CN102006880A - 葡萄籽萃取物的制备方法及含该萃取物的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供改进的制备葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的方法。本发明还提供含所述葡萄籽萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。

Description

葡萄籽萃取物的制备方法及含该萃取物的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物
技术领域
本发明涉及葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备方法，及含有所述葡萄籽萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。
背景技术
葡萄属(Genus Vitis)为攀缘植物，属于鼠李目(order Rhamnales)葡萄科(family Vitaceae)，在全球范围内为自然生长或栽培，赤道地区和纬度50°或更高纬度地区除外。葡萄科有11个属700个种。欧洲葡萄(Vitis vinifera)、美国葡萄(Vitis labrusca)、河岸葡萄(Vitisriparia)、沙地葡萄(Vitis rupestris)、冬葡萄(Vitis berladieri)、紫葛葡萄(Vitis coignetiae)、山葡萄(Vitis amurensis)等都是栽培的水果。
由葡萄籽(seeds of Vitis vinifera)得到的萃取物包括(-)表儿茶素、原花青素(proanthocyanidin)B1和B2、(+)儿茶素及它们聚合衍生物的混合物，已知这些是原矢车菊酚(procyanidol)或黄烷醇(flavanol)低聚物(GB-A-1541469和FR-A-2092743)。上述萃取物已用于治疗循环系统疾病。
美国专利公开号No.2003/0165589公开了葡萄(Vitis vinifera)、尤其是葡萄叶(leaves of Vitis vinifera)的提取物，能抑制一氧化氮合酶(NO-合酶)，因此可以用于抑制各种与NO-合酶相关的疾病，诸如细胞分化和/或增殖、表皮生长和/或过度增生疾病、细胞降解和凋亡，以及免疫学和/或感染过程。
同时，美国专利公开号No.2006/0280811公开了用于治疗关节炎的制剂，包括水杨醇或柳杨梅(Salix rubra)提取物；乳香酸或乳香(Boswellia serrata)提取物；来自葡萄(Vitis vinifera)或茶树(Camellia sinensis)的原花青素，优选与磷脂、大黄酸或其亲脂性衍生物结合；N-乙酰葡萄糖胺；以及葡萄糖醛酸和葡醛内酯。根据美国专利公开号No.2006/0280811，原花青素与环氧合酶(COX-2)协同作用能抑制柳杨梅(Salix)和乳香(Boswellia)提取物中存在的成分。然而，该专利申请没有公开哪个成分明确地作为活性成分用于治疗关节炎。采用GB-A-1541469(和FR-A-2092743)或美国专利No.5,484,594(EP 348,781)中公开的萃取方法能够得到原花青素。
美国专利No.4,963,527公开了含有葡萄(Vitis vinifera)萃取物的磷脂复合物的化妆品成分，其在FR-A-2092743(即GB-A-1541469)中也有描述。
根据GB-A-1541469(以及FR-A-2092743)，将含有3-4体积丙酮和1体积水的丙酮-水混合溶液作为第一萃取溶剂，用于萃取低聚物，并通过沉淀除去杂质(即部分沉淀物)。也就是，用含有3-4体积丙酮和1体积水的丙酮-水混合溶液处理葡萄(Vitis vinifera)(例如种子)，并通过蒸馏除去丙酮。然后，过滤沉淀的杂质，用不溶于水的有机溶剂诸如乙酸乙酯处理水层滤液。然后，除去有机溶剂，并除去残渣。通过加入氯化钠进行沉淀以除去剩余的杂质，用乙酸乙酯和氯仿处理水层滤液。根据GB-A-1541469，由于当使用过量的水时，不会发生部分沉淀，因此使用过量的水不能有效应用于大量生产。
GB-A-1541469中公开的萃取应采用含有过量丙酮的混合溶液作为第一萃取溶剂，在丙酮的沸腾温度(约57℃)下进行，过量的丙酮应通过蒸馏除去。因此，该萃取可能由于加热条件和较长的蒸发时间而导致成本增加，且还可能由于使用过量的丙酮而导致环境污染。另外，丙酮可能残留在最终获得的萃取物中。而且，由于采用不溶于水的有机溶剂诸如乙酸乙酯处理，以及在加入氯化钠前必须除去乙酸乙酯，因此可能延长萃取过程。
美国专利No.5,484,594(欧洲专利No.348,781)公开了一种可选的萃取方法，采用截留分子量3000至600的超滤膜；以及采用醚类、或酯类、或者乙酸乙酯和芳香烃的混合物。然而，与GB-A-1541469中公开的方法相比，由于需要采取更多的萃取步骤，以及需要使用其他的设备诸如超滤设备，因此导致了高的萃取成本。
同时，韩国专利No.10-0509119公开了采用包括柱色谱的多步萃取方法，从榆白皮(Ulmi cortex)中得到的原花青素低聚物(儿茶素-4-间苯三酚)，其能抑制基质金属蛋白酶(MMP)的活性，因此可有效用于预防和治疗疾病，诸如肿瘤迁移、牙周疾病、类风湿性关节炎、炎症、甲状旁腺机能亢进、糖尿病、角膜溃疡、骨质疏松症、胃溃疡、创伤、皱纹、痤疮、艾滋病、烧伤、动脉硬化、骨折。然而，该专利没有公开获得葡萄(Vitis vinifera)萃取物的方法。韩国专利No.10-0509119仅公开了原花青素低聚物富含于榆白皮(Ulmi cortex)、葡萄籽、大黄、Pleuropterus multiflorus、樟脑树(camphor trees)、肉桂、侧柏(Thuja orientalis)、山茶、小米、荞麦、橡树等中，但没有公开葡萄籽萃取物、特别是葡萄(Vitis vinifera)萃取物可能与类风湿性关节炎有关。
发明内容
技术问题
本发明人研究的目的是通过简单的步骤开发改进的制备葡萄(Vitis vinifera)萃取物的方法。结果，本发明人发现，采用含有相对少量丙酮的水-丙酮混合溶液作为第一萃取溶剂，萃取葡萄籽(Vitisvinifera seeds)，蒸馏除去丙酮，然后直接用氯化钠处理所得的水层，该萃取步骤可以在室温(约25℃)进行，还可以简化蒸馏操作。另外，还发现由于无需采用不溶于水的有机溶剂进行萃取的步骤，因此可以简化所述萃取过程。
本发明人还发现改进的制备所述萃取物的方法。该方法包括分别制备第一萃取物和第二萃取物，然后将它们混合。也就是，通过采用丙酮-水混合溶液进行萃取，然后采用乙酸乙酯进行萃取来制备第一萃取物；通过仅用水作为萃取溶剂进行萃取，然后用乙醇进行萃取来制备第二萃取物；以及将所述第一萃取物和第二萃取物混合的方法制备所述萃取物。根据该方法，可以减少丙酮的用量，由于不需要氯化钠饱和及氯仿萃取从而简化萃取步骤，以及将因使用有机溶剂所致的环境污染最小化。特别是，所述萃取物的产量可以增加约10倍。
本发明人对葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的各种药理作用进行了研究，发现葡萄籽萃取物具有很强的预防和治疗类风湿性关节炎的作用。令人惊讶的是葡萄萃取物可能与类风湿性关节炎存在关联尚未见报道。
因此，本发明提供改进的制备葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的方法。
本发明还提供含有葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。
技术方案
本发明的一个方面是提供葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备方法，该方法包括：(a)在室温下用体积比为1∶1-2的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；(b)蒸馏步骤(a)中制备的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液；(c)用乙酸乙酯萃取步骤(b)中制备的滤液，然后浓缩所得溶液；以及(d)向步骤(c)中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤来沉淀所得溶液。
步骤(a)的混合溶液中丙酮和水的体积比可以是1∶1.5。步骤(a)和(c)中的萃取可以重复2-3次。步骤(b)中的蒸馏可以在50℃或稍低的温度下减压进行，步骤(b)中的过滤是将氯化钠的饱和溶液静置2-3小时后进行。步骤(c)中的浓缩为浓缩至萃取液总体积的0.4-0.7倍。
本发明的另一方面是提供葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备方法，该方法包括：(A)制备第一萃取物：(i)用体积比为3-5∶1的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；(ii)浓缩步骤(i)中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液；(iii)用乙酸乙酯萃取步骤(ii)中制备的滤液；及(iv)干燥步骤(iii)中制备的萃取液，得到第一萃取物；(B)制备第二萃取物：(p)用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；(q)用乙醇萃取步骤(p)中制备的滤液，然后过滤所得溶液；及(r)干燥步骤(q)中制备的滤液，得到第二萃取物；以及(C)将第一萃取物和第二萃取物混合。
步骤(i)的混合溶液中丙酮和水的体积比可以是4∶1。步骤(iii)或(q)中的萃取可以重复2-3次。步骤(iii)中可以进一步包括对所得萃取液进行脱水处理。步骤(iv)中的干燥可以通过浓缩步骤(iii)中制备的萃取液以除去乙酸乙酯，将浓缩液溶于水中，然后喷雾干燥所得溶液。步骤(r)中的干燥可以通过喷雾干燥步骤(q)中制备的滤液或者通过浓缩步骤(q)中制备的滤液，然后喷雾干燥浓缩液来实施。第一萃取物和第二萃取物的混合比例按重量计可以是1∶0.5-1.5。
优选地，通过上述方法得到的葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物，具有的原花青素值(Procyanidolic value，PCV)为80-130％；(+)儿茶素和(-)表儿茶素为30％或更低；以及原花青素为95-105％。
本发明的另一方面提供含有葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其药用载体。优选地，根据上述方法制备所述葡萄籽萃取物。更优选地，所述葡萄籽萃取物具有的原花青素值(PCV)为80-130％；(+)儿茶素和(-)表儿茶素为30％或更低；以及原花青素为95-105％。
有益效果
本发明的方法采用丙酮含量相对较小的水-丙酮混合溶液作为第一萃取液来进行萃取。因此，丙酮可以通过简单地蒸馏除去，使残余溶液最少。而且，由于萃取可以在室温(约25℃)进行，所以不需要加热的步骤，且在加入氯化钠前不需要采用不溶于水的有机溶剂萃取。因此，本发明葡萄籽萃取物的制备方法简单，节约成本，适于工业化大量生产。
另外，通过分别制备第一萃取物和第二萃取物、并将其混合来制备葡萄籽萃取物的方法，可以减少丙酮的用量，由于不需要氯化钠饱和及氯仿萃取，可以简化萃取步骤，将因使用有机溶剂所致的环境污染最小化。特别是，所述萃取物的产量可增加约10倍。
此外，根据本发明方法制备的葡萄籽萃取物，作为一种天然的萃取物，具有非常好的安全性，并显示出很强的预防和治疗类风湿性关节炎的效果，例如对胶原蛋白诱发关节炎(CIA)的动物模型具有很好的效果。
附图说明
图1示出胶原蛋白诱发关节炎(CIA)动物的关节炎得分，对CIA动物连续5次腹膜内注射100mg/kg葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物(GSPE)，对CIA动物连续5次腹膜内注射生理盐水，观察10周。
图2示出CIA动物和正常动物处死前的关节区照片，其中对CIA动物注射葡萄籽萃取物。
图3示出通过组织染色的CIA动物和正常动物处死后的关节和软骨组织的破坏度，其中对CIA动物各注射50mg/kg和10mg/kg葡萄籽萃取物。
图4示出注射100mg/kg葡萄籽萃取物的CIA动物、注射生理盐水的CIA动物和正常动物的血清中II型胶原蛋白-特异性抗体(抗-CII IgG1和抗-CII IgG2a)的量。
图5示出采用酶联免疫法(ELISA)测量的培养物上清液中IL-17和TNFα的量，该培养物上清液通过以10∶1的比例对胸腺CD4+T细胞和脾CD11c+树突状细胞共培养3天制备得到，其中胸腺CD4+T细胞和脾CD11c+树突状细胞从注射100mg/kg葡萄籽萃取物的CIA动物或注射生理盐水的CIA动物中获得。
图6示出采用ELISA法测量的培养物上清液中IL-17和IL-4的量，该培养物上清液通过与图5中所述相同的方式获得的细胞，在未增补或增补用抗-CD3激发的含10μg/ml和20μg/ml葡萄籽萃取物的培养基中，共培养3天制备得到。
图7示出采用实时转录酶-聚合酶式链反应(PCR)，来自引流区淋巴结(dLN)的IL-17mRNA的表达度，该dLN从分别注射50mg/kg和10mg/kg葡萄籽萃取物或者生理盐水的CIA动物中获得，并在未增补或增补用抗-CD3、CII和脂多糖(LPS)激发的含10μg/ml葡萄籽萃取物培养基中培养3天。
图8和9分别示出采用荧光激活细胞分类器(FACS)测量的胸腺CD4+T细胞和脾CD11c+树突状细胞共培养的结果，上述细胞从CIA动物模型和自身免疫关节炎动物模型IL-1Ra-/-中得到，以10∶1的比例在未增补或增补用抗-CD3、CPG或CII激发的含10μg/ml葡萄籽萃取物的培养基中培养6天。
图10示出通过腹膜内注射生理盐水、塞来昔布或10％DMSO或者灌胃给予葡萄籽萃取物的CIA动物的关节炎得分。
图11示出用苏木精和曙红染色的CIA动物的关节切片，其中对CIA动物通过腹膜内注射生理盐水、塞来昔布或10％DMSO或者灌胃给予葡萄籽萃取物。
图12-13分别示出通过腹膜内注射生理盐水或灌胃给予葡萄籽萃取物的CIA动物的总IgG抗体的亚型。
图14-16分别示出通过腹膜内注射生理盐水、塞来昔布或10％DMSO，或者灌胃给予葡萄籽萃取物的CIA动物的IL-17、TNFα和IL-1β的量。
具体实施方式
本发明包括葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备方法，该方法包括：(a)在室温下用体积比为1∶1-2的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；(b)蒸馏步骤(a)中制备的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液；(c)用乙酸乙酯萃取步骤(b)中制备的滤液，然后浓缩所得溶液；以及(d)向步骤(c)中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤使所得溶液沉淀。
葡萄籽粉可以通过如下方法制备：通过压制葡萄获得茎皮、种子和分枝，用水清洗，在烘箱中干燥，分离种子，然后采用常规方法将种子磨粉。
在本发明的方法中，采用丙酮和水的混合溶液作为第一萃取溶剂，与常规萃取(例如GB-A-1541469中公开的萃取)中的用量相比，丙酮的量较低，本发明的第一个萃取方法在室温(约25℃)进行，无需加热。本发明所用的丙酮和水的混合溶液中，丙酮与水的体积比在1∶1-2的范围内，优选约1∶1.5。第一次萃取可以进行一次或重复多次，优选2-3次。步骤(a)中可以采用常规的方法过滤，收集滤液用于下一步操作。
本发明的方法包括蒸馏步骤(a)中的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液[步骤(b)]。在蒸馏过程中，除去沸点相对较低的丙酮，从而沉淀出溶于丙酮的杂质。蒸馏可以采用常规的方法进行，例如，减压蒸馏。蒸馏可以在50℃或稍低的温度下减压进行。通过蒸馏得到的萃取液不能用有机溶剂萃取，但可用氯化钠饱和后过滤。如果萃取液(即丙酮蒸发的萃取液)用氯化钠饱和，那么杂质诸如单宁酸就会沉淀出来并通过过滤除去。在用氯化钠饱和并过滤的杂质沉淀步骤中，所述过滤是将氯化钠的饱和溶液静置2-3小时后进行。可以采用常规的方法过滤，收集滤液用于下一步操作。
本发明的方法包括用乙酸乙酯萃取步骤(b)中制备的滤液，然后浓缩所得溶液[步骤(c)]。采用乙酸乙酯萃取(第二次萃取)可以进行一次或重复多次，优选2-3次。可以将所得萃取液的总体积浓缩至0.4-0.7倍。
本发明的方法包括向步骤(c)中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤使所得溶液沉淀[步骤(d)]。当将氯仿加入到浓缩液中时，包括低聚物在内的不溶于氯仿的活性成分被沉淀出来。通过过滤沉淀可以简单地分离葡萄籽萃取物。采用常规的方法干燥由过滤得到的沉淀，获得干燥粉末。可以采用减压干燥，例如在50℃或稍低的温度下减压。
本发明还包括葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备方法，该方法包括：(A)制备第一萃取物：(i)用体积比为3-5∶1的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；(ii)浓缩步骤(i)中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液；(iii)用乙酸乙酯萃取步骤(ii)中制备的滤液；及(iv)干燥步骤(iii)中制备的萃取液，得到第一萃取物；(B)制备第二萃取物：(p)用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；(q)用乙醇萃取步骤(p)中制备的滤液，然后过滤所得溶液；及(r)干燥步骤(q)中制备的滤液，得到第二萃取物；以及(C)将第一萃取物和第二萃取物混合。
葡萄籽粉可采用前述的方法制备。可以用通过分别制备第一萃取物和第二萃取物并将它们混合来制备本发明的萃取物。因此，本发明的方法可以减少丙酮的用量。而且，由于氯化钠饱和及氯仿萃取不是必须的，可以简化方法，并将因使用有机溶剂所导致的环境污染最小化。另外，萃取物的产量可以增加约10倍。
在第一萃取物的制备中，步骤(i)用体积比为3-5∶1、优选4∶1的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液。该萃取可以进行一次或重复多次，优选2-3次。步骤(i)的过滤可以采用常规的方法进行，收集滤液用于下一步操作。
在第一萃取物的制备中，步骤(ii)为浓缩步骤(i)中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液。在浓缩过程中，除去沸点相对较低的丙酮，从而沉淀溶于丙酮的杂质。可以采用常规的方法在减压下浓缩(或减压蒸馏)，例如在减压的条件下蒸馏。通过过滤除去沉淀，收集滤液。
在第一萃取物的制备中，步骤(iii)为用乙酸乙酯萃取步骤(ii)中制备的滤液。采用乙酸乙酯萃取(第二次萃取)可以进行一次或重复多次，优选2-3次。另外，步骤(iii)可以进一步包括脱水步骤，例如在乙酸乙酯萃取后，采用无水硫酸钠脱水。
在第一萃取物的制备中，步骤(iv)为干燥步骤(iii)中制备的萃取液。可以采用常规的方法进行干燥，例如在50℃或稍低的温度下减压。更优选地，可以采用下述方式进行干燥：通过浓缩步骤(iii)中制备的萃取物以除去乙酸乙酯，将浓缩液溶于水中，然后喷雾干燥所得溶液。
在第二萃取物的制备中，步骤(p)为用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；步骤(q)为用乙醇萃取步骤(p)中制备的滤液，然后过滤所得溶液。步骤(q)中的提取可以进行一次或重复多次，优选2-3次。
在第二萃取物的制备中，步骤(r)为干燥步骤(q)中制备的滤液。步骤(r)中的干燥可以采用喷雾干燥步骤(q)中制备的滤液；或浓缩步骤(q)中的滤液，然后喷雾干燥浓缩液。可以将步骤(q)中制备的滤液体积浓缩至0.4至0.7倍，但不限于此。
第一萃取物和第二萃取物的混合可以将所述萃取物进行简单地混合。所述第一萃取物和第二萃取物的混合比例按重量计可以是1∶0.5-1.5。
步骤(iii)或(q)中的萃取可以重复2-3次。步骤(iii)中可以进一步包括对所得萃取液进行脱水处理。步骤(iv)中的干燥可以通过浓缩步骤(iii)中制备的萃取液以除去乙酸乙酯来实施，将浓缩液溶于水中，然后旋转蒸干所得溶液。步骤(r)中的干燥可以通过旋转蒸干步骤(q)中制备的滤液或者浓缩步骤(q)中制备的滤液、然后旋转蒸干浓缩液来实施。第一萃取物和第二萃取物的混合比例按重量计可以是1∶0.5-1.5。
采用上述方法得到的葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物，其原花青素值(PCV)为80-130％；(+)儿茶素和(-)表儿茶素为30％或更低；以及原花青素为95-105％。
本发明中的“原花青素值(PCV)”按如下方法计算。
①对照品溶液的制备
精密称取葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物标准品100mg，与异丙醇混合形成50ml溶液。取10ml该溶液与10ml 3M盐酸混合，然后将所得溶液与异丙醇混合制成50ml对照品溶液。
②供试品溶液的制备
取供试品各100mg，按照与标准品溶液相同的制备方法处理，制备供试品溶液。
③测量
取供试品溶液和对照品溶液各10ml，分别加入5个试验管中，给试验管盖上管帽。然后，将试验管置于100℃的水浴中加热45分钟。加热后，将试验管在冷水中冷却，从每个试验管中取2ml溶液，分别与20ml异丙醇混合。在550nm处测量供试品溶液和对照品溶液的吸光度，以异丙醇作为空白对照溶液，计算5个吸光度的平均值。
④计算
PCV＝105×[A(t)×Mt×(100-Et)]/[A(s)×M×(100-E)]
A(t)：供试品溶液吸光度的平均值
A(s)：对照品溶液吸光度的平均值
Mt：标准品的质量，mg
M：供试品的质量，mg
Et：标准品中水的含量(％)
E：供试品中水的含量(％)
本发明中的(+)儿茶素和(-)表儿茶素按如下方法定量。
①对照品溶液的制备
取(+)儿茶素和(-)表儿茶素标准品各50mg，溶于乙腈和稀磷酸(5∶95)的混合溶液中，制成100ml对照品溶液。
②供试品溶液的制备
取供试品各50mg，溶于乙腈和稀磷酸(5∶95)的混合溶液中，制成10ml供试品溶液。
③分析条件
-色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充柱(0.46×25cm，5μm)
-流动相：
表1
  时间(分钟)   流动相A   流动相B
  0   95   5
  50   85   15
  60   20   80
  70   95   5
流动相A：稀磷酸溶液
流动相B：乙腈
-流速：0.7ml/min
-检测器：UV检测器(波长：278nm)
-进样量：10μl
④计算
儿茶素的含量，用表儿茶素表达(％)
＝[A1×Me×100×100]/[Ae×M1×(100-E)×10]
表儿茶素的含量(％)
＝[A2×Me×100×100]/[Ae×M1×(100-E)×10]
A1：供试品溶液中儿茶素的峰面积
A2：供试品溶液中表儿茶素的峰面积
Ae：对照品溶液中表儿茶素的峰面积
Me：对照品溶液中表儿茶素的质量，mg
M1：供试品溶液中萃取物的质量，mg
E：萃取物中水的含量(％)
另外，“原花青素的量”采用下述的方法计算。
①内标溶液的制备
取30mg 2，6-二-叔-丁基-4-甲基苯酚(BHT)，加入到100ml烧瓶中，加入流动相至刻度，制备内标溶液。
②供试品溶液1的制备
将10mg样品加入到10ml烧瓶中，用5ml内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备供试品溶液1。
③供试品溶液2的制备
将10mg样品加入到10ml烧瓶中，用5ml内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备供试品溶液2。
④对照品溶液校准曲线的绘制
-对照品溶液1：将8mg原花青素标准品加入到10ml烧瓶中，用5ml内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备对照品溶液1。
-对照品溶液2：将10mg原花青素标准品加入到10ml烧瓶中，用5ml内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备对照品溶液2。
-对照品溶液3：将12mg原花青素标准品加入到10ml烧瓶中，用5ml内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备对照品溶液3。
⑤分析条件
-色谱柱：PL凝胶柱(7.6×300mm，5μm)或相似柱
-检测器：UV检测器(波长：280nm)
-流动相：四氢呋喃和溴化锂溶液(95∶5)的混合溶液
*溴化锂溶液：将1.04g溴化锂加入到1000ml烧瓶中，加水至刻度。
-流速：1.0ml/min
-进样量：10μl
-运行时间：15分钟
⑥方法
采用下述液相色谱法，将对照品溶液1、2、3和供试品溶液1、2各分析两次。通过对照品溶液的浓度和主峰与IS峰的比例(A原花青素/ABHT)建立对照品溶液的校准曲线，计算方法如下。
⑦计算
-Ti％＝{[(A原花青素/ABHT)供试-a]/b}×(1/C供试)×100
A原花青素＝供试品溶液中原花青素的峰面积
ABHT＝供试品溶液中BHT的峰面积
a＝对照品溶液校准曲线的截距
b＝对照品溶液校准曲线的斜率
C供试＝供试品溶液的浓度(mg/ml)
-原花青素的含量(％)＝Ti％×[(100-KFstd)/(100-KF供试)]
KFstd＝对照品中水分的含量(％)
KF供试＝供试品中水分的含量(％)
本发明包括含有葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其药用载体。
根据上述方法制备所述葡萄籽萃取物。更优选地，所述葡萄籽萃取物含原花青素值(PCV)为80-130％；(+)儿茶素和(-)表儿茶素为30％或更低；以及原花青素为95-105％。
如下述的实验例，根据本发明的方法制备的葡萄籽(Vitis viniferapip)萃取物显示出很强的预防和治疗类风湿性关节炎的效果，例如对胶原蛋白诱发关节炎(CIA)的动物模型具有很好的效果。
也就是，当对CIA动物腹膜内注射100mg/kg葡萄籽萃取物时，关节炎得分显著降低(图1和图2)。而且，在具有慢性炎性关节炎的类风湿性关节炎动物模型(IL-Ra-/-)中，观察到关节炎的症状减轻。组织学检验结果表明，当注射100mg/kg葡萄籽萃取物时，动物的关节破坏度与正常小鼠相似，对软骨的破坏也有所改善(图3)。另外，血清学试验结果表明，当注射100mg/kg葡萄籽萃取物时，Th2型抗-CIIIgG1的水平没有变化，但产生的CII-特异性Th1型IgG2a降低了(图4)。由此可见，因为产生的CII-特异性Th1型IgG2a降低了，所以通过施用葡萄籽萃取物可以有效治疗类风湿性关节炎。
另外，当注射葡萄籽萃取物时，类风湿性关节炎的炎性因子-IL-17和TNFα的量显著降低(图5)，采用葡萄籽萃取物体外治疗时，炎性因子IL-17与抗炎性因子IL-4呈反比例关系(图6)。也观察到了同样模式的转录水平的IL-17曲线。在体外用CII或LPS激发，然后用葡萄籽萃取物治疗时，由CII或LPS所致增加的IL-17mRNA的表达量降低(图7)。
由于类风湿性关节炎与免疫细胞(尤其是慢性炎性T细胞)的过度活性有关，因此CD4T细胞的调节可以作为治疗的靶标。当采用葡萄籽萃取物对CIA动物和IL-1Ra-/-动物治疗时，Foxp3+调节性CD4T细胞的诱导增加。与仅用CII处理的组相比，当采用CII和葡萄籽萃取物对CIA动物中的CD4T细胞处理时，Foxp3+调节性CD4T细胞的诱导增加(图8和图9)。我们期望通过由葡萄籽萃取物产生的CII-特异性调节性CD4T细胞的传代可以有效抑制慢性炎性T细胞的增殖。
由此可见，通过抑制炎性因子的传代和诱导抗-炎性因子及调节性T细胞，葡萄籽萃取物具有很强的预防和治疗类风湿性关节炎的作用。
本发明的药物组合物包括药用载体，且能按照常规方法制成各种制剂，例如口服制剂，诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂或气雾剂；外用制剂；栓剂；或无菌注射溶液。优选地，本发明的药物组合物可以制成片剂。所述药用载体可以是乳糖、葡聚糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。所述药物组合物可进一步包括稀释剂或赋形剂，诸如填充剂、膨胀剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂或表面活性剂。固体口服制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂。这种固体制剂可以包括至少一种选自例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶的赋形剂。另外，这种固体制剂可以进一步包括润滑剂，诸如硬脂酸镁或滑石粉。液体口服制剂可以是混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂。另外，所述液体制剂可以包括稀释剂，诸如水、液体石蜡；湿润剂；甜味剂；矫味剂；或防腐剂。肠外制剂可以是无菌水溶液、无水溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂或栓剂。无水溶剂或混悬试剂可以是丙二醇，聚乙二醇，天然油脂，诸如橄榄油，或注射用酯类诸如油酸乙酯。栓剂的载体可以是半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可黄油、月桂精(Laurin)或甘油明胶(glycerogelatine)。
在本发明的药物组合物中，葡萄籽萃取物的萃取物的剂量可以根据患者的状态或体重、疾病的严重程度、剂型、给药途径和给药时期而有所不同，可以由本领域的普通技术人员适当地确定。例如，葡萄籽萃取物的施用剂量可以是每天1-100mg/kg，优选5-50mg/kg，更优选5-10mg/kg。可以每天完全给药一次或者分次给药。本发明的药物组合物可以与其他治疗类风湿性关节炎的药物联合给药。当联合给药时，所述治疗药物可以顺序给药或者同时给药。当联合给药时，可以使用能达到最佳治疗效果的尽可能少的各剂量，这可以由本领域的普通技术人员来确定。
本发明的药物组合物可以通过例如口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下等各种途径施用于哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、家畜或人类，其中优选口服给药。
以下将通过下面的工作实施例来更具体地说明本发明。但是，下面提供的工作实施例仅用于解释本发明，因此不用于限定本发明的范围。
实施例1：葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备
通过压制葡萄(Vitis vinifera)获得茎皮、种子和分枝，用水清洗，在烘箱中干燥，分离葡萄的种子。将1kg种子磨成粉，在室温下加入纯水(300ml)与丙酮(200ml)的混合溶液500ml进行萃取。重复三次萃取，合并萃取液，过滤。将滤液在50℃或稍低的温度减压蒸馏以除去丙酮，用氯化钠饱和所得溶液。将所得溶液在室温放置3小时然后过滤。滤液用250ml乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸钠脱水。将萃取液的体积浓缩至125ml。向浓缩液中加入约600ml氯仿以进行沉淀，过滤所得溶液。将沉淀在50℃或稍低的温度于真空箱中干燥，得到约3.5g棕色葡萄籽萃取物粉末。将得到的萃取物在稀酸溶液中加热水解，通过对原花青素低聚物定量来测量PCV值。结果，PCV约为105。另外，按上述方法测量时，原花青素的量为103％。因此，该萃取物包括至少由诸如(+)儿茶素和(-)表儿茶素两种单体聚合的大量的低聚物。
实施例2：葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备
通过压制葡萄(Vitis vinifera)获得茎皮、种子和分枝，用水清洗，在烘箱中干燥，分离葡萄的种子。将1kg葡萄的种子磨成粉，用500ml丙酮的水溶液(丙酮/水＝8/2，v/v)萃取。重复三次萃取，合并萃取液，过滤。减压浓缩滤液以除去丙酮，然后过滤。滤液用250ml乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸钠脱水。减压浓缩萃取液以除去乙酸乙酯，将浓缩液溶于500ml水中，将该溶液喷雾干燥，得到约20g萃取物粉末(第一萃取物)。
通过压制葡萄(Vitis vinifera)获得茎皮、种子和分枝，用水清洗，在烘箱中干燥，分离葡萄的种子。将1kg葡萄的种子磨成粉，用500ml纯水萃取。重复三次萃取，合并萃取液，过滤。将滤液用250ml乙醇萃取三次，过滤。减压浓缩滤液，将浓缩液喷雾干燥，得到约15g萃取物粉末(第二萃取物)。
将上述第一萃取物和第二萃取物混合，得到约35g葡萄籽萃取物。将得到的萃取物在稀酸溶液中加热水解，通过对原花青素低聚物定量来测量PCV值。结果，PCV约为98。另外，按上述方法测量时，原花青素的量为98.5％。因此，该萃取物包括至少由诸如(+)儿茶素和(-)表儿茶素两种单体聚合的大量的低聚物。
实验例1：腹膜内注射对关节炎治疗效果的评价
1.制备动物模型及施用葡萄籽萃取物
制备胶原蛋白诱发关节炎(CIA)动物模型，按照如下方式给予实施例1制备的葡萄籽萃取物。
使用6-7周龄的雄性DBA-1小鼠。将2型胶原蛋白(CII)溶于0.1N乙酸溶液中，配成4mg/ml的浓度，用透析缓冲液(50mM Tris，0.2NNaCl)进行透析。将所得溶液与等体积的含有结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的完全弗氏佐剂(CFA，Chondrex)混合，将100μl(即100μl/100μg)免疫原经皮下注射到小鼠的尾根部(第一次注射)。
第一次注射一周后，通过腹膜内注射，给小鼠注射100mg/kg葡萄籽萃取物(溶于生理盐水)各200μl，以200μl生理盐水作为对照组。一周后(即第一次注射两周后)，将CII与等体积不完全弗氏佐剂(IFA，Chondrex)混合，将100μl(即100μl/100μg)该混合液注射到一只后腿(第二次注射)。第二次注射后，每三天腹膜内注射100mg/kg葡萄籽萃取物(溶于生理盐水)，以生理盐水作为对照组，共注射四次。
每组使用5只小鼠，该评价进行了10周。当关节炎得分出现明显改变时，处死小鼠，测量血、细胞和关节组织中关节炎的活度，进行各种体外实验。
2.葡萄籽萃取物对CIA动物类风湿性关节炎的治疗效果的评价
(2-1)Rosoliniec的平均关节炎得分的评价
未参加前述实验的三位观察者从第一次注射开始，在第三周到第十周，每周三次，评价了的关节炎症的严重性。基于Rosioniec EF的标准关节炎得分，由三位观察者给出从三条腿(在第二次注射时注射CII/CFA的腿除外)获得的平均得分，通过获得的平均得分来进行关节炎的评价。以0-4分记录关节炎的严重程度，作为平均关节炎指数。
评价关节炎的得分和标准如下：
0：无水肿和皮肤发红
1：足或踝关节轻度水肿且皮肤发红
2：从踝关节至跖骨轻度水肿且皮肤发红
3：从踝关节至跗骨中度水肿且皮肤发红
4：从踝关节至整条腿水肿且皮肤发红
因为单条腿的最高关节炎得分是4分，所以小鼠的最高关节炎得分是16分。
观察到注射葡萄籽萃取物的动物的关节炎得分是递减的。另一方面，观察到CIA动物中关节炎的正常发作，在CIA动物中注射生理盐水作为对照组。因此，葡萄籽萃取物处理组与葡萄籽萃取物未处理组的关节炎的临床症状不同(图1)。
为了确认关节炎得分，拍摄了受试组的照片。与图1所示的关节炎得分相同，注射葡萄籽萃取物的动物的肿胀关节被治愈到与正常小鼠关节相同的程度(图2)。
(2-2)组织学试验
按照上述相同的方式对CIA动物注射50mg/kg和10mg/kg葡萄籽萃取物。8周后处死小鼠。用10％福尔马林固定每只小鼠的后腿，脱钙并涂上石蜡。用苏木精和曙红将关节切片(5-7μm)染色。另外，为了确认软骨的破坏度，通过用甲苯胺蓝和番红精O染色进行组织学试验。
组织学试验的结果表明，在注射生理盐水的CIA动物关节中，许多免疫细胞被浸润，并观察到血管翳形成、软骨破坏和骨渗透。另一方面，注射葡萄籽萃取物的小鼠的关节和软骨的破坏度与正常小鼠的相似(图3)。
(2-3)血清学试验(由胶原蛋白-特异性抗体测定)
应用酶联免疫法(ELISA)，采用血清学试验来检测CII-特异性IgG抗体的亚型。在小鼠中，IgG抗体的亚型中IgG1具有抑制炎症的调节剂的功能。另一方面，IgG2a具有促进和调解炎症反应的因子的功能。据报道，当在DBA-1小鼠中诱导关节炎时，能导致Th1反应的IgG2a显著增加。
对每个受试组的血清以1∶8000的比例稀释，测量CII-特异性血清IgG抗体的亚型。结果，与CIA动物相比，在注射葡萄籽萃取物的动物中，Th2型IgG1未发生改变，但Th1型CII-特异性IgG2a降低了(图4)。
3.葡萄籽萃取物对细胞因子调节的评价
(3-1)IL-17和TNFα量的测定
每组的动物被处死后，分离胸腺CD4+T细胞和脾CD11c+树突状细胞，以10∶1的比例共培养3天，采用ELISA法在上清液中测量Th17型细胞因子IL-17和Th1型细胞因子TNFα的量。
结果，与CIA动物相比，注射葡萄籽萃取物的动物中，这两种细胞因子都显著降低(图5)。
(3-2)葡萄籽萃取物对由TCR激发的IL-17和IL-4传代的影响
从每组动物中获得的胸腺CD4+T细胞和脾CD11c+树突状细胞在培养基中培养3天，该培养基中未增补或增补用抗-CD3激发的含10μg/ml和20μg/ml葡萄籽萃取物，采用ELISA法在上清液中测量IL-17和IL-4的量。
在注射生理盐水的CIA动物中通过TCR激发后产量增加的IL-17，依据体外葡萄籽萃取物的治疗浓度而有所降低。抗-炎性细胞因子IL-4的产量依据所述浓度而有所增加。另一方面，注射葡萄籽萃取物的动物中IL-17的产量比CIA动物体外降低的更多，注射葡萄籽萃取物的动物中IL-4的产量比CIA动物体外增加的更多(图6)。
结果，在注射葡萄籽萃取物的动物中，能产生抗-炎性细胞因子IL-4的细胞占主导地位，但Th17细胞在体外降低。这表明葡萄籽萃取物通过调节炎性细胞因子和抗-炎性细胞因子的产量来治疗关节炎。另外，IL-4是能诱导调节性T细胞的细胞因子。由此可见，葡萄籽萃取物可以诱导调节性T细胞。
4.葡萄籽萃取物对调节性CD4T细胞的诱导和Th17细胞的抑制
为了证明葡萄籽萃取物对类风湿性关节炎的治疗机制，检查了由葡萄籽萃取物诱导或抑制的免疫系统。
(4-1)由葡萄籽萃取物引起的IL-17的mRNA表达的变化
对CIA动物分别注射50mg/kg和10mg/kg葡萄籽萃取物，以及生理盐水，然后将其处死。从中获得引流区淋巴结(dLN)，在未增补或增补用抗-CD3、CII或脂多糖(LPS)激发的含10μg/ml葡萄籽萃取物培养基中培养3天。然后，采用实时转录酶-聚合酶链式反应(PCR)测量IL-17的mRNA表达水平。
图6中也观察到了同样模式的转录水平的IL-17曲线。当在体外用CII或LPS激发动物，然后用葡萄籽萃取物治疗时，由CII或LPS所致增加的IL-17mRNA表达量降低(图7)。
(4-2)葡萄籽萃取物对调节性CD4T细胞的诱导
胸腺CD4+T细胞和脾CD11c+树突状细胞从CIA动物和IL-1Ra-/-动物(另一种类风湿性关节炎动物)中得到，以10∶1的比例在未增补或增补用抗-CD3、CPG或CII激发的含10μg/ml葡萄籽萃取物的培养基中培养6天。然后，采用荧光激活细胞分类器(FACS)测量表达Foxp3的细胞的诱导度。
与仅用葡萄籽萃取物治疗CIA动物相比，用CII和葡萄籽萃取物治疗CIA动物，调节性T细胞的诱导增加的更多。另外，在IL-1Ra-/-动物中，当用葡萄籽萃取物体外激发时，能识别出Foxp3+调节性CD4T细胞的诱导(图8和图9)。
结果，与仅用CII治疗时相比，当用CII和葡萄籽萃取物治疗时，通过增加CD4T细胞的诱导，产生CII-特异性调节性细胞。因此，可以抑制与类风湿性关节炎有关的慢性炎性T细胞的过度增殖，平衡炎性细胞因子和抗-炎性细胞因子，从而抑制类风湿性关节炎的过程并治愈类风湿性关节炎。
实验例2：口服给药对关节炎治疗效果的评价
1.制备动物模型及施用葡萄籽萃取物
制备胶原蛋白诱发关节炎(CIA)动物模型，按照如下方式给予实施例2制备的葡萄籽萃取物。
使用6-7周龄的雄性DBA-1小鼠。将2型胶原蛋白(CII)溶于0.1N乙酸溶液中，配成4mg/ml的浓度，用透析缓冲液(50mM Tris，0.2NNaCl)进行透析。将所得溶液与等体积的含有结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的完全弗氏佐剂(CFA，Chondrex)混合，将100μl(即100μl/100μg)免疫原经皮下注射到小鼠的尾根部(第一次注射)。
第一次注射一周后，给小鼠灌胃给予300mg/kg葡萄籽萃取物(溶于生理盐水)。通过腹膜内注射，分别给小鼠注射200μl生理盐水、3mg/kg塞来昔布(溶于10％DMSO)、10％DMSO。灌胃给药和注射一周后(即第一次注射两周后)，将CII与等体积不完全弗氏佐剂(IFA，Chondrex)混合，将100μl(即100μl/100μg)该混合液注射到一只后腿(第二次注射)。第二次注射后，每三天腹膜内注射300mg/kg葡萄籽萃取物、生理盐水、3mg/kg塞来昔布和10％DMSO，共注射四次。
每组使用5只小鼠，该评价进行了8周。当关节炎得分出现明显改变时，处死小鼠，测量血、细胞和关节组织中关节炎的活度，进行各种体外实验。
2.葡萄籽萃取物对CIA动物类风湿性关节炎的治疗效果的评价
按照实验例1中(2-1)所述相同的方式测量平均关节炎得分，结果如图10所示。观察到施用葡萄籽萃取物和塞来昔布的动物的关节炎得分降低。另一方面，观察到注射生理盐水和10％DMSO的动物中关节炎正常发作。葡萄籽萃取物处理组与葡萄籽萃取物未处理组的关节炎的临床症状不同(图10)。
按照实验例1中(2-2)所述相同的方式用苏木精和曙红对关节切片染色，结果如图11所示。组织学试验的结果表明，在注射生理盐水和10％DMSO的动物关节中，许多免疫细胞被浸润，并观察到血管翳形成、软骨破坏和骨渗透。另一方面，注射葡萄籽萃取物和塞来昔布的小鼠的关节和软骨的破坏度与正常小鼠的相似(图11)。
按照实验例1中(2-3)所述相同的方式进行血清学试验，结果如图12和图13所示。对每个受试组的血清以1∶8000的比例稀释，测量总IgG抗体的亚型。结果，与注射生理盐水的动物相比，在注射葡萄籽萃取物的动物中，Th2型IgG1未发生改变(图12)，但Th1型CII-特异性IgG2a降低了(图13)。
3.葡萄籽萃取物对细胞因子调节的评价
按照实验例1中的3所述相同的方式测量IL-17、TNFα、IL-1β的量。结果，与施用生理盐水的组相比，IL-17、TNF α2、IL-1β的量在施用葡萄籽萃取物的组中显著降低(图14-16)。

Claims (31)

1.一种葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备方法，该方法包括：
(a)在室温下用体积比为1∶1-2的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；
(b)蒸馏步骤(a)中制备的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液；
(c)用乙酸乙酯萃取步骤(b)中制备的滤液，然后浓缩所得溶液；以及
(d)向步骤(c)中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤来沉淀所得溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)所述的混合溶液中丙酮和水的体积比为1∶1.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)和(c)中所述的萃取重复2-3次。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所述的蒸馏是在50℃或稍低的温度下减压进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所述的过滤是将氯化钠的饱和溶液静置2-3小时后进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中所述的浓缩是将所述萃取液的总体积浓缩至0.4-0.7倍。
7.一种葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物的制备方法，该方法包括：
(A)制备第一萃取物：(i)用体积比为3-5∶1的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；(ii)浓缩步骤(i)中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液；(iii)用乙酸乙酯萃取步骤(ii)中制备的滤液；及(iv)干燥步骤(iii)中制备的萃取液，得到第一萃取物；
(B)制备第二萃取物：(p)用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；(q)用乙醇萃取步骤(p)中制备的滤液，然后过滤所得溶液；及(r)干燥步骤(q)中制备的滤液，得到第二萃取物；以及
(C)将所述第一萃取物和所述第二萃取物混合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(i)所述的混合溶液中丙酮和水的体积比为4∶1。
9.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(iii)或(q)中所述的萃取重复2-3次。
10.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(iii)中进一步包括对所得萃取液进行脱水处理。
11.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(iv)中所述的干燥是通过浓缩步骤(iii)中制备的萃取液除去乙酸乙酯、将浓缩液溶于水中，然后喷雾干燥所得溶液来进行的。
12.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(r)中所述的干燥通过喷雾干燥步骤(q)中制备的滤液来实施。
13.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(r)中所述的干燥通过浓缩步骤(q)中制备的滤液、然后喷雾干燥浓缩液来实施。
14.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一萃取物和所述第二萃取物的混合比例按重量计为1∶0.5-1.5。
15.根据权利要求1-14任一所述的方法，其中所得到的葡萄籽萃取物具有的原花青素值(PCV)为80-130％；(+)儿茶素和(-)表儿茶素为30％或更低；以及原花青素为95-105％。
16.一种含有葡萄籽(Vitis vinifera pip)萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其药用载体。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述葡萄籽萃取物通过如下方法获得，该方法包括：
(a)在室温下用体积比为1∶1-2的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；
(b)蒸馏步骤(a)中制备的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液；
(c)用乙酸乙酯萃取步骤(b)中制备的滤液，然后浓缩所得溶液；以及
(d)向步骤(c)中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤来沉淀所得溶液。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤(a)所述的混合溶液中丙酮和水的体积比为1∶1.5。
19.根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤(a)和(c)中所述的萃取重复2-3次。
20.根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤(b)中所述的蒸馏是在50℃或稍低的温度下减压进行。
21.根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤(b)中所述的过滤是将氯化钠的饱和溶液静置2-3小时后进行。
22.根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤(c)中所述的浓缩为浓缩至萃取液总体积的0.4-0.7倍。
23.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述葡萄籽萃取物通过如下方法获得，该方法包括：
(1)制备第一萃取物：(i)用体积比为3-5∶1的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；(ii)浓缩步骤(i)中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液；(iii)用乙酸乙酯萃取步骤(ii)中制备的滤液；及(iv)干燥步骤(iii)中制备的萃取液，得到第一萃取物；
(2)制备第二萃取物：(p)用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；(q)用乙醇萃取步骤(p)中制备的滤液，然后过滤所得溶液；及(r)干燥步骤(q)中制备的滤液，得到第二萃取物；以及
(3)将所述第一萃取物和所述第二萃取物混合。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤(i)所述的混合溶液中丙酮和水的体积比为4∶1。
25.根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤(iii)或(q)中所述的萃取重复2-3次。
26.根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤(iii)中进一步包括对所得萃取液进行脱水处理。
27.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(iv)中所述的干燥通过浓缩步骤(iii)中制备的萃取液以除去乙酸乙酯，将浓缩液溶于水中，然后喷雾干燥所得溶液。
28.根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤(r)中所述的干燥通过喷雾干燥步骤(q)中制备的滤液来实施。
29.根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤(r)中所述的干燥通过浓缩步骤(q)中制备的滤液、然后喷雾干燥该浓缩液来实施。
30.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述第一萃取物和所述第二萃取物的混合比例按重量计为1∶0.5-1.5。
31.根据权利要求16-30任一所述的方法，其中所述葡萄籽萃取物具有的原花青素值(PCV)为80-130％；(+)儿茶素和(-)表儿茶素为30％或更低；以及原花青素为95-105％。
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