KR100858733B1

KR100858733B1 - 관절 보호용 과루근 생약조성물

Info

Publication number: KR100858733B1
Application number: KR1020020022035A
Authority: KR
Inventors: 한창균; 곽의종; 정기원; 유헌승; 금도승; 조용백; 류근호; 이해인; 이정범; 김주현; 엄기안
Original assignee: 에스케이케미칼주식회사
Priority date: 2002-04-22
Filing date: 2002-04-22
Publication date: 2008-09-17
Also published as: KR20030083850A

Abstract

본 발명은 관절보호용 과루근 생약조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 과루근의 생약 추출물로부터 얻은 활성 분획을 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산의 함량으로 규격화 및 표준화시킨 조성물로서 관절연골 조직 분해 억제 활성 및 관절조직 분해 효소 발현 활성 억제 효과가 매우 우수하고 관절조직 보호 활성도 우수하여 관절조직 보호제로 유용한 과루근 생약조성물에 관한 것이다.

과루근, HPLC 크로마토그램, 관절보호, 매트리스메탈로프로테나제, 4-히드록시-벤조인산, 바닐린산, 글리코스아미노글리칸, 연골조직

Description

관절 보호용 과루근 생약조성물 {Cartilage protective ingredients from Trichosanthes kirilowii}

도 1은 실시예 1에 의해 제조된 과루근 생약조성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

도 2는 실시예 1∼2 및 비교예 1∼3에 의해 제조된 과루근 생약조성물의 관절조직 분해 효소 인 메트리스메탈로프로테아제-3(MMP-3) 활성 억제 정도를 나타낸 그림이다.

과루근은 한약재로서 널리 잘 알려져 있으며, 각종 종기나 상처, 기관지염, 유선염, 편도선염 및 치루 등의 일반적인 염증에 널리 사용되어 왔다. 그 뿐만 아니라 과루근은 습비를 제거하는 작용이 있어 손발이 차거나 저린데, 무릎이 아파 걷지 못하는데, 허리와 어깨 아픈데, 온몸이 힘이 없고 살갗통증 등의 증상 치료에 탕제 또는 생약분말제로 이용되어 왔다. 이들 증상은 현대 병리학적 개념으로 보면 만성류마티스 관절염을 포함한 일반적 관절염의 증상과 유사하다.

과루근은 '천화분' 또는 '백약'이라고도 하며 다년생의 덩굴성 초본인 하눌타리, 노랑하눌타리의 뿌리를 가을에 캐내 깨끗이 씻어 외피를 깍아내고 적당한 길이로 잘라 햇볕에 말린 것을 약재로 사용하여온 무독한 한방 생약이다. 한방에서는 소갈증을 멈추게 하고 각종 종기, 치루 유선염 등에 유효하며 배농, 소종, 해독, 해열작용에 널리 이용되어 왔다. 지금까지 알려진 과루근의 성분으로는 단백질류인 트리코산틴(trichosanthin)이 가장 널리 알려져 있고, 그외 아미노산 성분으로서 아르기닌(arginine), 시트룰린(citrulline) 등이 알려져 있으며 지방산으로서 팔미틴산(palmitic acid), 리놀레인산(linoleic acid) 등이 알려져 있다. 최근에는 브리오놀산(bryonolic acid), 4-히드록시-벤조인산(4-hydroxy-benzoic acid) 및 알파-스피나스테롤(α-spinasterol) 등의 스테놀류가 밝혀진 바 있다[한국유용식물자원 연구총람, 한국화학연구소, pp1354∼1357(1988); 도해향약 대사전, 영림사, pp960∼963(1990)].

동의보감, 향약집성방 및 광제비급 등의 기성 한약서나 관련 문헌에서는 대부분 이 생약에 대한 단방 생약으로서의 외형상의 형태 감별 방법 및 한방의학적 약효와 탕액의 제조방법에 관해서만 언급하였을 뿐, 이 방법을 통해 추출된 성분 중 약효를 발현하는 유효활성 성분들에 관한 지견은 얻을 수 없었다.

한편, 본 발명자들은 과루근 및 위령선, 하고초 원생약을 적절히 분쇄하여 추출 정제함으로써 소염 진통작용, 혈소판 응집억제작용, 전혈 응고 억제작용, 관절조직 분해효소의 억제작용, 면역세포증식 억제작용, 염증유발관련 효소 억제작용, 유해활성산소라디칼 소거작용 및 만성류마티스 관절염 치료에 유효한 활성분획을 효율적으로 추출 정제하는 방법과 그 추출물을 함유하는 생약 조성물에 대한 특허를 허여 받은 바도 있다[대한민국특허 제180,567호]. 상기와 같은 대한민국특허 제180,567호는 생약조성물을 알콜성 수용액으로 추출하는 단계, 상기 추출단계에서 얻어진 여액을 동량의 수포화 부틸알콜 등으로 층분리하여 알콜층을 감압농축하는 단계, 농축단계에서 얻어진 엑기스를 물로 공비농축하고 동결건조하여 분말엑기스를 제조하는 단계로 이루어진 것을 그 특징한다.

본 발명자들의 계속적인 연구결과에 따르면, 과루근의 생약은 산지 및 채취시기별로 지표성분의 함량 편차가 크게 나타나기 때문에 추출물의 규격화가 어렵고 소염진통, 혈액순환 개선, 관절염 치료 등의 활성이 우수한 활성 분획을 재현성 있게 얻을 수 없어서 상품화가 곤란하다는 사실을 알게되었다. 이에, 최대로 약효를 극대화할 수 있는 생약 추출물의 조성을 결정하는 방법에 대해 연구하였고, 그 결과 과루근의 생약 추출물이 포함된 생약 조성물 중의 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산의 함유량을 조절함으로써 관절염 치료 효과를 극대화함은 물론 관절조직 보호효과를 가지는 생약 조성물을 용이하게 그리고 재현성 있게 얻을 수 있어 상품화가 가능함을 알게 되었다.

따라서, 본 발명은 과루근의 생약 추출물로부터 얻은 활성 분획을 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산의 함량으로 규격화 및 표준화하여 재현성이 우수하게 관절염 치료효과 및 관절 보호효과를 얻는 과루근 생약 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 과루근 분획물이 유효성분으로 함유되어 있으며, 상기 과루근 분획물 중에는 4-히드록시-벤조인산이 0.02 중량% 이상 그리고 바닐린산이 0.02 중량% 이상 함유된 관절 보호용 과루근 생약조성물을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 생약조성물은 규격화 및 표준화하는 지표물질로서 종래 제안된 바 없는 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산의 함량을 일정 수준으로 한정하여 제조함으로써 관절연골 조직 분해 억제 활성 효과와 관절조직 보호 활성이 매우 우수하고, 특히 상기한 약효발현에 대한 재현성이 우수하므로 관절염 보호제로 매우 유용하다.

원생약에 함유된 유효 생리 활성물질의 함량은 산지, 채취시기, 보관기간 및 보관상태 등에 따라 크게 달라질 수 있으므로 각 생약조성물의 조성을 한정함에 있 어 사용성분의 중량비 한정은 커다란 의미를 갖지 못하는 경우가 많다.

따라서, 본 발명에서는 약효발현을 극대화하는 과루근 생약조성물을 얻기 위한 지표물질로서 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산을 선정한데 그 특징이 있다. 4-히드록시-벤조인산의 알려진 생리활성으로는 항산화 활성, 항균 활성 및 자궁적출 골다공증 질환 모델에서의 호르몬 유사 활성 등이 알려져 있으며[Free Radical Biol & Medicine, 27, 1427∼1436(1999); J. Ethonopharma., 53, 11∼14(1996); Environ. Res., 75, 130∼134(1997)], 바닐린산은 항산화 작용, 암예발 효과가 있다고 알려져 있다[J Agric. Food Chem., 47(12), 4894∼4898(1999); J. Agric. Food Chem. 49(6), 2788∼2798(2001); Cancer Epidemiol. Biomarkers. Prev., 9(11), 1163∼70(2000)]. 또한, 본 발명의 과루근 원생약에 함유되는 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산의 함량범위가 산지, 채취시기, 보관기간 및 보관상태에 따라 편차가 심할 뿐만 아니라 이 성분의 함량에 따라 관절보호 생리활성에 커다란 차이를 나타내므로, 이에 본 발명에서는 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산을 지표물질로 선정한 것이다. 따라서, 본 발명의 생약조성물은 과루근으로부터 추출하여 얻은 생약 엑기스를 제조하거나, 또는 원생약을 추출하여 활성분획을 분획하여 제조할 수 있으며, 이때의 배합비율은 원생약의 중량비율에 관계없이 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산의 생약조성물 중의 함유량으로 결정된다.

이로써 본 발명의 생약조성물은 지표물질인 4-히드록시-벤조인산이 전체 추출물에 대해 0.02 중량% 이상 바람직하기로는 0.02 ∼ 0.4 중량% 함유되어 있을 때 목적하는 약효를 얻을 수 있었다. 4-히드록시-벤조인산의 함량이 0.02 중량% 미만인 생약조성물은 관절연골 조직 분해 억제 활성 효과와 관절조직 보호 활성이 상대적으로 저조한 결과를 얻게 된다. 또한, 본 발명에서는 4-히드록시-벤조인산의 함량의 상한 범위에 대해 특별한 제한은 두지 않으나, 다만 일정수준 이상을 초과하여 4-히드록시-벤조인산이 함유하게 되면 더 이상 증가하지 않을 뿐만 아니라 제조하기에도 기술적, 경제적 측면에서 바람직하지 않으므로 0.4 중량% 이하 정도면 바람직한 효과를 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 생약조성물 중의 또 다른 지표물질인 바닐린산의 함량은 0.02 중량% 이상, 바람직하기로는 0.02 ∼ 0.4 중량% 함유되어 있을 때 목적하는 약효를 얻을 수 있다. 바닐린산의 함량이 0.02 중량% 미만인 생약조성물은 관절연골 조직 분해 억제 활성 효과와 관절조직 보호 활성이 상대적으로 저조한 결과를 얻게 된다. 또한, 본 발명에서는 바닐린산의 함량의 상한 범위에 대해서는 특별한 제한은 두지 않으나 다만 일정수준 이상을 초과하여 바닐린산이 함유하게 되면 더 이상 증가하지 않을 뿐만 아니라 제조하기에도 기술적, 경제적 측면에서 바람직하지 않으므로 0.4 중량% 이하 정도면 바람직한 효과를 얻을 수 있다.

본 발명이 지표물질로 선정한 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산은 본 발명에서 얻어진 생약조성물의 중요한 성분이며, 서로 일정 함량범위로 함유되어 있을 때 약효 상승효과를 발현하여 보다 강력한 약효를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에서 얻은 생약조성물의 유효성분으로서 상기 성분 이외에의 기타 다른 성분의 작용을 배제할 수는 없다.

본 발명에 따른 과루근 생약조성물의 제조방법은 다음과 같은 과정을 포함한 다:

1) 과루근 생약 중량의 10 ∼ 15배의 물 또는 알콜 수용액으로 환류 추출한 후 여과하고, 다시 잔사에 상기 혼합생약 중량의 7 ∼ 12배의 물 또는 알콜 수용액을 가하고 가온하여 여과한 다음 이전의 여액과 혼합하고 여과한 다음,

2) 상기 1)에서 얻어진 여액을 동량의 저급알콜 또는 비극성용매로 층분리한 후, 60 ∼ 70 ℃로 감압 농축한 다음,

3) 상기 2)에서 얻어진 엑기스 총량의 50 ∼ 100배의 물로 공비 농축하고 동량의 물로 균질 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말엑기스를 제조한다.

상기한 제조방법 중에 사용되는 저급알콜 용매로는 이소프로판올, 프로판올 또는 부탄올 등이 포함될 수 있으며, 비극성용매로는 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소 및 메틸에틸키톤 등이 포함될 수 있다. 바람직하기로는 부탄올을 사용하는 것이 활성이나 추출 효율면에서 볼 때 바람직하다.

상기한 바와 같은 본 발명에 따른 과루근 생약조성물의 제조과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명이 과루근을 주재로 한 생약조성물로부터 관절 보호 효과가 우수한 유효 활성성분을 지니도록 표준화 및 규격화한데 그 특징이 있는 것으로, 본 발명이 주재로 사용하는 과루근은 가을에 채취한 것이다. 채취한 과루근은 종래 일반 탕제로 사용해 온 열수 추출 방법뿐 아니라 물 또는 알콜 수용액으로 추출하는 단계와 이로써 얻어진 여액을 동량의 저급알코올 및 비극성용매로 층분리하는 단계로 추출한다.

이와 같이 과루근 원생약에 물 또는 알콜 수용액을 가하고 2 ∼ 5시간 환류 추출하는데, 이때 물 또는 알콜 수용액의 사용량은 상기 생약원료 중량의 10 ∼ 15배가 적당하다. 그 다음 여과하여 여액을 모으고, 다시 잔사에 생약원료 중량의 7 ∼ 12배의 물 또는 알콜 수용액을 가하여 가온 후 2 ∼ 5시간 재추출하고 여과하여 이전의 여액과 혼합함으로써 추출효율을 높인다. 여기서 물의 양이 너무 적으면 교반이 어렵게 되고 추출물의 용해도가 낮아져 추출효율이 떨어지게 되고, 지나치게 많은 경우는 다음 정제단계에서 사용되는 저급알콜 및 비극성용매의 사용량이 많아져 경제적이지 못하여 취급상 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택하였는데, 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 ∼ 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌고, 3차 이상의 다단계 추출은 경제성이 없는 것으로 판단된다.

상기와 같이 1, 2차에 걸쳐 물 또는 알콜 수용액로 추출하여 얻은 추출액은 여과 및 농축한 다음, 여액 중에 함유된 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제하는데, 본 발명에서는 여액과 동량의 저급알콜 또는 비극성용매로 2 ∼ 4회 층분리를 실시하여 용매 분획을 얻음으로써 불순물을 정제한다. 이때 저급알콜로는 부틸알콜, 프로필알콜 또는 이소프로필알콜을 사용하며, 비극성용매는 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소 및 메틸에틸케톤을 사 용한다. 저급알콜 또는 비극성용매의 사용량이 여액에 비하여 적을 경우에는 지방산 등의 불필요한 성분들에 의한 미립자가 형성되어 층분리가 원활하지 못할 뿐만 아니라 유효활성성분의 추출 함량이 낮아지게 되므로 효율적이지 못하다.

층분리 후 얻어진 저급알콜 또는 비극성용매 분획을 60 ∼ 70 ℃로 감압 농축하여 시료 중에 잔존하는 용매를 제거한다. 농축 후 얻어진 엑기스는 엑기스 총량의 25 ∼ 50 배의 물로 2 ∼ 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시킨다. 이와 같이 농축 건조시 물로 공비 농축하는 이유는 얻어진 생약 추출액을 의약품 원료로 사용하기 위해 잔존하는 저급알콜의 함량을 효과적으로 조절하고자 함이다.

이렇게 하여 얻은 추출물을 동결 건조시킴으로써 분말상태의 엑기스를 얻는데, 이 엑기스는 관절조직 분해 효소 억제작용 및 관절 보호 작용이 우수하여, 이 엑기스를 이용한 생약제는 관절 보호제로 유용하다.

따라서, 본 발명은 상기에서 제조된 분말엑기스를 유효 성분으로 함유한 생약조성물을 관절 보호제로 사용하는 방법도 포함한다.

본 발명에서 얻어진 분말 엑기스를 함유하여 통상의 제조방법으로 제형화하여 정제, 캅셀제, 주사제 등을 제조하는데, 이들 중 정제 제조시 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산마그네슘 등을 합한 것과 본 발명 엑기스를 2 : 1의 비율로 사용하면 관절염 치료에 활성을 갖는 정제를 제조할 수 있다.

이러한 의약물으로 제조시에는 생약추출물 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등 과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로도 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 생약추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 생약추출물은 체중 1 ㎏당 0.1 내지 10 ㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 유효성분을 포함하는 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 과루근 생약조성물의 제조

2.0 ∼ 4.0 ㎝ 정도로 세절된 과루근 250 g을 고루 섞은 후, 2 ℓ의 물을 가해 잘 교반하여 주면서 5 시간 열탕 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 2 ℓ의 물을 가해 3 시간 재열탕 추출한 후 여액을 모두 합하여 1 ℓ로 농축하였다. 여기에 동량의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 3회 층분리한 후 n-부틸알콜만을 모아 60 ∼ 70 ℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 0.1 ℓ의 물을 가해 공비 농축한 후 다시 2회 반복하고, 최종적으로 동량의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하 여 분말상태의 과루근 엑기스를 얻었다.

이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약조성물의 4-히드록시-벤조인산의 함량은 0.09 %(w/w), 바닐린산의 함량은 0.05 %(w/w)이었다.

또한, 상기 방법으로 얻어진 과루근 생약조성물은 다음과 같은 조건으로 HPLC 분석하였으며, HPLC 분석한 크로마토그램은 도 1에 나타내었다.

1) 전개용매 (Eluent) :

구 분	0분	60분	70분	80분
0.1 N 인산	10%	60%	50%	50%
아세토니트릴	90%	40%	50%	50%

2) 컬럼 : 제이스피어 (J'sphere, YMC) ODS-H80 (250×4.6 mm I.D., 4 ㎛)

3) 유속 : 1.0 ㎖/min

4) 검출기 : UV 254 nm

실시예 2 : 과루근 생약조성물의 제조

2.0 ∼ 4.0 ㎝ 정도로 세절된 과루근 250 g을 고루 섞은 후, 2 ℓ의 30% 에탄올을 가해 잘 교반하여 주면서 5 시간 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 2 ℓ의 30% 에탄올을 가해 3 시간 재환류 추출한 후 여액을 모두 합하여 1 ℓ로 농축하였다. 여기에 동량의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 3회 층분리한 후 n-부틸알콜만을 모아 60 ∼ 70 ℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 0.1 ℓ의 물을 가해 공비 농축한 후 다시 2회 반복하고, 최종적으로 동량의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 과루근 엑기스를 얻었다.

이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약조성물의 4-히드록시-벤조인산의 함량은 0.07 %(w/w), 바닐린산의 함량은 0.12 %(w/w)이었다.

비교예 1 : 과루근 생약조성물의 제조

2.0 ∼ 4.0 ㎝ 정도로 세절된 과루근 250 g을 고루 섞은 후, 2 ℓ의 물을 가해 잘 교반하여 주면서 5 시간 열탕 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 2 ℓ의 물을 가해 3 시간 재열탕 추출한 후 여액을 모두 합하여 1 ℓ로 농축하였다. 최종적으로 동량의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 과루근 엑기스를 얻었다.

이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약추출물의 4-히드록시-벤조인산의 함량은 0.01 %(w/w), 바닐린산의 함량은 0.01 %(w/w)이었다.

비교예 2 : 과루근 생약조성물의 제조

2.0 ∼ 4.0 ㎝ 정도로 세절된 과루근 250 g을 고루 섞은 후, 2 ℓ의 30% 에탄올을 가해 잘 교반하여 주면서 5 시간 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 2 ℓ의 30% 에탄올을 가해 3 시간 재환류 추출한 후 여액을 모두 합하여 1 ℓ로 농축하였다. 최종적으로 동량의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 과루근 엑기스를 얻었다.

이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약추출물의 4-히드록시-벤조인산의 함 량은 0.05 %(w/w), 바닐린산의 함량은 0.01 %(w/w)이었다.

비교예 3 : 과루근 생약조성물의 제조

2.0 ∼ 4.0 ㎝ 정도로 세절된 과루근 250 g을 고루 섞은 후, 2 ℓ의 50% 에탄올을 가해 잘 교반하여 주면서 5 시간 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 2 ℓ의 50% 에탄올을 가해 3 시간 재환류 추출한 후 여액을 모두 합하여 1 ℓ로 농축하였다. 최종적으로 동량의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 과루근 엑기스를 얻었다.

이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약추출물의 4-히드록시-벤조인산의 함량은 0.01 %(w/w), 바닐린산의 함량은 0.04 %(w/w)이었다.

실험예 1 : 관절조직 분해 효소 매트리스메탈로프로테나제-3(MMP-3)의 활성 억제 효과 테스트

상기 실시예 1 ∼ 2 및 비교예 1 ∼ 3에 의해 제조된 과루근 생약조성물 각각에 대한 관절조직 분해효소 활성을 억제하는 정도를 비교하기 위하여, 토끼 관절조직을 배양하여 연골 분해를 촉진시키는 조건에서 관절조직 분해 효소인 매트리스메탈로프로테나제-3(MMP-3) 효소 활성 억제 실험을 실시하였고, 그 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다.

[실험방법]

5주령의 토끼 관절로부터 연골조직을 분리하여 37 ℃로 맞추어진 배양용기에 50 ∼ 60 mg 씩 잘라 배양한 후, 과루근 생약조성물을 첨가하고 인터루킨 원 알파(Interleukin 1α, IL-1α)를 연골조직 당 5 ng/㎖ 농도로 첨가하여 60 시간 배양 후, 배양 상등액을 수집하였다. 배양 상등액을 끓는 물로 열변성시킨 다음 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 적용하고 이를 PVDF막에 이전 시켰으며, 이 막을 1 ㎍/㎖ 농도의 단클론 항체인 매트릭스메탈로프로테나제-3(MMP-3) 항체와 함께 배양시켜 반응하도록 하였다. 반응이 끝나면, 막을 씻어낸 다음 다시 쥐의 이뮤노글로빈 G(IgG)에 대한 퍼옥시다제가 접합된 토끼의 항체와 함께 배양시킨 후 막의 표면을 X선 필름(X-ray film)과 접촉시켜 반응 정도를 측정하였다.

도 2에서 보는 바와 같이 본 발명과 같이 제조된 추출물은 관절조직 분해효소 매트릭스메탈로프로테나제-3(MMP-3) 활성을 억제하는 정도가 큰 것을 알 수 있다.

실험예 2 : 프로테오글리칸 분해 억제 효과 테스트

상기 실시예 1 ∼ 2 및 비교예 1 ∼ 3에 의해 제조된 과루근 생약조성물의 관절조직 보호 활성을 비교하기 위하여, 토끼 관절조직을 배양하며 연골분해를 촉진시키는 조건에서의 연골조직의 주요 성분중 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 분해 억제 활성실험을 실시하였고, 그 결과는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

[실험방법]

5주령의 토끼 관절로부터 연골조직을 분리하여 37℃로 맞추어진 배양용기에 50 ∼ 60 mg 씩 잘라 배양한 후 상시 실시예 1 ∼ 2 및 비교예 1 ∼ 3에 의해 제조 된 엑기스를 첨가하고 인터루킨 원 알파(Interleukin 1α,IL-1α)를 연골조직 당 5 ng/㎖ 농도로 첨가하여 60시간 배양 후, 연골조직의 구성 성분중 프로테오글리칸의 분해를 유발시켜 배양액 내의 프로테오글리칸 분해 산물인 글루코스아미노글리칸(Glucosaminoglycan, GAG)을 1,9-디메틸메틸렌블루 발색제(1,9-Dimethylmethylene blue dye)에 발색된 정도를 525 nm에서의 흡광도로 정량하였다.

구 분	시험농도(㎎/㎖)	글리코스아미노글리칸 생성 억제율 (%)
실시예 1	1.0	105
	0.3	79
	0.1	69
	0.03	50
실시예 2	1.0	120
	0.3	92
	0.1	80
	0.03	62
비교예 1	1.0	84
	0.3	62
	0.1	54
	0.03	35
비교예 2	1.0	88
	0.3	67
	0.1	56
	0.03	40
비교예 3	1.0	91
	0.3	73
	0.1	62
	0.03	47

상기 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명과 같이 제조된 추출물은 관절조직의 프로테오글리칸 분해를 억제하는 정도가 큰 것을 알 수 있다.

실험예 3 : 관절염 치료 효과 테스트

상기 실시예 1 ∼ 2 및 비교예 1 ∼ 3에 의해 제조된 엑기스의 관절조직 보호 활성을 비교하기 위하여, 콜라게나제(Collagenase)를 토끼 관절강에 주사하여 관절조직을 손상시킴으로써 사람의 관절염과 유사한 조직병리학적 소견을 나타내는 토끼 모델 실험을 실시하였고, 그 결과는 다음 표 2에 나타낸 바와 같다.

[실험방법]

2.0 ∼ 2.5 Kg의 토끼 관절강에 1 Kg 당 1 mg의 콜라게나제를 실험 1일째와 4일째에 주사하여 관절염과 유사하게 관절조직의 손상을 유발시겼고, 상기 실시예 1 ∼ 2 및 비교예 1 ∼ 3에 의해 제조된 엑기스를 토끼 1 Kg 당 200 mg 씩 4주일간 경구 투여하였다(각 군당 5마리). 관절염 유발 4주 후 토끼를 해부하여 관절 조직을 분리 한 후 탈회 과정을 거쳐 사프라닌-O(Sapranin-O) 등으로 염색시킨 후 현미경으로 관절 조직을 연골 조직 및 활액조직으로 대별하여 부위별로 관찰함으로써 조직병리학적 병변을 점수화하였다(병변 없음: 0, 미세한 병변: 1, 확실한 병변 소견: 2, 심한 병변: 3, 매우 심한 병변: 4).

구 분	연골 조직¹⁾	활액 조직²⁾	합 계³⁾
대조군 (무처치군)	11.9	10.7	22.6
실시예 1	5.2	6.3	11.5
실시예 2	4.9	6.1	11.0
비교예 1	6.8	7.4	14.2
비교예 2	6.4	7.3	13.7
비교예 3	6.2	7.1	13.3
1) 연골 조직(완전 관절염 24점) : 표층의 상실, 연골 부식, 섬유화 세포의 파괴 및 손상 등 2) 활액 조직(완전 관절염 24점) : 내층의 과다형성, 비대, 세포 침윤, 과립조직의 증식 등 3) 합계 (완전 관절염 48점)

상기 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명과 같이 제조된 추출물은 콜라게나제 에 의해 유발된 관절염 모델에서 관절조직을 보호하여 조직병리학적으로 병변 심화를 완화시켜주는 정도가 우수함을 알 수 있다.

제조예 1 : 정제의 제조

본 발명의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.

[조성]

생약추출물 200 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 옥수수 전분 113 mg, 무수에탄올 적량.

제조예 2 : 연고제의 제조

본 발명의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

생약추출물 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알콜 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량

제조예 3 : 주사제의 제조

본 발명의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

생약추출물 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트륨 25 mg, 주사용 물 2974 mg

제조예 4 : 경피제의 제조

본 발명의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 방법으로 경피제를 제조하였다.

[조성 1]

생약추출물 0.4 g, 폴리아크릴산 나트륨 1.3 g, 글리세린 3.6 g, 수산화 알루미늄 0.04 g, 메틸 파라벤 0.2 g, 물 14 g.

[조성 2]

생약추출물 0.8 g, 프로필렌 글리콜 1.6 g, 유동 파라핀 0.8 g, 이소프로필 미리스테이트 0.4 g, 젤바 1430 16.4 g.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 과루근 생약조성물은 과루근으로 추출 조제된 것으로 히드록시-벤조인산과 바닐린산을 지표물질로서 선정하여 이들 지표물질의 함량 조절으로 관절조직 분해효소 억제활성 및 관절보호 활성을 극 대화하는 효과를 얻고 있다.

Claims

삭제
과루근을 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜 수용액으로 추출 및 탄소수 1 내지 4의 수포화된 알콜으로 층분리하여 얻은 과루근 분획물이 유효성분으로 함유되어 있으며, 상기 과루근 분획물 중에는 전체 분획물 중량에 대하여 4-히드록시-벤조인산이 0.02 ∼ 0.3 중량% 그리고 바닐린산이 0.02 ∼ 0.3 중량%가 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 관절보호용 약학조성물.
과루근을 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜 수용액으로 추출하는 단계;

상기 추출단계에서 얻어진 여액을 동량의 탄소수 1 내지 4의 수포화된 알콜으로 층분리하여 감압 농축하는 단계; 및

상기 농축단계에서 얻어진 엑기스를 물로 공비농축하고 동결건조하여 4-히드록시-벤조인산이 0.02 ∼ 0.3 중량% 그리고 바닐린산이 0.02 ∼ 0.3 중량% 함유된 분말엑기스를 제조하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 생약추출물의 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 추출단계는 과루근 중량의 10 ∼ 15배의 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜 수용액으로 환류 추출하고 여과한 다음, 얻어진 잔사는 혼합생약 중량의 7 ∼ 12배의 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜 수용액을 가하여 가온여과하고, 여기에 상기 환류 추출여액을 가하여 다시 여과하는 방법으로 시행됨을 특징으로 하는 생약추출물의 제조방법.
과루근을 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜 수용액으로 추출 및 탄소수 1 내지 4의 수포화된 알콜으로 층분리하여 얻은 과루근 분획물이 관절보호 및 관절염 치료의 유효성분으로 함유되어 있으며, 상기 과루근 분획물 중에는 전체 분획물 중량에 대하여 4-히드록시-벤조인산이 0.02 ∼ 0.3 중량% 그리고 바닐린산이 0.02 ∼ 0.3 중량%가 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 관절 보호제.
제 5 항에 있어서, 경구용 정제, 경구용 캅셀제, 연고제, 주사제 또는 경피투여제로 제형화된 것임을 특징으로 하는 관절 보호제.