KR20070088984A - 독활 추출물을 함유하는 염증성 질환 및 치료에 유용한 약제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 독활 추출물을 함유하는 염증성 질환 및 치료에 유용한 약제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 독활의 추출물 중 엽산(folic acid)의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시키고, 진통억제, 급성염증억제, 만성염증억제, 급성부종억제 및 만성부종억제 등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 독활 추출물을 함유하는 염증성 질환 및 치료에 유용한 약제에 관한 것이다.

독활, 관절염, 급성염증, 만성염증, 급성부종, 만성부종, 엽산(folic acid)

Description

독활 추출물을 함유하는 염증성 질환 및 치료에 유용한 약제{Araliaceae extracts compositions for treating or preventing inflammatory diseases}

도 1은 본 발명에 따른 독활 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

본 발명은 독활 추출물을 함유하는 염증성 질환 및 치료에 유용한 약제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 독활의 추출물 중 엽산(folic acid)의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시키고, 진통억제, 급성염증억제, 만성염증억제, 급성부종억제 및 만성부종억제 등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 독활 추출물을 함유하는 염증성 질환 및 치료에 유용한 약제에 관한 것이다.

관절염은 의학적으로 세균이나 외상과 같은 어떤 원인에 의해서 관절 내에 염증성 변화가 생긴 것을 총괄해서 지칭하는 병명이다. 이러한 관절염은 크게 급성과 만성으로 나뉜다.

급성 관절염은 다음과 같이 분류한다. ① 장액성(奬液性) 관절염:보통 외상(外傷)에 의해서 일어나는데 원인불명의 것도 있으며, 대개 하나의 관절에만 발생한다. ② 장액섬유소성(奬液纖維素性) 관절염:급성관절류머티즘 때에 일어나는데, 관절강 내에 혼탁한 삼출액(渗出液)이 괸다. 섬유소의 위막(僞膜)이 생겨 염증이 가라앉아도 심한 운동장애를 남긴다. ③ 화농성(化膿性) 관절염: 관절의 개방창(開放創) 또는 임질·장티푸스·성홍열·패혈증(敗血症) 같은 전염병에 다발성을 보인다. 생후 1 ∼ 2개월의 유아는 뼈가 심하게 상하여 치료할 수 없는 탈구(脫臼)를 일으킨다. 성인에서는 골막골수염에 걸려 화농부가 터져 고름이 관절로 들어가는 것이 많은데, 이를 2차화농관절염이라고 한다.

만성 관절염은 다음과 같이 분류한다. ① 특수성(特殊性) 염증:결핵성ㅇ매독성 혹은 중년 이후의 남자에 많은 요산(尿酸)의 대사 장애로 인한 통풍성(痛風性) 관절염이 있다. ② 다발성 관절염: 만성관절류머티즘에 의한 것이 많은데 급성장액성 관절염에서 이행(移行)되거나 결핵·매독·임질의 경과중에 다발성으로 나타나기도 하며 패혈증의 하나인 것도 있다. 그밖에 스틸병(病)이라는 관절염도 포함된다. ③ 변형성 골관절염: 뼈나 관절의 노화 또는 외상이 원인이다. ④ 혈우병성(血友病性) 관절염: 혈우병을 앓을 때 관절 내의 출혈에 의한 것이다.

상기한 바와 같은 관절염으로 대표되는 염증성 변화에 의한 질환의 치료를 목적으로 많은 약제들이 개발되고 있다.

한편, 독활은 땃두릅 혹은 땅두릅이라고도 불리며, 산에서 주로 자생하고, 높이는 1.5 m이고 꽃을 제외한 전체에 털이 약간 있다. 잎은 어긋나고 길이 50 ∼ 100 cm, 나비 3 ∼ 20 cm이며 홀수 2회 깃꼴겹잎으로서 어릴 때에는 연한 갈색 털이 있다. 작은잎은 달걀 모양 또는 타원형이고 가장자리에 톱니가 있으며, 잎 표면은 녹색이고 뒷면은 흰빛이 돌며 잎자루 밑부분 양쪽에 작은 떡잎이 있다. 꽃은 7 ∼ 8월에 크고 연한 녹색으로 피고 원추꽃차례가 자라며 총상(總狀)으로 갈라진 가지 끝에 산형꽃차례로 달린 양성화이다. 열매는 장과로서 9 ∼ 10월에 검게 익는다. 바람에 움직이지 않는다는 뜻으로 독활이라고 부른다. 이른 봄 어린 순은 식용하며, 가을에 잎이 죽은 다음 흙을 덮어서 어린 순이 길게 자랄 수 있도록 한다. 뿌리는 약용하는데, 근육통·하반신마비·두통·중풍의 반신불수 등에 많이 쓰인다. 동아시아 지역의 산지에 분포한다.

독활은 스테로이드 호르몬의 복합물질을 함유하고 있어, 신경 중추를 마비시키는 진통 작용을 한다. 또한, 약리 실험에서 강장작용, 혈당량 감소 작용, 중추신경 흥분작용, 성선 자극작용, 강심작용, 이뇨작용, 피로회복 촉진작용 등이 밝혀져 있다. 한방에서는 또한 다리나 무릎에 무력감이 올 때에도 응용되었고 반신불수 ㅇ 하지마비, 손발이 차거나 저린데, 허리와 어께 통증 등에 널리 이용되어 왔다. 지금까지 알려진 독활의 성분으로는 비타민 B12, 엽산(folic acid), 리모넨(limonen), 사비넨(sabinene), α-피넨(α-pinene), γ-테르피넨(γ-terpinene), 미르센(myrcene), 후물렌(humulene, α-caryophyllene)등이 가장 널리 알려져 있다.

예로부터 동의보감, 향약집성방 및 광제비급 등의 기성 한약서나 관련문헌에 서 상기한 독활을 단방 생약으로서의 처방하고 있으나, 이러한 처방은 독활의 외형상의 형태 감별 방법 및 한방의학적 약효와 탕액의 제조방법에 관한 간단한 언급에 불과하였다. 즉, 상기 제시된 방법을 통해 추출된 성분 중 약효를 발현하는 유효활성 성분들에 관한 의견은 얻을 수 없었다.

또한, 독활은 산지 및 채취시기별로 지표성분의 함량편차가 크게 나타나기 때문에 추출물의 규격화가 어렵고, 소염진통, 혈액순환 개선, 관절염 치료 등의 활성이 우수한 활성 분획을 재현성 있게 얻을 수 없어서 상품화가 곤란하다는 사실도 해결하여야할 문제점으로 남아있다.

이에 본 발명의 발명자들의 상기와 같은 문제점을 해결하여 염증성 변화에 의한 제증상의 억제로서, 소염 진통작용, 혈소판 응집억제 작용, 관절조직 분해효소 억제작용, 면역세포증식 억제 작용, 급성염증억제, 만성염증억제 및 급성부종억제 등의 효과가 우수한 특정 성분 및 이의 함량 조절에 따른 독활 추출물의 규격화를 달성하기 위하여 연구 노력하였다.

이러한 본 발명의 연구 결과에 따르면, 독활 추출물 중 상기한 염증성 질환에 따른 제증상의 억제 효과가 우수할 것으로 판단되는 활성분획을 일정함량 포함하는 독활 추출물을 용이하고 재현성 있게 얻을 수 있어 상품화가 가능함을 알게 되었다.

따라서, 본 발명은 염증성 질환의 치료 및 예방용 독활 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기한 독활 추출물 중 염증성 변화에 의한 제증상의 억제 효과가 우수한 활성 분획인 지표물질로 판단되는 엽산(folic acid)의 함량이 특정 범위로 포함된 독활 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 지표물질로 엽산(folic acid)이 0.01 ∼ 0.1 중량% 함유되어 있는 독활(Araliaceae) 추출물인 염증성 질환의 치료 및 예방용 약제에 그 특징이 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 독활의 추출물 중 엽산(folic acid)의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시켜 진통억제, 급성염증억제, 만성염증억제, 급성부종억제 및 만성부종억제 등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용한 약제에 적용할 수 있는 독활 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 염증성 질환의 치료 및 예방용 약제는 독활 추출물을 유효성분으로 포함하며, 이러한 독활 추출물 중에는 지표물질로서 엽산(folic acid)이 0.01 ∼ 0.1 중량% 함유된 것을 사용하는 것이 좋다.

이는 원 생약에 함유된 유효 생리 활성물질의 함량이 산지, 채취시기, 보관기간 및 보관상태 등에 따라 크게 달라질 수 있으므로 각 생약조성물의 조성을 한정함에 있어 사용성분의 중량비의 한정보다는 특정 유효물질의 함량을 한정하는 것 이 보다 바람직하다.

따라서, 본 발명에서는 약효 발현을 극대화하는 독활 추출물을 얻기 위한 지표물질로서 엽산(folic acid)을 선정한 것이다. 상기 엽산(folic acid)의 활성으로는 항빈혈성 인자 또는 원수이 항펠라그라인자(비타민 M)라고도 하며, 황색 결정으로 물에 약간 녹는다. 엽산은 동물의 성장 및 조혈에 관여하며 악성빈혈의 치료에 유효하며, 대사과정에서 비타민 B12와 함께 핵산대사에 중요한 역할을 한다. 환원형 엽산인 테트라히드로엽산은 메틸기와 수산기를 전이하는 반응을 조절한고, 메티오닌, 세린, 글리신, 퓨란염기 합성 시 메틸기를 공급한다. 페닐 알라니, 타이로신, 트립토판에 히드록시기를 첨가하여 노에피네프린과 세라토닌을 합성한다[(이영노, 원색한국식물도감, 교학사, 592p(1998), 안덕균, 원색한국본초도감, 교학사(1998), 이우철, 원색한국기준식물도감, 아카데미서적(1996), 이창복, 대한식물도감, 향문사(1979), 정태현, 한국식물도감, 신지사(1958)].

본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제 중에 사용되는 독활 추출물은 독활로부터 추출한 추출물 자체(생약 엑기스)나, 상기 독활 추출물로부터 특정 활성분획을 추출하여 선택 사용할 수 있다. 이 때의 배합비율은 독활의 원래 함량과는 관계없이 지표물질인 엽산(folic acid)의 함량으로 결정되는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 경우 상기 지표물질인 엽산(folic acid)의 함량이 약제에 사용된 독활 추출물 중 0.01 ∼ 0.1 중량% 함유되어 있을 때 목적하는 약효를 얻을 수 있었다. 이때, 상기 엽산(folic acid)의 함량이 0.01 중량% 미만인 경우 관절염 등의 치료에 상대적으로 저조한 결과를 얻게 된다. 또한 본 발명에서 상기 엽산(folic acid) 함량의 상한 범위에 대해 특별한 제한은 두지 않으나, 다만 일정수준 이상을 초과하여 함유되면 효과가 더 이상 증가하지 않을 뿐만 아니라 제조하기에도 기술적, 경제적 측면에서 바람직하지 않으므로 0.05 중량% 정도 사용되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 상기 지표물질로 선정한 엽산(folic acid)은 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 중요한 성분이며, 일정 함량범위로 함유되어 있을 때 약효 상승효과를 발현하여 보다 강력한 약효를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에서 얻은 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 유효성분으로서 상기 성분 이외의 기타 다른 성분의 작용을 배제할 수는 없다.

본 발명에 따른 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료에 유효한 독활 추출물의 제조방법을 간단하게 설명하면 다음과 같다.

1) 독활 원생약 중량의 5 ∼ 8 배량의 물, 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출, 냉각 및 여과하는 단계;

2) 상기에서 얻어진 여액을 알콜 수용액으로 층분리한 후 60 ∼ 80 ℃ 로 감압 농축하는 단계, 및

3) 상기에서 얻어진 농축물에, 알콜을 가한 후 500 ∼ 1,000 rpm으로 원심분리한 여액을 감압 농축, 진공건조, 분쇄 및 멸균하는 단계를 포함하여 이루어진다.

이를 상세하게 설명하면, 독활 원생약에 물, 알콜 또는 알콜 수용액을 가하고 2 ∼ 3 시간, 2 ∼ 5 회 반복하여 추출하며, 상온에서 서서히 냉각시킨 후 원심 분리 등의 방법으로 여과하여 잔사와 분리한다. 상기 잔사에 상기 혼합 생약 중량의 5 ∼ 8 배량의 물, 알콜 또는 알콜 수용액을 가하고 가온하여 재추출한 후 여과한 다음, 이전의 여액과 혼합하여 여과한다. 상기와 같이 잔사에 물 또는 알콜 수용액을 가하여 재추출 및 여과함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 이때, 추출에 사용되는 물, 알콜 또는 알콜 수용액의 사용량이 너무 적으면 추출물의 용해도가 나빠져서 추출효율이 떨어지고, 사용량이 너무 많으면 층분리에 사용하는 알콜 수용액의 사용량이 증가하고, 감압 농축 시간이 오래 걸리는 등의 경제적이지 못하거나 취급상의 문제가 생길 수 있다.

상기 알콜은 당 분야에서 일반적으로 사용되는 지방족, 방향족 알콜이 모두 사용 가능하며, 바람직하기로는 지방족 알콜, 보다 바람직하기로는 탄소수 1 ∼ 6의 저급 알콜을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택하였는데, 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 ∼ 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌고, 3차 이상의 다단계 추출은 경제성이 없는 것으로 판단된다.

상기와 같이 1, 2차에 걸쳐 물, 알콜 또는 알콜 수용액로 추출하여 얻은 추출액은 여과 및 농축한 다음, 여액 중에 함유된 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제하는데, 본 발명에서는 여액과 동량의 알콜 수용액을 용매로 사용량 2 ∼ 5 회 층 분리를 실시하여 용매 분획을 얻음으로써 불순물을 정제한다.

상기 알콜로는 탄소수 1 내지 6개의 알콜이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30 % 에탄올 수용액을 사용하는데, 저급 알콜 수용액 사용량이 여액에 비하여 적을 경우에는 지방산 등의 불필요한 성분들에 의한 미립자가 형성되어 층 분리가 원활하지 못할 뿐만 아니라 유효활성성분의 추출 함량이 낮아지게 되므로 효율적이지 못하다.

상기 층분리한 추출액은 60 ∼ 80 ℃에서 감압 농축하여 잔존하는 용매를 제거하며, 이렇게 얻어진 농축물에 상기 감압 농축시 회수된 알콜을 가한 후 500 ∼ 1,000 rpm으로 원심분리한 여액을 가하여 농축물을 혼탁시킨 다음 재차 감압 농축시킨다.

이렇게 얻어진 농축물을 60 ∼ 80 ℃에서 0.08 ∼ 0.3 pa로 진공건조시킨 후 30∼ 80 메쉬로 분쇄 및 멸균하여 분말상의 독활 추출물을 얻는데, 이러한 독활 추출물은 관절염 등의 치료 작용이 우수하여, 이 추출물을 포함하는 생약제는 관절 보호제로 유용하리라 기대된다.

본 발명에 따른 독활 추출물을 통상의 제조방법으로 제형화하여 정제, 캅셀제 주사제 등을 제조하는데, 이들 중 정제 제조시 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 상기 독활 추출물을 1 : 1의 비율로 사용하면 관절염 등의 염증성 변화에 의한 질환 치료에 활성을 갖는 정제를 제조할 수 있다.

이러한 의약물로 제조 시에는 생약추출물 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약 학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(dilute)등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 독활 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 독활 추출물은 체중 1 kg당 0.1 ∼ 10 mg 정도를 투여하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 유효성분을 포함하는 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 독활 추출물의 제조

물로 세척하고 잘 건조시킨 후 독활을 30% 에탄올 수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 2시간 단위로 2회 열탕추출하였다. 상기 추출 물질을 상온으로 서서히 냉각한 후 원심여과하여 찌꺼기를 제거 후 여액을 병합하여 60 ∼ 80 ℃에서 감압 농축 하였다.

상기한 에탄올 분획을 통하여 회수된 에탄올을 상기 농축물에 가한 후 농축물을 충분히 현탁시킨 후 1000 rpm으로 원심여과한 여액을 다시 감압농축한 다음 60 ℃, 0.08 pa 조건으로 진공건조시킨 후 80 메쉬로 분쇄 과정을 거쳐 멸균시켰다. 상기한 방법으로 추출, 정제한 독활 추출물 중 엽산의 함량은 0.05 중량% 이었다. 또한, 상기 방법으로 얻어진 독활 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC 분석하였다.

1) 전개용매(Eluent) :

물(H₂O) : 메탄올(MeOH) : 1-핵산술포내이트염(1-Hexanesulfonate sodium) : 초산(HAC) = 720 : 270 : 1.4 : 10 (부피비)

2) 컬럼 : 오피마팩(Opima pak) OP C18-5100259(250 × 4.6 mm I.D., 5 ㎛)

3) 유속 : 1 ml/min

4) 컬럼온도 : 25 ℃

5) 검출기 : UV 280 nm

실험예 1 : TPA 유도 귀부종 억제 테스트(TPA-induced mouse ear edema.)

상기 실시예 1에 의해 제조된 독활 추출물에 대한 TPA 유도 귀부종 억제 테스트(TPA-induced mouse ear edema.)를 실시하였고, 그 결과는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 1]

7주령된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 아스피린(Aspirin)을 200 mg/Kg, 독활 추출물 100, 200, 400 mg/Kg 을 경구 투여 후 1 시간 뒤 TPA(2.5 ㎍/20 ㎕)는 아세톤(Aceton)에 녹인 후, 쥐의 귀에 부종을 유발하였다. 부종 유발 시 실험자는 실험체를 뒤에서 완전히 고정 후 2차 실험자가 마이크로 피펫(micro pipet)을 이용하여 귀에 부종 유발 물질을 자극해 주었다. 그 후 4 시간 뒤 각 실험구 별로 귀 부종을 측정하였다. 측정 시에는 경골 탈추법을 이용하여 실험체를 도태 시킨 후 정확한 측정을 유도하였다.

처리	귀의 두께	염증유발정도(%)
Negative control	0.295 ± 0.058	39 %
Positive control	0.765 ± 0.010	100 %
아스피린	0.381 ± 0.010	49 %
독활(100 mg/kg-엽산함량 0.01 중량%)	0.620 ± 0.024	81 %
독활(200 mg/kg-엽산함량 0.02 중량%)	0.584 ± 0.024	76 %
독활(400 mg/kg-엽산함량 0.04 중량%)	0.585 ± 0.024	76 %
독활(50 mg/kg-엽산함량 0.005 중량%)	0.760 ± 0.011	99 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ± S.E.M (n=12) 2. Negative control : 부종을 유발하지 않은 실험 구 3. Positive control : 부종유발후 약제 무처리 실험 구

상기 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 독활 추출물을 사용한 경우 TPA 유도 귀부종 억제효과가 우수하며, 특히 독활 추출물 200 mg/kg 농도일 경우 TPA 유도 귀부종 염증 억제율이 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 2 : 아라키돈산(Arachidonic acid) 유도 귀 부종억제 테스트(Arachidonic acid-induced mouse ear edema assay)

상기 실시예 1에 의해 제조된 독활 추출물에 대한 아라키돈산 유도 귀 부종억제 테스트(Arachidonic acid-induced mouse ear edema assay)를 실시하였고, 그 결과는 다음 표 2에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 2]

7주령된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 아스피린을 200 mg/Kg, 독활 추출물 100, 200, 400 mg/Kg 을 경구 투여 후 1 시간 뒤 아라키돈산은 아세톤(2 mg/20 ㎕)에 녹여 주어 귀에 부종을 유발하였다. 부종 유발 시 실험자는 실험체를 뒤에서 완전히 고정 후 2차 실험자가 마이크로 피펫을 이용하여 귀에 부종 유발 물질을 자극해 주었다. 그 후 1 시간 뒤 각 천연물 별로 귀 부종을 측정하였다. 측정 시에는 경골 탈추법을 이용하여 실험체를 도태시킨 후 정확한 측정을 유도하였다.

처리	귀의 두께	염증유발정도(%)
Negative control	0.303 ± 0.004	40 %
Positive control	0.755 ± 0.008	100 %
아스피린	0.349 ± 0.008	46 %
독활(100 mg/kg-엽산함량 0.01 중량%)	0.581 ± 0.012	77 %
독활(200 mg/kg-엽산함량 0.02 중량%)	0.528 ± 0.010	70 %
독활(400 mg/kg-엽산함량 0.04 중량%)	0.536 ± 0.015	71 %
독활(50 mg/kg-엽산함량 0.005 중량%)	0.752 ± 0.014	99 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ± S.E.M (n=12) 2. Negative control : 부종을 유발하지 않은 실험 구 3. Positive control : 부종유발후 약제 무처리 실험 구

상기 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 독활 추출물을 사용한 경우 아라키돈산 유도 귀부종 억제효과가 우수하며, 특히 독활 추출물 200 mg/kg 농도일 경우 아라키돈산 유도 귀부종 염증 억제율이 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 3 : 아라키돈산 유도 스트레칭 억제 테스트(Arachidonic acid-induced writhing response in mice.)

상기 실시예 1에 의해 제조된 독활 추출물에 대한 아라키돈산 유도 스트레칭 억제 테스트(Arachidonic acid-induced writhing response in mice)를 실시하였고, 그 결과는 다음 표 3에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 3]

본 실험은 "Siegmund"의 실험 방법을 참조하여 7주령된 ICR 마우스를 각 생약 후보별로 분리한 후 아스피린을 200 mg/Kg, 독활 추출물 100, 200, 400 mg/Kg을 경구 투여 1시간 후 아라키돈산(0.075%)의 복강 내 투여(0.1 ml/10 g)로 장기의 염증을 유발하였다. 10분 후 10 분 동안 마우스의 스트레칭(streching)을 관찰하였는데, 그 이유는 부종 시 가려움증을 유발하기 때문이며 이러한 현상을 통해서 부종의 정도를 짐작할 수 있다.

처리	비틀림 횟수 (Writhing number)	염증유발정도(%)
Positive control	52.00 ± 0.92	100 %
아스피린	10.17 ± 0.57	20 %
독활(100 mg/kg-엽산함량 0.01 중량%)	24.96 ± 1.40	48 %
독활(200 mg/kg-엽산함량 0.02 중량%)	17.67 ± 1.43	34 %
독활(400 mg/kg-엽산함량 0.04 중량%)	19.24 ± 1.22	37 %
독활(50 mg/kg-엽산함량 0.005 중량%)	51 ± 1.21	99 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ± S.E.M (n=12) 2. Positive control : 스트레칭 유발 후 약제 무처리 실험 구

상기 표 3에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 독활 추출물을 사용한 경우 아라키돈산 유도 스트레칭 억제효과가 우수하며, 특히 독활 추출물 200 mg/kg 농도일 경우 아라키돈산 유도 스트레칭 억제 효과가 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 4 : 급성 관절염 치료효과 검정

상기 실시예 1 에 의해 제조된 독활 추출물에 대한 급성 관절염 치료효과 검정을 실시하였고, 그 결과는 다음 표 4에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 4]

수컷 SD계 레트(200 g 내외)에 미리 조제한 S사 J제품을 200 mg/Kg, 독활 추출물 100, 200, 400 mg/Kg을 1 ml 경구 투여하고 1% 카라기닌 생리식염수 100 ㎕를 좌측 족저부에 주사하여 급성 족부 부종을 유도하였다. 부종은 플레티스모메터(plethysmometer, LE 7500)를 이용하여 3시간 후의 발 용적을 측정 하였다.

처리	염증유발정도(%)
Negative control	0 %
Positive control	89 %
S사 J제품	70 %
독활(100 mg/kg-엽산함량 0.01 중량%)	81 %
독활(200 mg/kg-엽산함량 0.02 중량%)	76 %
독활(400 mg/kg-엽산함량 0.04 중량%)	76 %
독활(50 mg/kg-엽산함량 0.005 중량%)	86 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ± S.E.M (n=12) 2. Negative control : 부종을 유발하지 않은 실험 구 3. Positive control : 부종유발후 약제 무처리 실험 구

상기 표 4에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 독활 추출물을 사용한 경우 급성 관절염 치료효과가 우수하며, 특히 독활 추출물 200 mg/kg 농도일 경우 급성 관절염 치료효과가 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 5 : NO 및 프로스타글란딘 E2 생성에 미치는 영향

상기 실시예 1에 의해 제조된 독활 추출물에 대한 급성 관절염 치료효과 검정을 실시하였다.

[실험방법 5]

마우스 유래 대식세포인 Raw 264.7 세포주에 LPS(1 ㎍/ml)로 처리 한 후 24시간 경과 후에 배양액을 모아 효소법 및 라디칼 크로마토그래피(radical chromatography)법을 이용하여 체내 염증유발 분자인 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성량에 미치는 독활 추출물의 영향을 검색하였다. NO의 측정은 배양액 50 ㎕를 취하고 그리스(Griess)시액 1, 2를 25 ㎕ 씩 혼합하여 OD 540 nm에서의 흡광도를 측정함. PGE2는 ELISA kit(R&D systems, USA)를 사용하여 측정하였다.

마우스 유래 대식세포인 Raw 264.7 세포주에 LPS(1 ㎍/ml)와 독활 추출물(25 ㎍/ml)를 처리한 후 24시간 경과 후에 배양액을 모아 효소법 등을 이용하여 체내 염증유발 분자인 NO를 정량한 결과, 약재 및 LPS를 처리하지 않은 경우는 10 μM 미만의 낮은 농도의 아질산염(nitrite)이 검출되었으나, LPS 단독으로 24시간 동안 처리한 세포주의 배양액으로부터는 약 40 μM의 아질산염을 검출할 수 있었다. 이는 LPS에 의해 NO_S 등의 면역 관련 단백질의 발현으로 세포내 NO의 생성량이 증가되었음을 의미하며, 독활 추출물을 처리한 세포주에서는 40 μM 보다 유의성 있게 억제된 5 ∼ 25 μM의 농도로 검출되었고, LPS에 의한 대식세포의 NO 생성을 억제하였다.

실험예 6 : 실시간-PCR(Real Time-PCR)에 의한 염증관련 유전자의 발현량 비교

상기 실시예 1에 의해 제조된 독활 추출물에 대한 염증관련 유전자의 발현량 비교를 COX2(Cyclooxygenase), iNOS(nitrogen Oxide Synthetase), mRNA 발현의 변화를 실시간-PCR(Rotar gene 3000, Corbett) 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 이용하여 검색하였다.

[실험방법 6-1] COX2(Cyclooxygenase 2), iNOS(nitrogen Oxide Synthetase) 유전자 발현억제 실험

독활 추출물의 항염증 효과와 염증 관련 체내 분자와의 상관성 규명을 위해 COX2(Cyclooxygenase 2), iNOS(nitrogen Oxide Synthetase) 유전자 및 단백질 발현에 미치는 독활 추출물의 영향을 실시간-PCR(Rotar gene 3000, Corbett) 및 웨스턴 블로팅을 이용하여 검색하였다.

[실험방법 6-2] mRNA 발현의 변화 측정

LPS(lipopolysaccharide)(1 ㎍/ml)와 독활 생약조성물을 처리하여 8 시간 배양한 Raw 264.7 세포로부터 Qiagen RNasy kit로 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후 실시간-PCR로 정량적 분석을 시행하였다. 실시간 RT-PCR은 cDNA를 주형으로 SYBER GREEN 또는 Taqman 방법으로 실시간 PCR을 실시하였다.

[실험방법 6-3] 웨스턴 블로팅

LPS 및 독활 생약조성물을 24 시간 동안 처리한 후 세포로부터 분리한 단백질을 10 % SDS 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 전기영동하고 이 젤상의 단백질을 적절한 전압 하에서 PVDF 막으로 이동시후, 단백질이 이동된 막을 10% skim milk와 0.5 % BSA가 포함된 tris 완충용액(25 mM Tris, pH 7.6, 192 mM NaCl)으로 실온에서 2 시간 블로킹(blocking)하였다. 각 인자에 대한 항체를 3% 우혈청 알부민이 함유된 TBST에 적정비율로 희석하여 막에 넣어준 후 실온에서 1 시간동안 흔들어주면서 표지하였다. 막을 PBST로 3회 수세하고 적절한 2 차 항체 용액에 담가 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 세척함. ECL kit를 사용하여 X-선 필름에서 적절한 시간 동안 감광시켜 확인하였다.

LPS처리에 의해 대식세포의 면역관련분자의 유전자 발현을 유도하고 그 발현량에 대한 약재의 효과를 Real Time-PCR로 비교 정량한 결과, 다음과 같은 결과를 얻었다.

즉, LPS 처리군과 미처리군의 발현량을 비교하여 LPS의 유도효과를 확인하였다. COX-2의 mRNA 발현량은 LPS 처리 8시간 만에 약 66배 이상 증가함을 알 수 있으며 독활 추출물을 처리한 경우는 약 76 %의 발현 억제 효과를 나타내었다.

또한 iNOS의 mRNA 발현량은 LPS 처리 8시간만에 약 12배 이상 증가함을 알 수 있으며 독활 추출물을 처리한 경우는 49 %의 발현억제 효과를 나타내었다. LPS 및 약물을 24 시간 동안 처리한 후 세포로부터 분리한 단백질을 50 ㎍ 정량하여 10 % SDS 폴리아크릴아미드 젤로 전기영동한 후 상기한 바와 같이 웨스턴 블로팅을 수행한 결과, 다음과 같은 결과를 얻었으며, 염증관련 단백질인 COX-2와 iNOS는 LPS 처리 24 시간 경과 후에 가장 많은 발현량을 보였으며 LPS를 처리하지 않은 경우에는 두 가지 단백질 모두 발현하지 않았다.

실험예 7 : 혈소판 응집반응에 미치는 영향

[실험방법 7]

독활 추출물의 항혈소판 작용을 검색하기 위해 소듐 시트레이트 용액을 미리 채워둔 주사기를 이용하여 토끼의 복대 동맥으로부터 채혈하고 200 g에서 10분간 원심분리한 후 상등액인 혈소판이 풍부한 혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)를 얻었으며, 일부 PRP를 2.000g에서 10분간 재 원심 분리하여 침전을 제외한 상등액인 혈소판이 적은 혈장(Platelet Poor Plasma, PPP)를 얻고 이때 얻은 PPP로 혈소판 응집 실험에 사용할 PRP를 혈소판수가 2 × 10⁸ cell/ml 농도가 되도록 희석하였다. 혈소판 응집은 콜라겐(collagen)으로 유도하였으며 응집의 정도는 혈소판 응집측정기(Platelet aggregometer)를 사용하여 튜비도-메트릭 방법(turbido-metric method)에 따라 측정하였다. 검색시 사용한 시료의 농도는 500, 300, 100 ㎍/ml이었다.

토끼 혈액으로부터 얻은 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)를 혈소판수가 2 × 10⁸ cell/ml 농도가 되도록 조제한 후 콜라겐으로 혈소판 응집을 유도하였으며, 그 응집정도를 혈소판 응집측정기(Platelet aggregometer)를 사용하여 튜비도-메트릭 방법(turbido-metric method)에 따라 측정한 결과, 다음과 같은 결과를 얻었다.

항 혈소판 응집 억제 효과는 독활 생약조성물을 처리한 경우 300 ㎍/ml 농도로 처리한 실험군에서도 약 30%의 억제 효과를 보였다.

제조예 1 : 정제의 제조

본 발명의 생약추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.

[조성]

독활 추출물 200 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 유당 101 mg, 포비돈 12 mg, 무수에탄올 적량.

제조예 2 : 연고제의 제조

본 발명의 독활 추출물의 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

독활 추출물 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알콜 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량.

제조예 3 : 주사제의 제조

본 발명의 독활 추출물의 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

독활 추출물 100mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트류 25 mg, 주사용 정제수 2974 mg

제조예 4 : 경피제의 제조

본 발명의 독활 추출물의 이용하여 다음과 같은 조성으로 경피제를 제조하였다.

[조성]

독활 추출물 0.4 g, 폴리아크릴산 나트륨 1.3 g, 글리세린 3.6 g, 수산화알루미늄 0.004 g, 메틸 파라벤 0.2 g, 물 14 g.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 염증성 변화에 의한 제증상의 억제로서, 소염 진통작용, 혈소판 응집억제 작용, 관절조직 분해효소 억제작용, 면역세포증식 억제 작용, 급성염증억제, 만성염증억제 및 급성부종억제 등의 효과가 우수한 특정 성분 및 이의 함량 조절에 따른 독활 추출물의 규격화를 달성할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 독활 추출물은 독활로부터 추출 조제된 것으로 엽산(folic acid)을 지표물질로서 선정하여 지표물질의 함량 조절을 통하여 관절염 치 료활성을 약제를 제조할 수 있다.

Claims (3)

1. 지표물질로 엽산(folic acid)이 0.01 ∼ 0.1 중량% 함유되어 있는 독활(Araliaceae) 추출물인 것임을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 약제.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 독활 추출물은

   1) 독활 원생약 중량의 5 ∼ 8 배량의 물, 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출, 냉각 및 여과하는 단계;

   2) 상기에서 얻어진 여액을 알콜 수용액으로 층분리한 후 60 ∼ 80 ℃ 로 감압 농축하는 단계, 및

   3) 상기에서 얻어진 농축물에, 알콜을 가한 후 500 ∼ 1,000 rpm으로 원심분리한 여액을 감압 농축, 진공건조, 분쇄 및 멸균하는 단계를 포함하여 이루어진 것으로,

   엽산(folic acid)이 0.01 ∼ 0.1 중량% 함유된 분말인 것임을 특징으로 하는 약제.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절염 및 부종인 것임을 특징으로 하는 약제.

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