KR20090079576A

KR20090079576A - 류마티스성 관절염 치료용 식물 추출물

Info

Publication number: KR20090079576A
Application number: KR1020080005662A
Authority: KR
Inventors: 레이-유 우; 지아-밍 창; 춘-밍 쳉; 유-샨 충
Original assignee: 재단법인 생물기술개발중심
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2009-07-22
Also published as: KR100972690B1

Abstract

본 발명은 플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 [Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng] (PA)의 추출물 또는 조 추출물을 포함하는 류마티스성 관절염 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 류마티스성 관절염 치료용 약제의 제조를 위한 플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 추출물 또는 조 추출물의 사용 방법을 제공한다.

Description

류마티스성 관절염 치료용 식물 추출물{PLANT EXTRACTS FOR THE TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS}

본 발명은 중국 한방약 추출물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 류마티스성 관절염 (RA) 치료용 플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 [Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng] (PA)의 추출물 또는 조 추출물의 사용 방법에 관한 것이다.

다양한 완화성 약제 및 면역 억제제를 사용한 결과, 류마티스성 관절염의 치료는 상당한 진전을 이루었다. 대부분의 연구는 완화성 약제 또는 면역 억제제를 발생 초기에 가능한 빨리 사용할수록, 뼈의 파괴 속도가 효과적으로 감소될 수 있음을 나타낸다. 현재 류마티스성 관절염 치료를 위한 약제는 다음의 3그룹으로 분류된다.

1. 염증을 효과적으로 억제하고 통증 효과를 경감시킬 수 있는, 예를 들어 아스피린, 인도메타신 또는 나프록센과 같은 비스테로이드성 항염증 약제 (NSAIDs).

2. 증상을 억제하고 면역 이상을 개선할 수 있는, 예를 들어 금 조제물, 히 드록시클로로퀸, 메토트렉사이트 (MTX) 또는 페니실라민과 같은 질환 변경성 항류머티스 약물 (DMARDs)로 일컬어지는 항류마티스 약물 (ARDs).

3. 항염증성이고 면역 억제제로서 사용될 수 있는 코르티코스테로이드로 일컬어지는 스테로이드.

또한, 임상학적으로 일반적인 완화성 약물은 설파살라진을 포함하고, 면역 억제제는 시클로스포린, 아자티오프린 또는 시클로포스파미드를 포함한다. 게다가, 미노싸이클린과 같은 일부 항생제는 효소를 억제하고, 뼈 흡수를 억제하며, 염증성 물질의 생산을 억제할 수 있으므로, 이를 또한 류마티스성 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 많은 치료 모델은 톱니바퀴 치료 (sawtooth therapy), 스텝-다운 브릿지 치료 (step-down therapy), 스테이징 치료 (staging therapy) 및 타깃 치료 (target therapy)와 같이 약제의 사용 및 치료 시기를 제안하고 있다. 이들 치료 모델의 정신은 초기 단계에서 다양한 완화성 약제 또는 면역 억제제를 단독 또는 조합하여 사용하는 것이 확실하다.

하지만, 이들 약제의 문제점은 이들, 특히 스테로이드가 작용할 때 부작용이 유발될 것이라는 점이다. 종종 항염증성 약제는 창자관에서 예컨대 출혈 등의 이상을 유발한다.

또한, TNF-α와 같은 단백질 길항제도 증상을 빠르게 완하시키기 위해 임상학적으로 사용될 수 있지만, 침입 모드에서 사용될 필요가 있어 불편하다. 또한, 약초인 라딕스 트립테리기이 윌포르디이 (Radix Tripterygii Wilfordii)는 항염증성, 살균성, 및 발열 및 통증 경감 효과를 갖기 때문에, 현재 류마티스성 관절염을 치료하는데 사용되고 있다; 그러나, 이의 독성 부작용으로 인해 안전성에 대한 고려가 이루어질 수 있다.

통계에 따르면, 전 세계 인구의 1%가 류마티스성 관절염을 앓고 있다. 따라서, 류마티스성 관절염 치료를 위한 편리하고, 안전하며, 효과적인 약제를 개발하는 것은 매우 중요하다.

플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 (PA)은 말레이시아 및 인도에서 유래된 것으로, 일반 가정에서 관상용 약초로서 종종 재배된다. 일반적인 약초인 PA는 플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 식물의 지상 부위 (epigeal portion)로서, 일명 리시마키아 카필리페스 헴슬 (Lysimachia capillipes Hemsl), 스피어민트 (Spearmint), 아가스타케 라고수스 (Agastache ragosus), 파츌리 (Patchouly), 인도 페퍼민트 (Indian peppermint) 또는 포고스테몬 카블린 (pogostemon cablin)이다. 동인도인들은 PA를 직물 방향제로 사용하였고, 영국인들은 1820년에 인도로부터 숄 직물을 들여온 후에 PA의 매혹적인 향을 발견하였다. PA의 잎을 직접 의복에 넣으면, 의복은 향을 지닐 뿐만 아니라, 나방이 의복을 먹는 것도 방지하였다. 동남아에서는 PA가 살균성, 자극성 또는 벌레 퇴치 기능을 갖는 것으로 여긴다. 또한, PA는 독사 또는 모기 및 벌레에게 물린 것을 치료하고, 두통, 고창 (flatulence), 구토, 설사 및 발열 등을 완화할 수도 있다. 플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 정유는 아시아에서 가장 대중적인 조미료이다. 아로마테라피에서 PA는 상피 세포 재생 및 여드름, 습진, 무좀 및 건조하고 갈라진 피부 치료를 촉진하게 위해 사용된다. 아울러, PA는 불안을 완화시키고, 성적 욕구 를 향상시키는 훌륭한 안정제 및 최음제이다.

본 발명에서는 예기치 않게 PA의 추출물 또는 조 추출물이 RA 치료에 효능이 있음을 발견했다.

본 발명의 목적은 치료적 유효량의 플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 (PA)의 추출물 또는 조 추출물을 포함하는 류마티스성 관절염 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 류마티스성 관절염 치료용 약제의 제조를 위한 PA의 추출물 또는 조 추출물의 사용 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PA의 추출물 또는 조 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 아래에 상세하게 기술될 것이다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 효과는 명세서 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 증상이 개선된 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "환자"라는 용어는 동물, 특히 포유류를 의미한다. 바람직한 구현예에서, 환자는 인간이다.

본 명세서에서 사용되는 "치료적 유효량"이라는 용어는 본 발명의 약학적 조성물 단독으로 또는 다른 약물과 조합하여 치료시 치료 이익을 제공할 수 있는 약학적 조성물의 성분량을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "담체" 또는 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 용 어는 희석제, 부형제, 수용체 등을 의미하는데, 이들은 모두 당업자에게 잘 알려져 있고, 약학적 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "PA 조 추출물" 또는 "PA 추출물"이라는 용어는 직접 즙 프레싱 (direct juice pressing) 또는 PA 식물의 지상 부위에 대해 사용되는 추출 과정에 의해 얻어진 것들을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "고극성 (high-polarity) 용매"라는 용어는 제조 과정에서 사용되는 용매 중 가장 높은 극성을 갖는 용매를 의미한다. 상기 고극성 용매는 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들 용매 2 이상의 혼합물을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 "저극성 (low-polarity) 용매"라는 용어는 제조 과정에서 사용되는 용매 중 가장 낮은 극성을 갖는 용매를 의미한다. 상기 저극성 용매는 클로로포름, 이소프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 이들 용매 2 이상의 혼합물, 또는 1 이상의 이들 용매와 이들 용매보다 높은 극성을 갖는 1 이상의 용매가 약 70:30 내지 약 50:50의 비율 (v:v)로 혼합된 혼합물을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 "아-고극성 (sub-high-polarity) 용매"라는 용어는 제조 과정에서 사용되는 고극성 용매보다는 극성이 낮지만 제조 과정에서 사용되는 중간-극성 용매의 극성보다는 높은 극성을 갖는 용매를 의미한다. 상기 아-고극성 용매는 고극성 용매를 저극성을 갖는 용매와 약 30:70 내지 약 70:30, 바람직하게는 약 60:40 내지 약 40:60의 비율 (v:v)로 혼합하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "중극성 (medium-polarity) 용매"라는 용어는 제조 과정에서 사용되는 아-고극성 용매보다는 극성이 낮지만 제조 과정에서 사용되는 저극성 용매의 극성보다는 높은 극성을 갖는 용매를 의미한다. 상기 중극성 용매는 고극성 용매를 저극성을 갖는 용매와 약 30:70 내지 약 5:95, 바람직하게는 약 15:85 내지 약 5:95의 비율 (v:v)로 혼합하여 얻을 수 있다.

본 발명은 RA 치료를 위해 PA 조 추출물 또는 PA 추출물을 사용하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 치료적 유효량의 PA 조 추출물 또는 PA 추출물을 포함하는 RA 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

치료를 위한 가장 적합한 루트 및 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 본 발명에 따르면, 바람직한 루트는 경구 투여로, 예를 들어 캡슐, 정제, 분말, 연고, 물약 또는 스프레이 등이지만, 이에 한정되지는 않는다. 투여량은 치료될 증상의 성질 및 상태, 치료받을 환자의 나이, 전반적인 몸 상태, 투여 루트 및 이전에 수행된 임의의 치료력에 따라 다를 것이다. 투여량은 나이, 크기, 건강 상태 및 관련 요인에 의존하여 환자에 따라 달라질 것임은 당업자에 의해 이해될 것이다. 아울러, 필요하다면 상기 조성물은 살균되거나 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제조는 통상의 방법에 따라 당업자에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 PA 조 추출물 또는 추출물은 직접 즙 프레싱 또는 칼럼 분리에 의해 얻어지며, 외용 또는 경구로 사용될 수 있는 매우 안전한 약초이다. 또한, 본 발명에서는 RA 래트 모델을 이용함으로써 경구 투여시 PA 조 추출물 또는 추출물이 자기 면역 질환의 동물 질병 및 콜라겐 + 면역 아주반트에 의해 유발되는 관련 생화학을 효과적으로 억제할 수 있고, 따라서 PA 조 추출물 또는 추출물은 잠재적 부기 방지 및 항염증성 효능을 가져, RA를 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, PA 조 추출물 및 PA 추출물의 제조는 다음에 나타낸다.

PA 조 추출물의 제조

신선한 PA 식물을 취하여 깨끗한 물로 세정한 다음, 즙 추출기로 프레스하여 즙을 얻었다. 그런 다음, 상기 PA 즙을 냉동 건조하여 건조된 분말을 얻고, 이를 클로로포름 또는 메탄올과 같은 적합한 용매 내에 녹여 PA 조 추출물을 얻었다.

PA 추출물의 제조

임의의 양의 건조된 PA를 적당량의 고극성 용매에 담그고, 여과한 다음, 다시 적당량의 고극성 용매에 담궜다. 이후, PA 추출액을 감압하에서 회전 농축기로 원래 부피의 2-3%로 농축시키고, 용매 내에서 희석한 다음, 칼럼에서 분리했다. 선택적으로, 고극성에서 저극성 (고극성 용매, 아-고극성 용매, 중극성 용매 및 저극성 용매를 의미)까지의 4가지 다른 용매를 연속적으로 용출하기 위해 사용할 수 있다. 상기 고극성 용매, 아-고극성 용매, 중극성 용매 및 저극성 용매는 상기에서 정의된 바와 같다. 바람직하게는 상기 칼럼 분리 방법은 메탄올로 전처리된 DIAION 칼럼을 사용한다. 예를 들면, 건조된 PA와 동일한 양의 DIAION을 칭량하고, 메탄올에 담근 다음, 칼럼에 충전하였다. 충전 후, DIAION을 1-2배 부피의 메탄올로 세정한 다음, 5-6배 부피의 탈이온된 증류수로 세정하였다. 일단 세정이 완료되면, 충전은 완료된 것이다.

PA 약재 추출물의 성분 분석

기구 및 장치

고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)

펌프: Spectra-Physics P4000

검출기: UV/VIS Spectra-Physics Spectra System UV600OLP

자동화된 샘플러: Thermo Separation Products AS3500

소프트웨어: Thermo Separation Products Chrom Quest

시스템 콘트롤: Thermo Separation Products SN4000

액체 크로마토그래피의 조건

크로마토그래피 칼럼: COSMOSIL, 4.6×250㎜, 5C18-MS

유속: 1.0 ㎖/분,

제한 압력: 250 ㎏f/㎠

샘플 주입량: 10 ㎕

PDA 조건:

샘플링: 0.64초

파장 범위: 190-370 ㎚

UV 파장: 254 ㎚

용출 조건(1):

	시간(분)
이동상	0	15	55	60
물	90%	90%	20%	80%
아세토니트릴	10%	10%	80%	20%

용출 조건(2):

	시간(분)
이동상	0	11	20	30
물	95%	67%	67%	60%
아세토니트릴	5%	33%	33%	40%

본 발명은 다음의 비제한적 실시예를 참조하여 상세하게 기술한다. 다음의 절차는 RA 치료에 대한 PA 조 추출물 또는 추출물의 효과를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 당업자에 의해 용이하게 달성될 수 있는 임의의 변경 및 변화는 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 개시된 범위 내에 포함된다.

구현예

구현예 1: 직접 즙 프레싱을 사용하여 얻어진 PA 조 추출물

1.25㎏의 신선한 PA를 칭량하고, 깨끗한 물로 세정한 다음, 즙 추출기로 프레스하여 즙을 얻었다. 즙의 부피를 측정하기 위해 부피 실린더를 사용하였고, 부피 실린더로부터 1050㎖를 취해 냉동 건조시켜 19g의 건조된 분말을 얻었다 (수득률 1.5%). HPLC 패턴은 도 1에 도시된다.

구현예 2: PA 조 추출물에 의한 동물에서의 RA 치료에 대한 동물 시험

[시험 동물]

시험 동물인 체중이 약 155-165g이고 8주령인 루이스 래트 (Lewis rats)를 국립 실험 동물 센터로부터 구입했다. 이 래트들을 12시간 빛/12시간 어둠 주기를 갖는 동물 집에서 23±1℃의 실온, 적당한 습도 및 우수한 공기 조건하에 키웠고, 물 및 먹이는 임의로 제공했다. 또한, 실험하는 동안 모든 시험 동물은 실험 동물의 표준 규칙에 대한 국제 위원회의 기준에 따랐다.

[약제]

1. 소 기관 연골로부터 얻은 콜라겐 타입 Ⅱ (Sigma C-1188)

2. 프로인트 완전 아주반트, CFA (BD, BBL^TM 231131)

3. 프로인트 불완전 아주반트, IFA (BD, BBL^TM 263910)

4. 래트의 종양 괴사 인자 (TNF-α), 인터류킨-6 (IL-6) 및 인터류킨-1β (IL-1β)에 대한 ELISA 키트 (R&D, Duoset)

5. 래트의 C-반응성 단백질 (CRP), ELISA 키트 (BD^TM Pharmingen 557825)

6. 인도메타신 (대만 산청시 존슨 화학 약품사로부터 상업적으로 이용가능함)

7. 신선한 중국 약초 PA를 직접 프레스하여 즙을 얻고, 감압하에서 농축하여 PA 농축액을 형성한 다음, 각각 고농도의 22.5g 조 약 (crude medicine)/㎏ (PA-H) 및 저농도의 4.5g 조 약/㎏ (PA-L)으로 희석했다. 마지막으로, 각각의 실제 체중에 기초하여 상기 용액을 래트에 직접 경구 투여했다.

[장치]

1. 주사기: 1㎖, 3㎖ 및 5㎖ (Terumo)

2. 저울

3. 버니어 캘리퍼 (Mitutoyo Corporation)

4. 3단 피스톤 튜브

5. 발진기 (Vortex)

6. ELISA 판독기 (Dynex, Thermo Labsystems)

[프로토콜]

1. 항원 제형 및 면역 주사

동물 시험 개요는 도 2에 도시된다. 소 콜라겐 타입 Ⅱ (소 C Ⅱ)을 0.1M 아세트산 용액에 용해하고, 교반하여 완전하게 용해하여, 1.5㎎/㎖ 및 3㎎/㎖의 농도를 갖는 용액으로 제형하고, 나중에 사용하기 위해 4℃에서 보관하였다. 첫 번째 면역 주사를 위해, 100㎕의 C Ⅱ 용액을 동량의 CFA로 유화시키고, 유화가 끝난 후에 래트 꼬리의 뿌리 부분에 피하 주사했다 (200㎕/래트). 첫 번째 면역 후, 래트의 체중을 3일마다 기록하고, 사지가 붓는지 여부를 발견하기 위해 관찰하였다. 약 15일 후, 두 번째 면역을 수행하였다. 100㎕의 C Ⅱ 용액을 동량의 IFA로 유화시키고, 유화가 끝난 후 래트 꼬리의 뿌리 부분에 피하 주사했다 (200㎕/래트). 대략 20일째부터 관절염 증상이 관찰되었고 (CIA 래트), PA 및 인도메타신을 45일째까지 제공하였다.

2. 동물의 그룹화 및 치료

그룹	치료	위관 영양법
A	일반 래트 (블랭크)	일반 위관 영양법
B	CIA 래트 + 비히클 (질병 발생의 대조군)	증류수
C	CIA 래트 + 인도메타신 (상업적 의약품의 대조군)	인도메타신 2.5㎎/㎏/일
D	CIA 래트 + PA-L	PA, 75㎎/㎏/일
E	CIA 래트 + PA-H	PA, 375㎎/㎏/일

[시험 아이템 및 지수]

1. 체중 관찰: 3일마다 측정해서 나타냄.

2. RA 조사의 평가: 최대 관절염 지수 (MAI)로 평가함.

3. 관절의 부어 오름 속도: 버니어 캘리퍼 (15-28일 관절염 진행)로 측정함.

4. 류마티스성 요인 (RF)

5. 급성 염증성 C-반응성 단백질 (CRP)

6. 사이토카인: TNF-α, IL-1β 및 IL-6 (염증성 사이토카인)

- RA 조사의 평가

면역 후, 래트를 일주일에 3번 관찰하였다. 사지에서의 붉어짐 및 부기 등의 변화를 기록하고, 비교를 위해 사진을 찍고 철하였다. 조사에 대한 점수 계산은 다음의 5등급에 기초하였다.

0: 관절염 증상이 나타나지 않음.

1: 발바닥 및 발꿈치가 약간 붉고 부어 올랐음.

2: 발꿈치 및 발목이 적당히 붉고 부어 올랐음.

3: 발꿈치 및 발목이 심하게 붉고 부어 올랐음.

4: 관절이 경직되고, 뼈가 변형되었음.

각 그룹에 대한 최대 관절염 지수, 평균 MAI는 다음과 같이 계산하였다:

평균 MAI = 각 래트의 사지에 기록된 전체 MAI (0: CIA 발생 없음, 16: 최고 점수)/4/각 그룹의 전체 래트 마리 수

- 관절의 부어 오름 정도 측정

래트의 발바닥 두께 변화를 버니어 캘리퍼로 측정하였고 (일주일에 2번), 각 래트에서 총 8군데 부위를 측정하였는데, 이는 각각 2개의 앞발의 발바닥 중앙 1군데씩 및 각각 2개의 뒷발의 3군데씩 (발목 관절, 발바닥 및 발가락의 뿌리 부분)을 포함한다.

- 혈청 RF 분석

1. 콜라겐을 코팅 버퍼에서 40㎍/㎖의 농도로 제형하여, 이것의 0.1㎖를 각각 96-웰 마이크로 플레이트에 넣은 후, 밤새 4℃에서 유지시켰다.

2. 트리스 버퍼로 3번 세정한 후, 1% BSA를 함유하는 0.2㎖의 차단 버퍼를 각 웰에 넣었다. 실온에서 반응을 2시간 지속시킨 후, 다시 트리스 버퍼로 3회 세정하였다.

3. 혈청 샘플을 0.05% 트윈 20 (1/20 또는 1/40)을 함유하는 트리스 버퍼로 적절히 희석한 후, 0.1㎖ 혈청 샘플을 96-웰 마이크로 플레이트의 각각의 웰에 넣었다. 실온에서 반응을 2시간 지속시킨 후, 다시 트리스 버퍼로 3회 세정하였다.

4. 코팅된 항-래트 면역글로블린 M (IgM)을 양고추냉이 과산화효소 (HRP)와 결합시키고, 적절히 희석한 다음 (1/12000), 96-웰 마이크로 플레이트에 넣었다. 실온에서 반응을 2시간 지속시킨 후, 다시 트리스 버퍼로 3회 세정하였다.

5. 발색 반응을 위해 0.1㎖의 테트라메틸 벤지딘 (TMB)을 각 웰에 직접 넣은 후, 반응을 종결시키기 위해 멈춤 용액 (stopping solution)을 첨가하였다. 마지막으로 450㎚ 파장에서 흡광도 (O.D)값을 읽어냈다.

- 혈청 C-반응성 단백질 (CRP) 분석

1. CRP ELISA 키트를 마이크로 플레이트에 미리 코팅한 다음, 여기에 0.1㎖의 적절히 희석된 혈청 샘플이 직접 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 세정 버퍼로 4회 세정하였다.

2. 토끼 항-래트 C-반응성 단백질 (CRP)을 HRP Ab와 결합시키고, 세정 버퍼로 100배 희석한 다음, 0.1㎖를 각 웰에 넣었다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 세정 버퍼로 4회 세정하였다.

3. 발색 반응을 위해 0.1㎖의 TMB를 각 웰에 넣고, 약 5 내지 10분 후, 반응을 종결시키기 위해 멈춤 용액을 넣었다. 마지막으로 450㎚ 파장에서 O.D값을 읽어냈다.

(상기 분석 방법은 모두 키트에 포함되어 있는 검사 규칙에 따라 수행하였다.)

- 복강 세포 배양 및 사이토카인 분석

1. 이산화탄소로 안락사시킨 후, 래트 복강의 바깥 가죽을 가위로 잘라 전체 복강을 노출시켰다.

2. HBSS 버퍼를 10㎖ 주사기를 이용해 복강에 배치 방식으로 주사하여 전체 부피를 약 20㎖/래트로 만들었다.

3. 배를 부드럽게 마사지한 후 래트의 복강을 열었다. 가위를 사용하여 복강을 약 2㎝ 절단하였다. 복막 삼출 세포 (PEC)액 (약 10 내지 15㎖의 세포액이 수집될 수 있음)을 주사기로 빼내 50㎖ 원심분리관에 넣었다.

4. 상기 액을 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 상청액을 제거한 후, 10㎖의 HBSS 버퍼를 첨가하여 세정한 다음, 원심분리하였다.

5. 신선한 배지 (항생 물질 함유)를 사용하여 세포 농도를 2 × 10⁶ 세포/㎖로 조정하였다.

6. 세포 현탁액을 0.5㎖/웰로 48-웰 플레이트에 분주하였다.

7. 추가로 0.5㎖의 지질다당질 (LPS) (20㎍/㎖)을 따로따로 넣어 최종 농도 10㎍/㎖을 만들었다.

8. 마지막으로, 37℃ 인큐베이터에 24시간 동안 두었다. 상청액을 수집하여 -20℃에 저장하였다. 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 농도를 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다.

[결과 및 토의]

Ⅰ. 래트의 체중 변화

상기 동물 시험에서, 약물을 적용하거나, 다른 외부적 힘을 적용하는 것 모두 체중 변화에 직접 또는 간접적으로 영향을 준다. 따라서, 체중의 직접적 관찰은 외관상 가장 중요한 지수이다. 체중 측정의 결과는 콜라겐에 의해 유도된 관절염 증상이 약 20일 후에 발생함을 보여주고, 도 3에 도시된 바와 같이 일반 래트와 비교하여 체중이 현저히 감소한다; 그러나, PA-H 및 인도메타신을 먹인 래트 그룹에서는 일반 그룹과 동일한 성장 곡선을 가지면서 체중 감소가 효과적으로 방지된다. 또한, 체중 감소 현상이 PA-L을 먹인 그룹에서는 효과적으로 억제되지 않았다.

Ⅱ. 최대 관절염 지수

재료 및 방법 부분에 기재된 바와 같이, 검사 득점에 대한 기준으로서 5단계 차이점을 갖는 최대 관절염 지수 (MAI)는 외관 지수 중 하나이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 콜라겐에 의해 유도된 래트의 관절염은 약 35일째에 최고점에 도달한 반면, PA 및 인도메타신을 먹인 래트 그룹에서는 관절염 지수가 효과적으로 감소되었으며, 이때 PA-H 및 인도메타신의 결과가 가장 뛰어나다.

Ⅲ. 관절의 부어 오름 정도

래트에 두 번째 항원 주사 후 약 20일째에 류마티스성 관절염이 성공적으로 발생했고, 사지의 관절 부위를 실제로 버니어 캘리퍼로 측정하였다. 관절 팽창 속도 (8군데 측정 부위로부터 얻은 평균)는 도 5에 도시된 바와 같이 39일째에 20%에서 최고 61%까지 증가했는데, 이는 일반적인 그룹과 비교하여 현저한 차이를 갖는 것이다(P<0.01). PA 및 인도메타신을 먹이로 준 점으로부터, PA-H 및 PA-L 모두 관절의 부어 오름을 효과적으로 억제할 수 있고, 이때 PA-H 및 인도메타신의 효과가 여전히 가장 바람직하며, 이는 PA-H가 인도메타신과 유사한 항염증성 효과를 가질 수 있음을 제시한다.

Ⅳ. 혈청 RF에 대한 PA를 먹이로 준 효과

RA 진행 동안, 몇 가지 자기 항체가 발생한다. 하지만, 임상 진단에서 환자 혈청에서의 자기 항체 존재 여부는 RA인지 아닌지를 결정하는데 있어서 주요한 기준이며, 이때 RF의 자기 항체가 가장 중요하다. 따라서, 본 시험에서의 CIA의 동물 모델도 중요한 생화학 지수로서 RF를 취한다. 인간 또는 래트 혈청에서의 RF는 ELISA법 (Vittecoq 등, 2001; Jonsson 등, 1986)을 사용하여 분석될 수 있다는 것이 과거 연구에서 알려져 있다. 본 연구에서 본 발명자들은 과거 분석 방법에 기초하여 약간의 진전을 이루었으며, 래트 혈청 RF 분석을 위한 기술적 강령을 다시 세웠다. 상기 분석 결과는 도 6에 도시된 바와 같이 2번의 항원 주사 후 20일째에 래트의 혈청 RF 역가가 모두 최고점에 도달한 것을 보여 준다; 그러나, 20일째와 비교하여, 35일째에는 PA 및 인도메타신을 먹이로 준 그룹의 혈청 RF 값이 각각 33% 및 47%로 감소되었고, 또 45일째에는 각각 39% 및 51% 더욱 감소하였다. 또한 본 연구에서는 음성 대조군의 혈청 RF값은 20일째부터 점진적으로 감소하는 경향이 있음을 발견하였는데, 이는 래트에서 콜라겐에 의해 관절염 증상이 유도된 후에 상기 증상은 경감되고, 심지어 시간 경과시 회복되는 경향이 있음을 암시한다; 결과적으로 질병 진행에 대한 "황금 시간"은 20일째부터 45일째까지라고 추측된다.

Ⅴ. 혈청 CRP에 대한 PA를 먹이로 준 효과

혈청 CRP는 주로 간에서 생산되며 전신 염증 반응을 일으키는 지수이다; 이것은 급성 염증이 있는 동안 혈청에 존재하는 가장 중요한 반응물이다. 몇 가지 문헌에서는 RA 환자의 혈청에서 CRP 수준, 및 IL-1 및 TNF-α의 생산이 관절염 질환의 진행과 밀접하게 관련 있음을 언급하고 있다 (나카무, 류마티스성 관절염, 2000). 상기 연구 결과는 2번의 항원 면역 주사 후, 래트 혈청에서의 CRP 농도가 현저하게 증가하여, 도 7에 도시된 바와 같이 35일째에 최고점에 도달하고, 일반 그룹과 비교하여 현저한 차이가 있음을 보여준다(P<0.01). 또한 본 발명자들은 PA-H 및 인도메타신을 먹이로 준 후 35일째에 혈청 CRP 농도가 CIA 래트에서 효과적으로 억제될 수 있고, 또한 동일한 효과가 45일째에도 여전히 존재함을 발견하였는데, 이는 PA-H를 먹이로 주는 것은 인도메타신의 임상적 항염증성 투여와 동일한 치료 효과를 갖는 것을 제시한다. PA-L을 먹이로 주는 것은 현저한 염증성 억제 효과를 갖지 않는다.

Ⅵ. PEC 사이토카인의 변화

PA가 부기 방지 또는 항염증성 효과를 갖는지 여부에 대해 평가하는 상기 몇 가지 중요한 생화학적 지수 외에, 본 연구는 또한 RA 증상 발생 전후에 래트의 상태 변화를 보다 용이하게 이해하기 위하여 염증성 반응에 대한 사이토카인의 분비 효과를 추가로 조사했으며, 이때 TNF-α, IL-6 및 IL-1β와 같은 염증성 사이토카인은 가장 중요한 지수로서, 즉 체내에서 이들 사이토카인의 양은 염증성 반응과 매우 밀접한 관련이 있다. 본 연구 결과는 CIA 래트에게 PA-H를 먹이로 주었을 때 PEC가 TNF-α 및 IL-1β (도 8에 도시됨) 뿐만 아니라, IL-6 (도 9에 도시됨)를 분비하는 것을 현저히 억제시킬 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 인도메타신을 먹이로 준 경우, PEC가 염증성 사이토카인을 분비하는 것을 억제하는 효과는 없었는데, 이는 인도메타신의 효과 메카니즘이 이와는 관련이 없다는 것을 의미한다; 따라서, 부기 방지 또는 항염증성 용도에서 PA의 적용 가치는 더욱 강조된다.

상기로부터 본 발명의 약물과 대조군의 인도메타신의 비교에서, 크게 농축된 PA 조 추출물의 약물 효능은 인도메타신의 2.5㎎/㎏과 같음을 알 수 있다. 또한, 인도메타신은 COX의 억제제이고, 이의 약학적 효과는 나타내어진 사이토카인의 억제 현상에 근거하여 PA와는 다른 것일 수 있다.

구현예 3: 칼럼 분리 정제를 이용하여 얻어진 PA 추출물 (PA- EtOH , PA-F1, PA-F2, PA-F3 및 PA-F4)

2㎏의 건조된 PA 물질을 취하여 10배 높게 농축된 에탄올에 24시간 동안 담구고, 여과한 다음, 다시 10배 높게 농축된 에탄올에 24시간 동안 담궜다. 이후, PA 추출액을 회전 농축기로 감압하에서 원래 부피의 2~3%가 되도록 농축하고, 분말로 건조하여 PA-EtOH로 명명하였다 (중량 30g, 수득률 1.5%).

용매로 희석시킨 다음, 전처리된 DIAION 칼럼에 충전시켰다. 상기 칼럼을 건조된 약초의 약 10배 부피를 갖는 고극성 용매로 세정한 다음, 용출액을 수집하여 PA-F1으로 명명하였다 (중량 8.5g, 수득률 0.43%).

상기 칼럼을 건조된 약초의 약 5배 내지 10배의 부피를 갖는 아-고극성 용매로 세정한 다음, 용출액을 수집하여 PA-F2로 명명하였다 (중량 12g, 수득률 0.6%). HPLC 패턴은 도 10에 나타낸다.

상기 칼럼을 건조된 약초의 약 5배 내지 10배의 부피를 갖는 중극성 용매로 다시 세정한 다음, 용출액을 수집하여 PA-F3로 명명하였다 (중량 15g, 수득률 0.75%).

상기 칼럼을 건조된 약초의 약 5배 내지 10배의 부피를 갖는 저극성 용매로 다시 세정한 다음, 용출액을 수집하여 PA-F4로 명명하였다 (중량 12g, 수득률 0.6%).

구현예 4: RA 동물 치료를 위한 PA 추출물의 동물 시험

본 동물 시험에서 사용되는 시험 동물 및 장치는 구현예 2에서 개시된 것과 동일한 것이다.

[약제]

1. 소 기관 연골로부터 얻은 콜라겐 타입 Ⅱ (Sigma C-1188)

2. 프로인트 완전 아주반트, CFA (BD, BBL^TM 231131)

3. 프로인트 불완전 아주반트, IFA (BD, BBL^TM 263910)

4. 인터류킨-6 (IL-6) 및 인터류킨-1β (IL-1β)에 대한 ELISA 키트 (R&D, Duoset)

5. Ceelebrex (CBX)

6. 각각의 실체 체중에 기초하여 래트에게 직접 경구 투여되는 구현예 3에서의 PA 추출물 (PA-EtOH, PA-F1, PA-F2, PA-F3 및 PA-F4)

[프로토콜]

1. 항원 제형 및 면역 주사

동물 시험 개요는 도 11에 도시된다. 소 콜라겐 타입 Ⅱ을 0.1M 아세트산 용액에 용해하고, 교반하여 완전하게 용해하여 1.5㎎/㎖ 및 3㎎/㎖의 농도의 용액으로 제형하고, 나중에 사용하기 위해 4℃에서 보관하였다. 첫 번째 면역 주사를 위 해 100㎕의 C Ⅱ 용액을 동량의 CFA로 유화시키고, 유화가 끝난 후 래트 꼬리의 뿌리 부분에 피하 주사했다 (200㎕/래트). 첫 번째 면역 후, 래트의 체중을 3일마다 기록하고, 사지가 붓는지 여부를 발견하기 위해 관찰하였다. 약 15일 후, 두 번째 면역을 수행하였다. 100㎕의 C Ⅱ 용액을 동량의 IFA로 유화시키고, 유화가 끝난 후 래트 꼬리의 뿌리 부분에 피하 주사했다 (200㎕/래트). 대략 18일째부터 관절염 증상이 관찰되었고 (CIA 래트), PA 및 CBX는 19일째부터 38일째까지 제공되었다.

2. 동물의 그룹화 및 치료

그룹	치료	위관 영양법
A	CIA 래트 + PA-EtOH	PA, 40.5㎎/㎏/일
B	CIA 래트 + PA-F1	PA, 3.0㎎/㎏/일
C	CIA 래트 + PA-F2	PA, 1.13㎎/㎏/일
D	CIA 래트 + PA-F3	PA, 11.3㎎/㎏/일
E	CIA 래트 + PA-F4	PA, 11.3㎎/㎏/일
F	CIA 래트 + H₂O	증류수
G	CIA 래트 + CBX	CBX, 18㎎/㎏/일
J	일반 래트 (블랭크)	일반 위관 영양법

[결과 및 토의]

Ⅰ. 래트의 체중 변화

도 12에 도시된 바와 같이, 각 그룹에서 일반 래트와 CIA 래트의 체중 간에는 뚜렷한 차이가 없었다. 증류수를 먹이로 준 대조군과 비교하여, PA-EtOH, PA-F2 및 PA-F4를 먹이로 준 래트는 체중이 더 많이 나갔다.

Ⅱ. 최대 관절염 지수

도 13에 도시된 바와 같이, 콜라겐에 의해 유도된 래트의 관절염 지수는 약 31일째에 최고점에 도달한 반면, PA-EtOH, PA-F1, PA-F2, PA-F3, PA-F4 및 CBX를 먹이로 준 래트 그룹에서는 관절염 지수가 효과적으로 감소되었으며, 이때 상기 PA-F1 및 CBX 결과가 가장 뛰어나다.

Ⅲ. 관절의 부어 오름 정도

래트에 두 번째 면역 주사 후 약 20일째에 류마티스성 관절염이 성공적으로 발생했고, 사지의 관절 부분을 실제로 버니어 캘리퍼로 측정하였다. 관절의 부어 오름 속도는 연속적으로 증가하여 27일째에 최고 64%에 도달했다. 도 14에 도시된 바와 같이, 이는 일반 그룹과 비교하여 현저한 차이를 갖는다. 그러나, PA-EtOH, PA-F1, PA-F2, PA-F3, PA-F4 및 CBX를 먹인 래트는 모두 관절의 부어 오름이 억제되는 효과를 나타냈는데, 이때 PA-F1 및 CBX가 가장 뛰어나며, 이는 PA-F1이 CBX와 유사한 항 염증성 약효를 가질 수 있음을 보여준다.

Ⅳ. 혈청 RF에 대한 PA를 먹이로 준 것에 대한 영향

상기 분석 결과는 도 15에 도시된 바와 같이 2번의 면역 주사후 18일에 래트의 혈청 RF 역가가 모두 최고점에 도달함을 보여준다. 그러나, PA-F2 및 CBX를 먹이로 준 그룹에서는 PA-F2는 RF값이 30일에 약 34%, 37일에 약 44% 감소한 반면, CBX 치료는 RF값이 30일에 약 52%, 37일에 약 66%로 감소되었다; 그리고, 18일째와 비교할 때는 혈청 RF값은 각각 현저하게 감소했다.

Ⅴ. PEC 사이토카인의 변화

본 연구 결과는 CIA 래트에게 PA-F2, PA-F3 및 PA-F4를 먹이로 준 경우 PEC가 IL-6을 분비하는 것을 현저하게 억제하고 (도 16에 도시된 바와 같음), CIA 래트에게 PA-F1, PA-F2 및 CBX를 먹이로 준 경우는 PEC가 IL-1β를 분비하는 것을 현 저하게 억제한다 (도 17에 도시된 바와 같음)는 것을 보여준다.

[결론]

상기한 동물의 활동도의 분석 결과는 표 1에 요약된다.

[표 1]

	CBX	PA-EtOH	PA-F1	PA-F2	PA-F3	PA-F4
발가락 두께	++ (49%)	+ (16%)	++ (44%)	+ (23%)	+ (28%)	+ (23%)
MAI	++ (40%)	+ (34%)	++ (46%)	+ (24%)	+ (37%)	+ (21%)
RF	++ (43%)	- (0%)	- (0%)	+ (16%)	- (0%)	- (0%)
IL-6	++ (36%)	+ (30%)	+ (21%)	+++ (52%)	++++ (82%)	++++ (78%)
IL-1β	++ (38%)	- (0%)	+++ (64%)	++ (45%)	+ (30%)	+ (14%)

"++++"은 75 내지 100%의 억제 효과를 나타낸다.

"+++"은 50 내지 75%의 억제 효과를 나타낸다.

"++"은 25 내지 50%의 억제 효과를 나타낸다.

"+"은 0 내지 25%의 억제 효과를 나타낸다.

구현예 5: 래트 대식세포의 시험관내 세포 모델 분석

1. TNF-α 및 IL-1β의 농도 결정 방법

[목적]

래트의 대식 세포 RAW264.7 세포 배양에서 TNF-α 및 IL-1β의 농도를 측정하여, LPS-유도성 α 합성을 억제할 수 있는 활성 성분을 스크리닝했다.

[장치 및 재료]

1. 기구

(1) ELISA 판독기

(2) 원심분리기

2. 분석 키트 DY410: 래트 TNF-α/TNFSF1A (ELISA 키트) (R&D, Duoset)

(1) 담체 단백질이 없는 염소 항-래트 TNF-α 또는 IL-1β 항체: 인산 버퍼 식염수 (PBS) 내에서 0.8㎍/㎖

(2) 바이오틴화된 염소 항-래트 TNF-α 또는 IL-1β 항체: 희석제 내에서 150ng/㎖

(3) 희석제 내에서의 재조합 래트 TNF-α 또는 IL-1β: 2000pg/㎖

(4) 스트렙타비딘-HRP

3. 필요한 용액

(1) PBS: 137mM 염화나트륨, 2.7mM 염화칼륨, 8.1mM 인산수소이나트륨 (Na₂HPO₄), 1.5mM 인산이수소칼륨 (KH₂PO₄), pH 7.2~7.4

(2) 세정 버퍼: PBS 내의 0.05% 트윈 20

(3) 차단 버퍼: PBS 내의 1% BSA, 5% 수크로오스, 0.05% 아지드화 나트륨 (NaN₃)

(4) 희석제: PBS 내의 1% BSA

(5) 기질 용액: 발색 시약 A 및 발색 시약 B의 1:1 혼합물 (R&D 시스템 #DY999)

(6) 멈춤 용액: 2N 황산

4. 약제

(1) 그리스 시약: 5% 인산 내의 1% 술파닐아미드 및 0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌 디아민

(2) 표준액: 아질산나트륨

(3) 면역 자극제: 지질다당질 (LPS)

(4) 활동도 조절제: 니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME), 인도메타신

(5) 배양액: DMEM 내의 10% 우태아 혈청 (FCS)

(6) PBS

(7) 트립신

5. 세포 : RAW 264.7

[방법]

1. 세포 배양 및 플레이팅

(1) T-75 내의 오래된 배양 배지를 없애고, PBS로 1 내지 2회 세정한 후, 3㎖ 트립신을 첨가하고, 37℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 7㎖ 배지 (10% FCS가 첨가된 DMEM)를 첨가하여 트립신 작용을 중지시켰다.

(2) 1000rpm에서 원심분리기를 이용하여, 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 트립신 함유 배지를 제거하였다. 10㎖의 배지를 넣고, 완전히 혼합한 후 세포를 계수하였다.

(3) RAW 264.7 세포를 5 × 10⁵세포/웰의 세포 밀도로 24-웰 플레이트에 분주하고, 5% 이산화탄소에서 37℃에서 배양하였다.

2. LPS 자극 및 약물 치료

(1) 샘플 뿐만 아니라 L-LAME 및 인도메타신 (활동도 조절제)을 1㎍/㎖ LPS를 함유하는 페놀이 없는 배양액에 첨가하였다.

(2) 오래된 배양 배지를 제거하고, LPS 및 활동도 조절제 또는 샘플을 함유하는 신선한 배지로 교체하였다. 이를 3회 반복했다. 이를 5% 이산화탄소에서 18 내지 24시간 동안 37℃에서 배양하였다.

3. 샌드위치 ELISA의 제형

(1) 100λ의 포획 항체 (PBS 내에서 0.8㎍/㎖로 희석됨)을 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 실온에서 밀봉하여 밤새도록 배양했다.

(2) 자유 포획 항체를 제거한 후, 세정 버퍼로 3회 세정하였다. 300λ의 차단 버퍼를 넣고 실온에서 최소 1시간 배양하여 비특이성 결합을 감소시켰다.

(3) 세포 현탁액을 수집하고, 원심분리기로 10krpm에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하고 나서, -20℃에서 저장하였다.

4. ELISA 분석

(1) 차단 버퍼를 제거한 후, 세정 버퍼로 3회 세정했다. 100λ의 적절히 희석된 세포 배양액 또는 표준액 (최고 농도는 2000pg/㎖)을 넣고, 실온에서 2시간 동안 배양했다.

(2) 세포 배양액 또는 표준액을 제거한 후, 세정 버퍼로 3회 세정했다. 100λ의 검출 항체 (용매 내에서 100ng/㎖로 희석됨)를 넣고, 실온에서 2시간 동안 배양했다.

(3) 자유 검출 항체를 제거한 후, 세정 버퍼로 3회 세정했다. 100λ의 작용 희석액인 스트렙타비딘-HRP를 넣고, 빛을 차단시키고 실온에서 20분간 배양했다.

(4) 자유 스트렙타비딘-HRP을 제거한 후, 세정 버퍼로 3회 세정했다. 100λ의 기질 용액을 넣고, 빛을 차단시키고 실온에서 20분간 배양했다.

(5) 100λ의 멈춤 용액을 넣고 부드럽게 흔들어 완전히 혼합되도록 하였다.

(6) O.D 값을 450㎚의 파장에서 읽어내고 540㎚ 또는 570㎚ 값으로 보정하거나, 또는 450㎚에서 읽혀진 값으로부터 570㎚(또는 540㎚)에서 읽혀진 값을 직접 산출하였다.

Ⅱ. NO 결정

[목적]

래트의 대식세포 RAW264.7 세포 배양에서의 일산화질소(NO)의 농도를 측정하여, LPS 유도성 NO 합성을 억제할 수 있는 활성 성분을 스크리닝했다.

[장치 및 재료]

1. 기구

(1) ELISA 판독기

(2) 원심분리기

2. 약제

(2) 표준액: 아질산 나트륨

(3) 면역 자극제: 지질다당질 (LPS)

(5) 배양 배지: DMEM 내의 10% 우태아 혈청 (FCS)

(6) PBS

(7) 트립신

3. 세포: RAW 264.7

[방법]

1. 세포 배양 및 플레이팅

(2) 1000rpm에서 원심분리기를 이용하여 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 트립신 함유 배지를 제거하였다. 10㎖의 배지를 넣고, 완전히 혼합한 후 세포를 계수하였다.

2. LPS 자극 및 약물 치료

(1) 1㎍/㎖ LPS를 함유하는 페놀이 없는 배양액에, 샘플 뿐만 아니라 L-LAME 및 인도메타신 (활동도 조절제)을 첨가하였다.

(3) 세포 현탁액을 수집하고, 원심분리기로 10krpm에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, -20℃에서 저장하였다.

3. NO 농도의 측정

(1) 표준액의 제형: 100μM/㎖ 아질산나트륨 (배양 배지에 용해됨)을 제형하고, 2배로 희석하여 각각 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13 및 1.56μM/㎖의 농도를 갖는 총 7개의 표준액을 얻었다.

(2) 표준액 또는 세포 배양액의 상청액을 그리스 시약과 1:1로 혼합하고, 빛을 차단시키고 실온하에서 15분간 배양했다.

(3) O.D 값은 550㎚의 파장에서 읽어냈다.

Ⅲ. 프로스타글란딘 E2 (PGE₂)의 결정

RAW 264.7 세포를 10⁵세포/웰의 세포 밀도로 24-웰 플레이트에 분주하고, 밤새도록 배양하였다 (16시간 내지 24시간). 활동도 조절제 및 시험 샘플을 각각 1㎍/㎖ LPS를 함유하는 페놀이 없는 배양 배지에 넣었다. 오래된 배지를 제거한 후, 시험 샘플 및 LPS를 함유하는 1㎖의 신선한 배지를 넣고 함께 배양하였다. 24시간 후, 원심분리기로 1000rpm에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액을 뽑아내고, -20℃에서 저장하거나, 또는 PGE₂ 코릴레이트-EIA 키트 (Amersham RPN222)를 사용하여 상청액 내의 PGE₂ 함량을 직접 정량하였다.

[결론]

상기 세포 모델의 분석 결과는 표 2에 요약된다.

[표 2]

	PAW	PA-F1	PA-F2	PA-F3	PA-F4
NO	-	IC₅₀ > 4.27㎍/㎖	-	-	-
PGE₂	ED₅₀ ≒ 50㎍/㎖	-	ED₅₀ ≒ 13.27㎍/㎖	ED₅₀ ≒ 0.0423㎍/㎖	ED₅₀ ≒ 185㎍/㎖
TNF-α	ED₅₀ > 50㎍/㎖	ED₅₀ ≒ 4.27㎍/㎖	-	ED₅₀ ≒ 42.3㎍/㎖	ED₅₀ > 1000㎍/㎖
IL-1β	ED5₀ ≒ 0.5-50㎍/㎖	-	ED₅₀ ≒ 0.1327㎍/㎖	ED₅₀ ≒ 4.23㎍/㎖	ED₅₀ ≒ 18.5㎍/㎖

PA 추출물은 LPS에 의해 유도된 래트의 대식세포 염증을 억제할 수 있다. PA-F1은 LPS로부터 유도된 붉은 빛을 띠며 부어 오른 염증성 세포에 의해 생산되는 TNF-α를 현저하게 억제할 수 있고, PA-F2는 1L-1β에 의해 발생되는 효과를 억제할 수 있는 반면, PA-F3은 COX의 생성물인 PGE₂를 억제할 수 있다.

도 1은 구현예 1의 PA 조 추출물의 HPLC 패턴이다.

도 2는 구현예 2의 동물 시험의 개요를 도시한다.

도 3은 CIA 래트의 체중에 대한 PA 조 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 4는 CIA 래트의 관절염 지수에 대한 PA 조 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 5는 CIA 래트의 관절 부기 정도에 대한 PA 조 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 6은 CIA 래트의 혈청 RF에 대한 PA 조 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 7은 CIA 래트의 혈청 CRP에 대한 PA 조 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 8은 CIA 래트의 복강 내에서 사이토카인 TNF-α 및 IL-1β에 대한 PA 조 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 9는 CIA 래트의 복강 내에서 사이토카인 IL-6에 대한 PA 조 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 10은 구현예 3의 PA 추출물 PA-F2의 HPLC 패턴이다.

도 11은 구현예 4의 동물 시험의 개요를 도시한다.

도 12는 CIA 래트의 체중에 대한 PA 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 13은 CIA 래트의 관절염 지수에 대한 PA 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 14는 CIA 래트의 관절 부기 정도에 대한 PA 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 15는 CIA 래트의 혈청 RF에 대한 PA 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 16은 CIA 래트의 복강 내에서 사이토카인 IL-6에 대한 PA 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

도 17은 CIA 래트의 복강 내에서 사이토카인 IL-1β에 대한 PA 추출물을 먹이로 하는 효과를 도시한다.

Claims

치료적 유효량의 플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 [Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng] (PA)의 추출물 또는 조 추출물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 류마티스성 관절염 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

캡슐, 정제, 분말, 연고, 물약 또는 스프레이의 형태인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 PA 조 추출물은 PA의 직접 즙 프레싱 (direct juice pressing)에 의해 얻어지는 조 추출물인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 PA 추출물은 PA를 극성 용매에 담근 다음 칼럼 분리하고, 농축하여 얻어지는 추출물인 약학적 조성물.

청구항 4에 있어서,

상기 PA를 극성 용매에 담금으로써 얻어지는 추출물은 하기 체류 시간 (Retention Time)의 HPLC 피크를 갖는 약학적 조성물:

피크 번호 체류 시간 (분) 1 18.7 2 19.8 3 20.7 4 23.9 5 24.2 6 28.3 7 33.2 8 33.7 9 37.5 10 41.7 11 43.4 12 45.8

여기서, 상기 HPLC는 하기 조건하에서 수행된다:

유속: 1.0 ㎖/분

제한 압력: 250 kgf/cm²

샘플 주입량: 10 ㎕

PDA 조건:

샘플링: 0.64초

파장 범위: 190-370 nm

UV 파장: 254㎚

용출 패턴:

시간(분) 이동상 0 10 55 60 물 90% 90% 20% 80% 아세토니트릴 10% 10% 80% 20%

청구항 4에 있어서,

상기 추출물은 다음의 단계에 의해 칼럼 분리되는 약학적 조성물:

- 고극성 (high-polarity) 용매로 세정하고, 용출 버퍼를 수집하는 단계;

- 건조된 물질 부피의 약 5 내지 10배의 부피를 갖는 아-고극성 (sub-high-polarity) 용매로 세정하고, 용출 버퍼를 수집하는 단계;

- 건조된 물질 부피의 약 5 내지 10배의 부피를 갖는 중극성 (medium-polarity) 용매로 세정하고, 용출 버퍼를 수집하는 단계; 및

- 건조된 물질 부피의 약 5 내지 10배의 부피를 갖는 저극성 (low-polarity) 용매로 세정하고, 용출 버퍼를 수집하는 단계.

청구항 6에 있어서,

상기 건조된 물질 부피의 약 5 내지 10배의 부피를 갖는 아-고극성 용매로 세정된 PA 추출물은 하기 체류 시간의 HPLC 피크를 갖는 약학적 조성물:

피크 번호 체류 시간 (분) 1 2.6 2 2.8 3 3.4 4 6.3 5 6.9 6 12.2 7 12.8 8 13.8 9 14.1 10 20.0 11 23.3

여기서, 상기 HPLC는 하기 조건하에서 수행된다:

유속: 1.0 ㎖/분

제한 압력: 250 kgf/cm²

샘플 주입량: 10 ㎕

PDA 조건:

샘플링: 0.64초

UV 파장: 254㎚

용출 패턴:

류마티스성 관절염 치료용 약제의 제조를 위한 플렉트란서스 앰보이니쿠스 (라우어.) 스프렝 (PA)의 추출물 또는 조 추출물의 사용 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 약제는 캡슐, 정제, 분말, 연고, 물약 또는 스프레이의 형태인 사용 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 PA 조 추출물은 PA의 직접 즙 프레싱에 의해 얻어지는 조 추출물인 사용 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 PA 추출물은 PA를 극성 용매에 담근 다음 칼럼 분리하고, 농축하여 얻어지는 추출물인 사용 방법.