를 위한 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에서 정의된 조성물의 용도;

(12) (11)에 있어서, 상태가 (7) 내지 (10) 중 하나에서 정의된 것과 같은 것인 용도;

(13) 유효량의 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에서 정의된 것과 같은 조성물을 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료가 필요한 인간 또는 동물 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료 방법; 및

(14) (13)에 있어서, 상태가 (7) 내지 (10) 중 하나에서 정의된 것과 같은 것인 방법.

본 발명은 바람직하게는 증기 증류에 의해 얻을 수 있는 카모마일 꽃 머리의 수성 추출물을 사용하여 얻어진 데이터를 기준으로 한다. 정확하게는, 수성 추출물은 문헌 [PhEur 5.1]에서 기재된, 당업자들에게 마트리카리아 이더롤륨 (Matricaria aetheroleum)으로도 알려진 마트리카리아 레쿠티타 엘. (Matricariae recutita L.)의 꽃 머리의 휘발성 성분으로 구성된다. 추가적으로, 본 발명은 블랙 쿠민 시드 오일 및 카모마일 꽃 머리의 휘발성 오일의 조합물을 사용하여 얻어진 데이터를 기준으로 한다.

추출물은 당업자들에게 알려진 방법을 비롯한 임의의 적합한 절차에 의해 얻을 수 있다. 추출물은 수성 또는 유기 매질을 사용하여 얻을 수 있으며, 여과, 크로마토그래피, 초임계 유체 추출 등에 의해 다른 성분으로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용할 수 있는 물질은 국화과 (Asteraceae) 식물 마트리카리아 레쿠티타 엘.의 건조된 꽃 머리, 또는 휘발성 오일, 카마줄렌, 비사볼론 및 다른 물질을 비롯한 그 안의 하나 이상의 물질로부터 유래된다. 바람직한 절차는 먼저 크로스포비돈 (가교된 포비돈) 및 황산나트륨과의 접촉에 의해 얻어진 휘발성 오일을 정제하는 것이다. 크로스포비돈은 페놀계 화합물 및 쿠마린과 복합체를 형성하는 것으로 당업자들에게 알려져 있다. 황산나트륨은 물 잔류물과 결합하는 것으로 알려져 있다. 정제 작용제의 분리는 쿠마린, 페놀 및 물 잔류물이 없거나 거의 없는 추출물을 얻는다. 카모마일 추출물의 원료는 중요하다. 이는 꽃 머리, 바람직하게는 마트리카리아 레쿠티타 엘. (플로레스 투비포르미스)의 관 모양의 꽃 (tubular flower)이어야 한다. 조성물은 카모마일의 휘발성 오일 이외에 활성 성분으로서 블랙 쿠민 시드 오일, 및 아세틸시스테인 및 아스코르빌 팔미테이트를 함유할 수 있다. 다른 작용제는 존재할 필요가 없다.

사용되는 조성물은 주사에 적합하여야 한다. 상기 목적을 위해, 내독소, 폴리페놀, 쿠마린 및 (당업자들에게 알려진 임의의 적합한 수단에 의한) 거대 분자량 성분, 예를 들어 1000 또는 10000 이상의 분자량을 갖는 성분을 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하기 위한 조성물은 당업자들에게 알려진 방법에 의해 제형화할 수 있다. 제약상 허용되는 성분을 사용하여야 한다. 용어 "제약상 허용되는"은 조성, 안정성, 환자 수용성 및 생체이용률과 같은 인자에 관하여 약리학/독성학 관점으로부터 환자에게 허용가능하며, 물리/화학 관점으로부터 제조 제약 화학자에게 허용가능한 성분 특성 및/또는 물질을 의미한다.

바람직하게는, 투여는 정맥내, 보다 바람직하게는 근육내 주사, 가장 바람직하게는 호흡관을 통한 에어로졸 또는 마이크로/나노-에멀션으로서의 흡입기에 의한 것이다.

활성 성분을 함유하는 제약 조성물은 경구 용도에 적합한 형태, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지제, 수성 또는 오일성 현탁제, 분산성 산제 또는 입제, 에멀션제, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르제일 수 있다. 이러한 조성물은 제약적으로 우아하며 맛 좋은 (palatable) 특성을 제공하기 위해 감미제, 풍미제, 착색제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 함유할 수 있다. 정제는 비-독성 제약상 허용되는 부형제, 예를 들어 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크와의 혼합 상태로서 활성 성분을 함유한다. 정제는 코팅되지 않거나, 또는 알려진 기법에 의해 코팅되어 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시키며, 이에 의해 보다 장기간에 걸친 지속된 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 이용할 수 있다. 또한, 이들을 코팅하여 제어 방출을 위한 삼투압 치료 정제를 형성할 수 있다.

또한, 경구 사용을 위한 제제는 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 것인 경질 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 것인 연질 젤라틴 캡슐로서 존재할 수 있다.

수성 현탁제는 적합한 부형제와의 혼합 상태로 활성 성분을 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐 피롤리돈, 트래거캔스검 및 아카시아검; 분산제 또는 습윤제, 예를 들어 천연 인지질, 예컨대 레시틴, 또는 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌과 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 또한, 수성 현탁제는 하나 이상의 보존제, 예를 들어 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 풍미제, 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.

오일성 현탁제는 식물성 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일, 또는 미네랄 오일, 예컨대 액체 파라핀 중에 활성 성분을 현탁하여 제제화 할 수 있다. 상기 오일성 현탁제는 증점제, 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제 (예컨대 상기 설명한 것들) 및 풍미제를 첨가하여 맛 좋은 경구 제제를 제공할 수 있다. 이들 조성물은 항산화제, 예컨대 아스코르브산의 첨가에 의해 보존할 수 있다.

물의 첨가에 의한 수성 현탁제의 제조에 적합한 분산성 산제 및 입제는 분산제, 습윤제, 현탁화제 및 하나 이상의 보존제와의 혼합 상태의 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제, 습윤제 및 현탁화제는 상기 예시되어 있다. 감미제, 풍미제 및 착색제 또한 존재할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용하기 위한 제약 조성물은 수중유 에멀션 형태일 수 있다. 오일성 상은 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일 또는 땅콩 오일, 또는 미네랄 오일, 예를 들어 액체 파라핀, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연 검, 예를 들어 아카시아검 또는 트래거캔스검, 천연 인지질, 예를 들어 대두, 레시틴, 및 에스테르, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 또한, 에멀션은 감미제 및 풍미제를 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭시르제는 감미제, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로스와 제제화 할 수 있다. 상기 제제는 또한 점활제, 보존제, 풍미제 및 착색제를 함유할 수 있다. 제약 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 오일성 현탁제 형태일 수 있다. 상기 현탁제는 적합한 분산제, 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 제제화할 수 있으며, 이의 예는 상기 언급되어 있다. 또한, 멸균 주사용 제제는 비독성 비경구 허용되는 희석제 또는 용매 중 멸균 주사용 용액제 또는 현탁제, 예를 들어 1,3-부탄디올 중 용액제일 수 있다. 이용할 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 추가적으로, 멸균 불휘발성 오일을 용매 또는 현탁화 매질로서 편리하게 이용한다. 상기 목적을 위해, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 비롯한 임의의 블랜드 (bland) 불휘발성 오일을 사용할 수 있다. 추가적으로, 지방산, 예컨대 올레산이 주사 제조에서 용도를 제공한다.

또한, 조성물은 약물의 직장내 투여를 위한 좌약제 형태로 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 통상적인 온도에서 고체이되 직장내 온도에서 액체이며, 이에 따라 직장에서 용융하여 약물을 방출하는 적합한 비-자극성 부형제와 약물을 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이다.

국소 사용을 위하여, 적합한 조성물은 예를 들어 크림, 연고, 젤리, 용액제 또는 현탁제 형태이다.

상기 언급된 것과 같이, 본 발명의 조성물은 주사로 주어질 수 있다. 임의의 비경구 투여가 적합하지만, 근육내 주사가 바람직하다.

또한, 조성물이 경구로 주어지는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 및 투과성-증가제를 사용하는 경우, 인슐린은 경구 제제에 포함되지 않아야 한다. 경구 투여는 수의학에서 특히 바람직할 수 있다.

또한 다른 활성 물질을 대상체에게 줄 수 있다. 비록 추가의 물질이 필요한 것으로 생각되지는 않지만, 통상적으로 경구로 주어지는 특정 스테로이드 및 비타민은 의약의 효과를 보조하거나 또는 증강시킬 수 있다. 적합한 스테로이드 호르몬은 필수 대사산물, 예컨대 비타민 및 아미노산의 보조 하에 특정 시스트론의 탈마스킹 (unmasking)에 의해 특정 단백질의 합성을 증가시킬 수 있다. 적합한 스테로이드의 예는 에스트라디올, 난드롤론 및 에스트리올이다. 비타민, 예컨대 A, D 및/또는 E 또한 주어질 수 있다. 비타민 A의 기능은 상피 조직의 보존을 유지하고, 단백질 합성에서 역할을 하며, 세포막 및 세포내 막을 안정화시키기 위한 것일 수 있다.

비록 일부 내용이 특정 물질의 적합한 투여량으로 주어지지만, 정확한 투여량 및 투여 주기는 여러 인자에 의존한다. 이들 인자에는 사용되는 특정 성분, 치료되는 특정 상태, 상태의 중증도, 특정 환자의 연령, 체중 및 일반적 신체 상태, 및 개체가 취할 수 있는 다른 투약이 포함되며, 당업계에 잘 알려져 있다.

도 1A는 마트리카리아 정유 (essential oil)에 대한 실시예 1에서의 IL-6 억제 복제 1의 결과를 나타낸다:

VIP_Matr'07_78

IC50 = 5 μg/ml (그래프 측정됨)

PRISM IC50 = 7.782 μg/ml (그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism)에 의해 계산됨)

95％ 구간 3.169 내지 19.11.

도 1B는 마트리카리아 정유에 대한 실시예 1에서의 IL-6 억제 복제 2의 결과를 나타낸다:

VIP_Matr'07_78

IC50 = 8 μg/ml (그래프 측정됨)

PRISM IC50 = 8.78 μg/ml (그래프패드 프리즘에 의해 계산됨)

95％ 구간 6.248 내지 12.35 μg/ml.

도 1C는 니겔라 정유에 대한 실시예 1에서의 IL-6 억제 복제 1의 결과를 나타낸다:

VIP_Nig'07_8

IC50 = 해당 없음

PRISM IC50 = 수렴되지 않음 (그래프패드 프리즘)

95％ 구간.

도 1D는 니겔라 정유에 대한 실시예 1에서의 IL-6 억제 복제 2의 결과를 나타낸다:

VIP_Nig'07_8

IC50 = 해당 없음

PRISM IC50 = 수렴되지 않음 (그래프패드 프리즘)

95％ 구간

도 2는 NICHA에 의한 5-LOX 활성의 억제를 시험하는, 실시예 2에서의 5-LOX 억제 분석으로부터 얻어진 결과를 나타낸다 (2 내지 4개 독립적 분석으로부터의 평균; ViP_E_Nig'07_8에 대하여 3개 독립적 5-lox 분석, VIP_Matr'07_78에 대하여 4개 독립적 5-lox 분석, 및 1:1 혼합물에 대하여 2개 독립적 5-lox 분석으로부터의 결과).

도 2A: ViP_Matr'07_78 (카모마일 오일), 복제 1

도 2B: ViP_Nig'07_8 (니겔라 사티바 오일), 복제 1

도 2C: ViP_Matr'07_78 (카모마일 오일), 복제 2

도 2D: ViP_Nig'07_8 (니겔라 사티바 오일), 복제 2

도 2E: 1:1 혼합물 (VIP_Matr'07_78:ViP_E_Nig'07_8)

도 3은 실시예 2에서의 NICHA 영향 하에 WST-1로 HL-60 세포에서의 생존율 분석으로부터 얻어진 결과를 나타낸다.

도 3A: ViP_Matr'07_78 (카모마일 오일)

도 3B: ViP_Nig'07_8 (니겔라 사티바 오일)

도 4는 실시예 3에서의 전립선암 세포 DU145에서의 DNA 합성에 대한 NICHA의 효과에 대해 얻어진 결과를 나타낸다.

도 4A: 24시간 인큐베이션, ViP_Matr'07_78 (카모마일 오일)

도 4B: 24시간 인큐베이션, ViP_Nig'07_8 (니겔라 사티바 오일)

도 4C: 48시간 인큐베이션, ViP_Matr'07_78 (카모마일 오일)

도 4D: 48시간 인큐베이션, ViP_Nig'07_8 (니겔라 사티바 오일)

도 5는 실시예 3에서 48시간 인큐베이션에서의 U-87MG에서의 DNA 합성에 대한 NICHA의 효과에 대한 얻어진 결과를 나타낸다.

도 5A: ViP_Matr'07_78 (카모마일 오일)

도 5B: ViP_Nig'07_8 (니겔라 사티바 오일)

도 5C: 1:1 혼합물 (VIP_Matr'07_78:ViP_E_Nig'07_8)

하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.

실시예 1 - 인터류킨 6 방출에 대한 THP1 (대식세포)에서의 억제 활성

샘플 및 참조 물질

시험 샘플	종류	공급자	품번	배치 번호	ViP 번호
니겔라 오일	니겔라 올레움	핸셀러 아게 (Haenseler AG)	26-4150-1	2006.08.0537	ViP_Nig'07_8
마트리카리아 정유	마트리카리아 이더롤륨 PhEur	핸셀러 AG	1-4925-2	2006.09.0181	ViP_Matr'07_78

참조 물질	주문 번호	배치 번호	공급자	분석
NDGA	74540	422 780/1 5400	플루카 (Fluka)	상이한 HL-60 세포에 대한 5-LOX 억제

IL-6 억제 분석

분석	세포주	샘플	분석에서의 세포 농도 (오일 중량 기준)	용매	복제
IL-6 억제^*	분화된 THP-1	Vip_Nig'07_8	300 ng, 3 μg, 30 μg/ml	EtOH abs.	2
IL-6 억제^*	분화된 THP-1	Vip_Matr'07_78	300 ng, 3 μg, 30 μg/ml	S.O.	2

* 2개의 독립적인 복제물 (independent replication)에서 분석을 수행하였다.

THP-1 세포에서의 IL-6 억제 분석

샘플을 PMA로 미리 분화된 세포 (인간 THP-1)와 함께 37℃에서 30분 동안 예비인큐베이션하였다 (0.125×10⁶ 세포/웰). LPS (1 ug/ml)와 함께 반응을 시작하 고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. LPS-자극 없는 분석 혼합물로 음성 대조군 t(0)을 수행하였다 [ref.1].

카이만 (Cayman) 번호: 583361로부터의 효소 면역 분석 (EIA) 키트로 IL-6의 정량을 수행하였다. 파장 415 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 5개 이상의 상이한 농도의 표준 곡선을 사용하여 양을 계산하였다.

각각의 샘플 점을 2중으로 측정하였다. 용량 관련 억제 값을 양성 대조군 값의 백분율로서 표현하였다. IC50 값 (억제 수준이 50％인 샘플 농도에 해당함)을 그래프패드-프리즘 프로그램 (버전 4, 그래프패드 소프트웨어 인크. (GraphPad Software Inc.; 미국 캘리포니아주 샌 디에고 (San Diego, CA, USA) 소재)으로 측정하였다.

결과

실시예 1에 대한 결과를 도 1에 나타낸다.

실시예 2 - 류코트리엔 방출에 대한 인간 암세포주에서의 NICHA 001의 억제 활성

류코트리엔 방출에 대하여 상이한 NICHA 농도 하의 2개 인간 세포주 (과립백혈구)의 반응을 연구하였다. 각 실험을 니겔라 오일, 카모마일 오일, 및 상기 두 오일의 조합물로 수행하였다.

샘플

시험 샘플	종류	공급자	품번	배치 번호	ViP 번호
니겔라 오일	니겔라 올레움	핸셀러 AG	26-4150-1	2006.08.0537	ViP_Nig'07_8
마트리카리아 정유	마트리카리아 이더롤륨 PhEur	핸셀러 AG	1-4925-2	2006.09.0181	ViP_Matr'07_78

분석

분석	세포주	샘플	시험 농도
5-LOX 억제	과립백혈구 분화된 HL60	ViP_Nig'07_8 ViP_Matr'07_78 혼합물	0,3 / 3 / 30 μg/ml 0.1 / 0.3 / 1 / 3 /10 / 30 μg/ml 0,3 / 3 / 30 μg/ml
WST-1 분석	HL-60 세포	ViP_Nig'07_8 ViP_Matr'07_78	0,3 / 3 / 30 μg/ml

5-LOX 억제 분석

인간 HL-60 세포 (골수성 백혈병, DSMZ No ACC 3)을 5％ CO₂를 갖는 습윤 분위기 중 37℃에서 유지시키고, 10％ 소 태아 혈청 및 1％ (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 용액으로 보강된 완전 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 세포를 6 내지 8일 동안 DMSO (1.2％ v/v)로 분화시켰다. 베넷 (Bennet) 등의 [ref: 2]에 의해 기재된 것과 같이 5-LOX 활성 분석을 수행하였다. 요약하면, 분화된 세포를 수확하고, Ca²⁺ (1 mM) 및 글루코스 (1 mM)를 함유하는 PBS에 현탁시키고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (1×10⁶ 세포/웰)에 분배하였다.

샘플 또는 비히클과 실온에서 15분 동안 예비인큐베이션한 이후, 칼슘 이온 투과 담체 (ionophore) A 23187 (5 uM) 및 아라키돈산 (10 uM)을 첨가하여 반응을 시작하였다. 모든 값은 최종 농도였다. 음성 대조군은 칼슘 이온 투과 담체 자극 없이 수행하였다. 분석 혼합물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, HCl 함유 메탄올 100 μl (1 M, 3％ v/v)를 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트를 얼음에 두어 종결시켰다. 50 μl PBS로의 중화 및 10분 동안 원심분리 (340×g)한 이후, 상층액에서의 LTB₄ 농도를 측정하였다.

분석 조건 하에 생성된 류코트리엔 B₄의 양을 측정하여 5-LOX의 활성에 대한 샘플 및 참조 화합물 [ref: 3]의 효과를 측정하였다. 카이만 번호: 520111 (LTB₄)로부터의 효소 면역 분석 (EIA) 키트를 사용하여 류코트리엔 B₄의 정량을 수행하였다. 파장 415 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 5개 이상의 상이한 농도의 표준 곡선을 사용하여 양을 계산하였다. 샘플 점을 2중으로 측정하였다. 용량 관련 억제 값을 양성 대조군 값의 백분율로서 표현하였다. 적당한 경우, IC₅₀ 값 (억제 수준이 50％인 샘플 농도에 해당함)을 그래프패드-프리즘 (버전 4, 그래프패드 소프트웨어 인크 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재))으로 측정하였다.

WST-1로의 HL60에 대한 생존율 분석

세포 기능/미토콘드리아: 인간 간 세포 (Hep G2), 인간 과립백혈구 (분화된 HL60), 인간 단핵구 (THP-1) 및 인간 대식세포 (분화된 THP-1)에서 테트라졸륨 염 WST-1 키트 (바이오비전 (Biovision), K301-500, 미국 캘리포니아주)로 대사 활성의 감소 [ref: 4]를 시험하였다. 세포를 24시간 동안 추출과 함께 예비인큐베이션 하였다.

테트라졸륨 염 WST-1을 포르마잔으로 환원시키는 살아있는 세포의 능력에 의해 세포의 대사 활성을 측정하였다. λ = 450 nm의 파장에서 플레이트 리더 (BioRad, USA)로 광학 밀도 (OD)를 측정하여 포르마잔의 양을 직접 측정하였다.

광학 측정을 3중으로 수행하였으며, 표준 편차를 계산하였다. 각 시험 농도에 대하여, 블랭크 (세포 부재하의 샘플과의 분석 혼합물)의 OD값을 세포와의 OD 측정치의 평균값으로부터 차감하였다. 샘플 부재의 대조군의 측정치에 해당하는 100％의 생존율 판독값으로 OD450 값을 백분율 값으로 변환시켰다.

결과

실시예 2의 결과를 도 2 및 3에 나타낸다.

5-LOX 억제 분석으로부터 얻어진 IC₅₀ 값:

실시예 3 - 인간 암세포주의 증식에 대한 NICHA 001의 영향

상이한 농도의 NICHA 하에 교모세포종 세포 및 전립선암 세포의 증식성 반응을 연구하였다. 니겔라 오일, 카모마일 오일, 및 두 오일의 조합물로 각 실험을 수행하였다.

샘플

분석

분석	세포주	샘플	시험 농도
DNA 합성	전립선암 세포 DU145	ViP_Nig'07_8	0.3 / 3 / 30 μg/ml
		ViP_Matr'07_78	0.3 / 3 / 30 / 60 μg/ml
	교모세포종 세포 U-87 MG	ViP_Nig'07_8 ViP_Matr'07_78 혼합물	0.3 / 3 / 30 μg/ml

DNA 합성

³H-티미딘 혼입: 트립신처리 (trypsinisation)에 의해 DU145 및 U-87MG 세포를 수확하고, 10000 세포/웰로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 37℃ 및 5％ CO₂에서 24시간 및/또는 48시간 동안 원하는 농도에서 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 24시간 동안 ³H-티미딘 (1 μCi/ml) (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer))과 함께 펄싱 (pulse)하였다. 이후, 이를 PBS로 세척하고, 5분 동안 메탄올로 2회 고정시켰다. 0.3 N TCA에 의해 단백질을 침전시켰다. 세척 단계 이후, 0.3 N NaOH 150 μl를 15분 동안 첨가하여 세포를 용균시켰다. 바탕 대조군을 세포 없이 샘플로 측정하였다.

DNA 합성에 대해 혼입된 ³H-티미딘을 검출하기 위해, 샘플을 섬광 칵테일을 갖는 섬광 튜브에 옮겼다. Tri-Carb 1900 TR 액체 섬광 계수기 (패커드 (Packard; 미국))에서 정량을 수행하였다.

분석 조건 하에 방사성표지의 양 (dpm)을 측정하여 여러 농도의 샘플의 효과를 측정하였다. 용량 관련 값을 양성 대조군 값의 백분율로서 표현하였다. 샘플 점을 4중으로 측정하였으며, 오차를 표준 편차로 표현하였다.

전립선암 세포 DU145에 대해 얻어진 결과

전립선암 세포 (DU145)에서의 DNA 합성에 대한 NICHA의 효과의 결과를 도 4A 내지 4D에서 나타낸다.

DNA 합성에 대한 참조 화합물의 IC₅₀ 값은 아래와 같다:

교모세포종 세포 U87MG에 대해 얻어진 결과

U-87MG 세포에서의 DNA 합성 (48시간 인큐베이션)에 대한 NICHA의 효과의 결과를 도 5A 내지 5C에서 나타내었다.

U-87MG 세포로의 DNA 합성에 대한 참조 화합물의 IC50 값은 아래와 같다:

실시예의 결과로부터의 결론

카모마일 정유 (마트리카리아 레쿠티타: VIP_Matr07_78) 및 블랙 쿠민 시드 오일 (니겔라 사티바: VIP_Nig07_8)을 분회된 인간 과립백혈구 세포주 HL60 (인간 급성 골수성 백혈병)에서 류코트리엔 합성을 억제하는 그의 잠재력에 대해 연구하였다. 니겔라 사티바 시드 오일은 3.02 ug/ml의 IC50값 (실시예 2, 도 2d)으로 5-Lox 활성의 강한 억제를 나타내었다. 놀랍게도, 2개 성분의 혼합물은 첨가제보다 L60 과립백혈구 세포주에서 류코트리엔의 합성을 더 억제하였다. 0.76 ug/ml의 IC50 예상치 대신, 0.53 ug/ml의 IC50을 얻었다 (실시예 2, 도 2e). 2개 화합물의 조합물이 단일 성분의 활성을 강화시킨다고 결론지을 수 있다.

VIP_Matr07_78은 류코트리엔 합성의 억제에 대해 보다 높은 억제 활성을 나타내었으며, 0.38 ug/ml의 IC50값을 나타내었다 (실시예 2, 도 2c). 이에 따라 마트리카리아 정유는 매우 강력한 5-LOX 억제제가 되는 것으로 생각된다.

관측된 억제 활성이 세포독성 효과에만 의한 것인지 평가하기 위해, 세포를 5-LOX 실험에 대해 선택된 농도로 인큐베이션하고, 미토콘드리아 활성 (WST)을 측정하였다. 도 3a 및 3b에서 나타난 것과 같이, 세포독성은 선택된 농도에서의 VIP_Nig07_8 또는 VIP_Matr07_78로 발생하지 않았다 (실시예 2, 도 3a 및 3b). 류코트리엔 합성을 억제하기 위한 관찰된 활성이 5-리폭시게나제와의 특정한 상호작용의 결과라고 결론지을 수 있다.

또한, 인간 대식세포 세포주 THP1에 의한 인터류킨 6 방출에 대해 추가의 결과를 얻었다. 니겔라 사티바는 활성 없음을 나타낸 반면 (실시예 1 도 1c 및 1d), 마트리카리아 레쿠티타는 용량 의존 방식 및 5 ug/ml의 IC50값으로 THP1 세포로부터 인터류킨 6 방출을 억제하였다 (실시예 1, 도 1a 및 1b). 반복 실험 (복제 2)은 복제 1의 결과의 재현성을 나타내었다 (실시예 1)

결과는 마트리카리아 레쿠티타 정유가 인간 급성 골수성 백혈병 세포 HL60에서 류코트리엔 합성에 대한 강력한 억제 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다 (실시예 2, 도 2C). 추가적으로, 결과는 인터류킨 6의 방출이 인간 대식세포 세포주 THP1에서 억제될 수 있다는 것을 나타낸다 (실시예 1, 도 1a 및 1b).

억제 효과를 얻는데 필요한 농도가 상당히 낮기 때문에, 치료 유효 용량은 특히 정유가 매우 친지성이며 쉽게 흡수될 것이기 때문에 사람에서 어렵지 않게 도달할 것이라고 생각된다.

인간 과립백혈구 세포주 HL60에서 나노몰 범위의 농도로 에이코사노이드 (류코트리엔)의 형성을 효과적으로 억제하는 정유의 특성과 함께, 마트리카리아 레쿠티타 정유는 염증성/자가면역 질환 및 특정 유형의 암의 치료에 대한 약물의 개발에 대한 매우 가치있는 후보가 되는 것으로 보인다.

제3 세트의 실험 (실시예 4)은 니겔라 사티바 시드 오일 또는 마트리카리아 레쿠티타 휘발성 오일이 전립선암 세포주 DU 145 및 교모세포종 세포주 U87MG에서 DNA 합성을 억제하는지를 시험관내 연구하였다. 마트리카리아 레쿠티타 (VIP_Matr07_78)가 용량 의존적 방식으로 DNA 합성에 대하여 48시간 이후 세포주 모두에서 억제시킨 반면 (실시예 4, 도 4c), 니겔라 사티바 (VIP_Nig07_8)는 두 암세포주 모두에서 억제 효과를 나타내는데 실패한다. DU145가 성장 인자로서 인터 류킨 6을 생성하는 것으로 알려져 있기 때문에, DNA 합성의 억제는 마트리카리아 레쿠티타의 휘발성 오일의 인터류킨 6 방출에 대한 억제 활성에 의해 (적어도 일부) 유발된다. 명백하게, 교모세포종 세포주 U87MG의 DNA 합성의 억제는 마트리카리아 레쿠티타의 휘발성 오일에 의한 류코트리엔 합성의 강한 억제의 효과가 있다.

Claims

- 카모마일 꽃의 수증기 증류를 포함하는 추출 방법에 의해 얻을 수 있는 휘발성 오일인, 카모마일 꽃의 수성 추출물, 및

- 블랙 쿠민 오일

을 포함하는, 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료를 위한 조성물.
제1항에 있어서, 카모마일 꽃이 플로레스 투비포르미스 (Flores tubiformis)인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 수증기 증류가 감압 하에 수행되는 것인 조성물.
제3항에 있어서, 증기 증류를 질소 분위기 하에 수행하며, 상기 방법이

(i) 쿠마린과의 복합체를 형성하는 가교된 포비돈과 조성물을 접촉시키는 단계;

(ii) 단계 (i)에서 얻어진 복합체를 제거하는 단계;

(iii) 단계 (ii)로부터 얻어진 조성물을 무수 황산나트륨과 접촉시켜 물을 제거하는 단계; 및

(iv) 단계 (iii)에서 얻어진 조성물로부터 황산나트륨을 분리시키는 단계

를 더 포함하는 것인 조성물.
제4항에 있어서, 0.1 중량％ 미만의 물을 함유하는 조성물.
제5항에 있어서, 0.01 중량％ 미만의 쿠마린 (7-히드록시쿠마린으로서 계산됨)을 함유하는 조성물.
제5항에 있어서, 카마줄렌을 5 내지 15 중량％의 양으로 함유하는 조성물.
제1항에 있어서, 블랙 쿠민 오일이

(i) 페놀계 화합물과의 복합체를 형성하는 가교된 포비돈과 블랙 쿠민 오일을 접촉시키는 단계;

(ii) 단계 (i)에서 얻어진 복합체를 제거하는 단계;

(iii) 단계 (ii)로부터 얻어진 블랙 쿠민 오일을 무수 황산나트륨과 접촉시켜 물을 제거하는 단계; 및

(iv) 단계 (iii)에서 얻어진 블랙 쿠민 오일로부터 황산나트륨을 분리시키는 단계

를 포함하는 정제 방법에 의해 얻을 수 있는 정제된 블랙 쿠민 오일인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 한외여과에 의해 얻을 수 있는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 내독소가 없거나 또는 100 EU/ml (Ph. Eur.에 따른 1 ml 당 내독소 단위) 이하의 양으로 내독소를 함유하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 10,000 초과의 분자량을 갖는 물질을 함유하지 않는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 쿠마린, 플라보노이드, 카모마일 및/또는 블랙 쿠민의 통상적 불순물인 다른 폐놀계 화합물, 및 잔류 물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 없는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 아스코르빌 팔미테이트 및/또는 아세틸시스테인을 더 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 제약 보조제를 더 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 치료가 조성물의 주사 또는 흡입에 의한 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상태가 염증성 상태인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상태가 암인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 염증성 상태가 자가면역질환에 의해 유발된 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상태가 증식성 장애에 의해 유발되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에서 정의된 것과 같은 조성물을 함유하는, 증식성 및/또는 염증성 상태의 치료용 의약.
제15항에 있어서, 주사용 조성물인 조성물.
제14항에 있어서, 하나 이상의 제약 보조제가 약제 및 제약 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제16항에 있어서, 염증성 상태가 크론 질환 (Morbus crohn) 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제17항에 있어서, 암이 교모세포종, 폐암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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