KR101044433B1

KR101044433B1 - 유럽종 포도의 씨 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101044433B1
Application number: KR1020080087109A
Authority: KR
Inventors: 민준기; 조미라; 박미경; 허유정; 박진실; 김호연; 류종현; 김현규; 이근혁
Original assignee: 에이치 엘 지노믹스(주); 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2007-09-04
Filing date: 2008-09-04
Publication date: 2011-06-27
Also published as: CN102006880A; KR101399925B1; KR20110036031A; KR20090024647A; EP2182967A1; JP2010538058A; US20100173028A1; WO2009031826A1

Abstract

본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 개선된 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

유럽종 포도, 류마티스 관절염

Description

유럽종 포도의 씨 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물{Process for preparing Vitis vinifera pip extract and pharmaceutical composition for preventing or treating rheumatoid arthritis comprising the same}

본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조방법 및 유럽종 포도(Vitis v inifera)의 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

포도속(Vitis) 식물은 갈매나무목(Rhamnales), 포도과(Vitaceae)에 속하는 덩굴성 식물로 적도부근 및 위도 50°이상 지역을 제외한 지구상 전역에서 자생 혹은 재배되고 있다. 포도과에는 11속 700 여종이 알려져 있으며, 유럽종 포도(Vitis vinifera), 미국종 포도(Vitis labrusca), 강변 포도(Vitis riparia), 사막 포도(Vitis rupestris), 겨울 포도(Vitis berladieri), 머루(Vitis coignetiae), 왕머루(Vitis amurensis) 등이 주로 과실을 이용하기 위하여 재배되고 있다.

이 중, 유럽종 포도(Vitis v inifera)의 씨로부터 얻어지는 추출물은 (-)에피카테킨, 프로안토시아니딘 B1 및 B2, (+)카테킨, 및 이들의 중합 유도체들의 혼합 물들을 포함하며, 이들은 프로시아니돌 또는 플라보놀 올리고머로서 알려져 있다 (GB-A-1541469 및 FR-A-2092743). 상기 추출물은 순환계 질환의 치료에 유용한 것으로 알려져 있다.

미국특허공개 제2003/0165589호는 유럽종 포도(Vitis vinifera), 바람직하게는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 잎으로부터 얻어진 추출물이 NO-신타아제(Nitric Oxide - synthase, NO-synthase)를 억제함으로써, NO-synthase와 관련한 다양한 질환, 예를 들어 세포 분화 및/또는 증식, 상피성장의 저해 및/또는 과다증식 질환, 세포의 퇴화 및 파괴, 면역 및/또는 염증 진행 등의 억제에 사용될 수 있음을 개시한 바 있다.

한편, 미국특허공개 제2006/0280811호는 살리제닌(saligenin) 또는 살릭스 루브라(Salix rubra) 추출물; 보스웰산(boswellic acid) 또는 보스웰리아 세라타(Boswellia serrata) 추출물; 유럽종 포도(Vitis vinifera) 또는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)로부터 얻어진 프로시아니딘(바람직하게는 인지질과의 복합체(complex)) 또는 레인(rhein) 또는 레인의 지용성 유도체; N-아세틸-글루코스아민; 및 글루쿠론산 또는 글루쿠로노락톤을 포함하는 관절염 치료용 조성물을 개시한 바 있다. 상기 조성물에서 프로시아니딘은 살릭스(Salix) 및 보스웰리아(Boswellia) 추출물에 존재하는 시클로옥시게네이즈-2(cyclooxygenanse-2, COX-2) 저해성분과 상승적으로 작용하는 것으로 개시되어 있으나, 구체적으로 어떠한 성분이 관절염 치료의 주성분으로 작용하는지 밝히고 있지 않다. 상기 프로시아니딘은 GB-A-1541469 (및 FR-A-2092743) 또는 미국특허 제5,484,594호(대응 유럽특허 제348,781호)에 개시된 추출방법에 따라 얻어질 수 있는 것으로 개시되어 있다.

기타, 미국특허 제4,963,527호는 유럽종 포도(Vitis vinifera) 추출물의 인지질 복합체를 함유하는 화장료 조성물을 개시하고 있으며, 상기 추출물도 FR-A-2092743(즉, GB-A-1541469)에 따라 얻어진 것을 사용하고 있다.

GB-A-1541469 (및 FR-A-2092743)에 개시된 추출방법은 올리고머를 추출함과 동시에 불순물을 침전(즉 부분적인 침전)시켜 제거하기 위하여, 물에 대하여 3 내지 4 배의 과량의 아세톤을 함유한 아세톤-물 혼합용매를 1차 추출용매로서 사용하는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 추출방법은 물에 대하여 3 내지 4 배 용량의 아세톤을 함유하는 아세톤/물 혼합물로 유럽종 포도(예를 들어, 씨)를 처리한 후, 증류에 의하여 아세톤을 제거하고 침전된 불순물을 여과한 다음, 얻어진 수성 여액을 에틸 아세테이트 등의 수-비혼화성 유기용매로 처리한 후, 상기 유기용매를 제거하고 잔사를 제거한 다음, 염화나트륨을 가하여 남아있는 불순물을 침전시켜 제거한 후, 얻어진 수성 여액을 에틸 아세테이트 처리 및 클로로포름 처리 과정을 수행한다. GB-A-1541469에 따르면, 과량의 물을 사용할 경우, 상기와 같은 부분적인 침전이 발생하지 않으므로, 산업적 규모의 대량생산에 적합하지 않은 것으로 개시하고 있다.

그러나, GB-A-1541469에서 개시한 추출방법은 1차 추출용매로서 과량의 아세톤을 포함한 혼합용매를 사용하여 아세톤의 비등점 온도(약 57 ℃)에서 추출을 수행하여야 하고, 또한 과량의 아세톤을 증류하여 제거하여 추출물을 얻어야 하므로, 가온 조건의 형성 및 장시간의 증류로 인하여 제조비용이 높아질 뿐만 아니라 과량 의 아세톤 사용으로 인한 환경오염 문제가 발생할 수 있다. 또한, 최종적으로 얻어지는 추출물에 아세톤이 잔류용매로 남을 수 있다. 더욱이, 염화나트륨을 가하기 전에 에틸 아세테이트 등의 수-비혼화성 유기용매 처리 및 에틸 아세테이트 제거 과정을 필수적으로 수행하여야 하므로, 추출공정이 길어지는 문제점이 있다.

미국특허 제5,484,594호(대응 유럽특허 제348,781호)은 3000 내지 600의 컷-오프의 멤브레인을 사용한 한외여과; 및 에틸 아세테이트 및 방향족 탄화수소의 에테르류, 또는 에스테르류를 사용한 다단계의 선택적 추출방법을 개시하고 있다. 그러나 이러한 추출방법은 GB-A-1541469에서 개시한 추출방법보다 많은 단계의 추출공정을 수행하여야 할 뿐만 아니라, 특수한 설비인 한외여과기를 사용하여야 하므로 제조단가가 높아지는 문제가 있다.

한편, 대한민국 특허등록 제10-0509119호는 유백피로부터 컬럼 크로마토그래피를 포함한 다단계의 추출과정으로 얻어진 특정 프로시아니딘 올리고머(카테킨-4-플로로글루시놀)가 기질 금속단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)의 활성을 억제함으로써, 암전이, 치주질환, 류마토이드 관절염, 염증, 부갑상선항진증, 당뇨병, 각막궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 주름, 여드름, 에이즈, 화상, 동맥경화, 골정 등의 질환을 예방 및 치료하는데 유용한 것으로 개시한 바 있다. 그러나, 상기 선행기술은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 추출물을 얻는 방법을 구체적으로 개시하고 있지 않다. 또한 상기 선행기술은 프로시아니딘 올리고머가 유백피, 포도씨, 대황, 하수오, 녹나무, 계피, 측백, 동백, 수수, 메밀, 떡갈나무 등에 프로시아니딘이 많이 함유되어 있다고 개시하고 있으나, 포도씨 특히 유럽종 포 도(Vitis vinifera)의 추출물이 특정 질환인 류마티스 관절염과 관련된다고 개시되어 있지 않다.

본 발명자들은 간단한 공정으로 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 추출물을 얻는 개선된 추출방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 1차 추출용매로서 상대적으로 소량의 아세톤 함량을 갖는 물/아세톤 혼합용매를 사용하여 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 추출하고, 아세톤을 증류하여 제거한 다음, 수층을 그대로 염화나트륨으로 처리하여 추출물을 제조할 경우, 실온(약 25 ℃)에서 추출을 수행할 수 있고 증류가 간단할 뿐만 아니라 수-비혼화성 유기용매 추출단계를 수행하지 않아 추출공정이 간단해진다는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 제1 추출물 및 제2 추출물을 별도로 제조하고, 이들을 혼합하여 추출물을 얻는 개선된 제조방법을 개발하였다. 즉, 상기 제조방법은 제1 추출물은 추출용매로서 아세톤과 물의 혼합용매를 사용한 1차 추출 및 에틸 아세테이트를 사용한 2차 추출에 의해 얻고; 제 2 추출물은 추출용매로서 물만을 사용한 1차 추출 및 에탄올을 사용한 2차 추출을 수행하여 얻고; 얻어진 제1 추출물 및 제1 추출물을 혼합하여 추출물을 얻는다. 본 발명자들은 상기 제조방법이 전체적으로 아세톤의 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 염화나트륨 포화공정 및 클로로포름 추출공정을 결여하므로, 추출이 간단하고 유기용매 사용으로 인한 환경오염의 문제도 최소화할 수 있다는 것을 발견하였다. 특히 얻어지는 추출물의 수율을 약 10배 정도로 높일 수 있다는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 대한 다양한 약리효과를 연구하던 중, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 우수한 류마티스 관절염에 대한 우수한 예방 및 치료효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 이는 유럽종 포도(Vitis vinifera)로부터 얻어진 추출물이 류마티스 관절염에 관련된다는 직접적인 보고가 없다는 것을 감안할 때, 매우 놀라운 것이다.

따라서, 본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 유럽종 포도(Vitis v inifera)의 씨 추출물의 제조방법이 제공된다.

단계(a)의 상기 아세톤과 물의 혼합용매의 부피비는 1 : 1.5가 바람직하며, 단계(a) 및 단계(c)의 상기 추출은 2 내지 3 회 반복되는 것이 바람직하다. 단계(b)의 상기 증류는 50 ℃ 이하의 감압 조건에서 바람직하게 수행될 수 있으며, 상기 염화나트륨 포화 및 여과 공정은 염화나트륨을 포화시킨 다음, 2 내지 3 시간 동안 방치한 후, 여과하는 것이 바람직하다. 단계(c)의 상기 농축은 추출액 총 부피에 대하여 0.4 내지 0.7 배로 농축되도록 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 태양에 따라, (1) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계; (2) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조방법이 제공된다.

단계(i)의 상기 아세톤과 물의 혼합용매의 부피비는 4 : 1이 바람직하며, 단계(iii) 또는 단계(q)의 상기 추출은 2 내지 3회 반복되는 것이 바람직하다. 단계(iii)에서 상기 추출 후, 탈수 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 단계(iv)의 상기 건조는 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 농축하여 에틸 아세테이트를 제거하고, 얻어진 농축물을 물에 용해시킨 후, 분무건조함으로써 수행되는 것이 바 람직하다. 또한, 단계(r)의 상기 건조는 단계(q)에서 얻어진 여액을 분무건조함으로써 수행되거나 단계(q)에서 얻어진 여액을 농축한 후, 얻어진 농축액을 분무건조함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 제1 추출물 및 상기 제2 추출물의 혼합비는 1 : 0.5∼1.5 의 중량비일 수 있다.

또한, 상기 제조방법으로 얻어지는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 상기한 제조방법으로 얻어지는 것이 바람직하며, 또한 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 추출방법은 1차 추출용매로서 상대적으로 소량의 아세톤 함량을 갖는 물/아세톤 혼합용매를 사용하여 추출을 수행함으로써, 아세톤의 증류를 간단히 수행할 수 있을 뿐만 아니라 잔류용매의 문제점도 최소화할 수 있다. 또한, 추출을 실온(약 25 ℃)에서 수행하므로, 별도의 가온을 필요로 하지 아니하며, 염화나트륨을 가하기 전에 수-비혼화성 유기용매 추출단계를 수행할 필요가 없다. 따 라서, 본 발명에 따른 제조방법은 간단할 뿐만 아니라 비용-효율적(cost-effective)이므로, 산업적 대량생산에 적합하다.

또한, 제1 추출물 및 제2 추출물을 별도로 제조하고, 이들을 혼합하여 추출물을 얻는 개선된 제조방법은 전체적으로 아세톤의 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 염화나트륨 포화공정 및 클로로포름 추출공정을 결여하므로, 추출이 간단하고 유기용매 사용으로 인한 환경오염의 문제도 최소화할 수 있다. 특히, 얻어지는 추출물의 수율을 약 10배 정도로 크게 높일 수 있다.

또한, 상기 추출방법에 의해 얻어진 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 천연 추출물로서 안전성이 높으며, 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 우수한 류마티스 관절염의 예방 또는 치료 효과를 갖는다.

본 발명의 제조방법은 (a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis v inifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계를 포함한다.

분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨는 유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 얻어진 껍질, 씨, 가지를 물에 세척하고 오븐 등을 사용하여 건조시킨 후, 씨를 분리하고, 이를 통상의 방법으로 분쇄함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 제조방법은 종래의 추출방법(예를 들어, GB-A-1541469)에 비하여 아세톤 함량이 낮은 물-아세톤 혼합용매를 1차 추출용매로 사용하고, 별도의 가온 없이 실온(약 25 ℃)에서 1차 추출공정을 수행한다. 본 발명의 제조방법에서 사용하는 물-아세톤 혼합용매로는 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2, 바람직하게는 약 1 : 1.5인 혼합용매를 사용할 수 있다. 상기 1차 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 단계(a)의 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.

본 발명의 제조방법은 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계[단계(b)]를 포함한다. 상기 증류에 의하여 상대적으로 비등점이 낮은 아세톤이 제거되게 되며, 아세톤에 용해되어 있는 불순물들이 침전되게 된다. 상기 증류는 통상의 증류 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 감압 조건에서 증류하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 약 50 ℃ 이하의 감압 조건에서 수행되는 것이 바람직하다. 증류 과정을 거쳐 얻어진 추출액은 별도의 유기용매 추출과정 없이, 곧바로 염화나트륨 포화 및 여과 과정이 수행된다. 상기 추출액(즉, 아세톤이 증류된 추출액)을 염화나트륨으로 포화시키면, 탄닌 성분 등의 불순물이 침전되게 되며, 이는 여과 과정을 통하여 제거되게 된다. 상기 염화나트륨 포화 및 여과에 의한 불순물 침전은 염화나트륨을 포화시킨 다음, 2 내지 3 시간 동안 방치한 후, 여과하는 것이 바람직하다. 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.

본 발명의 제조방법은 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계[단계(c)]를 포함한다. 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출(2차 추출)은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 농축은 단계(b)에서 얻어진 추출액(즉, 여액) 총 부피에 대하여 0.4 내지 0.7 배로 농축되도록 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법은 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계[단계(d)]를 포함한다. 즉, 상기 클로로포름을 가할 경우, 클로로포름에 용해되지 않는 올리고머를 포함한 유효성분들이 침전되게 되며, 생성된 침전물은 간단히 여과함으로써 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 간단히 분리해낼 수 있다. 여과하여 얻어진 침전물은 통상의 방법에 따라 건조함으로써, 건조 분말 형태로 얻을 수 있으며, 상기 건조는 감압 조건, 예를 들어 50 ℃ 이하의 감압 조건에서 건조함으로써 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 (1) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계; (2) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물 을 혼합하는 단계를 포함하는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조방법을 포함한다.

분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨는 상기한 바와 같이 얻을 수 있다. 상기 제조방법은 제1 추출물 및 제2 추출물을 별도로 제조하고, 이들을 혼합하여 추출물을 얻음으로써 수행된다. 따라서, 상기 제조방법은 전체적으로 아세톤의 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 염화나트륨 포화공정 및 클로로포름 추출공정을 결여하므로, 추출이 간단하고 유기용매 사용으로 인한 환경오염의 문제도 최소화할 수 있다. 또한, 얻어지는 추출물의 수율을 약 10배 정도로 크게 높일 수 있다.

제1 추출물 제조에 있어서, 단계(i)는 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1, 더욱 바람직하게는 4 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과함으로써 수행된다. 상기 1차 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 단계(i)의 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.

제1 추출물 제조에 있어서, 단계(ii)는 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과함으로써 수행된다. 상기 농축에 의하여 상대적으로 비등점이 낮은 아세톤이 제거되게 되며, 아세톤에 용해되어 있는 불순물들이 침전되게 된다. 상기 농축은 통상의 감압 농축(또는 감압 증류)에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 감압 조건에서 증류하여 수행될 수 있다. 농축 과정을 거친 후 여과에 의해 침전물을 제거하고 여액을 회수한다.

제1 추출물 제조에 있어서, 단계(iii)은 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출함으로써 수행된다. 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출(2차 추출)은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 단계(iii)은 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출공정 수행 후, 무수 황산나트륨 등을 이용한 탈수 공정을 추가로 포함할 수 있다.

제1 추출물 제조에 있어서, 단계(iv)는 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조함으로써 수행된다. 상기 건조는 통상의 방법, 예를 들어 50 ℃ 이하의 감압 조건에서의 건조에 의해 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 농축하여 에틸 아세테이트를 제거하고, 얻어진 농축물을 물에 용해시킨 후, 분무건조함으로써 수행될 수 있다.

제2 추출물 제조에 있어서, 단계(p)는 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과함으로써 수행할 수 있고; 단계(q)는 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과함으로써 수행할 수 있다. 단계(q)의 상기 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 제2 추출물 제조에 있어서, 단계(r)은 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조함으로써 수행할 수 있다. 단계(r)의 상기 건조는 단계(q)에서 얻어진 여액을 분무건조함으로써 수행되거나; 단계(q)에서 얻어진 여액을 농축한 후, 얻어진 농축액을 분무건조함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 농축은 단계(q)에서 얻어진 여액 총 부피에 대하여 0.4 내지 0.7 배로 농축될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같이 얻어진 제1 추출물 및 제2 추출물의 혼합은 단순히 추출물들을 혼합함으로써 수행될 수 있으며, 상기 제1 추출물 및 상기 제2 추출물의 혼합비는 1 : 0.5∼1.5 의 중량비일 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는다.

본 명세서에서 상기 "프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, 이하 'PCV'라 칭함)"은 다음 방법 및 식에 의해서 계산된 값을 의미한다.

① 표준액의 조제

유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 표준품 100 mg을 정밀히 달아 이소프로판올을 가해 50 ml로 한다. 이 액 10 ml를 취하여 3M 염산 10 ml를 가하고 이소프로판올을 가해 50 ml로 한 액을 표준액으로 한다.

② 검액 조제

샘플 100mg을 정밀히 달아, 표준액과 동일하게 조작하여 검액으로 한다.

③ 조작

검액 및 표준액 10 mlTlr각각 5개의 시험관에 넣고 마개를 한 다음, 100℃ 수욕중에서 45분간 가열한다. 가열 후 시험관을 냉수에 넣어 냉각시키고, 각 시험 관의 액 2 ml를 취한 후 이소프로판올 20 ml를 가한다. 반응시킨 검액, 표준액을 가지고 이소프로판올을 대조액으로 하여 550 nm에서 흡광도를 측정하고 각 5개의 평균 흡광도를 구한다.

④ 계산식

PCV = 105 X [A(t) X Mt X (100-Et)] / [A(s) X M X (100-E)]

A(t): 반응시킨 검액의 평균 흡광도

A(s): 반응시킨 표준액의 평균 흡광동

Mt: 표준품 취한 량(mg)

M: 검체 취한 량(mg)

Et: 표준품의 수분 함량(%)

E: 검체의 수분함량(%)

상기 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량은 다음과 같이 정량된 값을 의미한다.

① 표준액의 조제

(+)카테킨 표준품, (-)에피카테킨 표준품 각각 50 mg을 정밀하게 달아 아세토니트릴·묽은 인산 혼합액(5:95)에 녹여 100ml로 한 액을 표준액으로 한다.

② 검액 조제

샘플 50mg을 정밀하게 달아, 아세토니트릴·묽은 인산 혼합액(5:95)에 녹여 10ml로 한 액을 검액으로 한다.

③ 분석조건

- 컬럼: 옥타데실실릴화한 실리카겔을 충진한 컬럼 (0.46 X 25 cm, 5 um)

- 이동상

시간(분)	이동상A	이동상 B
0	95	5
50	85	15
60	20	80
70	95	5

이동상 A: 묽은 인산 (묽은 인산: 0.3%, V/V 수용액)

이동상 B: 아세토니트릴

- 유속: 0.7 ml/분

- 검출기: 자외부흡광도측정 (측정파장: 278 nm)

- 주입량: 10 ul

④ 계산식

에피카테킨으로서 카테킨의 함량(%)

= [A1 X Me X 100 X 100] / [Ae X M1 X (100-E) X 10]

에피카테킨의 함량(%)

= [A2 X Me X 100 X 100] / [Ae X M1 X (100-E) X 10]

A1: 검액 중 카테킨의 피크면적

A2: 검액 중 에피카테킨의 피크면적

Ae: 표준액 중 에피카테킨의 피크면적

Me: 표준액 중 에피카테킨의 양(mg)

M1: 검액 중 추출물의 양(mg)

E: 추출물중 수분(%)

또한, 상기 "프로안토시아디딘 함량"이라 함은 다음 방법 및 식에 의해서 계산된 값을 의미한다.

① 내부표준액의 조제

2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, BHT) 30.0 mg을 정밀하게 달아 100 ml 용량플라스크에 넣고 물로 표선을 맞추어 내부표준액으로 한다.

② 검액 1의 조제

샘플 10 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액 용액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 검액으로 한다.

③ 검액 2의 조제

④ 표준액의 검량선 조제

- 표준액 1: 프로안토시아니딘 표준품 8 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 1로 한다.

- 표준액 2: 프로안토시니딘 표준품 10 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 2 로 한다.

- 표준액 3: 프로안토시아니딘 표준품 12 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 3으로 한다.

⑤ 조작조건

- 컬럼: PL Gel Column (7.6 X 300 mm, 5 um) 또는 그와 유사한 컬럼

- 검출기: 자외부흡광광도계 (측정파장: 280 nm)

- 이동상: 테트라히드로퓨란과 리튬 브로마이드 수용액의 혼합용매(95:5)

* 리튬 브로마이드 수용액: 리튬 브로마이드 1.04g을 정밀하게 취하여 1000 ml 용량플라스크에 넣고 물로 표선을 맞춘다.

- 유속: 1.0 ml/min

- 주입량: 10 uL

- 측정시간: 15분

⑥ 조작방법

표준액 1, 2, 3 및 검액 1, 2를 아래의 액체크로마토그래피법으로 각각 2회씩 분석한다. 단 표준액의 농도와 그에 상응하는 주피크 대 IS피크 면적비(A_{proanthocyanidin}/A_BHT)로 표준액의 검량선을 작성하고 아래의 식에 따라 계산한다.

⑦ 계산식

- Ti% = {[(A_{proanthocyanidin}/A_BHT)_test - a] / b} x (1 / C_test) x 100

A_{proanthocyanidin} = 검액에서 프로안토시아니딘의 피크면적

A_BHT = 검액에서 BHT의 피크면적

a = 표준액 검량선의 Y 절편값

b = 표준액 검량선의 기울기값

C_test = 검액의 농도(mg/ml)

- 프로안토시아니딘 함량(%) = Ti% x [(100-KF_std)/(100-KF_test)]

KF_std = 표준품 수분보정

KF_test = 검체 수분보정

본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다.

상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 상기한 제조방법으로 얻어지는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 약학 조성물에 함유되는 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 바람직하게는 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는다.

하기 시험 예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 에서 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 우수한 류마티스 관절염 치료효과를 나타내었다.

즉, 콜라겐 유도 관절염 질환 동물에 본 발명에 따라 제조한 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 100 mg/kg의 용량으로 복강 주입했을 때, 효과적으로 관절염 지수가 떨어졌으며(도 1 및 2), 이는 자연적으로 만성 염증 관절염이 유발되는 다른 류마티스 관절염 질환 동물 모델인 IL-Ra-/- 에서도 동일하게 나타났다. 조직학적 연구 결과, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 100 mg/kg의 용량으로 주입한 경우 관절의 파괴 정도가 정상 마우스와 비슷하며 연골의 파괴 또한 호전되었다 (도 3). 또한, 혈청학적인 시험 결과, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 100mg/kg의 용량으로 주입한 경우 Th2 타입의 항 CII IgG1 는 차이를 보이지 않았나 Th1 타입의 경우에는 CII 특이적인 IgG2a 의 생성이 낮게 관찰되었다 (도 4). 이는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 투여할 경우 CII 에 특이적인 Th1 타입의 IgG2a 의 생산이 감소됨으로써 류마티스 관절염을 효과적으로 치료할 수 있음을 나타낸다.

또한, 류마티스 관절염의 대표적인 염증성 사이토카인으로 알려진 IL-17 과 TNF alpha의 양이 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 투여했을 때 유의성 있게 감소하였으며(도 5), 시험관내(in vitro) 시험으로 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리한 경우에는 염증성 사이토카인인 IL-17 과 항염증성 사이토카인인 IL-4 의 생성이 역 상관관계를 나타내었다(도 6). IL-17의 경우는 전사수준에서도 동일하게 확인되었으며 시험관내(in vitro) 시험으로 CII 또는 LPS 로 자극한 후 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리하였을 때 CII 또는 LPS에 의해 증가된 IL-17 의 mRNA 발현양이 감소하였다(도 7).

류마티스 관절염은 면역세포 (특히 만성 염증 T 세포) 들의 과도한 활성이 병인과 관련되어 있으므로 CD4 T 세포의 조절이 중요한 치료적 타켓이 될 수 있다. 실제로 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델과 IL-1Ra-/- 의 두 가지 동물 모델에서 모두 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리해준 경우에 Foxp3+ 인 조절 CD4 T 세포의 유도가 증가되었고 콜라겐 유도 관절염 질환 동물의 경우에는 CII 와 함께 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리해주면 CII 단독 처리보다 Foxp3+ 인 조절 CD4 T 세포의 유도가 증가하였다 (도 8a 및 8b). 이는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 의해 CII 에 특이적인 조절 CD4 T 세포가 만들어짐으로써 효과적으로 만성 염증 T 세포들의 증식 효과를 기대할 수 있다.

따라서, 상기 시험결과로부터, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고 항염증성 사이토카인과 조절 T 세포를 유도함으로써 류마티스 관절염에 대한 우수한 예방 및 치료 효과가 있음을 알 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 정체 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이 트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 함유되는 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 1일 1 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 5 내지 50 mg/kg의 용량, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 10 mg/kg의 용량으로 투 여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 류마티스 관절염 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여 시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조

유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 정제수 300 ml 및 아세톤 200 ml로 이루어진 아세톤 수용액 500 ml를 가하여, 실온에서 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 50 ℃ 이하의 감압하에서 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시킨 후, 약 3 시간 동안 실온에서 방치한 다음 여과하였 다. 얻어진 여액을 에틸 아세테이트 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 무수 황산나트륨으로 탈수하였다. 얻어진 추출액을 부피가 약 125 ml로 줄어들 때까지 감압 농축시켰다. 얻어진 농축액에 클로로포름 약 600 ml를 가하여 침전물을 생성시킨 후, 여과하였다. 여과하여 얻어진 침전물을 50 ℃ 이하의 진공 오븐에서 건조하여 약 3.5 g의 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 갈색 분말 상으로 얻었다. 얻어진 추출물을 희산성 용액에서 가열하여 가수분해한 다음, 프로시아니돌릭 올리고머의 함량을 정량하여 PCV (Procyanidolic value)를 측정한 결과, 약 105의 높은 값을 나타내었다. 또한, 상기한 바와 같이 프로안토시아디딘 함량을 측정한 결과 103 % 이었다. 따라서 상기 추출물은 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 모노머가 2개 이상 중합된 올리고머류를 다량으로 함유한다.

실시예 2. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조

유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 아세톤 수용액 (아세톤/물 = 8/2, v/v) 500 ml를 가하여 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 감압농축하여 아세톤을 제거한 후, 여과하였다. 얻어진 여액을 에틸 아세테이트 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 무수 황산나트륨으로 탈수하였다. 얻어진 추출액을 감압농축하여 에틸 아세테이트를 제거하고, 얻어진 농축물을 물 500 ml에 용해시킨 후, 분무건조하여 분말상의 추출물(제1 추출물) 약 20 g을 얻었다.

유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 정제수 500 ml를 가하여 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 에탄올 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 여과하였다. 얻어진 여액을 감압농축한 후, 얻어진 농축액을 분무건조하여 분말상의 추출물(제2 추출물) 약 15 g을 얻었다.

상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하여 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 약 35 g을 얻었다. 얻어진 추출물을 희산성 용액에서 가열하여 가수분해한 다음, 프로시아니돌릭 올리고머의 함량을 정량하여 PCV (Procyanidolic value)를 측정한 결과, 약 98 의 높은 값을 나타내었다. 또한, 상기한 바와 같이 프로안토시아디딘 함량을 측정한 결과 98.5 % 이었다. 따라서 상기 추출물은 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 모노머가 2개 이상 중합된 올리고머류를 다량으로 함유한다.

시험예 1. 복강 투여시 관절염 치료 효능 평가

1. 동물모델의 준비 및 투여

콜라겐에 의해 유도되는 관절염(collagen induced arthritis, CIA) 동물 모델의 준비 및 실시예 1에서 제조한 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 투여는 다음과 같다.

시험동물은 6∼7 주령의 수컷 DBA-1 계 마우스를 사용하였다. 제2형 콜라겐 (CII)을 4 ㎎/ml이 되도록 0.1N 아세트산 용액에 녹인 후 투석 완충액(dialysis buffer, 50mM Tris, 0.2N Nacl)으로 투석하여 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis)를 함유하는 Complete Freud's 애주번트(CFA, Chondrex)와 동량으로 섞은 후 마우스의 꼬리 기저부에 피하 주사하여 면역원을 마리당 100㎕ (즉 100㎕/100㎍)으로 주사하였다(1차 주사).

이로부터 1주 후 100 mg/kg 용량의 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물(식염수에 용해시킴) 및 대조군 식염수를 복강내 200㎕의 부피로 주입하고, 1주 후 (1차로부터 2주 후) 동일한 CII를 동량의 incomplete Freud's 애주번트 (IFA, Chondrex)와 섞은 후 100㎕ (즉 100㎕/100㎍)를 한쪽 뒷다리에 주사하였다 (2차 주사). 2차 주사 후 3일 간격으로 총 4번 100 mg/kg 용량의 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물, 대조군 식염수를 복강 내 주사하였다.

각 군은 5 마리씩을 대상으로 시행하였으며 관절염 평가는 10주까지 평가하였고, 시험관내(in vitro) 시험을 위해 관절염 지수가 유의성 있게 차이 나는 시기에 각 동물을 치사시켜 혈액, 세포, 관절조직 내에서 관절염의 병의 활성 정도 및 각종 시험관 내 실험을 진행하였다.

2. CIA 동물에서 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 류마티스 관절염 치료 활성 평가

(2-1) Rosoliniec 등에 의한 평균관절지수 평가

첫 번째 접종을 시작점으로 하여 3주 후부터 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 세 명이 일주일에 세 번씩 관절 염증의 위중도를 평가하여 10주까지 관찰하였다. 이때 관절염 평가는 Rossoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수에 기준하여 마리당 2차 접종 때 CII/CFA를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 동물 모델에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.

0점 : 부종이나 종창이 없다.

1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적

2점 : 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적

3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적

4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적

마리당 최고의 관절염 지수는 4 점이므로 쥐 1 마리당 최고의 질병 지수는 16이다.

유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 주입한 시험동물에서는 관절염지수가 점차 낮아지는 것을 확인할 수 있었고, 반면에 CIA 동물 및 대조군으로 식염수를 주입한 동물에서는 관절염이 정상적으로 발생하여 관절염 임상증상이 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 주입 동물과 지속적으로 큰 차이를 나타냈다 (도 1).

관절염지수를 확인하기 위해 시험군 별로 사진을 촬영하였다. 상기 (1)의 관절염 지수와 마찬가지로 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 주입한 동물 의 관절의 붓기가 정상 마우스와 비슷하게 가라앉아 있었다 (도 2).

(2-2) 조직학적 검사

상기한 바와 같이 준비된 콜라겐에 의해 유도되는 관절염(collagen induced arthritis, CIA) 동물 모델에 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 50 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량으로 상기와 동일한 방법으로 주입하였다. 8 주 후에 시험동물을 치사시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀을 묻혔다. 관절 절편(5-7㎛)을 준비하고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다. 또한, 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘 블루(Toluidine blue)와 사프라닌 O (safranin O) 염색으로 조직학적 검사를 실시하였다.

조직학적 검사 결과, CIA 동물과 식염수를 주입한 동물의 관절은 많은 면역 세포들이 침식(infiltration)되어 있었으며 판누스(pannus) 형성, 연골파괴 및 뼈 침식 등이 관찰되었다. 반면, 유럽종 포도(Vitis v inifera)의 씨 추출물을 주입한 마우스의 관절과 연골의 파괴 정도는 정상 마우스와 유사하게 유지되었다 (도 3).

(2-3) 혈청학적 검사 (콜라겐에 특이적인 항체의 측정)

혈청학적인 실험으로 CII 에 특이적인 IgG 항체의 아형을 측정하기 위해 효소결합 면역측정법(ELISA)을 수행하였다. 마우스의 경우 IgG 항체의 여러 아형 중 IgG1 은 염증을 주로 억제하는 조절자의 역할을 하는 반면, IgG2a 는 염증 반응을 촉진하고 매개하는 인자로 작용한다고 알려져 있다. DBA-1 마우스의 경우에서는 관절염이 유도될 경우, 주로 Th1 반응을 일으키는 IgG2a 가 특이적으로 증가되는 것으로 알려져 있다.

각 시험군의 혈청을 1:8000으로 희석한 후 CII에 특이적인 혈청 내 IgG 항체의 아형을 측정한 결과 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 주입한 동물의 경우 Th2 타입의 IgG1는 차이를 보이지 않았나 Th1 타입의 경우 CII 특이적인 IgG2a 의 생성이 CIA 동물보다 낮게 관찰되었다 (도 4).

3. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 의한 사이토카인의 조절 평가

(3-1) IL-17과 TNF alpha 의 생성량 측정

각 군별 동물을 치사시킨 후 흉선 CD4+ T 세포와 비장의 CD11c+ 수지상 세포를 얻어 10:1의 비율로 3일 동안 공조 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 Th17과 Th1 타입의 사이토카인인 IL-17과 TNF alpha 의 양을 ELISA 로 측정하였다.

그 결과, CIA 동물에 비하여 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 주입 동물에서 2가지 사이토카인 모두 유의성 있게 감소했음을 확인하였다.(도 5)

(3-2) TCR 자극에 의한 IL-17 및 IL-4 생성과 관련된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 효과

각 군별 동물로부터 획득한 흉선 CD4+ T 세포와 비장의 CD11c+ 수지상 세포 를 배지 단독 또는 anti-CD3 자극과 함께 농도별(10ug/ml, 20ug/ml) 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 첨가 유무에 따른 조건으로 3일 동안 배양한 상등액에서 IL-17 과 IL-4 를 ELISA 로 측정하였다.

CIA 동물에 식염수를 주입한 시험동물의 경우 TCR 자극상에서 높게 증가한 IL-17의 생산이 시험관내(In vitro)에서 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리한 경우 농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고 항염증성 사이토카인인 IL-4의 생성은 농도 의존적인 증가를 확인하였다. 반면 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 주입한 동물에서는 시험관내(In vitro)에서 CIA 동물의 경우와 비교시 IL-17의 생산은 더 낮게 감소하였으며 IL-4의 생산은 높게 증가하였다 (도 6).

결과적으로 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 주입한 시험동물의 경우 시험관내(In vitro) 시험에서 항염증성 사이토카인인 IL-4를 생산할 수 있는 세포가 더 우세하며 반면 Th17 세포는 감소시킴을 알 수 있다. 이는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 관절염 치료 메커니즘의 한 가지로 염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인의 생산량을 조절함으로써 관절염을 호전시킨다는 것을 의미한다. 또한 IL-4 는 조절 T 세포를 유도할 수 있는 사이토카인으로 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 의한 조절 T 세포 유도의 가능성을 시사한다.

4. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 의한 조절 CD4 T 세포의 유도 및 Th17 세포의 억제

유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 의한 류마티스 관절염의 치료 메커니즘을 규명하기 위해 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 의해 유도되거나 억제되는 면역 체계를 조사하였다.

(4-1) 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 의한 IL-17 의 mRNA 발현 변화

CIA 동물에 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 50 mg/kg, 10 mg/kg 또는 식염수를 주입한 동물을 치사시킨 후 얻은 draining lymph nodes (dLN)를 배지 단독으로 배양하거나 anti-CD3, CII 또는 LPS (lipopolysaccharide) 자극과 함께 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 10 ug/ml의 첨가 유무에 따른 조건으로 3일 동안 배양 후 세포로부터 IL-17 과 mRNA 발현 정도를 real-time PCR (Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)를 이용하여 측정하였다.

IL-17 의 경우는 도 6에서 관찰된 것과 같이 전사 수준에서도 동일하게 확인되었으며 시험관내(in vitro) 시험에서 CII 또는 LPS 로 자극한 후 유럽종 포도(Vitis v inifera)의 씨 추출물을 처리하였을 때 CII 또는 LPS에 의해 증가된 IL-17 의 mRNA 가 감소하였다 (도 7).

(4-2) 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 의한 조절 CD4 T 세포의 유도

CIA 동물과 또 다른 류마티스 관절염 동물인 IL-1Ra-/- 를 치사시켜 얻은 흉 선 CD4+ T 세포와 비장의 CD11c+ 수지상 세포를 10:1 의 비율로 배지 단독으로 배양하거나 anti-CD3 와 CPG 또는 CII 자극과 함께 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 10 ug/ml 첨가 유무에 따른 조건으로 6일 동안 공조 배양 후 유세포 분석기 (Fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 Foxp3를 발현하는 세포의 유도 정도를 관찰하였다.

CIA 동물의 경우 CII 와 함께 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리해주면 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 단독 처리보다 조절 T 세포의 유도가 증가하였다. 또한 또 다른 류마티스 관절염 동물인 IL-1Ra-/- 의 경우에도 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 시험관내(in vitro)에서 자극하였을 때 Foxp3+ 인 조절 CD4 T 세포가 유도됨을 확인하였다 (도 8a 및 8b).

결과적으로 CII와 함께 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리해 주었을 때 CII 단독 처리보다 조절 CD4 T 세포의 유도를 증가시킴으로써 CII에 특이적인 조절 세포가 만들어져, 류마티스 관절염의 병인과 관련되어있는 만성 염증 T 세포의 과증식이 억제되고 염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인의 균형이 이루어지면서 류마티스 관절염의 진행 억제와 치료가 가능하다는 것을 알 수 있다.

시험예 2. 경구 투여시 관절염 치료 효능 평가

1. 동물모델의 준비 및 투여

콜라겐에 의해 유도되는 관절염(collagen induced arthritis, CIA) 동물 모 델의 준비 및 실시예 2에서 제조한 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 투여는 다음과 같다.

이로부터 1주 후 300 mg/kg 용량의 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물(식염수에 용해시킴)을 경구투여하였다. 또한 별도로 식염수, 3 mg/kg 용량의 셀레콕시브(10% DMSO에 용해시킴), 및 10% DMSO를 복강내 200㎕의 부피로 주입하였다. 상기 경구투여 또는 주입한 다음, 1주 후 (1차로부터 2주 후) 동일한 CII를 동량의 incomplete Freud's 애주번트 (IFA, Chondrex)와 섞은 후 100㎕ (즉 100㎕/100㎍)를 한쪽 뒷다리에 주사하였다 (2차 주사). 2차 주사 후 3일 간격으로 총 4번 300 mg/kg 용량의 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물, 식염수, 3 mg/kg 용량의 셀레콕시브, 및 10% DMSO를 상기와 동일한 방법으로 투여하였다.

각 군은 5 마리씩을 대상으로 시행하였으며 관절염 평가는 8주까지 평가하였고, 시험관내(in vitro) 시험을 위해 관절염 지수가 유의성 있게 차이 나는 시기에 각 동물을 치사시켜 혈액, 세포, 관절조직 내에서 관절염의 병의 활성 정도 및 각종 시험관 내 실험을 진행하였다.

시험예 1의 (2-1)과 동일한 방법으로 평균관절지수를 측정한 결과는 도 9와 같다. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 셀레콕시브를 투여한 시험동물에서는 관절염지수가 점차 낮아지는 것을 확인할 수 있었고, 반면에 식염수 및 10% DMSO를 주입한 동물에서는 관절염이 정상적으로 발생하여 관절염 임상증상이 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 투여군과 지속적으로 큰 차이를 나타냈다 (도 9).

시험예 1의 (2-2)와 동일한 방법으로 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 결과는 도 10과 같다. 조직학적 검사 결과, 식염수 및 10% DMSO를 주입한 동물의 관절은 많은 면역 세포들이 침식(infiltration)되어 있었으며 판누스(pannus) 형성, 연골파괴 및 뼈 침식 등이 관찰되었다. 반면, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 셀레콕시브를 주입한 마우스의 관절과 연골의 파괴 정도는 정상 마우스와 유사하게 유지되었다 (도 10).

시험예 1의 (2-3)과 동일한 방법으로 혈청학적 검사를 수행한 결과는 도 11a 및 도 11b과 같다. 각 시험군의 혈청을 1:8000으로 희석한 후 혈청내 Total IgG 항체의 아형을 측정한 결과 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 주입한 동물의 경우 Th2 타입의 IgG1는 차이를 보이지 않았나(도 11a) Th1 타입의 경우 CII 특이적인 IgG2a 의 생성이 식염수를 투여한 동물보다 낮게 관찰되었다 (도 11b).

시험예 1의 3과 동일한 방법으로 IL-17, TNF alpha 과 추가적으로 IL-1β의 생성량을 측정하였다

그 결과, 식염수 투여군에 비하여 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 투여군에서 IL-17, TNF alpha2, 및 IL-1β 모두 유의성 있게 감소했음을 확인하였다.(도 12a 내지 도 12c)

도 1은 콜라겐 유도 관절염(Collagen induced arthritis, CIA) 동물과 CIA 동물에 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물(GSPE) 100 mg/kg 또는 식염수를 복강내로 전체 5번 반복 주입 후 10주까지 관찰한 관절염 임상지수를 나타낸 그래프이다.

도 2는 CIA 동물, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 주입, 그리고 정상 동물 모델을 치사시키기 직전에 관절 부위를 사진 촬영한 것이다

도 3은 콜라겐유도 관절염 질환 동물 모델, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 주입(50mg/kg, 10mg/kg), 그리고 정상 동물 모델을 치사시켜 관절과 연골 조직의 파괴 정도를 조직염색을 통해 확인한 것이다.

도 4는 콜라겐유도 관절염 질환 동물 모델에 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 100mg/kg 또는 식염수를 주입한 동물모델, 그리고 정상 동물모델의 혈청에서 제2형 콜라겐 (Type II collagen, CII) 에 특이적인 항체 (항CII IgG1,항CII IgG2a) 생성량을 측정한 결과를 나타낸다.

도 5는 콜라겐유도 관절염 질환 동물 모델에 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 100mg/kg 또는 식염수를 주입한 동물모델을 치사시켜 얻은 흉선 CD4+ T 세포와 비장의 CD11c+ 수지상 세포를 10:1 의 비율로 3일 동안 공조 배양 후 상등액 (supernatant) 에서 IL-17 과 IFN-α 를 효소결합 면역측정법 (ELISA) 로 측정한 결과를 나타낸다.

도 6은 상기 도 5에서 기술한 동일한 방법으로 획득한 세포를 배지 단독 또 는 anti-CD3 자극과 함께 농도별 (10ug/ml, 20ug/ml) 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 첨가 유무에 따른 조건으로 3일 동안 배양한 상등액에서 IL-17 과 IL-4 를 ELISA 로 측정한 결과를 나타낸다.

도 7은 콜라겐유도 관절염 질환 동물 모델에 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 50mg/kg, 10mg/kg 또는 식염수를 주입한 동물모델을 차시시켜 얻은 draining lymph nodes (dLN) 를 배지 단독으로 배양하거나 anti-CD3, CII 또는 lipopolysaccharide (LPS) 자극과 함께 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 10ug/ml 의 첨가 유무에 따른 조건으로 3일 동안 배양 후 세포로부터 총 RNA 를 추출하여 IL-17 mRNA 발현 정도를 real-time PCR (Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 를 이용하여 나타낸다.

도 8a 및 8b는 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델과 또 다른 자가면역 관절염 질환 동물 모델인 IL-1Ra-/- 를 치사시켜 얻은 흉선 CD4+ T 세포와 비장의 CD11c+ 수지상 세포를 10:1 의 비율로 배지 단독으로 배양하거나 anti-CD3 와 CPG 또는 CII 자극과 함께 유럽종 포도(Vitis v inifera)의 씨 추출물 10ug/ml 첨가 유무에 따른 조건으로 6일 동안 공조 배양 후 유세포 분석기 (Fluorescence activated cell sorter, FACS) 를 이용하여 나타낸다.

도 9는 콜라겐 유도 관절염 동물에서, 식염수, 셀레콕시브, 또는 10% DMSO를 복강주사하거나 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여한 후 측정한 관절염 임상지수를 나타낸 그래프이다.

도 10은 콜라겐 유도 관절염 동물에서, 식염수, 셀레콕시브, 또는 10% DMSO 를 복강주사하거나 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여한 후, 각 군의 동물로부터 얻어진 관절을 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 결과를 나타낸다.

도 11a 및 도 11b는 콜라겐 유도 관절염 동물에서, 식염수를 복강주사하거나 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여한 후, Total IgG 항체의 아형을 측정한 결과를 나타낸다.

도 12a 내지 도 12c는 각각 콜라겐 유도 관절염 동물에서, 식염수, 셀레콕시브, 또는 10% DMSO를 복강주사하거나 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여하였을 때, IL-17, TNF alpha, 및 IL-1β의 생성량을 측정한 결과를 나타낸다.

Claims

(a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계;

(b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계;

(c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및

(d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계

를 포함하는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 아세톤과 물의 혼합용매의 부피비가 1 : 1.5인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(a) 및 단계(c)의 상기 추출이 2 내지 3 회 반복되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 증류가 50 ℃ 이하의 감압 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(b)에서 상기 염화나트륨을 포화시킨 다음, 2 내지 3 시간 동안 방치한 후, 여과하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(c)의 상기 농축이 추출액 총 부피에 대하여 0.4 내지 0.7 배로 농축되도록 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
(1) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계;

(2) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및

(3) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하는 단계

를 포함하는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조방법.
제7항에 있어서, 단계(i)의 상기 아세톤과 물의 혼합용매의 부피비가 4 : 1인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계(iii) 또는 단계(q)의 상기 추출이 2 내지 3회 반복되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계(iii)에서 상기 추출 후, 탈수 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계(iv)의 상기 건조가 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 농축하여 에틸 아세테이트를 제거하고, 얻어진 농축물을 물에 용해시킨 후, 분무건조함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계(r)의 상기 건조가 단계(q)에서 얻어진 여액을 분무건조함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 단계(r)의 상기 건조가 단계(q)에서 얻어진 여액을 농축한 후, 얻어진 농축액을 분무건조함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 제1 추출물 및 상기 제2 추출물의 혼합비가 1 : 0.5∼1.5 의 중량비임을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어지는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제