KR101609535B1

KR101609535B1 - 쿠커비타신 ｂ의 함량이 감소된 관절염 치료 및 관절 보호용 생약조성물

Info

Publication number: KR101609535B1
Application number: KR1020100068084A
Authority: KR
Inventors: 정기원; 이해인; 류근호; 엄기안; 유헌승; 민동선; 이봉용; 표성수; 정지훈; 이중수; 박민석; 성진흥; 유근만
Original assignee: 에스케이케미칼주식회사
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2016-04-14
Also published as: KR20110006642A

Abstract

본 발명은 과루근이 포함된 생약 추출물이 유효성분으로 함유되어 있으며, 상기 추출물 중에는 부작용을 일으키는 쿠커비타신 B의 함량이 0.05 중량% 이하로 조절되어 안전한 관절염 치료 및 관절보호용 생약조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추출물은 종래의 과루근이 포함된 추출물이 가지고 있던 우수한 진통 활성, 염증 억제 활성 및 관절 조직 분해 효소 억제 활성을 그대로 가지면서도, 부작용을 일으키는 쿠커비타신 B의 함량을 최소화하여 다양한 환자에 대하여 널리 상용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

쿠커비타신 Ｂ의 함량이 감소된 관절염 치료 및 관절 보호용 생약조성물 {Anti-arthritis and cartilage protective herbal preparations containing reduced cucurbitacin B}

본 발명은 과루근이 포함된 생약 추출물이 유효성분으로 함유되어 있으며, 상기 추출물 중에는 부작용을 일으키는 쿠커비타신 B의 함량이 0.05 중량% 이하로 조절되어 안전한 관절염 치료 및 관절보호용 생약조성물에 관한 것이다.

과루근은 한약재로서 널리 잘 알려져 있으며, 각종 종기나 상처, 기관지염, 유선염, 편도선염 및 치루 등의 일반적인 염증에 널리 사용되어 왔다. 그 뿐만 아니라 과루근은 습비를 제거하는 작용이 있어 손발이 차거나 저린데, 무릎이 아파 걷지 못하는데, 허리와 어깨 아픈데, 온몸이 힘이 없고 살갗통증 등의 증상 치료에 탕제 또는 생약분말제로 이용되어 왔다. 이들 증상은 현대 병리학적 개념으로 보면 만성류마티스 관절염을 포함한 일반적 관절염의 증상과 유사하다.

과루근은 '천화분' 또는 '백약'이라고도 하며 다년생의 덩굴성 초본인 하눌타리, 노랑하눌타리의 뿌리를 가을에 캐내 깨끗이 씻어 외피를 깎아내고 적당한 길이로 잘라 햇볕에 말린 것을 약재로 사용하여온 무독한 한방 생약이다. 한방에서는 소갈증을 멈추게 하고 각종 종기, 치루 유선염 등에 유효하며 배농, 소종, 해독, 해열작용에 널리 이용되어 왔다. 지금까지 알려진 과루근의 성분으로는 단백질류인 트리코산틴(trichosanthin)이 가장 널리 알려져 있고, 그외 아미노산 성분으로서 아르기닌(arginine), 시트룰린(citrulline) 등이 알려져 있으며 지방산으로서 팔미틴산(palmitic acid), 리놀레인산(linoleic acid) 등이 알려져 있다. 최근에는 브리오놀산(bryonolic acid), 4-히드록시-벤조인산(4-hydroxy-benzoic acid) 및 알파-스피나스테롤(α-spinasterol) 등의 스테놀류가 밝혀진 바 있다[한국유용식물자원 연구총람, 한국화학연구소, pp1354∼1357(1988); 도해향약 대사전, 영림사, pp960∼963(1990)].

한편 쿠커비타신(Cucurbitacin) B는 일반적으로 오이, 참외와 같은 박과식물(Cucurbitaceae)에 존재하는 물질로, 쓴맛을 나타내며 주위에서 흔히 섭취할 수 있다. 그러나, 쿠커비타신 B를 고용량 복용했을 경우 구토나 설사, 위장관 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 쿠커비타신 B가 필요이상 함유된 추출물의 경우 복용에 주의를 하여야 한다. 과루근도 박과식물에 해당하여 쿠커비타신 B를 함유하고 있으므로, 이에 따라 인체에 부작용을 일으키지 않는 범위에서 쿠커비타신 B의 함량을 조절할 필요성이 있다.

특히 상기 쿠커비타신 B와 같은 부작용을 유발하는 물질의 함량을 감소시키면서도 약효를 유지하는 기술은 많은 시간과 노력이 요구되는 것으로, 당업계에서 오랫동안 해결하고자 하는 과제이다.

한편, 본 발명자들은 과루근의 생약 추출물로부터 얻은 활성 분획을 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산의 함량으로 규격화 및 표준화시킨 관절 조직 보호제용 과루근 생약조성물에 대한 특허를 받은 바 있다[한국등록특허 제858,733호].

그러나 상기 쿠커비타신 B의 함량을 최소화하는 방법이나, 부작용을 일으키지 않는 최소한의 함량 등에 대한 연구는 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은, 종래 과루근이 포함된 추출물에서 쿠커비타신 B의 함량을 최소화하기 위하여 연구, 노력한 결과 과루근이 포함된 추출 분말의 현탁액을 일정 조건하에서 열처리하면 쿠커비타신 B의 함량을 크게 감소시킬 수 있고, 이에 따라 나타나는 부작용도 최소화 할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 과루근이 포함된 생약 추출물을 함유하는 생약 조성물에 있어서, 전체 추출물에 대하여 쿠커비타신 B가 0.05 중량% 이하로 함유되어 있는 관절염 치료용 또는 관절보호용 생약 조성물을 그 특징으로 한다.

또한 본 발명은, 과루근, 위령선 및 하고초의 생약 추출물을 함유하는 생약 조성물에 있어서, 전체 추출물에 대하여 쿠커비타신 B가 0.05 중량% 이하로 함유되어 있는 관절염 치료용 또는 관절보호용 생약 조성물을 그 특징으로 한다.

따라서 본 발명은 과루근에서 추출된 생약 조성물이 유효성분으로 함유되어 있으며, 쿠커비타신 B의 함량이 0.05 중량% 이하로 조절된 관절염 치료 및 관절 보호용 생약조성물, 및 상기 생약조성물의 관절염 치료 효과에 영향을 미치지 않으면서 부작용을 줄이는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 추출물은 종래의 과루근이 포함된 추출물이 가지고 있던 우수한 진통 활성, 염증 억제 활성 및 관절 조직 분해 효소 억제 활성을 그대로 가지면서도, 부작용을 일으키는 쿠커비타신 B의 함량을 최소화하여 다양한 환자에 대하여 널리 상용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 실시예 4에 의하여 제조된 분획물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

본 발명은 과루근이 포함된 생약 추출물이 유효성분으로 함유되어 있으며, 상기 추출물 중에는 부작용을 일으키는 쿠커비타신 B의 함량이 0.05 중량% 이하로 조절된 관절염 치료 및 관절 보호용 과루근 생약조성물을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

과루근은 4-히드록시-벤조인산과 바닐린산을 함유하여 관절연골 조직 분해 억제 활성 효과와 관절조직 보호 활성이 매우 우수하고, 특히 상기한 약효발현에 대한 재현성이 우수하므로 관절염 보호제로 매우 유용하다. 그러나 과루근에 존재하는 쿠커비타신 B는 과량 복용하는 경우 구토나 설사, 위장관의 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서 본 발명은 쿠커비타신 B의 함량을 0.05 중량% 이하로, 일반적으로는 0.001 ~ 0.05 중량% 범위 내로 조절하여 부작용을 최소화하면서도 과루근이 포함된 추출물 고유의 관절 보호 활성을 유지하도록 하였다.

본 발명에 따른 과루근이 포함된 생약 조성물의 제조방법은 다음과 같은 과정을 포함한다.

1) 과루근이 포함된 생약 중량의 7 ∼ 15배의 물 또는 알콜 수용액으로 환류 추출한 후 여과하고, 다시 잔사에 상기 생약 중량의 7 ∼ 12배의 물 또는 알콜 수용액을 가하고 가온하여 여과한 다음 이전의 여액과 혼합하고 여과한 다음,

2) 상기 1)에서 얻어진 여액을 여액 중량의 1 ~ 5배의 저급알콜 또는 비극성용매로 층분리한 후, 60 ∼ 70 ℃로 감압 농축한 다음,

3) 상기 2)에서 얻어진 엑기스 총량의 5 ∼ 20배의 물로 공비 농축하고 동량의 물로 균질 현탁시킨 다음,

4) 상기 3)에서 얻어진 현탁액을 60 ~ 90℃에서 쿠커비타신 B 함량이 0.05 중량% 이하가 될 때까지 열처리하고, 동결건조하여 분말엑기스를 제조한다.

상기한 제조방법 중에 사용되는 저급알콜 용매로는 이소프로판올, 프로판올 또는 부탄올 등이 포함될 수 있으며, 비극성용매로는 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소 및 메틸에틸케톤 등이 포함될 수 있으며, 부탄올을 사용하는 것이 활성이나 추출 효율면에서 볼 때 바람직하다.

상기한 바와 같은 본 발명에 따른 과루근이 포함된 생약조성물의 제조과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명이 과루근을 주재로 한 생약조성물로부터 관절 보호 효과가 우수한 유효 활성성분을 지니도록 표준화 및 규격화한데 그 특징이 있는 것으로, 본 발명이 주재로 사용하는 과루근은 가을에 채취한 것이다. 또한 상기 생약 조성물은 과루근 이외에 위령선 및 하고초를 포함할 수 있다. 상기 생약 조성물을 종래 일반 탕제로 사용해 온 열수 추출 방법뿐 아니라 물 또는 알콜 수용액으로 추출하는 단계와 이로써 얻어진 여액을 저급알코올 및 비극성용매로 층분리하는 단계로 추출한다.

이와 같이 과루근이 포함된 생약에 물 또는 알콜 수용액을 가하고 2 ∼ 5시간 환류 추출하는데, 이때 물 또는 알콜 수용액의 사용량은 상기 생약원료 중량의 7 ∼ 15배가 적당하다. 그 다음 여과하여 여액을 모으고, 다시 잔사에 생약원료 중량의 7 ∼ 12배의 물 또는 알콜 수용액을 가하여 가온 후 2 ∼ 5시간 재추출하고 여과하여 이전의 여액과 혼합함으로써 추출효율을 높인다. 여기서 물의 양이 너무 적으면 교반이 어렵게 되고 추출물의 용해도가 낮아져 추출효율이 떨어지게 되고, 지나치게 많은 경우는 다음 정제단계에서 사용되는 저급알콜 및 비극성용매의 사용량이 많아져 경제적이지 못하여 취급상 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택하였는데, 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 ∼ 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌고, 3차 이상의 다단계 추출은 경제성이 낮아지는 것으로 판단된다.

상기와 같이 1, 2차에 걸쳐 물 또는 알콜 수용액로 추출하여 얻은 추출액은 여과 및 농축한 다음, 여액 중에 함유된 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제하는데, 본 발명에서는 여액과 여액 중량의 1 ~ 5배의 저급알콜 또는 비극성용매로 2 ∼ 4회 층분리를 실시하여 용매 분획을 얻음으로써 불순물을 정제한다. 이때 저급알콜로는 부틸알콜, 프로필알콜 또는 이소프로필알콜을 사용하며, 비극성용매는 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소 및 메틸에틸케톤을 사용한다. 저급알콜 또는 비극성용매의 사용량이 여액에 비하여 적을 경우에는 지방산 등의 불필요한 성분들에 의한 미립자가 형성되어 층분리가 원활하지 못할 뿐만 아니라 유효활성성분의 추출 함량이 낮아지게 되므로 효율적이지 못하다.

층분리 후 얻어진 저급알콜 또는 비극성용매 분획을 60 ∼ 70 ℃로 감압 농축하여 시료 중에 잔존하는 용매를 제거한다. 농축 후 얻어진 엑기스는 엑기스 총량의 5 ∼ 20 배의 물로 2 ∼ 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시켜 현탁액을 얻는다. 이와 같이 농축 건조시 물로 공비 농축하는 이유는 얻어진 생약 추출액을 의약품 원료로 사용하기 위해 잔존하는 저급알콜의 함량을 효과적으로 조절하고자 함이다.

이후, 상기 현탁액을 60 ~ 90℃에서 열처리하여 쿠커비타신 B의 함량을 0.05 중량% 이하로 감소시킨다. 60℃ 미만의 온도로 열처리하면 쿠커비타신 B 함량을 낮추는 시간이 현저히 증가하며, 90℃를 초과하여 열처리하면 추출물이 변성되는 문제가 있다. 쿠커비타신 B의 함량이 줄어드는 이유는 천연물추출물의 경우 수용액 상태에서 산성(pH 3 ~ 6)을 나타내는데, 이 때 열을 가하면 쿠커비타신 B의 가수분해가 활발하게 일어나기 때문으로 보여진다.

상기 열처리된 현탁액을 동결 건조시킴으로써 분말상태의 엑기스를 얻는데, 이 엑기스는 관절조직 분해 효소 억제작용 및 관절 보호 작용이 우수하면서도, 쿠커비타신 B의 함량이 0.05 중량% 이하로, 일반적으로는 0.001 ~ 0.05 중량% 범위로 존재하게 되어 부작용을 최소화할 수 있게 되므로, 이 엑기스를 이용한 생약제는 관절염 치료제 및 관절 보호제로 유용하다.

따라서, 본 발명은 상기에서 제조된 분말엑기스를 유효 성분으로 함유한 생약조성물을 관절염 치료제 및 관절 보호제로 사용하는 방법도 포함한다.

본 발명에서 얻어진 분말 엑기스를 함유하여 통상의 제조방법으로 제형화하여 정제, 캅셀제, 주사제 등을 제조하는데, 이들 중 정제 제조시 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산마그네슘 등을 합한 것과 본 발명 엑기스를 2 : 1의 비율로 사용하면 관절염 치료 및 관절 보호에 활성을 갖는 정제를 제조할 수 있다.

이러한 의약물으로 제조시에는 생약추출물 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약학적으로허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로도 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 생약추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 생약추출물은 체중 1 ㎏당 0.1 내지 10 ㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 유효성분을 포함하는 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

이하 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 과루근 1,000 g을 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 72시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다.

이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.01%(w/w) 임을 확인하였다.

1) 전개용매(Eluent)

구분	0분	35분	40분
초산니트릴-물(20 : 80)	100%	0%	0%
초산니트릴-물(45 : 55)	0%	100%	100%

2) 컬럼 : 제이스피어(J'sphere, YMC) ODS-H80 (250 × 4.6 mm I.D., 4㎛)

3) 유속 : 2.0 ㎖/min

4) 검출기 : UV 230nm

실시예 2 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 과루근 1,000 g을 7ℓ의 30중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 60시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.03%(w/w) 임을 확인하였다.

실시예 3 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 과루근 1,000 g을 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 48시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.05%(w/w) 임을 확인하였다.

실시예 4 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 위령선 250 g, 과루근 500 g, 하고초 250 g을 잘 혼합하여 7ℓ의 30중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 60시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.01%(w/w) 임을 확인하였고, HPLC 분석한 크로마토그램은 도 1에 나타내었다.

실시예 5 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 위령선 250 g, 과루근 500 g, 하고초 250 g을 잘 혼합하여 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6 시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 48시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.03%(w/w) 임을 확인하였다.

실시예 6 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 위령선 250 g, 과루근 500 g, 하고초 250 g을 잘 혼합하여 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6 시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 36시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.05%(w/w) 임을 확인하였다.

비교예 1 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 과루근 1,000 g을 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 36시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.07%(w/w) 임을 확인하였다.

비교예 2 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 과루근 1,000 g을 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 50℃에서 24시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.09%(w/w) 임을 확인하였다.

비교예 3 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 과루근 500 g을 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시키고, 상기 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.13%(w/w) 임을 확인하였다.

비교예 4 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 위령선 250 g, 과루근 500 g, 하고초 250 g을 잘 혼합하여 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6 시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 24시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.07%(w/w) 임을 확인하였다.

비교예 5 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 위령선 250 g, 과루근 500 g, 하고초 250 g을 잘 혼합하여 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6 시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 이 현탁액을 80℃에서 12시간 열처리 공정을 실시하였고, 열처리 완료된 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.09%(w/w) 임을 확인하였다.

비교예 6 : 생약 추출물의 제조

협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 위령선 250 g, 과루근 500 g, 하고초 250 g을 잘 혼합하여 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6 시간동안 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 7ℓ의 30 중량% 에탄올수용액을 가해 3시간 동안 재가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 1ℓ로 농축하였다. 여기에 농축된 여액 중량의 2배의 수포화 n-부틸알콜을 가하여 2회 층분리 한 후 n-부틸알콜층만을 모아 60 ∼ 70℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 대부분의 n-부틸알콜과 물이 증발된 상태에서 1ℓ의 증류수를 가해 공비농축을 실시하였으며, 이를 2회 더 반복하였다. 공비농축이 완료된 농축물에 1ℓ 증류수를 가하여 현탁시켰으며, 상기 현탁액을 동결건조하여 분말상태의 생약 추출물을 얻었다. 이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 생약 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 쿠커비타신 B 함량이 0.10%(w/w) 임을 확인하였다.

실험예 1 : 진통효과 테스트

상기 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6에 의해 제조된 엑기스의 진통작용에 대한 활성을 비교하기 위하여, 아세트산 유도 롸이딩 모델 테스트를 다음의 실험방법으로 실시하였으며 그 결과는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

[실험방법]

ICR (Institute of Cancer Research)계 쥐에 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6의 방법으로 제조된 엑기스를 쥐 1 kg당 200 mg 또는 400 mg 씩 경구투여하고 1 시간후 0.6 % (v/v) 아세트산을 쥐 몸무게 10 g당 0.1 ㎖의 용량으로 복강주사하고, 주사 후 10분 후부터 10 분간 각각의 쥐가 나타내는 통증 반응인 롸이딩(writhing : 등을 쭉펴거나 뒷다리를 몸 뒤로 완전히 뻗어 제치는 현상)을 보이는 횟수를 관찰하였다.

	엑기스 투여량 (mg/kg)	평균 롸이딩 횟수	억제율 (%)
대조군	-	19	-
실시예 1	200	12.0	36.8
실시예 1	400	9.0	52.6
실시예 2	200	11.0	42.1
실시예 2	400	8.0	57.9
실시예 3	200	10.6	44.2
실시예 3	400	7.9	58.4
실시예 4	200	9.1	52.1
실시예 4	400	6.9	63.7
실시예 5	200	9.5	50.0
실시예 5	400	7.1	62.6
실시예 6	200	9.6	49.4
실시예 6	400	7.0	63.2
비교예 1	200	10.1	46.8
비교예 1	400	7.0	63.2
비교예 2	200	10.0	47.4
비교예 2	400	7.1	62.6
비교예 3	200	9.8	48.4
비교예 3	400	7.0	63.2
비교예 4	200	9.3	51.1
비교예 4	400	6.8	64.2
비교예 5	200	9.8	48.4
비교예 5	400	7.4	61.1
비교예 6	200	10.0	47.4
비교예 6	400	7.0	63.2

상기 표 2에서 보는 바와 같이 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6의 추출물은 모두 진통 활성이 크며, 서로 간에 유의한 활성 차이는 없는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2 : 급성 염증에 대한 억제 효과 테스트

상기 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6에 의해 제조된 엑기스의 크로톤 오일(Croton oil) 유도 급성 염증에 대한 억제작용을 비교하였으며, 크로톤 오일에 의해 유도되는 귀 부종의 억제정도를 대조군과 비교하여 백분율로 표시하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[실험방법]

ICR (Institute of Cancer Research)계 쥐에 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6에서 얻어진 생약 추출물을 경구 투여하고, 1시간 후 2.5% 크로톤 오일(croton oil) 0.025 ㎖를 우측 귀에 골고루 바르고, 3시간 경과 후 좌측과 우측 귀 부종을 측정하였다.

	엑기스 투여량 (mg/kg)	평균 염증율 (%)	억제율 (%)
대조군	-	85.00	-
실시예 1	200	70.52	17.0
실시예 2	200	72.93	14.2
실시예 3	200	70.89	16.6
실시예 4	200	68.72	19.2
실시예 5	200	67.33	20.8
실시예 6	200	66.95	21.2
비교예 1	200	69.53	18.2
비교예 2	200	69.51	18.2
비교예 3	200	69.17	18.6
비교예 4	200	66.94	21.2
비교예 5	200	67.17	21.0
비교예 6	200	67.85	20.2

상기 표 3의 결과로부터 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6의 추출물은 부종율이 감소한 것으로 보아 염증 억제 활성이 우수함을 알 수 있었으나, 서로 간에 유의한 활성 차이는 없는 것을 확인하였다.

실험예 3 : 관절조직 분해 효소 활성 억제 효과 테스트

상기 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6에 의해 제조된 추출물의 관절조직 분해효소인 히알룰로니다제(Hyalulonidase) 억제작용에 대한 비교 실험을 하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

[실험방법]

히알룰로니다제를 아세테이트 완충액상에서 37℃로 20분간 배양하여 활성화시킨 후에 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6에서 얻은 추출물과 기질로서 포타슘 히알룰로네이트(potassium hyaluronate)를 가하여 약 40분간 계속 배양한다. NaOH로 반응을 종결시키고 포타슘 보레이트(potassium borate)를 가한 후, 100℃로 가열하고 DMBA(Dimethylbenzanthracene)로 발색시켜 흡광도를 측정하였으며 대조군과 비교하여 억제율을 계산하였다.

	시험농도 (mg/㎖)	억제율 (%)
실시예 1	1.0	82.3
실시예 2	1.0	83.7
실시예 3	1.0	89.6
실시예 4	1.0	92.5
실시예 5	1.0	91.6
실시예 6	1.0	91.8
비교예 1	1.0	80.5
비교예 2	1.0	79.1
비교예 3	1.0	82.5
비교예 4	1.0	89.8
비교예 5	1.0	91.7
비교예 6	1.0	90.6

상기 표 4에서 보는 바와 같이 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6의 추출물은 모두 관절조직 분해효소의 활성을 억제하는 정도가 우수함을 알 수 있었으나, 서로 간에 유의한 활성 차이는 없는 것을 확인하였다.

실험예 4 : 마우스 단회투여 독성 테스트

상기 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6에 의해 제조된 추출물이 급성독성을 나타내는지 여부를 실험하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

[실험방법]

ICR (Institute of Cancer Research)계 쥐에 실시예 1 ~ 6 및 비교예 1 ~ 6의 추출물을 경구로 kg 당 2 g씩 투여하고 사망개체 발생 유무를 관찰하였다.(각 군당 10마리)

	시험농도 (g/kg)	치사율 (%)	부검결과
실시예 1	2.0	0	특이증상 없음
실시예 2	2.0	0	특이증상 없음
실시예 3	2.0	0	특이증상 없음
실시예 4	2.0	0	특이증상 없음
실시예 5	2.0	0	특이증상 없음
실시예 6	2.0	0	특이증상 없음
비교예 1	2.0	10	+
비교예 2	2.0	20	+++
비교예 3	2.0	30	+++++
비교예 4	2.0	10	++
비교예 5	2.0	20	++++
비교예 6	2.0	30	+++++

※ + : 소화기에 발생한 병변의 정도, +가 많을수록 정도가 심해짐.

상기 표 5에서 보는 바와 같이 쿠커비타신 B 의 함량이 0.05 %(w/w) 이하인 실시예의 추출물을 투여하는 경우 특이증상이 나타나지 아니하였으나, 쿠커비타신 B 함량이 0.07 %(w/w) 이상인 비교예의 추출물을 투여한 경우 소화기에 병변이 나타나며 경우 치사개체가 나타남을 확인하였다. 특히 쿠커비타신 B의 함량이 증가할수록 치사개체가 증가하고 병변의 정도가 심해지는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 추출물은 우수한 진통 활성, 염증 억제 활성 및 관절 조직 분해 효소 억제 활성을 가지면서도, 부작용을 나타내지 아니하여 관절염 치료 및 관절보호제로 유용함을 확인하였다.

제조예 1 : 정제의 제조

상기 실시예 1의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.

[조성]

생약추출물 200 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 옥수수 전분 113 mg, 무수에탄올 적량.

제조예 2 : 연고제의 제조

상기 실시예 1의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

생약추출물 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알콜 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량

제조예 3 : 주사제의 제조

상기 실시예 1의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

생약추출물 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트륨 25 mg, 주사용 물 2974 mg

제조예 4 : 경피제의 제조

상기 실시예 1의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 방법으로 경피제를 제조하였다.

[조성 1]

생약추출물 0.4 g, 폴리아크릴산 나트륨 1.3 g, 글리세린 3.6 g, 수산화 알루미늄 0.04 g, 메틸 파라벤 0.2 g, 물 14 g.

[조성 2]

생약추출물 0.8 g, 프로필렌 글리콜 1.6 g, 유동 파라핀 0.8 g, 이소프로필 미리스테이트 0.4 g, 젤바 1430 16.4 g.

Claims

삭제
과루근, 위령선 및 하고초의 생약 추출물을 함유하는 생약 조성물에 있어서, 전체 추출물에 대하여 쿠커비타신 B가 0.05 중량% 이하로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 위장관 부작용이 감소된 관절염 치료용 또는 관절보호용 생약 조성물.
제 2 항의 생약 조성물이 관절염 치료의 유효성분으로 함유되어 있으며, 전체 추출물에 대하여 쿠커비타신 B가 0.001 ~ 0.05 중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 관절염 치료제.
제 3 항에 있어서, 경구용 정제, 경구용 캅셀제, 연고제, 주사제 또는 경피투여제로 제형화된 것임을 특징으로 하는 관절염 치료제.
제 2 항의 생약 조성물이 관절 보호의 유효성분으로 함유되어 있으며, 전체 추출물에 대하여 쿠커비타신 B가 0.001 ~ 0.05 중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 관절 보호제.
제 5 항에 있어서, 경구용 정제, 경구용 캅셀제, 연고제, 주사제 또는 경피투여제로 제형화된 것임을 특징으로 하는 관절 보호제.
삭제
과루근, 위령선 및 하고초를 물 또는 알콜 수용액으로 추출하는 단계, 및 추출액을 60~90℃에서 쿠커비타신 B의 함량이 0.05 중량% 이하가 될 때까지 열처리하는 단계를 포함하는, 위장관 부작용이 감소된 관절염 치료용 또는 관절보호용 과루근, 위령선 및 하고초 혼합 추출물의 제조방법.