KR20070008230A - 향나무 추출물 또는 세드롤을 포함하는 비만 및 제2형당뇨병 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 향나무(Juniperus chinensis) 추출물 또는 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase, DGAT) 저해 활성을 가지는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 비만 및 제2형 당뇨병에 대한 예방 및 치료 효과를 가진다.

향나무(Juniperus chinensis), 세드롤(cedrol), 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase :DGAT), 비만, 제2형 당뇨병

Description

향나무 추출물 또는 세드롤을 포함하는 비만 및 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 조성물{Composition for the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes comprising a Juniperus chinensis extract or cedrol}

도 1은 마우스를 이용한 화학식 1의 화합물을 반복하여 경구투여 시 비만억제 효과를 살펴본 결과이다.

도 2는 화학식 1의 화합물이 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 가짐을 살펴본 결과이다.

본 발명은 향나무(Juniperus chinensis) 추출물 또는 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase, DGAT) 저해 활성을 가지는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 조성물은 비만 및 제2형 당뇨병에 대한 예방 및 치료 효과를 가지는 조성물에 관한 것이다.

아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(Acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, 이하 DGAT 약칭함)는 글리세롤 3-포스페이트(Glycerol 3-phosphate) 경로의 마지막 과정을 촉매하는 효소로서, 1,2-디아실글리세롤(sn-1,2-diacylglycerol)과 지방 아실코에이(Fatty acyl CoA)를 기질로 사용하여 중성지방을 합성하는 역할을 한다. 중성지방의 생합성은 글리세롤 3-포스페이트 경로(간과 지방조직 등)와 모노아실글리세롤 경로 (소장의 장 상피세포)를 통해 이루어진다.

최근에는 간, 지방조직, 골격근 등에서의 중성지방 생합성 과정을 촉매하는 효소인 DGAT의 선택적 저해는 비만과 제2형당뇨의 예방 및 치료에 효과적인 것으로 부상되고 있으며(Chen HC, et al., Trends Cardiovasc . Med ., 10, p.188-192, 2000; Farese Jr. et al., Curr. Opin . Lipidol., 11, p.229-234, 2000, A. Subauste et. al., Currunt Drug Target-Immun, Endocrine & Metabol Disorders 3, p.263-270, 2003, Y. Yu et. al. Anals of Medicine 36. p.252-261, Hubert C. et al., Arterioscler . Thromb . Vasc . Biol. 25, p.1-5, 2005 ), 미국 글래드스톤 심장질환연구소의 Robert V. Farese Jr 박사 팀은 DGAT 유전자를 knock-out시킨 마우스를 이용한 연구를 통해 고지방식이에 의해 유도된 체중증가(diet-induced obesity)가 효과적으로 억제되었고 인슐린과 렙틴(leptin)에 대한 감수성이 증대되어 당대사가 개선된다는 증거를 밝힘으로써 선택적인 DGAT 저해물질이 비만과 제2형 당뇨의 치료에 유용하다는 사실이 밝혀졌다(Smith SJ. et al.,Nature genetics, 25, 87-90, 2000).

현재까지 DGAT 효소저해제의 합성품으로는 피롤카복실릭 에시드 유도체(JP05213985A, Mitsubishi Kasei Corp, Japan)과 포스포닉에시드 에스터 유도체(JP2004067635A, Otsuka Pharmaceut Factory INC, Japan)가 알려져 있으며, 천연물의 경우 DGAT 효소저해제를 개발하는 연구는 본 연구팀 (한국생명공학연구원, 지질대사연구실)이 처음으로 시작하여 인삼으로부터 비만억제활성을 갖는 신규물질을 찾아내어 보고한 바 있으며(대한민국 특허 출원번호 2001-75636, Lee et al. Planta Med. 70, p.179-200, 2004), 생약자원인 오수유, 단삼, 고삼으로부터 분리한 퀴놀론 알칼로이드(Quinolone alkaloid), 탄시논계(tanshinones), 플라보노이드계(Prenylflavonoids) 물질을 보고한 바 있다(대한민국 특허출원 제2002-64744, Ko et al. Arch. Phar. Res. 25, p.446-448, 2002, 대한민국 특허출원 제2003-00524). 국외의 경우, 일본의 기타사토 연구소의 오무라(Omura) 그룹에서 보고한 저해제로 로셀리핀[Gliocladium roseum KF-1040, IC₅₀; 15-22 μM, US6432682(2002), US6608185(2003)], 코클리오퀴논 에이와 에이원[cochlioquinone A and A1, L. Antibiot. 56, 967(2003), 57, 59(2004)], 아미뎁신[Humicola sp. FO-2942, IC₅₀; 10-50 μM] 및 크산토후몰[Humulus lupulus, IC₅₀; 50-194 μM,], 그 외 에이코사펜타에노익산, 2-브로모옥타노에이트 등이 보고되어 있다( Rustan et al.; J. Lipid. Res., 29, p.1417-1426, 1988).

상기에서 살펴본 기존의 DGAT 효소 저해제 외에도, 우수한 DGAT 저해 활성을 가지는 물질을 천연물로부터 획득하고자 하는 연구의 일환으로, 본 발명자들은 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제를 저해하는 활성물질을 탐색하는 과정에서 향나무의 추출물과 이로부터 분리된 세스퀴터페노이드계 화합물인 세드롤이 DGAT에 대한 우수한 저해 활성이 가지는 것을 확인하고, 상기 향나무 추출물 및 세드롤이 비만 및 제2형 당뇨병의 예방 및 치료에 사용될 수 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 향나무 추출물을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 갖는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 갖는 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 향나무 추출물을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 갖는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미하며, 여기서는 향나무로부터 분리된 물질로 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 가진다. 추출물은 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합용매 를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.

본 발명에서 용어, “향나무(Juniperus chinensis)"란 천연, 잡종 또는 변종 향나무의 모든 기관, 예를 들어, 뿌리, 가지, 줄기, 잎, 꽃을 모두 포함하여 의미하나, 바람직하게는 향나무의 목부이다. 한편, 향나무는 측백나무과 (Cypressaceae)에 속하는 교목으로 관상용, 약용으로 쓰이고 관상수 및 조각재, 가구재, 향료를 제조하며 민간에서는 잎과 열매를 이뇨, 통경약으로 쓴다.(김태정, 한국의 자원식물, 1 권, pp64, 1996, 서울대학교 출판부, 서울). 일본 특허 JP63150208호에는 향나무 등의 측백나무 속에 속하는 나무 추출물을 포함하는 조성물을 이용하여 여드름, 비듬 등을 억제하는 피부외용제로 사용하는 발명에 대하여 기술되어 있다. 일본 특허 출원 JP200154120호에는 동백나무(camellia), 소나무(pine), 향나무 등의 잎, 쌀 추출물을 포함하는 육모 조성물에 대하여 기술되어 있다. 일본 특허 출원 JP63150208호에는 향나무 등의 측백나무 속에 속하는 나무의 잎이나 가지 추출물을 포함하는 구강 조성물에 대하여 기재되어 있다. 그러나, 본 발명 이전에 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제에 대한 향나무 추출물의 저해활성을 살펴본 바는 없었다.

본 발명에서 용어, “아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase: DGAT) 저해”란 DGAT가 중성지방을 합성하는 효소 촉매 반응을 차단 또는 합성 효율을 감소시키는 것을 의미하고, 상기 효소 활성을 저해시킬 경우, 세포 내에서 다양한 반응이 유도될 수 있다. DGAT 효소 활 성을 저해시킴으로써 유도되는 반응 중의 구체적인 예가 비만 억제와 인슐린 민간성의 억제를 통한 제2형 당뇨병의 예방 및 치료 효과이다.

트리글리세라이드 합성에 관여하는 최종 단계의 효소인 DGAT를 저해하여 중성지방의 생합성을 억제할 경우, 지방조직 내의 지방의 축적이 억제되고 지방세포의 크기가 감소되고 지방세포로부터 에디포낵틴의 분비가 촉진, 운동량의 증가, 고지방식이에 의해 유도된 체중 증가가 억제된다는 사실이 밝혀짐으로써, 비만치료제로의 타겟으로 연구되어 왔다. 또한, DGAT 저해는 근육, 간, 췌장 등의 비지방조직(non-adipoise tissue)에 지방의 축적을 막아줌으로써 인슐린 저항성을 개선시키는 것으로 알려졌다. 세포가 인슐린에 의해 자극받으면 IRS-1(insulin receptor substance-1)의 세린 억제적 인산화(inhibitory phosphorylation)가 감소되면서, PI-3K(phosphatidylinositol-3 kinase), PKB(protein kinase B), PKC_λ(protein kinase C_λ) 등을 거치는 신호전달을 통하여 GLUT-4(glucose transporter-4)가 막으로 엑소사이토시스 되어 포도당이 세포내로 유입되게 된다. 세포내에서 DGAT의 활성이 저해될 경우, PI-3K, PKB 및 PKC_λ의 활성이 증가하게 되면서 막으로 엑소사이토시스되는 GLUT-4 수가 증가하게 되면서, 최종적으로 세포내로 유입되는 포도당의 수가 증가된다. 즉, DGAT의 활성 억제는 인슐린 민감성을 증가시킨다. (Chen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25(3):482-486, 2005; Chen et al., J Clin Invest. 111(11):1715-22, 2003; Chen et al., J Clin Invest. 109(8):1049-1055, 2002; Chen et al., Diabetes. 51(11):3189-3195, 2002; Subauste and burant., Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 3(4):263-270, 2003). DGAT 저해와 인슐린 저항성 극복의 직접적인 관련성이 밝혀지면서, DGAT 저해가 인슐린 분비량은 정상이나 인슐린 저항성을 가지게 되면서 포도당 흡수가 장애를 받는 제2형 당뇨병의 치료 타겟으로 작용하는 것을 알 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시에서, 향나무의 메탄올 추출물은 최종농도 125ug/ml에서DGAT의 활성을 77.7% 억제시키고, 메탄올 추출물의 노말헥산 분획은 83.1% 억제시켰다. 상기 결과는 본 발명의 향나무 추출물이 우수한 DGAT 저해 활성을 가지며, 나아가 비만과 제2형 당뇨병 치료 활성을 가진다는 것을 입증하는 것이다.

따라서, 바람직한 양태로서 본 발명은 비만과 제2형 당뇨병에 대한 예방 및 치료 활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, “비만(obesity)"은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 본 발명의 조성물을 투여함으로써, 몸무게를 감량할 수 있고 혈중내 콜레스테롤, 중성지방, 혈중저밀도지단백(LDL)-콜레스테롤 등의 함량이 감소된다.

본 발명에서 용어, “제2형 당뇨병(Type 2 diabetes)”이란 포도당의 생성 및 이용에서의 대사 장애로 인하여 몸의 적절한 혈당 수준 유지가 실패되어 고혈당(hyperglycemia)이 유발되는 상태 또는 질환을 의미한다. 당뇨는 발병 원인에 따라, 포도당 이용을 조절하는 인슐린 결핍이 그 원인인 제1형 당뇨병과, 인슐린 수준은 정상이나 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 않기 때문에 발병되는 제2형 당뇨병으로 구분된다. 본 발명의 목적상, 당뇨병은 인슐린 저항성을 가지는 제2형 당뇨병에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 투여함으로써, 당뇨병에 의해 유발되는 증상(symptom) 또는 합병증(complication)을 예방 및 치료할 수 있다. 향나무 추출물로 예방 및 치료할 수 있는 당뇨병 증상에는 조갈증(polydipsia), 다식증(polyphagia), 고인슐린혈증(hypeinsulinemia), 과혈당증(hyperglycemia) 등을 포함하고, 합병증에는 고혈압, 신장병, 시력장애, 치주질환, 신경장애, 혈관장애, 당뇨병성 괴저, 신근경색 등을 포함한다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 비만 및 제2형 당뇨병 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여로 비만 및 제2형 당뇨병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 향나무 추출물은 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 유기 용매를 사용하여 추출한다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 노말헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.

또한, 상기 추출물은 추가의 분획 공정을 수행할 수 있다. 바람직하게는 상기 추출물을 증류수에 현탁시켜 비극성 유기 용매, 예를 들어, 노말헥산, 에테로, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득하도록 하고, 이를 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 본 발명의 향나무 추출물은 건조된 향나무를 세절하여 중량(kg)의 3배 내지 50배, 바람직하게는 5배 내지 25배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올 용매로; 20 내지 70℃, 바람직하게는 20 내지 30℃의 추출 온도에서; 1시간 내지 10일, 바람직하게는 3일 내지 8일간; 냉침, 초음파 추출 또는 환류 냉각 추출 방법으로; 1회 내지 5회, 바람 직하게는 1회 내지 3회 추출하여 수득한 추출액을 여과, 감압 및 농축함으로써 수득하였다. 또한, 상기 추출물을 증류수에 현탁시킨 다음, 노말헥산으로 1회 내지 5회 추출한 뒤 감압 농축하여 DGAT 저해 활성이 높은 노말헥산 분획을 수득하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 기재되는 세드롤(cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 갖는 조성물에 관한 것이다.

본 발명자는 향나무 추출물에서, DGAT 저해활성을 나타내는 유효 성분을 밝히고자

향나무 비극성용매 가용 추출물을 흡착크로마토그래피를 수행하여 분획한 후, 겔필트레이션 크로마토그래피를 수행하여 얻은 화합물을 자외선 분광광도 스펙트럼, 전자충격 질량 분석, 수소 핵자기 공명스펙트럼, 탄소 핵자기 공명스펙트럼 등의 분석을 수행하였다. 그 결과, DGAT 활성을 가지는 유효성분이 화학식 1의 세스 퀴터페노이계 화합물인 세드롤임을 알 수 있었으며, 기 발표된 문헌[D. O. Collins et al. Phytochemistry. 56, 417-421, 2001]의 데이터와 일치하였다. 세드롤은 항균작용, 진정작용, 혈소판에서의 12(S)-HETE생성 저해, IL-4 생성저해등 다양한 활성이 알려져 있으나(D. Kagawa et al, Planta Med. 69, 637-641, 2003; I. Schneider et al. Planta Med. 70, 471-474, 2004, Iwase et al. US 2003/0129266 A1), 본 발명 이전에 세드롤의 DGAT 저해활성에 대하여 밝혀진 바는 없다.

본 발명의 구체적인 실시에서, 순수 분리된 세드롤은 농도가 증가할수록 DGAT 저해 활성이 높았으며, 125㎍/㎖의 농도로 처리할 경우, DGAT 활성을 85.2%, 41.6ug/ml의 농도에서 77.5% 수준으로 억제시켰으며, 50%의 저해활성을 나나내는 농도인 IC₅₀은 11.7 ㎍/㎖로 나타났다. 상기 결과는 세드롤이 우수한 DGAT 저해 활성을 가지며, 비만 및 제2형 당뇨병 치료활성을 가진다는 것을 입증하는 것이다.

따라서, 바람직한 양태로서 본 발명은 비만 및 제2형 당뇨병에 대한 예방 또는 치료 활성을 가지는 세드롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 “약제학적으로 허용가능한 염”이란 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산, 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 의미한다. 적합산 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포 함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예들 들어, 나트륨, 알칼리토금속, 예들 들어, 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.

화학식 1의 세드롤은 천연물질, 바람직하게는 식물로부터 분리할 수 있다. 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃뿐만 아니라 식물 조직 배양물을 추출하여 분리가능하다. 또한, 당 분야의 공지된 방법으로 화학적 합성이 가능하다.

식물로부터 세드롤을 수득하는 방법은 공지의 다양한 추출방법에 의한다. 예를 들어, 식물을 분쇄한 뒤 저급 알코올 용매, 예를 들어, 메탄올, 에탄올 등으로 추출한 다음, 이를 증류수에 현탁시켜 비극성 유기 용매, 예를 들어, 노말헥산, 에테로, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 얻은 비극성 유기 용매 분획으로부터 화학식 1의 세드롤을 수득할 수 있다. 추출물을 1회 이상의 크로마토그래피를 수행함으로써 더욱 정제할 수 있고, 이 때 칼럼의 종류와 전개 용매는 다양하게 조절될 수 있다(Harborne J. B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Ed. pp 6-7, 1998).

하나의 구체적 실시에서, 본 발명자는 향나무의 목부를 메탄올로 추출하고 1 내지 100배, 바람직하게는 1 내지 5배 부피의 노말헥산으로 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 추출하여 얻은 노말헥산 분획을 실리카겔 컬럼크로마토그래피와 같은 흡착크로마토그래피, 겔 필트레이션 크로마토그래피 등을 순차적으로 수행하여 순수한 세드롤을 분리하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 향나무 추출물 또는 화학식 1의 세드롤은 우수한 DGAT 저해 활성을 가지므로, 비만 및 제2형 당뇨병에 대한 우수한 예방 및 치료 활성을 가짐을 알 수 있다. 상기의 향나무 추출물 및 화학식 1의 세드롤은 천연 추출물로부터 획득한 성분을 유효 성분으로 함유하므로 안전하고 독성, 부작용 및 내성을 초래하지 않으므로 장기간의 복용이 가능하다는 장점을 가진다. 실제, 마우스 급성 실험결과, 독성을 유발하지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 조성물은 인간뿐만 아니라 비만 및 타입2 당뇨병이 발생될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 가축에게 사용될 수 있다.

본 발명의 비만 및 제2형 당뇨 질환 예방 및 치료용 약학조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 또한, 상기 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나 약재 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가성분을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비타민B₁, B₂, B₆, C, E, 니아신, 카르니친, 베타인, 엽산 판토텐산, 비오틴, 아연, 철, 칼슘, 크롬, 마그네슘, 이들의 혼합물 등의 무기, 유기 첨가물들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단독 사용하거나 기존 사용되어진 당뇨병에 대한 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물을 제제화 할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제한다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가 만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 향나무 추출물 또는 화학식 1의 세드롤을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하여 비만 및 제2형 당뇨병을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "환자"는 비만 및 제2형 당뇨병 및 이의 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가지고, 본 발명의 조성물을 투여에 의하여 증상이 호전될 수 있는 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 본 발명의 향나무 추출물 또는 화학식 1의 세드롤을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써, 상기에서 언급한 비만 및 제2형 당뇨병을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물을 기존의 비만 및 당뇨병 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성병, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물의 투여방법은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하고, 일반적으로 그 유효용량은 경구투여인 경우에는 보통 성인을 기준으로 1회에 1 내지 500 ㎎/㎏이 바람직하며, 정맥투여인 경우에는 1 내지 100 ㎎/㎏이 바람직하다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 . 분석기기

본 발명에서 사용된 자외선 분광광도 스펙트럼(UV) 기기는 시마주 UV-260 스펙트로포토미터 (Shimadzu UV-260 spectrophotometer,Shimadzu사)를 사용하였으며, 수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H-NMR) 기기는 배리안 유니티 300 NMR (Varian UNITY 300 NMR, Varian사)을 사용하였으며, 전자충격 질량분석기(EI-MS)는 휴렛팩커드 5989A (Hewlettpackard 5989A, Hewlettpackard사)을 사용하여 조사하였다.

실시예 1. 향나무 메탄올 조추출물의 제조

대전 약제상에서 구입한 향나무의 목부 5 ㎏을 세절하여 메탄올 100 ℓ에 침지시킨 후 실온에서 7일간 방치하여 추출액을 수득하고, 다시 50ℓ의 메탄올을 가하여 1회 더 추출하였고, 상기 각 추출액을 여과한 후, 여과액을 혼합하였다. 상기 메탄올 추출물을 감압, 농축 및 건조하여 총 추출물 320g을 수득하였다.

실시예 2. 향나무 노말헥산 가용추출물의 제조

상기 총 추출물 320g을 2ℓ의 메탄올에 현탁시킨 다음, 노말헥산 10ℓ를 가하여 3회 추출하였으며, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성이 높은 노말헥산 분획을 수득하였다. 상기 수득한 노말헥산 분획을 감압, 농축하여 노말헥산 가용부 150g을 수득하였다.

실시예 3. 향나무 노말헥산 가용추출물로부터 화학식 1( 세드롤 )의 분리

상기 실시예 2의 노말헥산 가용부 150g을 750g의 실리카겔 (230-400 mesh, Art. 9385, Merck사)에 흡착시킨 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10× 80㎝)를 수 행하였다. 이때 전개용매로서 노말헥산 : 에틸아세테이트 혼합액 (50 : 1)을 초기 용매로 하여 에틸아세테이트의 양을 증가시켜 노말헥산 : 에틸아세테이트 혼합액(1 : 1)까지 극성을 올리면서, 시간당 500㎖로 수행하여 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성 물질을 용출시켜 8개의 분획으로 나누었다. 이 분획들의 효소저해활성을 측정하여 저해활성이 높은 4번 분획을 모았다. 모은 분획을 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20)컬럼을 크로로포름:메탄올(1:1)로 실시하여 세드롤 약 20g을 얻었다.

실시예 4. 화학식 1 로 표시되는 화합물( 세드롤 )의 이화학적 특성

향나무로부터 분리한 화학식 1 화합물의 이화학적 특성은 다음과 같다.

화학식 1의 화합물

(1)물질의 성상: 백색 분말상

(2)물질의 분자식과 분자량: C₁₅H₂₆O, 222

(3)자외선 분광광도 스펙트럼[λ_max(㎚) MeOH]: 210

(4)전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 221[M-H]⁺

(5)수소 핵자기 공명스펙트럼[500MHz, 클로로포름, δ(ppm)]: 0.848 (d, J=7.2 Hz), 1.004 (s), 1.266 (s), 1.32 (s), 1.36, 1.53 (m), 1.368 (m), 1.430 (m), 1.58 (m), 1.655 (m), 1.693 (m), 1.8 (m), 1.873 (m)

(6)탄소 핵자기 공명스펙트럼[125MHz, 클로로포름, δ(ppm)]: 15.58 (q, C- 12), 25.36(t, C-4), 27.64 (q, C-13), 28.92 (q, C-14), 30.18(q, C- 15), 31.6 (t, C-10), 35.38 (t, C- 9), 37.01 (t, C-3), 41.48 (d, C-2), 41.98 (t, C-11), 43.4 (s, C-6), 54.1 (s, C-1), 56.53 (d, C-7), 61.05 (d, C-5), 75.13 (s, C-8)

실시예 5. 아실 코에이 : 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 활성 검정

5-1. DGAT 의 활성 측정

본 발명자들은 DGAT의 활성을 측정하기 위해 콜만 등의 방법(Coleman et al, Methods Enzymol., pp98-103, 1992)에 따라 랫트에서 분리한 마이크로좀 단백질을 효소원으로 사용하고, 기질로서 1, 2-디아실글리세롤(Sigma사, D0138)과 [¹⁴C]팔미토일-코에이(Amersham사, CFA583)를 사용하여 효소 반응 후 생성된 [¹⁴C]트리아실글리세롤의 방사능의 양을 측정하였다. 구체적으로, 반응액(175 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 ㎕의 소의 혈청 알부민(10 ㎎/㎖), 100mM의 MgCl₂, 30μM의 [¹⁴C]팔미토일 코에이(0.02 μCi, Amersham사) 및 200 μM 1,2-디올레오일 글리세롤)에 메탄올 또는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 시료액 10.0 ㎕을 가하고, 분리한 마이크로좀 단백질을 100 내지 200 ㎍을 넣은 다음 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 1.5 ㎖의 반응 종결액 (2-프로판올 / 헵탄 / 물 = 80 / 20 / 2, v/v/v) 을 가하여 반응을 정지시켰다. 상기 반응으로 생성된 [¹⁴C]트리아실글리세롤을 분리하기 위하여 1 ㎖의 헵탄 및 0.5 ㎖의 증류수를 가하여 진탕한 후 상등액 1 ㎖을 취하고 여기에 2 ㎖의 알칼리성 에탄올 용액(에탄올 / 0.5 N 수산화 나트륨 / 물 = 50 / 10 / 40, v/v/v)을 가하여 진탕하였다. 상기 진탕액의 상층액 0.65 ㎖을 취하여 LSC (liquid scintillation counter)로 방사능의 양을 측정하고 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제의 저해활성은 하기 수학식 1로 계산하였다.

T : 효소반응액에 시료를 넣은 시험구의 cpm 값,

C : 효소반응액에 시료를 넣지 않은 대조구의 cpm 값 및

B : 효소원을 넣지 않고 시료를 넣은 대조구의 cpm 값.

5-2. 향나무의 추출물과 화학식 1의 DGAT 저해활성 측정

상기 5-1의 DGAT 활성 측정 방법에 따라 실시예 1의 향나무의 메탄올 추출물 및 실시예 2의 노말헥산 분획을 각각 125㎍/㎖의 농도로 첨가하여 DGAT 효소 저해 활성을 측정하였고, 그 결과는 표 1에 나타난 바와 같다.

메탄올 추출물의 용매분획 결과 DGAT 효소저해 활성물질은 노말헥산 분획으로 이행되었음을 알 수 있다.

이 분획으로부터 활성물질을 분리, 정제하기 위해 컬럼 크로마토그래피를 수행하였고, DGAT 저해제로 분리, 정제된 활성물질인 화학식 1의 화합물을 첨가하여 DGAT 효소저해 활성 및 IC₅₀을 측정하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

실시예 6. 화학식 1의 마우스를 이용한 반복 경구투여시의 비만 억제효과 검증

설치류 랫트를 이용한 세드롤(화학식 1) 시료의 반복 경구투여 시 비만억제 효과를 검증하였다. 사용한 동물은 ICR계 마우스로서 5주령의 동물을 (주)오리엔트 (Charles liver)에서 입수하여 1주간 순화시킨 후 사용하였다. 사용 동물의 성은 수컷으로 대조군 6마리, 시험군(용량군) 6마리를 사용하였으며, 대조군에는 비히클(vehicle)로 사용된 5% 트윈 80 (Tween80)을, 시험군에는 5% 트윈 80에 녹인 세드롤 (화학식 1)을 25 ㎎/㎏로 하여 경구로 매일 오후 4시, 하루에 한번 씩 투여하여 28일간 실험하였다. 매주 체중을 측정하고 28일째 되는 날 실험동물을 희생하여 심장으로부터 혈액을 채취하였으며, 부고환 지방을 적출하여 지방의 무게를 측정하였다. 혈액중의 총중성지방(total triglyceride), 총콜레스테롤(total cholesterol)), 혈중고밀도지단백(HDL)-콜레스테롤을 각각의 측정용 kit를 사용하여 측정하였고, 측정용 kit는 (주) 아산제약에서 구입하여 사용하였다. 대조약물로 제니칼(xenical)을 10mg/kg로 매일 경구투여하였다.

본 시험은 온도 23 ± 3 ℃, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간 (오전 6시-오후 6시), 환기횟수 10-20회/시간. 및 조도 150-300 룩스(Lux)로 설정된 실험동물실에서 사육하였다. 사료는 (주) 중앙실험동물에서 구입한 고지방식이를 하루에 마리당 8g씩 공급하였다.

세드롤 (화학식 1) 시료의 비만억제활성을 검증하기 위한 목적으로 ICR계 수컷 마우스를 이용하여 25㎎/㎏로 반복 경구투여 하였다. 시험결과 체중의 경우, 세드롤 (화학식 1) 시료 25 ㎎/㎏ 용량군에서 최종일 결과를 보면 대조군에 비해 43.3%의 체중감소가 관찰되었다 (표 3). 또한 세드롤 (화학식 1)의 반복경구투여에 의한 혈중 내 총콜레스테롤의 함량과 총중성지방의 함량은 각각 16.7%와 13.1% 감소되었으며, 반면에 혈중고밀도지단백(HDL)-콜레스테롤의 함량은 58.58%로 현저한 증가가 관찰되었다. 또한 부고환의 지방무게는 23.86%의 감소율이 관찰되었고 이러한 변화는 표 4에 나타나 있다.

실시예 7. 급성 독성 시험

마우스(20±5 g, 중앙실험동물)와 래트(235±10 g, 중앙실험동물)를 사용하여 향나무 추출물 및 화합물의 급성독성 시험을 실시하였다. ICR계 마우스와 스프라그-도올리 래트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 향나무 추출물 및 화합물을 각각 100, 250 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 향나무 추출물과 그 유효성분인 세스퀴터페노이드계 화합물인 세드롤은 아실코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제를 저해하여 비만, 제2형 당뇨의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (6)

1. 향나무 추출물을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 가지는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 비만 또는 제2형 당뇨병에 대한 예방 또는 치료 활성을 가지는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출한 조성물.
4. 제3항에 있어서, 메탄올 및 노말헥산을 이용하여 추출한 조성물.
5. 화학식 1로 기재되는 세드롤(Cedrol) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 가지는 조성물.

   화학식 1

   
6. 제5항에 있어서, 비만 또는 제2형 당뇨병에 대한 예방 또는 치료 활성을 가지는 조성물.

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