KR101555872B1 - 고욤잎 추출물을 함유하는 항알레르기용 또는 항가려움용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고욤잎 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 고욤잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항알레르기 효과 ? 항가려움 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.

Description

고욤잎 추출물을 함유하는 항알레르기용 또는 항가려움용 조성물{Composition comprising Diospyros lotus L. leaf extract for anti-allergy or anti-pruritic}

본 발명은 고욤잎 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 고욤잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항알레르기 효과 및 항가려움 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.

알레르기성 질환(allergic disease)은 자가면역질환(autoimmune disease), 교원병(collagen disease) 등을 포함하여 아나필락시스쇼크, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 피부질환(allergic skin disease)등이 이에 해당 되는데, 전 세계적으로 22%가 알레르기성 질환에 노출되어있다. 이와 같이 알레르기성 질환이 폭발적으로 증가하는 이유는 환경오염, 식생활 및 생활환경의 변화로 인한 알레르겐(allergen)의 증가요인을 들 수 있는데, 알레르겐에 감작되어 일어날 수 있는 피부질환은 접촉피부염(contact dermatitis), 아토피피부염(atopic dermatitis), 지루성피부염(seborrheic dermatitis) 및 건조피부염(xerotic dermatitis) 등 습진(eczema)을 비롯한 두드러기(urticaria)을 대표적으로 들 수 있다. 특히 유아 및 어린이에 알레르겐(allergen)이 피부에 감작되면, 가려움증과 염증을 동반할 수 있는데, 지속적으로 알레르겐에 감작되면, 그 증상이 악화와 완화가 반복적으로 일어나는 아토피 피부염으로 진행되어 신체 및 심리 발달 장애를 유발할 수 있다.

어린 시기에 유발되는 아토피 피부염은 적절한 예방과 관리가 이루어지지 않으면, 아토피 또는 알레르기 행진(atopic or allergic march)이라 하여 알레르기성 비염, 천식 및 결막염 등 알레르기성 질환으로 이어질 수 있다. 즉, 피부에 알레르겐이 감작(senstization)되면, 피부발진과 가려움을 통해 염증반응이 가속되어 아토피 피부염이 유발될 수 있는데, 지속적으로 피부와 호흡기에 알레르겐이 감작되면 천식을 비롯한 알레르기성 비염 등 호흡기 질환이 발생될 수 있으며, 안구주위에 전이되어 알레르기성 결막염을 야기할 수 있다.

이러한 알레르기성 피부염의 면역학적 특징은 type 2 helper T (Th2) 세포와 같은 협조유도세포의 편향된 발달을 비롯한 비만세포(mast cells)의 과도한 활성화 등 면역불균형(immune disorder)에 의한 급성 및 만성 염증반응(acute/chronic inflammatory response)을 일으키는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염은 염증유발과 동시에 심한 가려움증을 동반하면서 피부장벽을 붕괴하여 그 증상을 더욱 악화시키는데 문제가 있다.

비만세포는 아토피 피부염을 비롯한 대부분의 알레르기성 질환에서 급성 및 만성 염증 질환을 일으키는 핵심적으로 참여하는 세포로 알려졌다. 비만세포가 활성화되면, tumor necrosis factor (TNF)-α), interleukin (IL)-1와 IL-6 등 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 생성뿐만 아니라 히스타민과 같은 가려움 유발물질(pruritogen)을 방출한다. 이와 같이 비만세포 유래 염증성 사이토카인은 염증반응을 더욱 촉진시키는 동시에 히스타민과 같은 가려움 유발물질은 가려움증을 더욱 촉진시켜 피부장벽을 붕괴시키는 원인이 된다. 따라서 부작용 없이 염증성 사이토카인과 가려움 매개물질을 억제시킬 수 있는 물질을 발굴한다면, 아토피 피부염을 비롯한 각종 알레르기성 질환을 제어하는데 효과적일 것이다.

고욤나무(Diospyros lotus L.)은 우리나라와 중국을 비롯한 아시아에서 자연적으로 자생하는 낙엽성 식물로 전통의약분야에서는 성숙한 과일인 고욤은 진정, 진통, 수렴 및 변비치료에 사용되어 왔다. 고욤의 생화학적 성분은 지방산, 당, 플라보노이드 및 비 휘발성 물질이 보고되었고, 최근에는 혈액의 항응고, 뇌세포 보호 작용, 항산화 및 항암효과에 대한 보고가 있다. 그러나 고욤잎 추출물을 대상으로 항알레르기 및 항가려움증 등에 대한 보고는 전혀 없다.

이에 본 발명자들은 부작용없이 염증성 사이토카인과 가려움 매개물질을 억제할 수 있는 천연 물질을 연구하던 중, 고욤잎 추출물이 세포에 독성 없이 염증성 사이토카인과 가려움 유발물질을 현저하게 억제함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 고욤잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항알레르기 효과 및 항가려움 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 고욤잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 고욤잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항알레르기용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 고욤잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항가려움용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 사용하는 고욤잎 추출물은 고욤나무(Diospyros lotus L.)의 잎으로부터 추출하여 얻는 것이며, 상기 고욤잎 추출물의 추출은 당업계의 통상적인 추출방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어 80℃ 이상의 고온 추출, 25℃ 이하의 저온 추출, 초음파추출, 침지추출, 벤젠 또는 에탄올과 같은 유기용매를 이용한 침지추출 등에 의할 수 있으며, 바람직하게는 80~100℃ 에서 10분간 열수추출에 의할 수 있다.

본 발명에 따른 고욤잎 추출물은 비만세포의 활성을 저해하며, 염증 반응에 관여하는 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IgE 등의 생성을 억제하고, 히스타민과 같은 가려움증 유발물질의 방출을 억제하여 알레르기 반응에 의한 염증 반응을 제어하며, 가려움증을 억제하여 아토피 피부염을 비롯한 알레르기성 질환의 제어에 효과적이다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적 조성물일 수 있으며, 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 피부 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 및 피부에 직접 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 고욤잎 추출물은 1일 25mg/kg 내지 1,000 mg/kg으로, 바람직하게는 200mg/kg 내지 500mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 고욤잎 추출물은 약제학적 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 0.01중량% 미만이면 그 효과가 미미하고, 10 중량% 초과이면 함량의 증가에 비해 효과의 차이가 크지 않다.

본 발명에 따른 조성물은 고욤잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 독성이나 부작용 없이 염증성 사이토카인과 가려움 매개물질을 억제하는 효과가 우수하기 때문에 아토피 피부염을 비롯한 각종 알레르기성 질환을 치료 또는 제어하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 고욤잎 추출물의 비만세포 생존율에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 고욤잎 추출물의 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 고욤잎 추출물의 히스타민 방출 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 고욤잎 추출물의 가려움증 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 DNFB 염증 모델 마우스에서의 피부 병변(A), 피부 조직 두께(B), 백혈구 침윤(C) 및 비만세포 침윤(D) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 DNFB 염증 모델 마우스에서의 IgE 및 IL-4 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 7의 A는 마지막 DNFB 공격 후 6시간 지난 시점의 정상 대조군과 추출물 투여군 마우스의 피부 상태를 찍은 사진이고, B는 마우스 피부조직을 H&E로 염색한 X100 배율 사진이며 백혈구의 침윤 상태를 나타내며, C는 톨루이딘 블루로 염색한 X400배율 사진으로 비만세포의 침윤상태를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명하나, 이러한 실시예 또는 시험예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1] 고욤잎 추출물의 제조

실험에 사용한 고욤(D. lotus L.)은 전라북도 진안군 부귀면 수항리 신기마을에서 2012년 6월 30일에 채취하였다. 고욤잎의 동정은 마을 주민으로부터 고욤나무을 확인한 후 최종적으로 우석대학교 한의과대학 본초방제학교실 김홍준 교수님으로부터 동정을 받았다. 고욤잎 표본(#2012-0630)은 전주대학교 대체의학대학 보건관리 연구실에 보관하고 있다. 채취된 고욤잎은 즉시 증류수로 세척한 후 5분간 증기찜을 한 후 실온에서 선풍기를 활용하여 건조하였으며, 최종적으로 건조기에서 40℃로 12시간 동안 건조하였다. 건조된 고욤잎은 200g으로 정량하여 증류수 2,000㎖를 주입하고 5분간 끓인 후 추출물은 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 동결건조기(Model, EYELA FDU-2100, Japan)에서 건조하여 19.5 g을 회수한 후 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

[참고예 2] 실험 동물 및 시약

무균환경에서 사육된 7주령의 수컷 무모마우스(hairless mouse) 와 ICR 마우스 및 10주령의 Sprague Dawley 래트는 중앙실험동물(주)(서울시, 대한민국)에서 구입하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육환경은 낮과 밤의 주기를 12시간씩 하였고, 온도(20-22℃)와 습도(50-60%)는 일정하게 유지하였으며, 실험동물위원회의 규정에 준하여 실험하였다.

Tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1), il-6 및 histamine 등 ELISA kit은 R&D Systems사(Minneapolis, USA)로부터 구입하였으며, compound 48/80, histamine, methysergide maleate, percoll, compound 48/80, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), calcium ionophore A23187, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB), dimethyl sulfoxide (DMSO), penicillin/streptomycin, hematoxylin & eosin, toluidine blue와 기타 시약은 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

[참고예 3] 복강비만세포(RPMCs)의 분리

상기 참고예 2에서 준비된 수컷 Sprague Dawley 래트로부터 복강비만세포(rat peritoneal mast cells, RPMCs)를 Martynova 등의 방법에 따라 분리하였다. 보다 구체적으로는, 상기 래트를 에테르(ether)로 마취시킨 다음 calcium-free HEPES-Tyrode buffer(10 mM Hepes, 113 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.13 mM MgCl₂, 0.6 mM NaH₂PO₄, 10 mM glucose, pH 7.4) 10㎖를 복강에 주입시켜 약 90초간 복강을 부드럽게 마사지한 후 복강을 주의 깊게 열어 파스퇴르 파이펫(Pasteur pipette)을 사용하여 세포부유액을 취하고 Percoll density gradient법으로 복강비만세포(RPMCs)를 얻었다. 실험에는 5~10마리 래트에서 얻은 복강비만세포를 혼합하여 사용하였다.

[시험예 1] 비만세포 생존율에 대한 효과

본 발명에 따른 고욤잎 추출물이 비만세포 생존율에 미치는 효과를 확인하기 위하여 MTT assay 법에 의하여 세포 생존율을 측정하였다.

보다 구체적으로는, 상기 참고예 3에서 분리된 래트 복강비만세포(RPMCs) 5×10⁵/㎖를 24웰(well) 배양 용기에 접종하고, 상기 참고예 1에 따른 고욤잎 추출물을 각각 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖의 농도로 처리한다. 상기 고욤잎 추출물 처리 후 2시간이 경과하였을 때 RPMCs 탈과립 유도 물질로 알려진 PMA 30 ng/㎖ 및 A23187 10 μM을 혼합하여 처리하고 12시간 후, MTT 용액 5㎎/㎖를 주입하여 4시간 동안 37℃에서 방치한 후, 상층액을 제거하고 포르마잔 산물을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 용해한 후 96웰 플레이트로 옮겨 ELISA reader(Molecular Divices, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하여 무처리군의 흡광도를 100으로 하였을 때 실험군의 흡광도를 백분율로 나타내어 세포 생존율을 산출하였으며, 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 A는 복강비만세포에 고욤잎 추출물만을 각 농도로 처리한 군에 대해 추출물 처리 후 24시간 경과 후에 PMA 및 A23187 투여를 제외하고 상기와 동일한 방법으로 MTT assay법에 따라 세포 생존율을 산출한 것으로서, 본 발명에 따른 고욤잎 추출물이 세포 독성이 없음을 확인할 수 있다.

도 1의 B의 결과에서, 비만세포의 탈과립 유도물질로 알려진 PMA 및 A23187로 처리한 경우 세포 생존율은 약 83%로 정상대조군(무처리군)에 비해 세포 생존율이 저하 되었으나, 고욤잎 추출물을 처리할 경우 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가됨을 확인할 수 있다. 특히 100㎍/㎖이상의 고욤잎 추출물 농도에서는 유의하게 세포 생존율이 증가 됨을 알 수 있다(p<0.05, p<0.01).

[시험예 2] 전염증성 사이토카인 생성 억제 효과

본 발명에 따른 고욤잎 추출물의 전염증성 사이토카인 생성 억제 효과를 확인하기 위하여 ELISA를 통해 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β의 양을 측정하였다. 보다 구체적으로는 상기 참고예 3에서 분리된 복강비만세포(RPMCs) 5×10⁵/㎖에 상기 참고예 1에 따른 고욤잎 추출물을 각각 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖의 농도로 처리하여 2시간 경과 후, PMA 30ng/㎖ 및 A23187 10μM을 처리하여 12시간 후, 세포 상층액을 얻는다. 상기 세포 상층액을 각각 anti-mouse TNF-α, anti-mouse IL-1β 항체가 코팅된 플레이트에 주입하여 반응시킨 후, 세척하여 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체(Rabbit Anti-mouse IgG)를 주입하여 반응시킨 후, 발색 기질로서 테트라메틸벤지딘(tertramethylbenzidine; TMB)을 주입하여 반응시켜 ELISA reader(Molecular Divices, USA)로 측정하였다. 각 물질의 농도별 표준곡선을 정하고 세포 상층액에 함유된 물질의 양을 계산하여 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 결과에서, PMA와 A23187를 처리한 비교예는 아무런 약물을 처리하지 않은 정상 대조군(무처리군)에 비해서 TNF-α 와 IL-1β 의 생성이 현저히 증가(p<0.001)한 반면, 고욤잎 추출물을 처리한 실험군은 농도 의존적으로 TNF-α와 IL-1β의 생성이 억제되었다. TNF-α의 경우 100㎍/㎖ 이상의 처리군에서 유의한 억제 효과를 나타냈으며(p<0.05와 p<0.01). IL-1β는 50μ㎍/㎖ 이상의 농도에서 현저히 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있다(p<0.05, p<0.01과 p<0.001).

[시험예 3] 히스타민 방출 억제 효과

본 발명에 따른 고욤잎 추출물의 가려움증 유발 핵심 물질인 히스타민에 대한 방출 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기 참고예 3에서 분리된 복강비만세포(RPMCs) 5×10⁵/㎖에 상기 참고예 1에 따른 고욤잎 추출물을 각각 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖의 농도로 처리하여 37℃에서 10분 경과 후, compound 48/80을 0.5㎍/㎖ 처리하여 30분간 방치하고, 반응을 중지시키기 위해 배양 튜브를 빙수에 넣어 충분히 냉각시킨 후 1,200rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻어 히스타민 양을 측정하였다. 히스타민 양의 측정은 상기 상층액을 anti-histamine 항체로 코팅된 플레이트에 주입하여 반응시키고, anti-histamine 항체에 특이적으로 작용하는 2차 항체로서 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)가 부착된 Rabbit Anti-mouse IgG를 주입하여 반응 시킨 후, 발색 기질로서 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조익애씨드)(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB)를 반응시켜 발색시키고, R&D 사가 제공하는 ELISA 법에 따라 ELISA reader(Molecular Divices, USA)로 히스타민 양을 측정하고 정량하여 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과에서, RPMCs를 compound 48/80로 자극할 경우 히스타민 방출량은 정상 대조군(무처리군)에 비해서 현저히 증가하며(p<0.001), 본 발명에 따른 고욤잎 추출물을 처리한 경우 농도 의존적으로 히스타민 방출 억제 효과가 나타나며, 특히 200㎍/㎖ 처리군에서 히스타민 방출 억제효과가 매우 현저하게 나타남을 알 수 있다(p<0.001).

[시험예 4] 가려움증 억제 효과

본 발명에 따른 고욤잎 추출물의 가려움증 억제 효과를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

상기 참고예 2에서 준비된 ICR 마우스를 실험군당 5마리씩 각각 투명 아크릴 케이지(20×26×13cm)에 한마리씩 넣고, 30분 동안 동일 환경에서 방치하여 안정시켰다. 그 후 대조군으로서 생리식염수를 경구투여 하였고, 실험군으로서 상기 참고예 1에 따른 고욤잎 추출물을 각각 0㎎/㎏, 50㎎/㎏, 100㎎/㎏, 200㎎/㎏씩 경구투여하고, 60분 후에 compound 48/80을 50㎍/site 또는 히스타민 100㎍/site 농도로 0.10㎖씩 마우스 등의 양쪽 어깨 사이 높이에 피하주사(s.c. injection) 하여 가려움증을 유발하였다.

가려움증 유발물질을 주사한 마우스는 곧바로 Mihara의 방법을 따라 micro-camera (ONCCTV, 서울, 대한민국)를 사용하여 60분 동안 녹화하였으며, 뒷발로 가려움증 유발물질이 주입된 부위를 긁는 횟수를 이중맹검법으로 계수하여 결과를 도 4에 나타내었다. 각 유발물질에 따른 실험은 각각 다른 날에 진행되었으며 매 실험에 사용된 마우스는 1회 사용되었다.

도 4의 결과에서, compound 48/80 또는 히스타민을 피하에 주입한 마우스는 정상 대조군(무처리군) 비해서 긁는 횟수가 현저히 증가하였다(p<0.001). 그러나 고욤잎 추출물을 투여한 실험군은 가려움증을 농도에 의존적으로 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(p<0.05, p<0.01과 p<0.001).

[시험예 5] DNFB 염증 모델 마우스의 항염증 효과

본 발명에 따른 고욤잎 추출물이 화학적 항원인 DNFB 유도 알레르기 모델 마우스에서 피부병변 억제 및 관련 매개물질의 생성 억제효과가 있는지 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

상기 참고예 2에서 준비된 7주령 수컷 무모마우스(nude mouse)의 등 쪽 피부에 아세톤:올리브 오일을 3:1로 제조한 용매를 사용하여 0.15% 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB)를 제조하여 1일과 4일에 각각 100㎕씩을 피부에 도포하여 감작(sensitization)시킨다. 두번째 감작일인 4일부터 대조군은 생리식염수만을 0.2 ㎖/마리로 복강에 하루에 한번 실험 종료일까지 주사하였으며, 실험군으로서 상기 참고예 1에 따른 고욤잎 추출물을 50㎎/㎏, 100㎎/㎏, 200㎎/㎏의 농도로 복강에 하루에 한번 실험 종료일인 13일까지 주사하였다. 또한 첫 번째 감작일로부터 7일, 10일과 13일에 3일 간격으로 0.2% DNFB를 감작시킨 부위에 같은 용량으로 공격(challenge)을 하였다.

<피부 병변 평가>

0주째부터 1주 간격으로 4주 동안 사진을 찍어 피부상태를 조사하였다. 최종공격 후 6시간 경과 후 피부의 건조상태(dryness)와 스켈링(scaling) 그리고 미란(erosion), 찰과상(excoriation), 출혈 등을 체크하여 병변이 없는 상태를 0점(none), 가벼운 상태를 1점(mild), 중간 상태를 2점(moderate), 심한상태를 3점(severe)을 주었고 각 단계별로 총점수를 부여하여 평가하였으며 결과를 도 5의 A에 나타내었다.

<피부 조직의 두께 측정>

상기 최종 공격 후 5시간 후에 등 피부조직의 두께를 digital caliper (Mitutoyo, Japan)를 사용하여 측정하여 도 5의 B에 나타내었다.

<염증 세포의 평가>

상기 마우스들을 희생시키고, 피부조직 약 5X5 mm를 적출하여 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, pH 7.4)로 고정하고 파라핀 블록을 제작한 후, 5 ㎛ 간격으로 피부조직을 종단면으로 절편 하였다. 조직학적 검사와 백혈구, 비만세포 침윤을 검사하기 위해 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin; H&E) 또는 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색하고 저배율(40X)에서 관찰하고 확대하면서 100X(H&E) 및 400X(톨루이딘 블루) 현미경 시야에서 사진을 찍어(각각 도 7의 B 및 C) 백혈구 침윤(도 7B) 및 비만세포(도 7C)를 검경하였다.

400X 현미경 시야에서(Olympus, Japan) 침윤된 백혈구 수를 세어 결과를 도 5의 C에 나타내었으며, 비만세포의 수를 세어 결과를 도 5의 D에 나타내었다.

<IgE 및 IL-4 생성량 측정>

최종 공격 후 5시간 후에 마우스의 간문맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 얻어 상기 혈청을 각각 anti-IgE 및 anti-IL-4 항체로 코팅된 플레이트에 주입하여 반응시키고, 각각 anti-IgE 및 anti-IL-4 항체에 특이적으로 작용하는 2차 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체(Rabbit Anti-mouse IgG)를 주입하여 반응시킨 후, 발색 기질로서 테트라메틸벤지딘(tertramethylbenzidine; TMB)을 주입하여 반응시켜 ELISA reader(Molecular Divices, USA)로 측정하였다. IgE와 IL-4 생성량을 ELISA법을 통해 측정 및 정량하여 결과를 도 6에 나타내었다.

도 5~7의 결과에서, 정상대조군은 실험 종료 후 피부조직의 변화가 없었지만, DNFB로 감작과 공격한 대조군에서는 심각한 피부병변과 염증이 동반되어 있었고(도 7A, 도 5A), 피부조직은 극세포증(acanthosis), 각질증식증(hyperkeratosis), 상처 및 출혈 수준이 매우 심각하였고(도 7) 그 두께가 현저히 증가되었다(도 5B). 그러나 DNFB로 유도되고 고욤잎 추출물이 투여된 실험군에서는 DNFB로만 감작한 대조군에 비해서 그 증상이 완화되었었으며 특히 200㎎/㎏ 고욤잎 추출물을 투여한 실험군은 그 증상이 현저히 개선된 것을 알 수 있다(p<0.001).

또한 백혈구 및 비만세포 침윤에 미치는 고욤잎 추출효과를 알아보기 위해 H&E와 톨루이딘블루(toluidine blue)로 조직을 염색하여 400배 현미경 시야에서 검경한 결과 DNFB로만 감작한 대조군는 백혈구 침윤(도 7B)과 비만세포의 활성 및 탈과립 (도 7C)이 매우 높았으나, 고욤잎 추출물을 처리한 실험군은 백혈구 침윤과 비만세포 활성이 억제되었으며, 특히 200㎎/㎏ 고욤잎 추출물을 투여한 실험군은 백혈구 침윤과 비만세포 활성 및 탈과립이 현저히 억제되는 효과를 나타냄을 알 수 있다(도 7B, 7C 및 도 5C, 5D).

또한 도 6의 결과에서, DNFB로만 감작과 공격한 대조군에서는 IL-4와 IgE의 생성이 매우 증가한 반면, 고욤잎 추출물이 투여된 실험군에서는 대조군에 비해서 IL-4와 IgE의 생성이 현저히 억제되었으며, 특히 200㎎/㎏ 고욤잎 추출물을 투여한 실험군은 그 증상이 현저히 개선되는 효과를 나타냄을 확인할 수 있다(p<0.001).

Claims (5)

1. 고욤(Diospyros lotus L.) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하며, 염증성 사이토카인 생성을 억제하거나 히스타민 방출을 억제하는 것을 특징으로 하는 항알레르기용 조성물.
2. 고욤(Diospyros lotus L.) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하며, 염증성 사이토카인 생성을 억제하거나 히스타민 방출을 억제하는 것을 특징으로 하는 항가려움용 조성물.
3. 삭제
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제용, 경구 투여용 또는 주사용인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 고욤잎 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~10중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.

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