KR20140119933A

KR20140119933A - 엉겅퀴잎 추출물을 함유하는 관절염 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20140119933A
Application number: KR1020130034505A
Authority: KR
Inventors: 강현주; 김현수; 전인화; 목지예; 정승일; 심재석; 장선일
Original assignee: 임실생약영농조합법인
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2014-10-13

Abstract

본 발명은 엉겅퀴(Cirsium japonicum var . ussuriense) 잎의 추출물을 함유하여 류마티스성 관절염 증상의 개선에 효과적인 관절염 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 엉겅퀴 잎의 열수추출물을 함유하여 염증세포뿐 아니라 비만세포의 침윤을 현저하게 감소시키며, PGE₂, TNF-α, IL-6, IL-4와 같은 염증유발 사이토카인을 억제하고 염증억제 사이토카인인 IL-10을 증가시켜 류마티스 관절염 개선 효과가 탁월한 관절염 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

엉겅퀴잎 추출물을 함유하는 관절염 개선용 조성물{Composition for improving arthritis comprising Cirsium japonicum var. ussuriense leaf extract}

본 발명은 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense) 잎의 추출물을 함유하여 류마티스성 관절염 증상의 개선에 효과적인 관절염 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 엉겅퀴 잎의 열수 추출물을 함유하여 염증세포뿐 아니라 비만세포의 침윤을 현저하게 감소시키며, PGE₂, TNF-α, IL-6, IL-4와 같은 염증유발 사이토카인을 억제하고 염증억제 사이토카인인 IL-10을 증가시켜 관절염 개선 효과가 탁월한 관절염 개선용 조성물에 관한 것이다.

관절염은 전 세계에서 성인인구의 약 10%로 발병되며, 골관절과 류마티스 관절염으로 구분되는데, 골관절은 연골의 퇴행성 변화로 관절을 이루는 뼈와 인대에 손상이 발생되어 염증과 통증을 동반하는 질환인 반면, 류마티스 관절염은 자가면역질환의 일종으로 유전적 및 환경적 요인에 의해서 유발되는데, 염증세포에서 시클로옥시제나아제-2(cyclooxigenase-2; COX-2)에 의해서 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2; PGE2)가 과다하게 생산되면 염증반응을 더욱 촉진시킨다. 또한 세포매개성 면역반응(cell mediated immune response)을 하는 협조/유도 세포 T 세포(CD4+) 중 제1형 T 세포(type 1 helper cell , Th1)가 Th2 세포보다 편향되어 발달함으로써 Th1 사이토카인이 대량 생산되어 유발된다. 이러한 류마티스 관절염은 전 세계적으로 약 1% 정도 발병되며, 국내는 1~2%로 주로 30~50대에 주로 발병된다. 류마티스 관절염의 병인은 아직까지 확실하지 않지만, 비가역적 관절 손상, 만성염증, 통증, 강직 등 관절의 기능이 상실되기 때문에 삶의 질을 떨어뜨리는 난치성 질환이기 때문에 이를 개선 또는 치료할 수 있는 약물의 발굴이 필요한 실정이다.

Th1 사이토카인은 종양괴사인자-α(tumor necrosis-α, TNF-α), 인터류킨-1β(interleukin-6, IL-6) 및 인터페론-γ(interferon-γ, IFN-γ)등이 대표적으로 알려져 있는데5,6), 이들 사이토카인들은 염증반응을 촉진시킨다. 반면, IL-10과 같은 Th2 사이토카인은 면역반응을 억제시키는 것으로 알려져 있다. 그러므로 Th1 사이토카인을 억제 시키고, Th2 사이토카인을 향상시킬 수 있는 물질은 류마티스 관절염 개선에 도움이 된다. 류마티스 발병 초기 염증 억제를 위한 비스테로이드성 소염진통제 또는 메토트렉세이트(methotrexate), 설파살라진(sulfasalazine) 등과 같은 항류마티스제제 등이 사용되고 있으며, 심한 증상에는 TNF-α 길항제, IL-6 수용체 길 항제 등의 생물학적 제제를 함께 사용하고 있다. 최근에는 분자생화학적 지식이 발달되면서 류마티스 관절염 치료를 위한 면역학적 접근방법들이 다양하게 시도되고 있으며, 특히 한약재 효능 및 기전에 대한 연구들이 활발하게 이루어지면서 한방처방약물로부터 우수한 천연물 개발이 주목받고 있다.

본 발명자들은 우수한 관절염 개선 효과를 나타내면서 부작용이 없는 천연물 개발을 위해 연구하던 중, 엉겅퀴의 잎 부분을 열수 추출하여 얻은 추출물이 류마티스 관절염에 대한 우수한 개선 효과를 가짐을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 우수한 관절염 개선효과를 나타내면서도 부작용이없는 관절염 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엉겅퀴 잎의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 개선용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 사용하는 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)는 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로 한방에서 지상부 또는 지하부(뿌리)를 대계라하여 약용으로 활용해왔다. 잎, 줄기, 꽃과 씨 등 지상부는 개화시기에서 씨가 여무는 5-6월에 채취하고, 뿌리는 가을에 채취하여 건조시킨 후 열수 또는 알콜 추출에 의한 약성분을 토혈, 혈뇨, 대하, 간염 및 고혈압 등 치료에 활용해왔다.

본 발명에서는 엉겅퀴의 잎 부분을 사용하는 경우 류마티스 관절염 개선에 관한 효능이 현저하게 높기 때문에 엉겅퀴의 지상부 중 잎 부분을 채취하여 사용하였다.

본 발명에 따른 엉겅퀴 잎의 열수 추출물은 건조된 엉겅퀴 잎을 열수 추출법에 의하여 추출하여 얻을 수 있으며, 보다 바람직하게는 건조된 엉겅퀴 잎을 분말화 하여 80~121℃의 증류수로 0.1~3시간 동안 열수 추출하여 얻을 수 있다. 상기 증류수의 온도가 80 ℃ 미만인 경우 생리활성물질이 물질이 한정되어 추출되기 때문에 한 문제가 있으며, 상기 추출 시간이 6분미만인 경우 생리활성물질이 한정되어 추출되기 대문에 문제가 있다.

본 발명에 따른 조성물은 류마티스 관절염 개선 효능을 달성할 수 있는 당업계에 통상적인 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 약제학적 조성물 또는 건강 식품 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적 조성물일 수 있으며, 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 피부 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 및 피부에 직접 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 엉겅퀴 잎의 열수 추출물은 1일 5 mg/kg 내지 500 mg/kg으로, 바람직하게는 50 mg/kg 내지 200 mg/kg 으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 엉겅퀴 잎의 열수 추출물은 약제학적 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 20 중량%로 포함될 수 있다. 1중량% 미만이면 그 효과가 미미하고, 20중량% 초과이면 함량의 증가에 비해 효과의 차이가 크지 않다.

본 발명에 따른 조성물은 엉겅퀴 잎의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하여 독성이나 부작용 없이 염증세포뿐 아니라 비만세포의 침윤을 현저하게 감소시키며, PGE₂, TNF-α와 IL-6와 같은 염증성 사이토카인과 항체형성과 관련된 IL-4을 억제하는 효과가 있고, IL-10을 증가시킴으로써 류마티스 관절염을 개선하는 우수한 효과를 나타내기 때문에 관절염 증상 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 시험예 1에 따른 콜라겐 유도 관절염 마우스의 확립 및 시료 투여 스케쥴을 나타낸 간략도이다.
도 2의 A는 시험예 1에 따른 콜라겐 유도 관절염 마우스에 대한 실험 종료일인 제2형 콜라겐으로 감작 후 48일째의 관절염 발생 빈도를 나타낸 그래프이며, 도 2의 B는 제2형 콜라겐으로 감작 후 21일째부터 5일 간격으로 이중맹검법으로 확인한 관절염 중증도를 나타낸 그래프이다.
도 3의 A는 시험예 1에 따른 콜라겐 유도 관절염 마우스 실험군(비교예 1~2및 실시예 1~2)과 정상군 마우스의 실험종료일의 뒷발 부종 상태를 나타낸 사진이며, 도 3의 B와 C는 상기 실험군과 정상군 마우스의 조직을 H&E와 톨루이딘블루로 염색 결과를 나타낸 광학현미경 사진이다.
도 4는 시험예 3에 따라 콜라겐 유도 관절염 마우스 실험군(비교예 1~2및 실시예 1~2)과 정상군 마우스의 뒷발의 염색된 조직을 400배 현미경 시야에서 검경하여 염증세포와 비만세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 5는 시험예 4에 따른 콜라겐 유도 관절염 마우스 실험군(비교예 1~2및 실시예 1~2)과 정상군 마우스의 PGE₂ 생성 및 COX-2 활성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 시험예 5에 따른 콜라겐 유도 관절염 마우스 실험군(비교예 1~2및 실시예 1~2)과 정상군 마우스의 Th1과 Th2 사이토카인 생성 변화 Th1과 Th2 사이토카인 생성 변화를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명하나, 이러한 실시예 또는 시험예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1] 엉겅퀴 잎 열수 추출물의 제조

실험에 사용한 전라북도 임실군 오수면 소재 임실생약영농조합법인에서 재배한 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense) 잎은 2011년 5월 30일에 채취하여 우석대학교 한의과대학 방제학교실의 김홍준 교수에게 의뢰하여 동정하였고, 표본(2011-011)은 전주대학교 대체의학대학 건강관리 연구실에 보관하고 있다. 상기 채취된 엉겅퀴 잎을 건조한 후, 건조된 상기 엉겅퀴 잎 200g을 분말로 제조하여 증류수 3 L로 3시간 동안 추출기(100℃)로 열수 추출하였다. 상기 추출물은 0.45μm 필터를 사용하여 여과한 후 동결건조기(Eyela FDU-2100, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)에서 건조하여 48.9g를 회수한 후 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

[참고예 2] 실험 동물, 시약 및 통계 처리

무균환경에서 사육된 7주령의 수컷 DBA/1J 마우스는 중앙실험동물(주)(서울시, 대한민국)에서 구입하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육환경은 낮과 밤의 주기를 12시간씩 하였고, 온도(20-22℃)와 습도(50-60%)는 일정하게 유지하였으며, 실험동물위원회의 규정에 준하여 실험하였다.

PGE2, COX-2, TNF-α, IL-6, IL-4와 IL-10 등 ELISA kit은 R&D Systems사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였으며, 우형 제2형 콜라겐(bovine type Ⅱ collagen), 프로인드 완전/불완전 면역반응 항진제(Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant), 인도메타신(indomethacin; IM), 헤마톡실린&에오신(hematoxylin & eosin H&E), 톨루이딘블루(toluidine blue)와 기타 시약은 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

모든 실험값은 평균±표준편차로 표시했으며, 통계분석은 ANOVA와 Student’s t-test로 처리하였으며, 유의성 한계는 p<0.05로 정하였다.

[시험예 1] 콜라겐 유도 관절염 마우스 확립 및 엉겅퀴 추출물 투여

콜라겐 감작에 의한 염증성 관절염 유발 마우스(DBA/1J) 모델은 송아지에서 추출한 제 2형 콜라겐을 항진제와 함께 주입하면 anti-collagen에 대한 항체를 형성함으로써 자가면역성이 유도되어 인체의 류마티스 관절염 증상과 유사하게 나타낸다. 이러한 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델을 이용하여 본 발명에 따른 엉겅퀴 추출물의 관절염에 대한 효과를 확인하였다.

상기 참고예 1에 따른 마우스를 대조군과 각 실험군 당 10마리로 나누어 수용한 후 콜라겐유도 염증성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 동물모델을 제작하기 위해 먼저 0.05 M 아세트산 1 ㎖에 제2형 콜라겐(bovine type Ⅱ collagen) 2 ㎎을 용해시킨 콜라겐 용액 1 ㎖과 동량(w/v)의 프로인드 완전 면역반응 항진제(Freund's complete adjuvant)를 혼합한 후 혼합액 100㎕를 마우스의 꼬리에 피하주사 하였다. 관절염을 촉진하기 위해 이를 다시 21일 후 상기와 동일 방법으로 제조된 콜라겐 용액 1 ㎖에 프로인드 불완전 면역반응 항진제(Freund's incomplete adjuvant)를 동량으로 혼합하여 마우스의 뒷발 피하에 상기 혼합액 100㎕를 주사하여 관절염을 유발하였다(도 1).

상기에서 21일 후에 프로인드 불완전 면역반응 항진제를 주사한 후, 대조군은 생리식염수 200 ㎕/마리를 경구투여 하였고(비교예 1), 상기 참조예 1에서 제조한 엉겅퀴 잎 열수추출물(이하 '엉겅퀴 추출물'이라 함)을 생리식염수에 최종농도가 각각 50 mg/kg, 100 mg/kg이 되도록 제조하여 하루에 한번씩 48일까지 경구투여 하였다(실시예 1, 2). 상기 엉겅퀴 추출물에 대한 효과를 비교하기 위하여 양성대조군으로서 인도메타신(IM) 1 mg/kg을 엉겅퀴 추출물과 같은 방법으로 투여하였다(비교예 2).

[시험예 2] 콜라겐 유도 관절염 마우스의 관절염 중증도 평가

상기 시험예 1에서 확립한 콜라겐 유도 관절염 마우스의 뒷발에 나타나는 부종과 종창 정도를 이중맹검법으로 관찰하여 관절염의 발생빈도(arthritis incidence) 와 위중도(clinical severity)를 평가하였다. 발생빈도는 추출물을 처리하지 않은 대조군과 추출물을 처리한 실험군 간의 뒷발에 관절염이 발생되는 마우스을 계수하여 백분율로 나타내었다. 위중도는 부종이나 발적, 종창 등 관절염의 증거가 없는 경우를 0점, 방 중앙이나 관절 부위에 국한되어 부종과 발적이 있을 때 1점, 발목관절에서 발근골에 걸쳐 경한 부종과 발적이 있을 때 2점, 발목관절에서 발가락사이에 부종과 발적이 있을 때 3점, 발목에서 발전체에 부종과 발적이 있을 때 4점을 부여하여 평가하여 결과를 도 2에 나타내었다. 또한 상기 비교예 1~2, 실시예 1~2와 상기 제2형 콜라겐 감작 처리를 전혀 하지 않은 정상 마우스인 정산군 마우스의 뒷발의 부종 정도를 나타낸 사진을 도 3의 A에 나타내었다.

도 3의 A의 결과에서, 비교예 1은 정상군에 비해서 심한 부종이 있었다. 반면 실시예 1~2의 경우 발 부종이 현저히 개선됨을 육안으로 확인할 수 있다.

도 2의 A의 결과에서, 제2형 콜라겐으로 감작과 공격을 한 비교예 1의 경우 실험 종료일인 48일에 관절염 발생빈도가 약 70%인 반면, 엉겅퀴 추출물을 kg(체중) 당 50 mg과 100 mg을 감작 후 21일째부터 48일까지 투여한 실시예 1 및 실시예 2의 경우 각각 51%와 42%로 감소되는 효과가 있었다.

또한 도 2의 B의 결과에서 제2형 콜라겐으로 감작한 후 21일째부터 5일 간격으로 이중맹검으로 관절염 위중도를 조사한 결과 대조군인 비교예 1은 제2형 콜라겐으로 감작한 후 5일째부터 관절염 증상이 나타나 15일째 관절염 점수가 약 12로 나타났고 실험 종료일까지 그 증상이 지속되었다. 반면 엉겅퀴 추출물 50 mg을 투여한 실시예 1은 제2형 콜라겐으로 공격한 후 25일째부터 관절염 증상이 완화되는 효과가 있었고(p<0.05), 100 mg을 투여한 실시예 2는 15일째 그 증상이 현저히 완화되는 효과가 있었다(p<0.05와 p<0.01). 양성 대조군인 비교예 2는 제2형 콜라겐으로 공격한 후 지속적으로 관절염을 완화시키는 효과가 있었다((p<0.01와 p<0.001).

[시험예 3] 염증세포 및 비만세포의 침윤 관찰

본 발명에 따른 엉겅퀴 추출물의 부종 억제 효과를 보다 자세히 확인하기 위하여 조직학적 관찰을 수행하였다. 상기 시험예 1의 실험 49일째 모든 실험동물을 희생시킨 후 우측 발근관절이 포함되도록 경골 원위부에서 발중앙뼈(metatarsal)와 원위부(distal) 사이를 적출하고 4℃에서 4% 중성 포르말린용액(formaldehyde)에 충분히 침지시켜 24시간 고정한 후 10% EDTA가 포함된 개미산(formic acid)에 21일간 침지하여 탈회하였다. 상기 탈회된 조직을 24시간 수세하여 조직 내 남아있는 포르말린을 제거한 후, 50% 알코올에서 무수알코올까지 농도 상승순으로 탈수하고 자일렌(xylene)으로 치환하였다. 파라핀 침투과정을 거친 후 포매하여 파라핀 블록을 제작하였으며 회전형 박절기(microtome)를 사용하여 5 ㎛두께로 자른 뒤 슬라이드 위에 놓아 조직표본을 제작하였다. 제작한 파라핀 조직표본은 자일렌, 무수알코올, 50% 알코올 순으로 탈 파라핀 과정을 거친 후 각각 H&E, 톨루이딘블루(toluidine blue) 염색시약으로 염색하여 광학현미경 하에 관절조직의 형태변화를 관찰하였으며 결과를 도 3의 B, C에 나타내었다.

또한, 염증세포 및 비만세포 침윤을 수치적으로 확인하기 위하여 상기 염색된 조직을 400배 현미경 시야에서 검경하여 염증세포와 비만세포 수를 도 4에 나타내었다.

도 3의 B 및 C, 도 4의 결과에서, 비교예 1은 정상군에 비해서 염증세포의 침윤이 심하게 나타났고, 비만세포의 침윤뿐만 아니라 탈과립 현상이 뚜렷히 관찰되었다. 반면 실시예 1 및 2의 경우 염증세포뿐만 아니라 비만세포의 침윤뿐만 아니라 탈과립 현상이 유의하게 억제되는 효과가 있음을 알 수 있었다. 특히 실시예 2의 경우 양성대조군인 비교예 2의 경우와 유사한 정도로 염증 유발 면역세포의 침윤이 현저히 줄어들어 관절염 개선 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

[시험예 4] PGE₂ 생성 및 COX-2 활성 억제 효과

본 발명에 따른 엉겅퀴 추출물 투여에 의한 염증 매개물 억제 효과를 확인하기 위하여 혈청에서 COX-2 활성과 PGE₂ 생성량을 조사하였다.

상기 시험예 1에서 제2형 콜라겐 감작으로부터 49일째에 각 마우스를 에테르(ether)로 마취하여 간 문맥으로부터 혈액을 채취하고 4℃에서 12시간 이상 혈액을 응고시킨 후 2,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 얻었다. anti-mouse PGE₂, anti-mouse COX-2 항체를 사용하여 각각에 특이적으로 작용하는 ELISA kit을 사용하여 R&D Systems사가 제공하는 방법에 준하여 측정하고 정량하였다. 보다 구체적으로는 상기 혈청을 5배 희석하여 100㎕를 각각의 항체가 코팅된 플레이트에 주입하고 반응시킨 후 잘 세척한 다음 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 주입하고 반응시킨 후 발색 기질을 주입하고 반응시켜 ELISA reader로 측정하였으며, 각 물질에 대한 정량은 각각의 물질을 농도별로 처리하여 반응시켜 표준곡선을 정하고 혈청에 함유된 물질의 양을 계산하여 PGE₂ 생성량을 산출하였으며, COX-2의 활성 억제율은 비교예 1의 활성을 100%로 하였을 때의 억제되는 비율로서 산출하여 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과에서, 비교예 1의 경우 혈청 PGE₂의 생성량(198.5±22.6 pg/mL)은 정상군(10.2±3.1 pg/mL)에 비해서 현저히 증가되었다(p<0.001). 그러나 엉겅퀴 추출물 50 mg 또는 100 mg를 투여한 실시예 1 및 2는 각각 133.6±16.4 pg/mL과 115.7±18.1 pg/mL으로 억제되었고, 비교예 2의 IM 투여군은 112.2±24.2 pg/mL로 억제되었다. 또한 COX-2 활성 억제율은 실시예 1에서 12.8% 였으나, 실시예 2는 34.3%로 비교예 2의 36.9%와 유사하게 억제됨을 확인할 수 있었다.

[시험예 5] Th1과 Th2 사이토카인 생성 변화

본 발명에 따른 엉겅퀴 추출물 투여에 의한 Th1 (TNF-α, IL-6)과 Th2 (IL-4, IL-10) 사이토카인의 변화를 알아보기 위하여, 혈청내에 존재하는 Th1과 Th2 사이토카인을 측정하였다.

상기 시험예 1에서 제2형 콜라겐 감작으로부터 49일째에 각 마우스를 에테르(ether)로 마취하여 간 문맥으로부터 혈액을 채취하고 4℃에서 12시간 이상 혈액을 응고시킨 후 2,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 얻었다. TNF-α, IL-6, IL-4 및 IL-10는 anti-mouse TNF-α, anti-mouse IL-6, anti-mouse IL-4 및 anti-mouse IL-10 항체를 사용하여 각각에 특이적으로 작용하는 ELISA kit을 사용하여 R&D Systems사가 제공하는 방법에 준하여 측정하고 정량하였다. 보다 구체적으로는 상기 혈청을 5배 희석하여 100㎕를 각각의 항체가 코팅된 플레이트에 주입하고 반응시킨 후 잘 세척한 다음 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 주입하고 반응시킨 후 발색 기질을 주입하고 반응시켜 ELISA reader로 측정하였으며, 각 물질에 대한 정량은 각각의 물질을 농도별로 처리하여 반응시켜 표준곡선을 정하고 혈청에 함유된 물질의 양을 계산하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.

비교예 1은 TNF-α (132.2±17.2 pg/mL), IL-6 (104.1±11.9 pg/mL), IL-4 (64.9±7.2 pg/mL)와 IL-10 (84.1±11.2 pg/mL)이 정상군에 비하여 현저히 증가하였다(p<0.001). 반면, 실시예 1은 TNF-α, IL-6과 IL-4가 억제하는 경향이 있었고, IL-10는 약간 증가하는 경향을 보였으며, 실시예 2는 TNF-α (79.8±11.7 pg/mL), IL-6 (62.5±10.9 pg/mL)과 IL-4 (42.1±4.7 pg/mL)가 비교예 1에 비해서 유의하게 억제되었고, IL-10은 각각 79.8±11.7 pg/mL, 79.8±11.7 pg/mL 로 억제하는 경향이 있었으며, IL-10는 118.8±5.9 pg/mL으로 유의하게 증가되었다(p<0.05). 실시예 2의 Th1과 Th2 변화는 양성대조군인 비교예 2와 유사하였다.

Claims

엉겅퀴(Cirsium japonicum var . ussuriense) 잎의 열수 추출물을 함유하는 관절염 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엉겅퀴 잎의 열수 추출물은 건조된 엉겅퀴 잎을 80~121℃의 증류수를 사용하여 0.1~3시간 동안 열수 추출하여 얻는 것임을 특징으로 하는 관절염 개선용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 엉겅퀴 잎의 열수 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 1~20중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 관절염 개선용 조성물.