KR20140098057A - 지치 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지치 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 지치 추출물, 지치의 헥산 추출물 또는 시코닌계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지치 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 시코닌계 화합물은 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 및 유방암 등 각종 암 세포의 세포증식 억제 효과를 가지며, 세포 주기 억류 효과 및 세포 사멸 인자의 발현 촉진 효과를 가짐으로써 종래 항암제에 비해 우수한 항암 활성을 가지며, 또한 천연 유래의 성분으로서 부작용이 없고 체내 안정한 특징이 있다. 따라서 본 발명에 따른 지치 헥산 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 시코닌계 화합물은 각종 암의 예방 및 치료를 위한 항암제의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

지치 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising Lithospermum erythrorhizon extract}

본 발명은 지치 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 선진국의 주된 사망 원인이고, 개발도상국에서는 2번째 사망 원인이다(WHO 2008년). 암 증가의 문제로 인해, 최근 몇 년 동안 암에 대한 연구가 크게 증가하였다. 많은 천연 제품 및 식이 제품이 효과적인 화학적 암 예방제로 평가되고 있으며 (Sharma 등, 1994), 민간요법에서 사용되는 약초 요법은 신규 약물을 개발하는데 있어서 흥미로운 미지의 공급원을 제공하고 있다.

지치 (Lithospermum erythrorhizon)(LE)는 아시아 민간요법에서 피부 발진, 여드름, 습진, 홍역, 궤양, 화상, 수두, 간염 및 변비 치료를 위해 오랫동안 사용되어 왔다.

예컨대, 대한민국 특허출원 10-2011-44235호에는 지치 추출물을 유효성분으로 하는 흡연독성 해독용 식품조성물이 기재되어 있고, 대한민국 특허출원 10-2011-44173호에는 지치 추출물을 유효성분으로 하는 비만개선용 약제학적 조성물이 기재되어 있으며, 대한민국 특허출원 10-2011-44045호에는 지치 추출물을 유효성분으로 하는 지방간 개선용 식품조성물이 기재되어 있다.

또한, 지치 뿌리에 포함된 시코닌 성분은 강한 상처 치유 및 항균 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

그러나, 지치와 관련하여 암을 예방하거나 치료하는 효과에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.

한편, 세포자멸은 정상 발달, 숙주 방어기전 및 발암 억제에 있어 중요한 세포 사멸의 필수적, 보존적 방식이다. 세포자멸은 발암성 또는 바이러스-감염된 세포를 제거하고, 비정상적인 세포자멸은 종양 발달 및 진행의 주요 원인이다(Han 등, 1995). 암 발달은 세포를 세포자멸로 감작시키는 발암유전자 활성에 대한 세포 증식 완화를 비롯한 여러 주요 현상과 관련되어 있다. 세포자멸은 많은 요인에 의해 일어나고, 이들 요인의 변형 및 세포자멸의 증가가 항암 약물의 필수 기능이다.

흑색종은 피부암의 가장 공격적인 형태이다. 최근의 약학적인 발전에도 불구하고, 전이성 흑색종에 걸린 환자에게 화학요법을 실시한 결과는 아직 만족스럽지 못한데, 이는 전이성 세포가 비교적 강한 약물 내성을 갖기 때문이다.

마찬가지로, 지난 수 십 년동안 소화암 발병이 크게 증가하였다. 예를 들어, 결장암은 서구사회의 두번째 암 사망 원인이고, 세계적으로 가장 흔한 악성종양의 하나이다.

상기 암을 비롯하여 위암, 간암 또는 유방암의 예방 또는 치료와 관련하여 지치 추출물의 효능에 대하여 보고된 바가 없다.

본 발명에서는 결장암, 흑색종, 위암, 간암 또는 유방암 등 각종 암에 대해 항암 효과가 우수하면서도 부작용이 거의 없는 항암제를 천연물로부터 발굴하기 위해 연구하던 중, 헥산을 사용하여 수득한 지치 추출물이 결장암, 흑색종, 위암, 간암 또는 유방암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 지치(Lithospermum erythrorhizon) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 지치의 헥산 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시코닌계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

그러므로 본 발명은 지치(Lithospermum erythrorhizon) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 또는 유방암일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지치 추출물은 지치의 뿌리를 헥산을 이용하여 추출한 지치 뿌리의 헥산 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 헥산 추출물은 시코닌계 화합물을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 지치의 헥산 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 또는 유방암일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지치의 헥산 추출물은 시코닌계 화합물을 함유할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지치의 헥산 추출물은 시코닌계 화합물을 55 중량％ 이상으로 함유할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지치의 헥산 추출물은 암 세포의 세포 증식을 50％로 억제시킬 수 있는 농도인 IC₅₀이 0.22∼2.88 ug/mL일 수 있다.

또한, 본 발명은 시코닌계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시코닌계 화합물은 시코닌, 디옥시시코닌, 아세틸시코닌, β-하이드록시아이소발레릴시코닌 및 아이소부틸시코닌으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 또는 유방암일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시코닌의 IC₅₀은 0.85∼4.62 ug/mL이고, 상기 디옥시시코닌의 IC₅₀은 0.13∼6.0 ug/mL이고, 상기 아세틸시코닌의 IC₅₀은 0.08∼3.2 ug/mL이고, 상기 β-하이드록시아이소발레릴시코닌의 IC₅₀은 0.52∼4.81 ug/mL일 수 있다.

본 발명은 지치 추출물, 지치의 헥산 추출물 또는 시코닌계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지치 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 시코닌계 화합물은 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 및 유방암 등 각종 암 세포의 세포증식 억제 효과를 가지며, 세포 주기 억류 효과 및 세포 사멸 인자의 발현 촉진 효과를 가짐으로써 종래 항암제에 비해 우수한 항암 활성을 가지며, 또한 천연 유래의 성분으로서 부작용이 없고 체내 안정한 특징이 있다. 따라서 본 발명에 따른 지치 헥산 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 시코닌계 화합물은 각종 암의 예방 및 치료를 위한 항암제의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 AGS 세포, MCF 세포, HCT116 세포, HepG2 세포, B16F10 세포 및 육종-180 세포에 대한 본 발명의 지치 헥산 추출물의 암 세포 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 흑색종 암 세포주인 B16F10 세포를 대상으로 본 발명의 지치 헥산 추출물의 농도별 처리에 따른 세포 주기 별 DNA의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 흑색종 암 세포주인 B16F10 세포를 대상으로 본 발명의 지치 헥산 추출물의 농도별 처리에 따른 세포 주기 별 세포수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도4는 흑색종 암세포주인 B16F10 세포주를 대상으로 본 발명의 지치 헥산 추출물을 농도별로 처리한 후, 암 세포의 형태학적 변화를 현미경으로 관찰한 사진으로서, A는 대조군인 베히클 처리군, B는 0.5ug/ml의 추출물 처리군, C는 1ug/ml의 추출물 처리군, D는 2ug/ml의 추출물 처리군, E는 3ug/ml의 추출물 처리군, F는 4ug/ml의 추출물 처리군을 나타낸 것이다.
도 5는 흑색종 암세포주인 B16F10 세포주를 대상으로 본 발명의 지치 헥산 추출물을 농도별로 처리한 후 DAPI 염색을 통해 핵의 형태학적 변화를 현미경을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 흑색종 암세포주인 B16F10 세포주에 대한 본 발명의 지치 헥산 추출물 처리에 따른 Bcl-2 패밀리 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 흑색종 암세포주인 B16F10 세포주에 대한 본 발명의 지치 헥산 추출물 처리에 따른 카스파제 3, 6, 9의 발현 및 활성정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 지치 헥산 추출의 흑색종 종양 성장 억제 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 흑색종 종양을 유발시킨 마우스에 본 발명에 따른 지치 헥산 추출물을 농도별로 처리한 후, 고형 종양 조직의 성장 억제 정도를 육안으로 관찰한 사진을 나타낸 것이고(A), (B)는 A의 종양의 무게를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 흑색종 종양을 유발시킨 마우스에 본 발명에 따른 지치 헥산 추출물을 농도별로 처리한 후, 종양 조직을 헤마토크실렌 및 에오신으로 염색한 사진을 나타낸 것으로서, A:(정상구조)올리브 오일만을 투여한 군, B:(약간의 세포 사멸) 0.1mg의 지치 헥산 추출물 투여군, C:(다량의 세포 사멸) 1mg의 지치 헥산 추출물 투여군, D: 양성대조군으로 사이클로포스파미드를 처리한 군을 나타낸 것이다.
도 11은 HCT-116 암 종을 갖는 마우스의 종양 체적에 대한 지치 헥산 추출물의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 HCT-116 암 종을 갖는 마우스의 종양 질량에 대한 JCH 효과를 나타낸 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 지치 뿌리의 추출물로부터 수득한 정제 화합물 (A) 및 지치 뿌리의 헥산 추출물(B)의 전형적인 HPLC 크로마토그램으로, 여기서 S는 시코닌; DS는 디옥시시코닌; AS는 아세틸시코닌; HIS는 β-하이드록시아이소발레릴시코닌; IBS는 아이소부틸시코닌을 의미하고, 획득 파장(Acquisition wavelength)은 215nm이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

본 발명은 각종 암에 대해 우수한 효과를 가지면서 체내 부작용이 없는 항암제로 지치 추출물을 사용할 수 있음을 규명하였다는 점에 특징이 있다.

따라서 본 발명은 지치(Lithospermum erythrorhizon) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

상기 지치는 앞서 종래기술에서도 언급했던 바와 같이, 여드름, 습진, 홍역, 궤양, 화상, 수두, 간염 및 변비 치료에 효과가 있음이 이미 알려져 있지만 항암 효과가 있다는 내용에 대해서는 본 발명에서 처음으로 규명하였다.

본 발명에 따른 상기 지치 추출물은 지치 자체, 또는 각 부위, 예컨대, 잎, 줄기 또는 뿌리 등을 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된'추출물'은 적절한 용매를 이용하여 지치로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 지치의 열수 추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.

지치 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 지치 뿌리를 헥산을 이용하여 추출물을 수득할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 지치 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 지치 추출물에 함유된 항암 활성을 갖는 주요 성분을 분리 및 정제하였는데, 상기 수득한 지치 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 활성 성분이 함유된 정제 분획을 얻을 수 있다.

따라서 본 발명에 있어서 지치 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

한편, 본 발명에서 제공하는 지치 추출물은 우수한 항암 활성을 갖는 특징이 있다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 지치 뿌리의 헥산 추출물을 위암, 간암, 결장암, 유방암, 흑색종암 및 육종암 세포주에 처리한 후, 세포 증식 억제 정도를 분석한 결과, 적은 농도의 지치 헥산 추출물에서도 암 세포의 세포 증식이 현저하게 억제되는 것으로 나타났으며, 각 암 세포주에 대해 세포 증식을 50％로 저해하는 IC₅₀ 값이 0.22, 0.39, 1.19, 1.21, 1.50 및 2.88 ㎕/mL으로 나타났고 특히 위암과 간암에서 매우 우수한 항암활성을 보였다(도 1 참조).

나아가 본 발명자들은 본 발명의 지치의 헥산 추출물이 갖는 항암활성이 어떠한 기작을 통해 나타나는지 확인하기 위해 일실시예에서 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 흑색종암 세포주에 본 발명의 추출물을 농도별로 처리한 후, 유세포 분석기를 통해 세포 주기 진행 정도를 분석하였는데, 그 결과, 본 발명의 추출물을 처리한 경우, 처리하지 않은 군에 비해 sub G1기를 억류하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 각 세포 주기별(sub G1, G1, S, G2/M) 세포수 측정 결과에서도 동일하게 나타났다(표 5, 도 2 및 도 3 참조).

또한, 다른 일실시예에서는 흑색종암 세포주에 본 발명의 추출물을 농도별로 처리한 후, 세포 형태 변화 및 핵 내의 DNA 변화를 현미경으로 관찰한 결과, 본 발명의 추출물 처리군이 처리하지 않은 군에 비해 세포 사멸이 유발되는 것으로 나타났고(도 4 참조), DAPI 염색 결과를 통해서도 추출물 처리군이 대조군에 비해 염색체가 응축되고 DNA 절편화가 나타나 종국에는 세포사멸(아팝토시스)이 일어나는 것으로 나타났다(도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 지치 헥산 추출물이 갖는 항암 활성에 대해 지치 헥산 추출물이 세포 주기를 조절하는 단백질의 조절과 세포 사멸 관련 단백질의 조절을 통해 나타나는 것인지를 분석하였는데, 먼저 웨스턴 분석 결과, 본 발명의 지치 헥산 추출물은 세포 사멸(아팝토시스)을 억제하는 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL, Bid의 발현은 감소시키는 것으로 나타났고, 반면 아팝토시스 유도 단백질들인 Bad 및 Bax 단백질의 발현은 증가시키는 것으로 나타났다(도 6 참조).

뿐만 아니라 세포 사멸을 유도하는 인자들인 카스파제의 활성 분석 결과, 본 발명의 지치 헥산 추출물이 카스파제 3, 8, 9을 활성화시켜 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다(도 7 참조).

즉 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 지치 헥산 추출물이 암 세포주 내에서 세포 사멸 유도 단백질의 발현은 증가시키고 세포 사멸 억제 단백질의 발현은 감소시켜 궁극적으로 암 세포의 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 지치 헥산 추출물이 실제적으로 종양의 증식과 크기를 억제하여 항종양 효과를 도출할 수 있는지 확인하기 위해, 흑색종 세포주를 마우스에 주입시켜 흑색종이 유발된 마우스 모델을 제작하고 본 발명의 지치 헥산 추출물을 상기 마우스에 주입시킨 후, 마우스로부터 종양 조직을 채취하여 종양의 크기 변화를 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 지치 헥산 추출물을 처리한 군의 경우, 종양 조직에서 세포가 괴사되는 것으로 나타났고 괴사 정도는 추출물의 농도에 비례하는 것으로 나타났으며, 종양 크기도 대조군(지치 헥산 추출물을 처리하지 않은 군)에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났다(도 8 내지 도 12 참조).

따라서 이러한 실험 결과들을 토대로 볼 때, 본 발명에 따른 지치 추출물, 바람직하게는 지치 헥산 추출물, 더욱 바람직하게는 지치 뿌리의 헥산 추출물은 암 세포의 세포 증식을 억제하고, 세포 주기를 조절(sub G1 억류)하며, 세포사멸 유도 인자의 발현 촉진을 통해 우수한 항암활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.

한편, 본 발명에서는 항암활성을 갖는 상기 지치 추출물로부터 시코닌계 화합물을 분리 및 동정하였다.

시코닌계 화합물은 상처 치유 및 항균 활성을 갖는다는 사실이 알려져 있으나, 항암 활성을 갖는다는 사실에 대해서는 본 발명에서 최초로 규명하였다.

즉, 본 발명의 지치 추출물로부터 분리 및 동정한 시코닌계 화합물은 시코닌, 디옥시시코닌, 아세틸시코닌, β-하이드록시아이소발레릴시코닌 및 아이소부틸시코닌이며, 이러한 화합물들은 모두 우수한 항암 활성을 갖는 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 시코닌계 화합물에 대해 항암 활성 여부를 조사하기 위해 위암, 간암, 결장암, 유방암, 흑색종암 및 육종암 세포주에 이들 화합물을 처리하고 암 세포 증식 억제 정도를 분석한 결과, 이들 암세포에 대해 항암 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 특히 시코닌 화합물의 IC₅₀은 0.85∼4.62 ug/mL이고, 상기 디옥시시코닌의 IC₅₀은 0.13∼6.0 ug/mL이고, 상기 아세틸시코닌의 IC₅₀은 0.08∼3.2 ug/mL이고, 상기 β-하이드록시아이소발레릴시코닌의 IC₅₀은 0.52∼4.81 ug/mL인 것으로 나타났다(표 4 참조).

그러므로 본 발명은 지치 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물과 지치의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 시코닌계 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 조성물에 함유된 유효성분인 시코닌계 화합물은 하기 화학식으로 표시되는 화합물 일 수 있고, 하기 화학식의 R에 위치하는 치환기에 따라 하기 5가지의 화합물을 가질 수 있다.

＜시코닌계 화합물 구조식＞

또한, 본 발명에 따른 상기 화합물은 바람직하게 약학적으로 허용 가능한 염의 형태를 포함할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 지치 추출물, 지치의 헥산 분획물에는 시코닌계 화합물이 함유되어 있는 특징이 있는데, 특히 상기 지치 헥산 분획물에는 시코닌계 화합물을 55 중량％ 이상으로 함유하고 있으며, 지치 헥산 분획물은 암 세포의 세포 증식을 50％로 억제시킬 수 있는 농도인 IC₅₀이 0.22∼2.88 ug/mL인 특징이 있다.

특히 본 발명의 일실시예에서, 지치 헥산 분획물에 함유된 시코닌계 화합물, 즉, 시코닌, 디옥시시코닌, 아세틸시코닌, β-하이드록시아이소발레릴시코닌 및 아이소부틸시코닌을 정량 분석한 결과, 표 3에 기재된 바와 같이 시코닌은 1.85 ±0.06(％), 디옥시시코닌은 3.82 ±0.05(％), 아세틸시코닌은 23.34 ±0.41(％), β-하이드록시아이소발레릴시코닌은 15.07 ±0.51(％), 아이소부틸시코닌은 18.62 ±0.36(％)으로 함유되어 있는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 토대로 볼 때 본 발명의 시코닌계 화합물은 지치 헥산 분획물에 55％(중량％) 이상으로 함유되어 있는 특징이 있으며, 바람직하게는 60∼65％(중량％)으로 함유되어 있을 수 있다.

한편 본 발명에 따른 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 지치 추출물, 지치의 헥산 분획물 또는 시코닌계 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 지치 추출물, 지치의 헥산 분획물 또는 시코닌계 화합물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ∼ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ∼ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 암 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제,감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 암 증상의 예방 및 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 암 증상의 예방 및 치료용 조성물은 암의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 지치 추출물, 지치의 헥산 분획물 또는 시코닌계 화합물 을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 암 증상의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 지치 추출물, 지치의 헥산 분획물 또는 시코닌계 화합물에 예방 및 치료할 수 있는 암으로는 이에 제한되지는 않으나, 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 또는 유방암일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 구체적인 실시예를 들어 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 예시를 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것이 아님이 당업자에게 자명하다.

발명의 실시를 위한 형태

하기 본 발명의 실시예에서 사용한 세포주, 시약 및 동물은 하기와 같이 준비한 것을 사용하였다.

세포주 및 반응시약

소태아 혈청(FBS), RPMI-1640 및 항생제는 깁코(그랜드 아일랜드(Grand Island), 미국 뉴욕주 소재)에서 구입하여 사용하였고, 다이메틸 설페이트(DMSO), 3-(4, 5- 다이메틸티아졸-2)-2, 5-다이페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(MTT), 사이클로포스파미드는 시그마(미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입한 것을 사용하였다. 세포주로는 AGS-인간 위암 세포주, HepG2-간세포암, HCT-116-인간 결장암, MCF7-유방암 세포, B16F10-쥐 흑색종 세포 및 육종-180 세포를 대한민국 세포주은행(Korean Cell Line Bank, 대한민국 서울 소재)에서 입수하였고, 이들 암 세포주들은 10％ FBS, 항생제(100 U/ml 페니실린 G, 100 /ml 스트렙토마이신)로 보충된 RPMI-1640 배지를 사용하여, 5％ CO₂, 및 37℃ 및 습도가 유지되는 배양기에서 배양시킨 후 실험에 사용하였다.

동물준비

6 내지 7주령 된 C57 BL/6 암컷 마우스 (흑색종 실험용) 및 6 내지 7주령된 BALB/C 수컷 마우스 (HCT 116 인간 결장암 실험용)를 샘타코 (대한민국 경기도 오산시 소재)에서 입수하고, 폴리카보네이트 우리에 넣고 22 ± 2℃ 온도 및 50-60％ 습도에서 12시간 명암 주기 하의 실험 조건에 두었다. 펠릿형태의 표준 래트 사료를 공급하고, 실험내내 물을 자유로이 섭취하도록 하였다. 동물 실험은 대한민국에서의 동물 실험에 대한 통제 및 감독(CPCSEA: control and supervision of experiments on animals)을 위한 협회 지침에 따르는 부산대학교 동물 윤리 위원회에서 승인받았다.

＜실시예 1＞

지치 뿌리 추출물의 제조

지치는 2010년 11월에 금산의 생약재 상가로부터 건조하지 않은 뿌리를 구입하였다. 뿌리를 잘게 썰어서 동결건조기로 건조한 후 분말로 만든 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 메탄올을 이용하여 순차적으로 각 용매 추출물을 수득하였다. 보다 구체적으로 추출방법은 동결 건조한 지치뿌리 분말 1.5 kg을 5 L의 삼각 플라스크에 넣고, 헥산 4.5 L를 첨가하여 1시간 동안 초음파 처리한 후, 헥산 용매를 따로 모은 후, 남은 분말에 다시 헥산 4.5 L를 첨가하여 초음파 처리하는 위의 방법을 총 3회 반복 수행한 다음, 회수한 헥산 추출물을 회전증발기에서 증발시켜 지치 뿌리의 헥산 추출물 15.48 g을 수득하였다.

이후 헥산을 이용하여 추출하고 남은 지치 뿌리 분말에 4.5 L의 에틸아세테이트를 첨가하여 초음파로 3회 반복 추출하는 과정을 통해 6.96 g의 에틸아세테이트 추출물을 수득하였고, 에틸아세테이트로 추출하고 남은 지치의 뿌리 분말에 다시 4.5 L의 메탄올을 사용하여 초음차 처리를 통한 위의 방법을 3회 반복 수행하여 361.3 g의 메탄올 추출물을 수득하였다.

＜실시예 2＞

지치 뿌리 추출물로부터 시코닌계 화합물의 분리 및 정제

＜2-1＞ 시코닌계 화합물의 분리

상기 실시예 1에서 수득한 지치 뿌리의 헥산 추출물(30.0g)을 진공에서 증발시키고, 실리카 겔(40㎛; 베이커(Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그 소재)을 컬럼 (70 x 5.5 ㎝)에 충진시킨 후 헥산추출물을 컬럼 상단에 조심스럽게 첨가한 후 50％ 헥산이 함유된 CH₂Cl₂, CH₂Cl₂, 5％와 33％ 아세톤이 각각 함유된 CH₂Cl₂, 5％와 33％의 메탄올이 각각 함유된 CH₂Cl₂ 용매를 단계적 구배로 한 크로마토그래피를 수행하여 총 59개의 분획물을 수득하였고, 수득한 분획물 중에서 제16 분획물로부터 디옥시시코닌을 정제 및 수득하였다(22.4mg).

또한, 상기 수득한 59개의 분획물 중 33번째 분획물(816.4mg)은 다시 실리카 겔 컬럼(70 x 3.0cm)크로마토그래피를 수행하였는데, 즉, 컬럼 상단에 33번째 분획물을 첨가한 후 1％ 아세톤이 함유된 CH₂Cl₂을 사용하여 8개의 분획물을 수득하였고, 상기 분획물(158.2mg)을 세파덱스 컬럼(78 x 3.0 cm, 시그마-알드리츠(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에 로딩하고 메탄올 용매를 이용하여 이소부틸시코닌(126.8mg) 화합물을 수득하였다.

또한, 상기 수득한 59개의 분획물 중 34번째 분획물(1,044mg)을 세파덱스 컬럼 (78 x 3.0cm) 상단에 첨가한 후 메탄올로 분리하여서 10개 분획물을 수득하였고, 상기 분획물(147.6mg)을 다시 세파덱스 컬럼 (100 x 3.0 cm) 상단에 첨가한 후 메탄올로 분리하여 아세틸시코닌(36.6mg) 화합물을 수득하였다.

또한, 상기 수득한 59개의 분획물 중 47번째 분획물(1,735 mg)은 실리카 겔 컬럼 (100 x 3.5 cm) 상단에 첨가한 후 5％ 아세톤이 함유된 CH₂Cl₂을 사용하여 13개의 분획물을 수득하였고, 상기 분획물(21.2mg)을 다시 세파덱스 컬럼 (78 x 3.0 cm) 상단에 첨가한 후 5％ 아세톤이 함유된 CH₂Cl₂을 사용하여 시코닌(6.4mg) 화합물을 수득하였다.

또한, 상기 수득한 13개의 분획물 중 다시 8번째로 수득한 분획물(507.1mg)을 세파덱스 컬럼 (78 x 3.0cm) 상단에 첨가한 후 메탄올로 분리하여 β-하이드록시아이소발레릴시코닌(256.5 mg) 화합물을 수득하였다.

＜2-2＞ 시코닌계 화합물의 동정

상기 ＜2-1＞에서 분리한 각 화합물을 분광분석법을 사용하여 다음과 같이 동정하였다.

Varian 분광기(미국, 팔로 알토 소재)를 500 MHz에서 분리된 순수물질을 CDCl₃에 용해한 후 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 연구를 실시하고, chemical shift 값 (δ)를 표준물질 (TMS) 신호에 대해 ppm 단위로 기록하였다. 전자 이온화 모드 (70eV)로 작동되며 메틸 실리콘 (methyl silicone) 컬럼 (30 x 0.25mm, 필름 두께 0.25㎛)이 장착된 Varian-Chrompack CP-3380 분광기 (미국 캘리포니아주)를 이용하고 운반 기체로서 He를 사용하여 (1ml min^-1) 1㎕를 주입하여 정제 화합물의 GC-MS 프로파일을 기록하였다. 주입기 및 MS 운반 라인 온도를 각각 280℃ 및 290℃로 설정하였다. 오븐 온도를 10℃ min^-1로 50℃ (2분)부터 300℃ (25분)까지 프로그래밍하였으며, 분리한 각 화합물은 다음과 같이 동정되었다.

(1) 시코닌

적자색 고형물. GC-MS (m/z) : 288 [M⁺]; 분자식 C₁₆H₁₆O₅; ¹H-NMR (in CDCl₃) δ : 1.66 (3H, s, H-6), 1.76 (3H, s, H-5), 2.39 (1H, m, H-2), 2.63 (1H, m, H-2), 4.92 (1H, m, H-1), 5.21 (1H, m, H- 3), 7.16 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-6 or H-7), 7.19 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-6 or H-7), 7.26 (1H, s, H-3), 12.49 (1H, s, OH-5), 12.59 (1H, s, OH-8). ¹³C-NMR (in CDCl₃) δ : 18.08 (C-6'), 25.96 (C-5'), 35.64 (C-2'), 68.30 (C-1'), 111.51 (C-10), 111.99 (C-9), 118.41 (C-3'), 131.84 (C-3), 132.27 (C-7), 132.37 (C-6), 137.47 (C-4'), 151.42 (C-2), 164.82 (C-8), 165.42 (C-5), 179.84 (C-4). 180.65 (C-1). ¹H-NMR와 ¹³C-NMR는 문헌 [Albreht et al., 2009; Ito et al., 2011] 자료와 일치하였다.

(2) 디옥시시코닌

적자색 고형물. GC-MS (m/z) : 272 [M⁺]; 분자식 C₁₆H₁₆O₄; ¹H-NMR (in CDCl₃) δ : 1.60 (3H, s, H-6), 1.70 (3H, s, H-5), 2.30 (1H, m, H-2), 2.63 (1H, m, H-2), 5.14 (1H, t, H- 3), 7.26 (1H, s, H-3), 7.21 (2H, s, H-6 and H-7), 12.49 (1H, s, OH-5), 12.65 (1H, s, OH-8). ¹³C-NMR (in CDCl₃) δ : 17.79 (C-6'), 25.69 (C-5'), 26.44 (C-2'), 29.64 (C-1'), 111.63 (C-9), 111.85 (C-10), 122.26 (C-3'), 130.73 (C-6), 131.03 (C-7), 133.64 (C-4'), 134.54 (C-3), 151.47 (C-2), 161.87 (C-5), 162.53 (C-8), 183.29 (C-4), 183.29 (C-1). ¹H-NMR와 ¹³C-NMR는 문헌[Papageorgiou, 1979] 자료와 일치하였다.

(3) β-하이드록시아이소발레릴시코닌

적자색 고형물. GC-MS (m/z) : 388 [M⁺]; 분자식 C₂₁H₂₄O₇; ¹H-NMR (in CDCl₃) δ : 1.29 (3H, s, H-4"), 1.29 (3H, s, H-5"), 1.58 (3H, s, H-6), 1.689 (3H, s, H-5), 2.49 (1H, dd, J=15.0/7.5, H-2), 2.58 (2H, d, J=1.0, H-2"), 2.60 (1H, dd, J = 6.0/3.0, H-2), 5.11 (1H, t, H-3), 6.08 (1H, m, H-1), 7.01 (1H, s, H-3), 7.12 (1H, s, H-6), 7.15 (1H, s, H-7), 12.37 (1H, s, OH-5), 12.56 (1H, s, OH-8). ¹³C-NMR (in CDCl₃) δ : 18.18 (C-6'), 25.98 (C-5'), 29.34 (C-4"), 29.48 (C-5"), 33.14 (C-2'), 46.73 (C-2"), 69.34 (C-3"), 69.98 (C-1'), 111.79 (C-9), 117.91 (C-3'), 112.04 (C-10), 131.56 (C-3), 133.29 (C-6), 133.50 (C-7), 136.59 (C-4'), 147.73 (C-1), 168.23 (C-5), 168.77 (C-8), 171.84 (C-1"), 177.25 (C-4), 175.71 (C-1). ¹H-NMR와 ¹³C-NMR는 문헌[Albreht et al., 2009; Ito et al., 2011] 자료와 일치하였다.

(4) 아세틸시코닌

적자색 고형물. GC-MS (m/z) : 330 [M⁺]; 분자식 C₁₈H₁₈O₆; ¹H-NMR (in CDCl₃) d : 1.63 (3H, s, H-6), 1.69 (3H, s, H-5), 2.16 (3H, s, H-2"), 2.46 (1H, m, H-2), 2.60 (1H, m, H-2), 5.12 (1H, t, , H-3), 6.01 (1H, dd, J=7.2/4.5 Hz, H-1), 6.98 (1H, s, H-3), 7.179 (1H, s, H-6), 7.182 (1H, s, H-7), 12.43 (1H, s, OH-5), 12.59 (1H, s, OH-8). ¹³C-NMR (in CDCl₃) δ : 17.90 (C-6'), 20.95 (C-2"), 25.73 (C-5'), 32.76 (C-2'), 69.46 (C-1'), 111.49 (C-9), 111.75 (C-10), 117.62 (C-3'), 131.40 (C-3), 132.64 (C-6), 132.80 (C-7), 136.07 (C-4'), 148.16 (C-2), 166.81 (C-5), 167.34 (C-8), 169.74 (C-1"), 176.70 (C-1), 178.21 (C-4). ¹H-NMR와 ¹³C-NMR는 문헌[Albreht et al., 2009; Ito et al., 2011] 자료와 일치하였다.

(5) 아이소부티릴시코닌

적자색 고형물. GC-MS (m/z) : 358 [M⁺]; 분자식 C₂₀H₂₂O₆, ¹H-NMR (in CDCl₃) δ : 1.11 (3H, d, J = 3.0 Hz, H-3"), 1.15 (3H, d, J = 3.3 Hz, H-4"), 1.51 (3H, s, H-6), 1.62 (3H, s, H-5), 2.47 (1H, m, H-2), 2.63 (1H, m, H-2), 2.64 (1H, m, H-2"), 5.05 (1H, t, H-3), 5.94 (1H, dd, J = 6.9/4.5 Hz, H-1), 6.90 (1H, s, H-3), 7.12 (2H, s, H-6 and H-7), 12.37 (1H, s, OH-5), 12.52 (1H, s, OH-8). ¹³C-NMR (in CDCl₃) δ : 17.88 (C-6'), 18.86 (C-3"), 18.87 (C-4"), 25.68 (C-5'), 32.87 (C-2'), 33.95 (C-2"), 68.92 (C-1'), 111.44 (C-9), 111.70 (C-10), 117.74 (C-3'), 131.26 (C-3), 132.50 (C-6), 132.67(C-7), 135.85 (C-4'), 148.47 (C-2), 166.55 (C-5), 167.09 (C-8), 175.66 (C-1"), 176.86 (C-4), 178.36 (C-1). ¹H-NMR와 ¹³C-NMR는 문헌 [Albreht et al., 2009; Ito et al., 2011] 자료와 일치하였다.

＜2-3＞ HPLC 분석을 통한 시코닌계 화합물의 동정

정제 화합물의 순도 검증 및 지치 헥산 추출물로부터 순수 분리한 시코닌 유도체 화합물들의 함량을 비교하기 위해서 HPLC 분석을 실시하였다. 진공 디개서 (vacuum degasser), 2원 (binary) 펌프, 오토샘플러, 온도조절 컬럼 구획 및 DAD (애질런트, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로 이루어진 애질런트 (Agilent)/HP 1100 시리즈 HPLC-DAD 시스템을 정량 분석 및 UV 스펙트럼 입수에 사용하였다. 시료 추출에는 JAC 초음파 추출기 4020P (고도 주식회사, 대한민국 화성 소재)를 이용하였다. 크로마토그래피 분석을 위해, 루나(Luna) C18 컬럼 (150mm x 3.0mm ID 5 ㎛)을 메탄올-아세토니트릴 구배로 1.0mL/분 유속으로 사용하였다. 지치로부터 분리된 각각의 시코닌 유도체의 표준 용액을 헥산으로 희석하여서 순차 농축액을 제공하였다. 표준용액은 0.45 ㎛ 필터에 여과시킨 후에, 각 농축액 20㎕을 HPLC 컬럼에 주입하여서 분석하였다. 농도에 대해 피크 면적비를 선형 회귀직선식을 구한 후에 보정 그래프를 표시하였으며, 결과를 각 조건에 대한 평균치 ± SD로 제공하고, Student-Newman-Keuls 시험에 의해 통계적으로 분석하였다. 통계적으로 유의한 차이는 P＜0.05로 간주되었다.

이상과 같이 본 발명에서 분리 및 동정한 상기 5개의 각 화합물에 대한 화학구조식은 표 1과 아래 도시된 바와 같으며, 각 화합물의 HLPC 크로마토그래피 분리 결과는 도 13에 나타낸 바와 같다.

또한, 상기 본 발명에 따른 지치뿌리의 헥산 추출물로부터 시코닌계 화합물(시코닌 유도체; 일명 '나프토퀴논')의 후속 정량화를 위해 회귀 방정식을 사용하였는데, 상관계수는 0.99900 내지 0.99987 범위를 갖는 것으로 밝혀졌다(하기 표 2 참조). 지치 헥산 추출물은 일반적으로 다수 유형의 나프토퀴논을 풍부하게 함유하고 있는 것으로 확인되었으며, 특히 5종의 시코닌 유도체(나프토퀴논) 중에서, 아세틸시코닌, 아이소부틸시코닌 및 β-하이드록시아이소발레릴시코닌이 각각 23.24 ± 0.41％, 18.62 ± 0.36％ 및 15.07 ± 0.51으로 지치 추출물의 주요 구성성분임을 확인할 수 있었다(표 3 참조). 이러한 결과는 지치의 헥산 추출물이 유용 생리활성을 갖는 주요 화합물을 대량 함유하고 있어 기능성 약품, 식품 및 화장품을 제조하는 산업에 있어서 특히 지치의 헥산 추출물이 주요하며, 따라서 이의 대규모 생산을 위한 기술 개발에 주력할 필요가 있음을 시사한다.

＜실시예 3＞

지치 헥산 추출물 및 시코닌계 화합물의 암세포에 대한 세포 독성분석

다양한 암 세포주에 대한 세포 독성을 조사하기 위해 MTT 분석을 수행하였다(Luo 등, 2008). 즉, 앞서 기술한 각종 암 세포주를 96 웰 플레이트에 1 x 10⁴ 세포/웰 밀도로 씨딩(seeding)하고, 24시간 동안 37℃와 5％ CO₂로 배양한 다음, 상기 암 세포주에 지치 뿌리의 헥산 추출물을 각 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 테트라졸륨 염료인 3-(4,5-다이메틸티아졸-2)-2,5-다이페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 (MTT, 시그마, PBS중 2mg/mL) 50㎕을 첨가한 후에, 각 암세포주들을 37℃에서 4시간동안 배양하였고, 형성된 포르마잔 침전물을 DMSO에 용해시키고, 각 웰의 흡광도 (A)를 Epoch 마이크로플레이트 리더 (BioTek instruments, 미국 버몬트주 위누스키 하이랜드파크 소재)로 540nm 에서 측정하였다. 또한 처리한 추출물의 각 농도에 대해 3회 반복(triplicate) 실험을 실시하고, 그 결과를 평균치 ± SD로 제공하였으며, 세포 억제율은 하기 수식 1로 계산하였다:

여기서 IC₅₀ 은 세포 증식의 50％를 억제시키는 농도이며, 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 프로그램로 계산하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 지치 뿌리의 헥산 추출물은 처리 농도에 비례하게 암세포의 증식을 유의하게 억제하는 것으로 나타났는데, 특히 AGS, HepG2, HCT-116, MCF7, B16F10 및 육종(Sarcoma)-180과 같은 상이한 암 세포에 있어서 각각 0.22, 0.39, 1.19, 1.21, 1.50 및 2.88 ㎕/mL의 IC₅₀ 값을 갖는 것으로 나타났으며, 흥미롭게도 AGS 및 Hep G2 세포는 낮은 농도의 추출물 처리에 의해서도 암 세포의 증식이 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 0.06 내지 10 ㎍/mL 농도의 지치 헥산 추출물로 여러 종류의 암 세포를 24시간 처리하였더니 시험관내 실험에서 모든 암 세포의 세포 증식이 약 4 내지 99％ 억제되는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명자들은 각종 암 세포의 증식 억제 효과가 지치 뿌리의 헥산 추출물로부터 분리 및 정제된 화합물인 디옥시시코닌 (JCKH16), 아세틸시코닌 (JCKH36), β-하이드록시아이소발레릴시코닌 (JCKH48) 및 시코닌 (JCKH47IHPD) 화합물에 대해서도 조사하였는데, 즉 상기 MTT 분석 방법에서 지치 뿌리의 헥산 추출물 대신 각 화합물을 처리한 것을 제외하고는 동일하게 실험하였고 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

분석 결과, 지치 뿌리의 헥산 추출물은 모든 시험된 암 세포에 대한 IC₅₀ 값이 0.22 내지 2.88㎍/mL 인 것으로 나타났고, 아세틸시코닌 (JCKH36), 시코닌 (JCKH47IHPD), β-하이드록시아이소발레릴시코닌 (JCKH48) 및 디옥시시코닌 (JCKH16)의 암 세포에 대한 IC₅₀ 값은 각각 0.08 내지 3.20, 0.85 내지 4.62, 0.52 내지 4.81 및 0.13 내지 6.0 범위를 나타냄으로써 이들 화합물 역시 우수한 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.

＜실시예 4＞

암 세포주의 세포 주기 진행 억제에 따른 항암활성 분석

상기 실시예 3을 통해 본 발명에 따른 지치의 헥산 추출물 및 상기 추출물로부터 분리 및 정제된 시코닌계 화합물이 각종 암에 대해 항암활성을 갖는다는 사실을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 이러한 항암활성이 구체적으로 암 세포의 세포 주기 억제 기작을 통해 이뤄지는지를 조사하기 위해 유세포 분석기를 통한 세포 주기 변화를 조사하였다. 즉, 이를 위해, 흑색종 암 세포주인 B16F10 세포를 6 웰 플레이트에 웰당 5 x 10⁵ 세포 밀도로 분주하고, 밤새 부착되도록 하였다. 이후 배지를 지치의 헥산 추출물이 각 농도별(0 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL, 1 ㎍/mL, 2 ㎍/mL, 3 ㎍/mL및 4 ㎍/mL)로 함유된 새로운 배지로 교체하였고, 이때 대조군으로는 DMSO를 함유하는 배지(즉, 0 ㎍/mL 추출물이 함유된 배지)로 교체하였다. 이후 37℃, 5％ CO₂에서 24시간 배양한 후, 세포를 수거하고, 차가운 PBS로 2회 세척한 다음, 4℃에서 75％ 에탄올로 30분 동안 고정하고, PI와 함께 DNA 염색 키트 (CycleTest Plus kit, Becton- Dickinson, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)를 이용하여 DNA를 염색하였다. 이어서, sub-G1, G1, S 및 G2/M 기에서의 DNA 함량을 유세포 분석기(FACS Calibur, Becton-Dickinson)를 사용하여 결정하고, Cell Quest 소프트웨어에 의해 분석하였다.

그 결과, 상기 표 5 및 도 2와 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 지치의 헥산 추출물 처리에 의해 암세포의 세포 주기 중 Sub G1 기가 억류되는 것으로 나타났으며, 추출물의 처리 농도에 비례하여 Sub G1기의 세포수가 다른 세포기에 비해 축적되어 있는 것으로 나타났는데, 특히 4㎍/mL의 지치 헥산 추출물 처리시 sub G1 기의 세포 비율은 전체 세포의 39.49％로 나타났고, 이때 대조군은 1.78％인 것으로 나타났다(p＜0.01).

이에 수반하여, G1, S 및 G2/M 기의 세포수는 유의하게 감소하는 것으로 나타났는데, 즉, G1, S 및 G2/M 기의 세포 비율은 각각 42.39％, 28.14％ 및 23.48％로 감소한데 반해, 대조군에서는 74.58％, 13.08％ 및 12.35％로 감소하였다(p＜0.001). 이러한 결과는 본 발명의 지치의 헥산 추출물이 암 세포의 sub G1 세포 주기를 억류시켜 암 세포의 세포사멸을 유도시켜 항암 효과를 도출한다는 것을 알 수 있었다.

＜실시예 5＞

지치 헥산 추출물의 암 세포주에 대한 형태학적 변화 및 세포사멸에 미치는 영향 분석

흑색종 암세포주인 B16F10 세포주를 대상으로 본 발명의 지치 뿌리의 헥산 추출물이 상기 암 세포주의 형태학적 변화 및 세포사멸에 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저 형태학적 변화 분석을 위해, 1 x 10⁵ /well의 세포수로 B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 농도별 지치 뿌리의 헥산 추출물을 각 웰에 24시간 동안 처리하였다. 이후 PBS를 사용하여 세포를 세척한 후, 70％ 에탄올로 15분 동안 고정시키고 이후 다시 PBS를 사용하여 세포를 세척하였다. 이후 DAPI(1ug/ml)로 15분 동안 염색하고 PBS로 세척한 후, AE31 인버티드 형광 현미경(Motic instruments, Richmond, Canada)를 사용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 지치 헥산 추출물을 처리하지 않은 대조군의 경우 정상 세포와 같이 잘 증식하는 것으로 나타난 반면, 지치 헥산 추출물을 처리한 군의 경우 부착된 세포들의 수가 감소하는 것으로 나타났고, 부착 세포수의 감소는 처리한 추출물의 농도에 비례하는 것으로 나타났다. 특히 1ug/ml의 농도로 추출물이 처리된 경우 세포의 모양은 둥근 형태로 형태가 변화된 것으로 나타났고 이러한 세포들은 결국 세포 사멸을 초래하는 것으로 나타났다. 또한, 2,3,4 ug/ml의 추출물을 처리한 경우 핵이 응축되고 세포막이 분해되어 있는 것으로 나타났으며 이러한 현상은 추출물의 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다.

뿐만 아니라, 도 5에 나타낸 바와 같이, DAPI의 염색 결과 1 또는 2ug/ml의 추출물을 처리한 군의 경우 핵 내에서 응축된 크로마틴의 형태가 관찰되었으며, 3 또는 4ug/ml의 추출물을 처리한 군에서는 크로마틴의 응축과 함께 DNA의 절편화가 관찰되었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 지치 헥산 추출물이 암세포주에 대해 핵의 응축과 DNA의 절편화를 통해 세포 아톱포시스를 유도하는 기작으로 항암활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.

＜실시예 6＞

지치 헥산 추출물의 세포주기 조절 단백질 발현에 미치는 영향 분석

＜6-1＞ 웨스턴 블롯을 통한 확인

앞서 수행한 실시예를 통해 본 발명에 따른 지치 헥산 추출물은 암 세포주의 세포 주기를 조절하고 암 세포 사멸을 유도하여 암 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 구체적으로 본 발명의 추출물이 세포 주기를 조절하는 단백질의 발현 조절을 통해 세포 주기 및 세포 증식을 조절하는 것인지를 조사하였다. 이를 위해 흑색종 세포주인 B16F10 세포를 1 x 10⁶ /well의 세포수가 되도록 배양한 후, 농도별로 지치 헥산 추출물을 세포에 처리하고 24시간 뒤에 죽은 세포와 살아있는 세포를 모아 PBS로 세포를 세척한 후, 세포 추출물로부터 Qproteome 포유류 단백질 제조 키트(퀴아젠, 독일)를 사용하여 단백질을 수득하였다. 이후 총 단백질을 2D Quant 키트(아머샴 바이오사이언스, UK)를 사용하여 정량화 하였다. 이후 30ug protein/sample의 양을 13％ SDS-PAGE로 전기영동 한 후, PVDF로 단백질들을 이동시키고 이후 상기 PVDF를 5％ 스킴 밀크로 블록킹 시켰다. 이후 T-TBS 용액으로 세척하고 멤브레인을 rabbit anti-mouse primary antibodies, 즉, Bcl-2 family 단백질들인 Bcl-2, Bcl-xL, Bid, Bad 및 Bax에 대한 항체, 카스파제 단백질인 pro-caspase 3, pro-caspase 8 및 pro-caspase 9에 대한 항체, poly (ADP-

ribose) polymerase (PARP) 및 internal standard β-actin에 대한 항체들을 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 이후 멤브레인을 상온에서 horseradish peroxidase가 접합된 goat anti-rabbit secondary 항체와 2시간 동안 반응시킨 후, ECL 웨스턴 블롯팅 키트를 통해 단백질의 발현 여부를 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 지치 헥산 추출물을 암세포주에 처리한 경우, 처리하지 않은 대조군에 비해 추출물의 처리 농도에 비례하여 항 아팝토시스(apoptosis) 단백질들인 Bcl-2, Bcl-xL, Bid의 발현은 감소되는 것으로 나타난 반면, 아팝토시스 유도 단백질들인 Bad 및 Bax 단백질의 발현은 증가한 것 으로 나타났다.

＜6-2＞ 카스파제 분석

세포의 아팝토시스를 유도하는 카스파제들의 발현 및 활성에 본 발명의 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 상기 ＜6-1＞에서 동일한 방법으로 지치 추출물이 처리된 흑색종 B16F10 세포주에 용해 버퍼(1％ Triton X-100, 0.32 M sucrose, 5 mM EDTA, 10mM Tris-HCl at pH 8.0, 2 mM dithiothreitol, 1 mM PMSF, 1 /ml aprotinin and 1 mg/ml leupeptin)로 30분 동안 4°C에서 세포를 용해시킨 후, 10,000 x g의 속도로 30분 동안 원심분리하였다. 카스파제의 활성을 측정하기 위해 50ul의 카스파제 특이적 반응 혼합액을 사용하였는데, 즉 caspase 3, 8 및 9에 대한 기질로 각각 DEVD-pNA, IETD-pNA, LEHD-pNA (200 )을 B16F10 세포 용해된 사이토졸릭 추출물(총 단백질 30ug)과 혼합한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 배양 후 추출물의 형광을 형광 플레이트 리더(BioTek instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 흥분 파장 400nm 및 방출 파장 505nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 지치 헥산 추출물은 카스파제를 활성화 시키는 것으로 나타났는데, 특히 도 7a를 보면 2∼4ug/ml의 지치 추출물을 처리한 경우, 카스파제 3,8,9가 활성화 되는 것으로 나타났고, 카스파제 3 의 기질인 PARP를 관찰한 결과 카스파제 3의 활성에 의해 PARP가 특이적으로 절단된 형태로 나타났으며, 프로카스파제 3은 분해되는 것으로 나타났다. 즉 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 지치 헥산 추출물이 카스파제 3을 활성화 시키고 따라서 이의 기질인 PARP 단백질을 분해시키며, 세포 주기 관련 단백질의 조절을 통해 Sub G1 세포 주기를 억류하여 궁극적으로 암 세포의 증식과 활성 억제를 통해 항암활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.

또한 도 7b의 결과에 의하면 카스파제 3, 8, 9의 활성화 정도는 본 발명의 지치 헥산 추출물의 농도에 비례하는 것으로 나타났다.

＜실시예 7＞

동질유전자( syngeneic ) C57BL /6 마우스에서 B16F10 흑색종 증식의 억제

생체 내 흑색종 증식에 대한 지치 헥산 추출물의 영향을 연구하기 위해서, B16F10 종양 세포를 동질유전자 C57BL/6 마우스에 피하 접종시켰다. B16F10 마우스 흑색종 세포를 트립신화에 의해 세포 배양물로부터 모으고, C57BL/6 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하 주사하였다 (1x10⁶ 세포). 종양 유도 24시간 후에, 마우스에 올리브 오일 비히클 (종양 대조군), 올리브 오일중 JCH 10mg/kg, PBS중 사이클로포스파미드 20mg/kg 및 올리브오일중 JCH 100/kg을 3일마다 복강내 주사하였다. 각 마우스 종양의 길이 (A) 및 너비 (B)를 7일째부터 3일마다 측정하였다. 종양 체적을 V= AB²/2에 의해 계산하였다. 처리 21일 후에, 동물을 죽이고, 종양을 해부하고, 즉시 칭량하였다. 억제율(％) = [(A-B)/A] × 100에 의해 종양 억제율을 계산하고, 여기서 A는 음성 대조군의 평균 종양 질량이고, B는 처리군의 평균 종양 질량 (Ref.)이다.

또한, 종양을 유도한지 수 주 후에 대조군, 지치 헥산 추출물 처리군 및 사이클로포스파미드 처리군의 종양 체적을 표 6 및 도 8, 9에 나타내었다.

도 8에서 알 수 있듯이, 지치 헥산 추출물 10mg/kg, 0.1mg/kg 및 사이클로포스파미드 20mg/kg을 처리한 각 군에서 43.39 ± 18.47 ％, 23.51 ± 11.32％ 및 19.54 ± 13.62％의 종양 증식 유의 억제율을 나타냈다.

또한, 도 9에 따르면, 지치 헥산 추출물 10mg/kg, 0.1mg/kg 및 사이클로포스파미드 20mg/kg을 처리한 각 군에서 모두 종량의 질량이 억제되는 것으로 나타났는데, 특히 양성 대조군인 사이클로포스파미를 처리한 군에 비해 본 발명의 지치 헥산 추출물을 처리한 군의 경우 더 효과적으로 종양의 크기가 감소되는 것으로 나타났고, 지치 헥산 추출물의 농도에 비례하여 종양 크기는 감소하는 것으로 나타났다.

＜실시예 8＞

종양 조직의 조직병리 분석

흑색종 종양 조직 시료를 10％ 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 포매시킨 후에 레이카 (Leica) 모델 RM2125 마이크로톰을 이용하여 4㎛ 절편을 준비하였다. 이어서, 헤마톡실린-에오진으로 절편을 염색하고, 현미경으로 검사하여서 종양의 조직병리학적 표현형, 분화의 형태와 정도 및 퇴행성 병변 존재여부를 평가하였다. 이때 본 실험에 사용한 상기 흑색종 종양 조직은 B16 F10 흑색종 세포주를 1 x 10⁶ 세포수로 C57BL/6 마우스의 우측 옆구리에 주사하였다. 종양 유도 24시간 후에 21일 동안 3일 간격으로 상이한 농도의 지치 헥산 추출물(0.1mg, 10mg)을 투여하였고, 양성 대조군 사이클로포스파미드 (20mg/kg) 및 음성 대조군으로는 올리브 오일을 투여하였다. 그리고 각 마우스의 종양 조직의 길이(A) 및 폭(B)을 3일마다 측정하였으며, 종양의 체적(V)은 AB²/2의 수식으로 계산하였다. 이후 각 시료의 투여가 끝나고 일정 시간이 경과한 후, 마우스들을 희생시킨 후 종양 조직을 분리하여 무게를 측정하였다. 또한, 이때 종양 억제 정도는 하기 수식을 사용하여 계산하였다.

종양 억제율(％)= [(A-B)/A]x 100

여기서 A는 음성 대조군의 종양 무게 평균을 나타내는 것이며, B는 각 처리군의 종양 무게의 평균을 나타내는 것이다.

분석 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 지치 추출물을 처리한 군의 경우 세포들이 괴사형태를 띄는 것으로 나타난 반면, 지치 추출물을 처리하지 않은 군의 경우 정상 구조를 갖는 생세포가 세포 조직에서 관찰되었다. 또한, 사이클로포스파미드 처리 조직 절편은 형태 변화만을 나타내었고 괴사 패턴은 매우 적게 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 지치 헥산 추출물은 암 조직의 세포괴사를 유도하는 것으로 확인되었다.

＜실시예 9＞

BALB /C 마우스에서 HCT -116 종양 증식에 대한 지치 헥산 추출물의 효과

마우스에서 HCT-116 인간 결장암에 대한 종양 증식에 있어서 JCH 영향을 연구하였다. HCT 116 종양을 유도하기 위해 6 x 10⁶ 세포를 BALB/C 마우스의 우측 옆구리에 주사하였다. 종양 유도 24시간 후에 10일 동안 1주일 간격으로 상이한 농도의 JCH (0.1mg, 1mg 및 10mg/kg b.w)를 2회 투약 마우스 처리하였다. 마찬가지로, 양성 대조군 사이클로포스파미드 (160 mg/kg) 및 올리브 오일 대조군 동물을 2주일동안 1주일 간격으로 i.p 투여하였다. 종양 체적을 3일마다 계산하고, 종양 억제율을 흑색종에서와 동일한 방법으로 계산하였다.

그 결과, 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 지치 추출물 10mg/kg, 1mg/kg, 0.1mg/kg 및 사이클로포스파미드 160mg/kg을 처리한 각 군에서 각각 50.27 ± 6.18 ％, 29.27 ± 7.44％, 10.50 ± 11.44％ 및 22.37 ± 5.3％의 유의한 종양 증식 억제율을 보였다.

또한, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 지치 헥산 추출물을 0.1, 1.0 및 10 mg/kg의 다양한 농도로 i.P 2회 투약 처리 후 종양 질량 역시 유의하게 감소한 것으로 나타났으며 억제율은 각각 39.59 ± 9.3％, 23.75 ± 6.40％ 및 11.75 ± 14.20 ％이었다. 반면, 사이클로포스파미드 처리 마우스에서는 종양 질량이 감소하지 않았다. 이와 대조적으로, 사이클로포스파미드 처리 마우스의 평균 종양 질량은 종양 대조군에 비해 증가한 것으로 나타났다. 아마도 이는 사이클로포스파미드의 면역억제 효과에 기인한 것으로 생각된다.

＜제조예 1＞

본 발명의 지치 헥산 추출물을 함유하는 정제의 제조

지치 헥산 추출물 10 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

Claims (13)

1. 지치(Lithospermum erythrorhizon) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 암은 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 지치 추출물은 지치의 뿌리를 헥산을 이용하여 추출한 지치 뿌리의 헥산 추출물인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 헥산 추출물은 시코닌계 화합물을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 지치의 헥산 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 암은 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 제4항에 있어서,
   상기 지치의 헥산 추출물은 시코닌계 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 지치의 헥산 추출물은 시코닌계 화합물을 55 중량％ 이상으로 함유하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 지치의 헥산 추출물은 암 세포의 세포 증식을 50％로 억제시킬 수 있는 농도인 IC₅₀이 0.22∼2.88 ug/mL인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
10. 시코닌계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    상기 시코닌계 화합물은 시코닌, 디옥시시코닌, 아세틸시코닌, β-하이드록시아이소발레릴시코닌 및 아이소부틸시코닌으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
12. 제10항에 있어서,
    상기 암은 결장암, 흑색종, 위암, 간암, 육종암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
13. 제11항에 있어서,
    상기 시코닌의 IC₅₀은 0.85∼4.62 ug/mL이고, 상기 디옥시시코닌의 IC₅₀은 0.13∼6.0 ug/mL이고, 상기 아세틸시코닌의 IC₅₀은 0.08∼3.2 ug/mL이고, 상기 β-하이드록시아이소발레릴시코닌의 IC₅₀은 0.52∼4.81 ug/mL인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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