CN108283671B - 文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用 - Google Patents

文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种文冠果种壳提取物的制备方法，该方法将文冠果种壳先进行甲醇水溶液萃取提取，再加入盐酸进行酸化并过滤，最后用乙酸乙酯萃取，减压下蒸发得到文冠果种壳提取物。硅烷化衍生后经GC‑MS测定组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％。主要成分为咖啡酸(20.05％)，对羟基苯乙酸(9.32％)，对香豆酸(8.84％)和邻羟基肉桂酸(8.29％)。经整体动物模型实验研究表明，口服该文冠果种壳提取物对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经功能评分有显著的改善作用，减轻了中枢神经系统的炎症和脱髓鞘程度，可用于制备治疗和/或预防多发性硬化疾病的药物。

Description

文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中 的应用
技术领域
本发明属于化合物提取及其医药应用技术领域，涉及文冠果种壳活性物质的提取方法及其产品和应用，特别涉及文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用。
背景技术
文冠果(拉丁学名Xanthoceras sorbifolia Bunge)，又称文冠木、文官果、土木瓜、木瓜、温旦革子。属无患子科、落叶灌木或小乔木植物，是我国特有的一种优良木本食用油料树种。分布于东北和华北及陕西、甘肃、宁夏、安徽、河南等地，寿命超过200年。该物种的性味及功效为甘，平，祛风除湿。传统上用于治疗动脉硬化，高脂血症，风湿病，慢性肝炎，夜间遗尿症和痢疾。此外，文冠果是一种经济和药学上重要的能源作物，其种子中的油含量超过50％，不仅作为营养坚果，而且还用于生产食用油和生物燃料。目前，人们对种子的植物油生产都十分关注，同时产生大量无用残渣，包括坚果壳和种子粉。
文冠果果实和种子的化学研究表明，它们含有多种化合物，包括类黄酮，三萜类化合物和甾醇。
多发性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)及其动物模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)是一种由自身异常激活的免疫细胞作用于中枢神经系统，造成的以炎性细胞浸润和髓鞘脱失为典型特征的神经退行性疾病，损害身体和认知能力，最终导致死亡。尽管多发性硬化症的发病机制尚未完全阐明，但通常认为由自身异常激活的
Figure BDA0001547609450000011
CD4+T细胞促进了MS和EAE中CNS的组织损伤。在这些CD4+T细胞中，分泌IL-17，IL-22和GM-CSF的Th17细胞被认为是诱导自身免疫和炎症的主要亚型之一。
长期以来，来自药用和食用植物的天然化合物及其衍生物被认为是新型治疗剂的丰富来源。例如，2010年批准的第一个口服MS治疗药物芬戈莫德(FTY720)是一种广泛使用的药用植物冬虫夏草(Cordyceps Sinensis)的天然产物的衍生物。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种文冠果种壳提取物及其在治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用，通过将文冠果种壳提取物衍生化，再经GC-MS测定其成分，得到关于文冠果果壳提取物体内抗炎活性结果，可作为一种替代的新来源，用于食品和制药行业，特别是在治疗脱髓鞘疾病药物方面的应用。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种文冠果种壳提取物的制备方法，其特征在于，将文冠果种壳先进行甲醇水溶液萃取提取，再加入HCl进行酸化并过滤；最后用乙酸乙酯萃取，减压下蒸发得到文冠果种壳提取物，硅烷化衍生后，经GC-MS成分测定衍生物，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％，和邻羟基肉桂酸，占8.29％。
上述文冠果种壳提取物的制备方法，依次按如下步骤制备：
(1)取文冠果种壳，粉碎，干燥，得到粉末；
(2)取所述粉末，脱脂，用体积百分比为70％的甲醇水溶液进行提取，得到提取液，所述的甲醇水溶液内每升含有1.0g的BHT；
(3)取所述提取液，加入6M的HCl并搅拌，得到混合物；
(4)用磁力搅拌器将混合物在35℃加热16小时，待溶液冷却，然后过滤；
(5)用乙酸乙酯萃取混合物，得到乙酸乙酯提取物；
(6)取乙酸乙酯提取物，并在旋转蒸发器上在35℃减压下蒸发至干，取所述有机相，得到文冠果种壳提取物，溶解于吡啶溶液后，用TMCS和BSTFA在80℃加热45分钟进行硅烷化衍生，再经GC-MS测定衍生物的组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％，和邻羟基肉桂酸，占8.29％。
根据本发明，步骤(2)中，所述粉末与所述体积百分比为70％的甲醇水溶液的配比为：1重量份粉末：8-15重量份甲醇水溶液。
所述步骤(3)中，所述提取液与加入6M的HCl的体积配比为1：4。
所述步骤(5)中提取液每次用10ml乙酸乙酯萃取混合物，且萃取三次，合并得到提取液。
进一步地，所述的GC-MS成分测定衍生物的方法是：
(1)取文冠果种壳提取物10μg溶解在100μl新鲜蒸馏的吡啶中；
(2)取上述吡啶溶液10μL加入三甲基氯硅烷(TMCS)和N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)的混合物，在密闭管中涡旋混合，得到混合物；
(3)取上述混合物放置在80℃的水浴中45分钟，得到甲硅烷基化的衍生混合物，取1μl衍生混合物用GC-MS分析。
所述三甲基甲硅烷基(TMCS)由于对水分具有高敏感性，因此在制备和衍生过程中应确保无水条件。
根据申请人的实验表明，所制备的文冠果种壳提取物，能够应用于制备治疗和/或预防多发性硬化药物。
所述的治疗和/或预防多发性硬化药物是治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物。
本发明的制备方法所制备的文冠果种壳提取物是一种含酚类成分，通过衍生化和GC-MS分析，共鉴定出20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％。主要化合物为咖啡酸(20.05％)，对羟基苯乙酸(9.32％)，对香豆酸(8.84％)和邻羟基肉桂酸(8.29％)。经整体动物模型实验研究表明，口服文冠果种壳提取物对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经功能评分有显著的改善作用，减轻了中枢神经系统的炎症和脱髓鞘程度，同时对CNS炎症细胞浸润有明显的抑制作用，并发现文冠果种壳提取物诱导的作用机制涉及减少致病性免疫细胞渗入中枢神经系统，抑制促炎因子和趋化因子的表达，并且通过JAK/STAT途径抑制辅助性T细胞Th1和Th17的分化，可用于制备防治/治疗多发性硬化疾病的药物。
附图说明
图1为文冠果种壳提取物(NE)成分测定的GC-MS色谱图。
图2为本发明中PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)预防组三个浓度，小鼠发病情况及体重情况对比。
图3为本发明中PBS对照组分别与两个同一浓度不同给药时间的文冠果种壳提取物(NE)治疗组小鼠发病情况对比。
图4为PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组第30天脊髓腰骶膨大病理切片图。
图5为正常小鼠、PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组CNS中炎性细胞数量对比图。
图6实时定量PCR检测PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组相关细胞因子基因表达图。
图7为流式细胞结果图。PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组的有关脾脏或中枢神经细胞CD4+和CD8+细胞表面染色和炎性因子的检测结果。
图8为文冠果种壳提取物(NE)治疗组与PBS对照组相比，CNS和脾脏中CD4+和CD8+T细胞的百分比和绝对数量显着降低图。
图9为Elisa分析，测定了文冠果种壳提取物(NE)治疗组与PBS对照组的脾细胞培养中上层清液细胞因子表达水平图。
图10为免疫印迹分析，从文冠果种壳提取物(NE)治疗组或PBS对照组小鼠纯化的脾CD4+T细胞获得蛋白质样品图。
图11是通过实时PCR检测CD4+T细胞的JAK/STAT信号通路阵列，并对其相对表达进行分析图。
下面通过附图和具体实施例对本发明得到的文冠果种壳提取物在制备防治多发性硬化疾病的药物中的应用进行详细的描述。
具体实施方式
为了提供文冠果种壳的全面和科学的信息，并避免植物油工业提取过程中对这种资源的浪费，是申请人正在进行的从药用植物和食用植物中提取免疫调节剂的研究的一部分。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，本发明不限于以下的实施例，显然，本领域的技术人员可以进行各种修正、添加或替换，并不需要付出创造性劳动，这些修正添加或替换也属于本发明的保护范围。
为了从药用植物和食用植物中开发免疫调节剂，应对自发免疫性疾病对人类的危害，且避免资源的浪费。申请人以文冠果种壳为研究对象，提供了一种从文冠果种壳中分离提取一系列天然产物的方法，并对其进行了免疫调节和抗炎活性测定。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所有实验程序和方案均由陕西师范大学的动物管理和委员会批准，并按照批准的机构指导方针和条例进行。统计学分析处理使用Graph Pad Prism 6软件(Graph Pad，LaJolla，CA)进行统计学分析。数据以平均值±SD表示。当比较多个组时，数据通过Tukey多重比较测试的方差分析(ANOVA)进行分析。所有的统计分析均采用p<0.05的显着性标准。
(1)文冠果种壳提取物(NE)的制备
本实施例给出一种文冠果种壳提取物的制备方法，依次按如下步骤制备：
(1)取文冠果种壳，粉碎，干燥，得到粉末；
(2)取所述粉末，脱脂，用体积百分比为70％的甲醇水溶液进行提取，该甲醇水溶液每升内含有1.0g的BHT，得到提取液；
(3)取所述提取液，加入6M的HCl溶液并搅拌，得到混合物；
(4)用磁力搅拌器将混合物在35℃加热16小时，待溶液冷却，然后过滤；
(5)用乙酸乙酯萃取混合物，得到乙酸乙酯提取物；
(6)取乙酸乙酯提取物，并在旋转蒸发器上在35℃减压下蒸发至干，取所述有机相，得到文冠果种壳提取物(NE)，置4℃冰箱保存备用。
步骤(2)中，所述粉末与所述体积百分比为70％的甲醇水溶液的配比为：1重量份粉末：8-15重量份甲醇水溶液。
步骤(3)中，所述提取液与加入6M HCl溶液的体积配比为1：4。
步骤(5)中提取液用10ml乙酸乙酯萃取混合物，且萃取三次，合并得到提取液。
(2)文冠果种壳提取物(NE)的衍生及成分的检测
GC-MS成分测定衍生物的方法是：将文冠果种壳提取物(NE)(10μg)溶解在100μl新鲜蒸馏的吡啶中，取10μl该吡啶溶液，加入三甲基氯硅烷(TMCS)100μl和N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)的混合物200μl并在螺旋盖玻璃管中涡旋，得到混合物；然后置于80℃的水浴中45分钟，得到甲硅烷基化的衍生混合物。直接取1μl衍生混合物用GC-MS分析。
通过GC-MS成分测定衍生物，确定了文冠果种壳提取物(NE)中有20种酚类化合物，占NE的84.62％(表1)。主要酚类化合物为咖啡酸(20.05％)，对羟基苯乙酸(9.32％)，对香豆酸(8.84％)和邻羟基肉桂酸(8.29％)。
由于三甲基甲硅烷基(TMCS)衍生物对水分的高敏感性，所以在制备和衍生过程中小心确保无水条件。
(3)文冠果种壳提取物(NE)用于治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验
按常规方法，选用C57BL/6小鼠，以髓鞘少突胶质细胞糖蛋白相关肽(MOG35-55)免疫，建立EAE模型；文冠果种壳提取物(NE)在造模前5天(预防方案)、第11天(疾病发作)或第16天(疾病高峰)开始口服给药，根据剂量优化研究选择剂量；每天观察临床神经功能表现并记录临床评分；所有小鼠在实验结束后，灌流固定，石蜡包埋，切片，显微镜下观察评估炎症，同时测定外周和中枢炎症因子的表达；结果表明，文冠果种壳提取物(NE)对EAE小鼠有显著的预防(图2)和治疗作用(图3)，文冠果种壳提取物(NE)可能通过抑制JAK/STAT信号传导途径，抑制Th1/Th17应答，从而缓解EAE的临床症状。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例1：文冠果种壳提取物(NE)的制备
取文冠果成熟种子(来自陕西西安植物园，收获期(2007年9月，凭证样本编号XS070918，由任毅博士鉴定)，干燥后研磨成细粉。将所得的细粉1.0g经石油醚脱脂，然后用40ml的体积百分比为70％甲醇水溶液萃取(该甲醇水溶液每升中含有1.0g的2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)。加入6M的HCl溶液10ml并小心搅拌。将萃取混合物在磁力搅拌器中35℃加热16小时。待溶液冷却，过滤。
将上述溶液用乙酸乙酯萃取三次，每次10ml，共得30ml萃取物。
将得到的萃取物用无水MgSO4干燥，且在35℃的旋转蒸发器上减压蒸发至干，得到干燥的文冠果种壳提取物(NE)，储存在冰箱中以供进一步分析。
实施例2：文冠果种壳提取物(NE)的衍生及总酚和酚类化合物的测定
对于文冠果种壳提取物(NE)的成分分析，将文冠果种壳提取物(NE)(10μg)溶解在100μl新鲜蒸馏的吡啶中，并将10μl吡啶溶液用于衍生。
对于甲硅烷基化程序，在10μl吡啶溶液中加入三甲基氯硅烷(TMCS)(100μl)和N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(200μl)的混合物并在螺旋盖玻璃管中涡旋混合，然后置于80℃的水浴中45分钟。从甲硅烷基化的混合物中直接取1μl，用于GC-MS分析。
注射器和离子源的温度分别设定在250℃和200℃。
温度控制如下：最初在80℃下保持1分钟，然后以5℃/分钟的速率编程至120℃，以10℃/分钟的速率从120℃至240℃编程，并以20℃/min的速率从240℃加热到280℃，最终保持时间为5分钟。在80℃下运行10分钟足以用于下一次注射。氦气以1.30ml/min的流速用作载气。质谱仪以电子轰击离子化(EI)模式运行，电子能量设定在70eV，质量范围在m/z 25-700。通过将保留时间与真实化合物的保留时间进行比较，并将其记录的质谱与由GC-MS系统软件提供的NIST05.LIB和NIST05s.LIB(美国国家标准与技术研究院)。
图1显示了该文冠果种壳提取物(NE)分析的总离子色谱图。主要酚类化合物的保留数据和质谱列于表1中。
表1：GC-MS测定NE中硅基酚类化合物的分子量和出现在质谱中主要的离子
Figure BDA0001547609450000081
Figure BDA0001547609450000091
GC-MS分析结果确定了20种成分，占NE的84.62％(表1)。NE中主要酚类化合物为咖啡酸(20.05％)，对羟基苯乙酸(9.32％)，对香豆酸(8.84％)和邻羟基肉桂酸(8.29％)。
本实施例给出的文冠果种壳提取物(NE)的数据填补了文献缺失的空白，并首次描述了文冠果种壳提取物(NE)的酚类特征。以前的报道已经很好地证明了各种植物提取物中酚类物质含量与抗氧化能力之间的正相关关系。因此，申请人所研究的文冠果种壳提取物(NE)的总酚酸含量较高，表明提取部位具有较强的抗氧化性能，可作为食品和制药行业的酚类产品进一步应用。
实施例3：文冠果种壳活性物质(NE)对EAE的防治性给药
1、EAE模型制备
雌性C57BL/6小鼠(8周)，购自西安交大医学院动物中心。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35-55多肽，购自Genescript公司，百日咳毒素，购于Sigma-Aldrich公司、含有结核分枝杆菌的完全弗氏完全佐剂，购于BD Difco公司。
用PBS溶解MOG35-55多肽，然后与等体积完全弗氏佐剂(含5mg/ml结核分枝杆菌)混合，用玻璃注射器推打至油包水状的白色抗原乳剂。
在背部的两个位点免疫小鼠，在免疫当天和2天后分别在腹腔注射百日咳稀释液(200ng/只)。
将EAE小鼠随机分为以下处理组：
1)PBS处理的对照组：将EAE小鼠用PBS灌胃。
2)文冠果种壳提取物(NE)处理组：NE(50，100，150mg/kg/d)从免疫前5天(预防方案)、第11天(疾病发作)或第16天(疾病高峰)开始每天口服。根据优化研究选择剂量。
2、实验后处理：
(1)EAE模型评分标准：
小鼠免疫后，观察其肢体力量情况并进行临床评分，EAE评分标准为：
0：没有临床症状；0.5：僵硬的尾巴；1：尾部瘫痪；1.5：尾部瘫痪和步态蹒跚；2：一肢瘫痪；2.5：肢体瘫痪，肢体无力；3：后肢完全瘫痪；4：濒死；5：死亡。
(2)组织病理学
对于CNS组织病理学评估，在实验结束时处死小鼠，经心脏灌注PBS，然后用4％多聚甲醛固定。用乙醇和二甲苯处理脊髓腰骶膨大，石蜡包埋的5μm切片用H&E染色以评估炎症，用Luxol fastblue(LFB)染色观察脱髓鞘，使用0-3级别的评分标准盲评切片的炎症和脱髓鞘程度。
PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组第30天脊髓腰骶膨大病理切片图参见图4。
(3)为了研究口服文冠果种壳提取物(NE)对免疫应答的影响，从小鼠的脾和CNS中分离出了单核细胞(Mononuclear cell，MNC)，并通过流式细胞术分析了表面标记物/细胞因子的表达。
(4)为了确定文冠果种壳提取物(NE)如何抑制炎性细胞浸润，使用细胞因子PCR阵列测定PBS组和文冠果种壳提取物(NE)处理组小鼠的脊髓中细胞因子及趋化因子基因表达(图6)。
(5)从脾和CNS中分离出了MNC，并通过流式细胞术对细胞进行表面标记物测定，同时测定细胞内的细胞因子的表达来研究口服文冠果种壳提取物(NE)处理组对免疫应答的影响。
(6)ELISA检测脾细胞经培养后上清液中细胞因子的表达。
(7)从文冠果种壳提取物(NE)处理组或PBS组小鼠纯化的CD4+T细胞获得蛋白质样品，并通过免疫印迹分析关键信号分子。
(8)通过实时定量PCR对JAK/STAT信号列阵进行测定。
3、实验结果
(1)对于预防性治疗方案，与PBS处理的对照小鼠相比，从免疫前5天开始的文冠果种壳提取物(NE)施用导致发病延迟并显著降低疾病严重程度(P＜0.01，图2)。
文冠果种壳提取物(NE)除了减少临床症状外，还可以防止体重下降(图2)。
通过测试不同的剂量，发现100mg/kg/d的文冠果种壳提取物(NE)是抑制临床EAE的最佳剂量，因此该剂量用于随后的所有体内实验。
(2)对于治疗方案，与PBS对照组小鼠相比，在第11天或第16天口服文冠果种壳提取物(NE)的小鼠发病较轻，(最大EAE评分，2.1±0.52)(图3)，并且伴随累积评分降低。此外，文冠果种壳提取物(NE)对临床EAE高峰期(第16天)治疗也能有效降低疾病严重程度并抑制EAE进展(图3)。这些发现表明文冠果种壳提取物(NE)对EAE具有显着的治疗效果。
(3)脊髓的组织学分析显示，正常小鼠、PBS对照组与文冠果种壳提取物(NE)治疗组相比，文冠果种壳提取物(NE)组的炎症减轻(P＝0.006)，脱髓鞘程度也明显降低(P＝0.035)(图4)。
(4)文冠果种壳提取物(NE)处理的小鼠与对照组相比在CNS中MNC数量明显减少(P＝0.0069，图5)。
(5)Real-Time PCR结果(如图6)发现文冠果种壳提取物(NE)治疗组显着降低了几种促炎因子的表达，如Il17a，Csf2(GM-CSF)和TNF-α等，而诱导一些抗炎因子或营养因子如Il10和Lif的表达。其中最大程度被抑制的是Th17细胞产生的必需细胞因子，IL-17家族。
(6)通过流式细胞技术，文冠果种壳提取物(NE)处理导致CNS和脾脏中CD4+和CD8+T细胞的百分比和绝对数量显著降低(P＜0.05)。与PBS处理的对照组相比，文冠果种壳提取物(NE)处理组的MOG反应性CD4+IFN-γ+Th1(脾脏，P＝0.0008；CNS，P＝0.0006)和CD4+IL-17+Th17(脾脏，P＝0.0005；CNS，P＝0.0003)脾细胞和中枢神经系统细胞显着减少(图7和图8)
(7)ELISA结果表明文冠果种壳提取物(NE)通过抑制Th1和Th17细胞发育来抑制EAE，并且可能通过诱导免疫调节细胞因子(图9)。
(8)通过免疫印迹分析JAK/STAT途径的关键信号分子。在NE处理的小鼠中，与Th1和Th17细胞分化密切相关的STAT1和STAT3的磷酸化水平显着降低(图10)
(9)通过实时定量PCR对JAK/STAT信号传导通路阵列(QIAGEN Inc)进行测定。在所有受NE处理影响的基因中，有5个显著上调，25个显著下调(p＜0.05)(图11)这些结果表明，文冠果种壳提取物(NE)直接抑制了EAE小鼠外周淋巴器官中的JAK/STAT信号通路和Th1和Th17标记细胞因子的表达，从而减轻了EAE小鼠的疾病症状。

Claims (8)

1.一种文冠果种壳提取物的制备方法，其特征在于，将文冠果种壳先进行甲醇水溶液萃取提取，再加入盐酸进行酸化并过滤，最后用乙酸乙酯萃取，减压下蒸发得到文冠果种壳提取物，硅烷化衍生后，经GC-MS测定组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％，和邻羟基肉桂酸，占8.29％；
所述的方法依次按如下步骤制备：
（1）取文冠果种壳，粉碎，干燥，得到粉末；
（2）取所述粉末，石油醚脱脂，用体积百分比为70%的甲醇水溶液进行提取，得到提取液，所述的甲醇水溶液内每升含有1.0g的BHT；
（3）取所述提取液，加入6M的HCl并搅拌，得到混合物；
（4）用磁力搅拌器将混合物在35℃加热16小时，待溶液冷却，然后过滤；
（5）用乙酸乙酯萃取混合物，得到乙酸乙酯提取物；
（6）取乙酸乙酯提取物，并在旋转蒸发器上在35℃减压下蒸发至干，取所述有机相，得到文冠果种壳提取物，溶解于吡啶溶液后，用TMCS和BSTFA在80℃加热45分钟进行硅烷化衍生，再经GC-MS测定衍生物的组成及含量，该文冠果种壳提取物中有20种酚类化合物，占文冠果种壳提取物的84.62％，主要酚类化合物为咖啡酸，占20.05％，对羟基苯乙酸，占9.32％，对香豆酸，占8.84％和邻羟基肉桂酸，占8.29％；
所述的GC-MS成分测定衍生物的方法是：
（1）取文冠果种壳提取物10μg溶解在100μl新鲜蒸馏的吡啶中；
（2）取上述吡啶溶液10μL，加入三甲基氯硅烷（TMCS）和N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）的混合物，在密闭管中涡旋混合，得到混合物；
（3）取上述混合物放置在80℃的水浴中45分钟，得到甲硅烷基化的衍生混合物，取1μL衍生混合物用GC-MS分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述粉末与所述体积百分比为70%的甲醇水溶液的配比为：1重量份粉末：8-15重量份甲醇水溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述提取液与加入6M的HCl溶液的体积配比为1：4。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述提取液用10ml乙酸乙酯萃取混合物，且萃取三次，合并得到提取液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三甲基氯硅烷（TMCS）由于对水分具有高敏感性，因此在制备和衍生过程中应确保无水条件。
6.权利要求1至5其中之一所述方法制备的文冠果种壳提取物。
7.权利要求6所述的文冠果种壳提取物在制备治疗和/或预防多发性硬化药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的治疗和/或预防多发性硬化药物是治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
文冠果化学成分预试与综合利用的研究;朱丹等;《国土与自然资源研究》;19971231(第1期);第70页，表1 *
文冠果神经酸;马宏福;《http://blog.sina.com.cn/s/blog_1300739260102y2p9.html》;20170221;第1页，第1部分 *
文冠果种皮的化学成分研究;李在留等;《时珍国医国药》;20071231;第18卷(第6期);第1330页，左栏第5-12行 *

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