KR100805745B1

KR100805745B1 - 비만 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100805745B1
Application number: KR1020060105070A
Authority: KR
Inventors: 이현선; 김영국; 노문철; 이승웅; 박혜란; 최정호; 강지윤; 이정원
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2008-02-21

Abstract

본 발명은 화학식 1 또는 2의 아마이드계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, DGAT) 저해 활성을 가지는 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 비만 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 조성물은 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, DGAT) 활성을 저해하여 에너지 대사와 당 대사를 개선함으로써 비만 또는 제2형 당뇨병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명은 또한 신규한 화학식 1의 화합물에 관한 것이다.

필발, 아마이드(amide), 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase :DGAT), 비만, 제2형 당뇨병

Description

비만 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물{A composition for preventing or treating obesity or type 2 diabetes}

도 1은 화학식 1 및 2의 화합물의 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 효소 활성 저해 효과를 농도별로 측정한 결과이다.

도 2는 화학식 1의 화합물의 수소핵자기공명 스펙트럼(CDCl₃, 500.13 MHz)을 나타낸 것이다.

도 3은 화학식 1의 화합물의 탄소 핵자기 공명스펙트럼(CDCl₃, 125.75 MHz)을 나타낸 것이다.

본 발명은 신규한 아마이드(amide) 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, DGAT) 저해 활성을 가지는 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 비만 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(Acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, 이하 DGAT 약칭함)는 글리세롤 3-포스페이트(Glycerol 3-phosphate) 경로의 마지막 과정을 촉매하는 효소로서, 1,2-디아실글리세롤(sn-1,2-diacylglycerol)과 페티아실코에이(Fatty acyl CoA)를 기질로 사용하여 중성지방을 합성하는 역할을 한다. 중성지방의 생합성은 글리세롤 3-포스페이트 경로(간과 지방조직 등)와 모노아실글리세롤 경로 (소장의 장 상피세포)를 통해 이루어진다.

최근에는 간, 지방조직, 골격근 등에서의 중성지방 생합성 과정을 촉매하는 효소인 DGAT의 선택적 저해가 비만과 제2형 당뇨의 예방 및 치료에 효과적인 것으로 부상되고 있으며(Chen HC, et al., Trends Cardiovasc . Med ., 10, p.188-192, 2000; Farese Jr. et al., Curr . Opin . Lipidol., 11, p.229-234, 2000, A. Subauste et. al., Currunt Drug Target-Immun, Endocrine & Metabol Disorders 3, p.263-270, 2003, Y. Yu et. al. Anals of Medicine 36. p.252-261, Hubert C. et al., Arterioscler . Thromb . Vasc . Biol. 25, p.1-5, 2005), 미국 글래드스톤 심장질환연구소의 Robert V. Farese Jr 박사 팀은 DGAT 유전자를 knock-out시킨 마우스를 이용한 연구를 통해 고지방식이에 의해 유도된 체중증가(diet-induced obesity)가 효과적으로 억제되었고 인슐린(insulin)과 렙틴(leptin)에 대한 감수성이 증대되어 당대사(glucose metabolism)가 개선된다는 증거를 밝힘으로써 선택적인 DGAT 저해물질이 비만과 제2형 당뇨의 치료에 유용하다는 사실을 밝혔다(Smith SJ. et al.,Nature genetics , 25, 87-90, 2000).

현재까지 DGAT 효소 저해제의 합성품으로는 피롤카복실릭 에시드 유도체(일본 공개특허 JP05213985A, Mitsubishi Kasei Corp, Japan)와 포스포닉에시드 에스터 유도체(일본 공개특허 JP2004067635A, Otsuka Pharmaceut Factory INC, Japan)가 알려져 있으며, 천연물의 경우 DGAT 효소저해제를 개발하는 연구는 본 연구팀이 처음으로 시작하여 인삼으로부터 비만억제활성을 갖는 신규물질을 찾아내어 보고한 바 있으며(대한민국 특허 출원 제2001-75636호; Lee et al. Planta Med. 70, p.179-200, 2004), 생약자원인 오수유, 단삼, 고삼으로부터 분리한 퀴놀론 알칼로이드(Quinolone alkaloid), 탄시논계(tanshinones), 플라보노이드계(Prenylflavonoids) 물질을 보고한 바 있다(대한민국 특허출원 제2002-64744호; Ko et al. Arch. Phar. Res. 25, p.446-448, 2002; 대한민국 특허출원 제2003-00524호). 국외의 경우, 일본의 기타사토 연구소의 오무라(Omura) 그룹에서 보고한 저해제로 로셀리핀(roselipins)[Gliocladium roseum KF-1040, IC₅₀; 15-22 μM, US6432682(2002), US6608185(2003)], 코클리오퀴논 에이와 에이원[cochlioquinone A and A1, L. Antibiot. 56, 967(2003), 57, 59(2004)], 아미뎁신(amidepsines) [Humicola sp. FO-2942, IC₅₀; 10-50 μM] 및 크산토후몰(xanthohumols)[Humulus lupulus, IC₅₀; 50-194 μM,], 그 외 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid), 2-브로모옥타노에이트(2-bromooctanoate) 등이 보고되어 있다(Rustan et al.; J. Lipid . Res ., 29, p.1417-1426, 1988).

상기에서 살펴본 기존의 DGAT 효소 저해제 이외에, 우수한 DGAT 저해 활성을 가지는 물질을 천연물로부터 획득하고자 하는 연구의 일환으로, 본 발명자들은 지방산 생합성 효소 저해용 물질을 포함하고 있는 것으로 알려진 필발 추출물에서 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제를 저해하는 활성물질을 탐색하였으며, 그 과정에서 분리된 아마이드계 화합물들이 DGAT에 대한 우수한 저해 활성이 가지는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 상기 분리된 아마이드계 화합물들이 비만과 제2형 당뇨병, 인슐린저항성 등 대사성질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (2E,4Z,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,8-노나트리에노일]피레리딘 ((2E, 4Z, 8E)-N-[9-(3, 4-methylenedioxyphenyl)-2, 4, 8-nonatrienoyl]piperidine) 또는 피페르노날린(pipernonaline) 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 아실 코에이: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 비만 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아실 코에이: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 2의 아마이드계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물에 관한 것이다.

상기 화학식 1 또는 2의 아마이드계 화합물은 천연물질, 바람직하게는 식물, 보다 바람직하게는 후추과 식물, 보다 더 바람직하게는 필발로부터 분리할 수 있다. 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃뿐만 아니라 식물 조직 배양물을 추출하여 분리가능하다. 또한, 당 분야의 공지된 방법으로 화학적 합성이 가능하다.

식물로부터 화학식 1 내지 2의 아마이드계 화합물을 수득하는 방법은 공지의 다양한 추출방법에 의할 수 있다. 예를 들어, 식물을 분쇄한 뒤 저급 알코올 용매, 예를 들어, 메탄올, 에탄올 등으로 추출한 다음, 이를 증류수에 현탁시켜 비극성 유기 용매, 예를 들어, 헥산, 에테로, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리한 후, 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 정제함으로써 칼럼의 종류와 전개 용매는 다양하게 조절될 수 있다(Harborne J. B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis . 3rd Ed. pp 6-7, 1998).

하나의 구체적 실시예에서, 필발의 과실을 에탄올로 추출하고 이의 증류수 현탁액을 1 내지 100배, 바람직하게는 1 내지 5배 부피의 클로로포름으로 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 추출하여 얻은 클로로포름 분획을 실리카겔 컬럼크로마토그래피와 같은 흡착크로마토그래피, 겔 필트레이션 크로마토그래피, 고속액체크로마토그래피 등을 순차적으로 수행하여 필발로부터 화학식 1의 (2E,4Z,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,8-노나트리에노일]피레리딘 ((2E, 4Z, 8E)-N-[9-(3, 4-methylenedioxyphenyl)-2, 4, 8-nonatrienoyl]piperidine) 및 화학식 2의 피페르노날린(pipernonaline)을 분리할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “약제학적으로 허용가능한 염”이란 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산, 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 의미한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예들 들어, 나트륨, 알칼리토금속, 예들 들어, 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “아실코에이: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase: DGAT) 저해”란 DGAT가 중성지방을 합성하는 효소 촉매 반응이 차단 또는 합성 효율이 감소되는 현상을 말한다. 상기 효소 활성을 저해시킬 경우, 세포내에서 다양한 반응이 유도될 수 있다. DGAT 효소 활성을 저해시킴으로써 유도되는 반응의 하나의 예는 비만 억제와 인슐린 저항성의 개선을 통한 제2형 당뇨병의 예방 및 치료 효과이다.

트리글리세라이드 합성에 관여하는 최종 단계의 효소인 DGAT를 저해하여 중성지방의 생합성을 억제할 경우, 지방조직 내의 지방의 축적이 억제되고 지방세포의 크기가 감소되고 지방세포로부터 에디포낵틴의 분비 촉진, 운동량의 증가, 고지방식이에 의해 유도된 체중 증가가 억제된다는 사실이 밝혀짐으로써, 비만치료제와 제2형 당뇨치료제로의 타겟으로 연구되어 왔다. 또한, DGAT 저해는 근육, 간, 췌 장 등의 비 지방조직(non-adipoise tissue)에서 지방의 축적을 막아줌으로써 인슐린 저항성을 개선시키는 것으로 알려져 있다. 세포가 인슐린에 의해 자극받으면 IRS-1(insulin receptor substance-1)의 세린 억제적 인산화(inhibitory phosphorylation)가 감소되면서, PI-3K(phosphatidylinositol-3 kinase), PKB(protein kinase B), PKC_λ(protein kinase C_λ) 등을 거치는 신호전달을 통하여 GLUT-4(glucose transporter-4)가 막으로 엑소사이토시스 되어 포도당이 세포 내로 유입되게 된다. 세포 내에서 DGAT의 활성이 저해될 경우, PI-3K, PKB 및 PKC_λ의 활성이 증가하게 되면서 막으로 엑소사이토시스되는 GLUT-4 수가 증가하게 되고 최종적으로 세포 내로 유입되는 포도당의 수가 증가된다. 즉, DGAT의 활성 억제는 인슐린 민감성을 증가시킨다(Chen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25(3):482-486, 2005; Chen et al., J Clin Invest. 111(11):1715-22, 2003; Chen et al., J Clin Invest. 109(8):1049-1055, 2002; Chen et al., Diabetes. 51(11):3189-3195, 2002; Subauste and burant., Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 3(4):263-270, 2003). DGAT 저해와 인슐린 저항성 극복의 직접적인 관련성이 밝혀지면서, DGAT 저해가 인슐린 분비량은 정상이나 인슐린 저항성을 가지게 되면서 포도당 흡수가 장애를 받는 제2형 당뇨병의 치료 타겟으로 작용하는 것을 알 수 있다.

이에, 본 발명자는 DGAT 저해활성을 나타내는 새로운 화합물을 찾고자, 지방 산 생합성을 저해하는 효과가 존재하는 것으로 알려진 필발의 비극성용매 가용 추출물을 흡착크로마토그래피를 수행하여 분획한 후, 겔 여과 크로마토그래피, 고속액체크로마토그래피를 수행하였다. 그로부터 얻은 물질에 대해 자외선 분광광도 스펙트럼, 전자충격 질량 분석, 수소 핵자기 공명스펙트럼, 탄소 핵자기 공명스펙트럼 등의 분석을 수행한 결과, DGAT 활성을 가지는 유효 성분이 화학식 1 및 2의 아마이드계 화합물인 (2E,4Z,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,8-노나트리에노일]피레리딘 ((2E, 4Z, 8E)-N-[9-(3, 4-methylenedioxyphenyl)-2, 4, 8-nonatrienoyl]piperidine) 및 피페르노날린(pipernonaline)임을 밝혀내었다. 이중 특히 화학식 1의 화합물은 이전에 알려지지 않은 신규한 화합물임을 확인하였다.

따라서, 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 신규한 상기 화학식 1의 아마이드계 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 순수 분리된 화학식 1 및 2의 아마이드계 화합물들은 농도가 증가할수록 DGAT 저해 활성이 높았으며, 30㎍/㎖의 농도로 처리할 경우, DGAT 활성을 80 내지 90% 수준으로 억제시켰으며, IC₅₀은 각각 10.1 및 12.7 ㎍/㎖로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 화학식 1 및 2의 아마이드계 화합물은 우수한 DGAT 저해 활성을 가지며, 비만 및 제2형 당뇨병 치료활성을 가진다는 것을 나타내는 것이다.

따라서, 하나의 바람직한 양태로서 본 발명은 화학식 1 또는 2의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 비만 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화학식 1 및 2의 아마이드계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 우수한 DGAT 저해 활성을 가지므로, 비만 또는 제2형 당뇨병에 대한 우수한 예방 또는 치료 활성을 가진다.

본 발명에서 사용된 용어, “비만(obesity)"은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 본 발명의 조성물을 투여함으로써, 몸무게를 감량할 수 있고 혈중내 콜레스테롤, 중성지방, 혈중저밀도지단백(LDL)-콜레스테롤 등의 함량이 감소된다.

본 발명에서 사용된 용어, “제2형 당뇨병(Type 2 diabetes)”이란 포도당의 생성 및 이용에서의 대사 장애로 인하여 몸의 적절한 혈당 수준 유지가 실패되어 고혈당(hyperglycemia)이 유발되는 질환 또는 상태를 의미한다. 당뇨는 발병 원인에 따라, 포도당 이용을 조절하는 인슐린 결핍이 그 원인인 제1형 당뇨병과, 인슐린 수준은 정상이나 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 않기 때문에 발병되는 제2형 당뇨병으로 구분된다. 본 발명의 목적상, 당뇨병은 인슐린 저항성을 가지는 제2형 당뇨병에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 투여함으로써, 인슐린저항성을 개선하여 당뇨, 고지혈, 고혈압, 동맥경화, 심혈관계질환 등의 대사성질환을 예방 또 는 치료할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용된 용어, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 화학식 1 및 2의 아마이드계 화합물을 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1g/kg 이상인 안전한 물질로 판단된다.

상기 약제학적 조성물은 인간뿐만 아니라 비만 또는 당뇨병이 발생될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 가축에게 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나 약제 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비타민 B₁, B₂, B₆, C, E, 니아신, 카르니친, 베타인, 엽산 판토텐산, 비오틴, 아연, 철, 칼슘, 크롬, 마그네슘 및 이들의 혼합물 등의 무기 또는 유기 첨가물들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단독 사용하거나 기존 사용되어진 비만과 당뇨병에 대한 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물을 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예 를 들면, 주사용수의 부가 만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1 또는/및 2의 아마이드계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 비만 또는 제2형 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 개체에 투여하여 비만 또는 제2형 당뇨병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, “개체”는 비만 또는 제2형 당뇨병, 또는 이의 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가지고 있으며, 본 발명의 상기 약제학적 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있도록 하는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물의 투여방법은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하고, 일반적으로 그 유효용량은 경구투여인 경우에는 보통 성인을 기준으로 1회에 1 내지 500 ㎎/㎏이 바람직하며, 정맥투여인 경우에는 1 내지 100 ㎎/㎏이 바람직하다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 . 분석기기

본 발명에서 사용된 자외선 분광광도 스펙트럼(UV) 기기는 시마주 UV-260 스펙트로포토미터(Shimadzu UV-260 spectrophotometer,Shimadzu사)를 사용하였으며, 수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H-NMR) 기기는 배리안 유니티 300 NMR (Varian UNITY 300 NMR, Varian사)을 사용하였으며, 전자충격 질량분석기(EI-MS)는 휴렛팩커드 5989A (Hewlettpackard 5989A, Hewlettpackard사)을 사용하여 조사하였다.

실시예 1. 효소저해 활성물질의 분리정제

발명에 사용한 필발은 대전 생약시장에서 구입하여 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조한 후, 칼날 달린 분쇄기로 분말화시켰다. 분말화된 필발 100g에 3배의 에탄올(건조된 필발 중량에 대해)을 가하여 3일간 실온에서 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 감압 농축하여 조추출물(32g)을 얻었고, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 이용하여 각각의 분획물로 분리하여 하기 실시예 3의 방법으로 DGAT 저해 활성을 측정하였다. 측정 결과, 클로르포름 층에서 가장 우수한 DGAT 저해 활성을 나타내었다. 클로로포름 층 (7.5g)을 감압 농축하고, 클로르포름: 메탄올 = (100/0 ~ 0/100)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였 다. 상기 분리된 활성분획의 DGAT 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 효소 저해활성이 높은 분획들 (3.86g)을 모아, n-헥산:에틸아세테이트 = (50/1 ~ 1/1)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였다. 이 중 DGAT 저해활성이 높은 분획들 (400mg)을 모아 최종적으로 용출 용매로서 80% 메탄올을 4㎖/min로 흘려주면서, 고속액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography; HPLC, YMC Jsphere ODS H-80 (250 ×20 ㎜))를 실시하여 순수화합물 1(8㎎) 과 2(11㎎)를 얻었다. 활성물질의 검출은 UV 210㎚에서 행하였으며, DGAT 저해활성 물질인 화합물 1과 화합물 2는 41분 과 54분에 용출되었다. 화합물 1은 자연계에서 처음 발견되는 신물질로 확인되었다. 화합물 1과 2의 이화학적 특성은 하기와 같다.

화합물 1

(1) 물질의 성상: 무색의 plate

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₁H₂₅NO₃, 339

(3) 전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 340[M+H]⁺

(4) 수소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 7.59 (1H, dd, J= 15, 14.4Hz), 6.88 (1H, s, H-2'), 6.75 (2H, m, H-5' and 6'), 6.36 (1H, d, J=14.4Hz, H-2), 6.32 (1H, d, J=15.6Hz, H-9), 6.17 (1H, t, J=11.4Hz, H-4), 6.03 (1H, dt, J=15.6, 7.2Hz, H-8), 5.94 (2H, s, H-7'), 5.79 (1H, dt, J=7.8, 10.2Hz, H-5), 3.63 (2H, br s, H-5"), 3.49 (2H, br s, H-1"), 2.48 (2H, m, H-6), 2.29 (2H, m, H-7), 1.67 (2H, m, H-3"), 1.58 (4H, m, H-2" and H-4")

(5) 탄소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 24.86 (t, C-3"), 25.80 (t, C-4"), 26.92 (t, C-2"), 28.14 (t, C-6), 32.91 (t, C-7), 43.43 (t, C-1"), 47.11 (t, C-5"), 101.12 (t, C-7'), 105.71 (d, C-2'), 108.41 (d, C-5'), 120.59 (d, C-4), 120.60 (d, C-6'), 121.26 (d, C-2 and 8), 130.43 (d, C-9), 132.39 (s, C-1'), 137.34 (d, C-3), 138.39 (d, C-5), 146.88 (s, C-3'), 148.12 (s, C-4'), 165.80 (s, C-1)

화합물 2

(1) 물질의 성상: 엷은 노란색의 오일상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₁H₂₇NO₃, 341

(3) 전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 364[M+Na]⁺

(4) 수소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 6.88 (1H, br s, H-2'), 6.83 (1H, dt, J=15.3, 6.6 Hz), 6.73 (4H, br s, H-5' and 6'), 6.28 (1H, d, J=15.6Hz, H-9), 6.23 (1H, d, J=14.7Hz, H-8), 6.02 (1H, dt, J=15.6, 6.6Hz, H-2), 5.93 (2H, s, H-7'), 3.59 (2H, br s, H-5"), 3.47 (2H, br s, H-1"), 2.21 (4H, m, H-4 and 7), 1.63 (2H, m, H-3"), 1.56 (4H, m, H-2" and H-4"), 1.49 (4H, m, H-5 and 6)

(5) 탄소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 24.63 (t, C-3"), 25.56 (t, C-4"), 26.65 (t, C-2"), 27.92 (t, C-5), 28.94 (t, C-6), 32.36 (t, C-4), 32.64 (t, C-7), 42.56 (t, C-1"), 46.64 (t, C-5"), 100.88 (t, C-7'), 105.36 (d, C-2'), 108.18 (d, C-5'), 120.19 (d, C-6'), 120.50 (d, C-2), 128.88 (d, C-8), 129.56 (d, C-9), 132.32 (s, C-1'), 145.57 (d, C-3), 146.56 (s, C-3'), 147.90 (s, C-4'), 165.52 (s, C-1)

실시예 2. 활성물질의 구조결정

완전히 분리정제된 화합물 1은 무색의 plate로, 분자량을 측정한 결과 [M+H]⁺가 m/z 340 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₂₁H₂₅NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 214㎚ 과 266㎚에서 나타났으며, 적외선 흡광도를 측정한 결과 1654 cm^- ¹에서의 흡수가 관찰되어 카르보닐기의 존재를 추정할 수 있었다. 화합물의 구조를 결정하기 위해 NMR 시험을 행하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서는 여섯 개의 올레핀 프로톤 (olefinic proton)이 δ 6.36 (1H, d, J = 14.4 Hz, H-2), 7.59 (1H, dd, J = 15.0, 14.4 Hz, H-3), 6.17 (1H, t, J = 11.4 Hz, H-4), 5.79 (1H, dt, J = 10.2, 7.8 Hz, H-5), 6.03 (1H, dt, J = 15.6, 7.2 Hz, H-8) 그리고 6.32 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-9)에서 각각 관 찰되었다. 메틸렌디옥시 프로톤(methylenedioxy proton, 5.94, s)이 관찰되었으며, δ 2.48 (2H, m, H-6)과 2.29 (2H, m, H-7)에서 아릴릭 메틸렌 프로톤 (allylic methylene proton)이 관찰되었다. 또한, 피페리딘 고리 (piperidine ring)의 존재는 δ 3.49 (2H, br s) 과 3.63 (2H, br s)의 브로드한 싱글렛 피크 및 δ 1.58 (4H, m) 과 1.67 (2H, m)의 3개의 메틸렌 프로톤 피크를 통하여 추정할 수 있었다. 화합물 1은 디하이드로피페르노날린(dehydropipernonaline)과 유사한 패턴의 NMR 스펙트럼을 보여주고 있다. 무엇보다도, 화합물 1의 H-3 (δ 7.59)과 H-5 (δ 5.79)는 종래 알려진 디하이드로피페르노날린(dehydropipernonaline)과 비교하여 화학적 이동 값에서 차이를 보이고 있다. 특히, H-6과 H-7의 아릴릭 메틸렌 프로톤이 디하이드로피레르노날린는 δ 2.31 (4H, m)에서 관찰되는데 반하여, 화합물 1은 δ 2.48 (2H, m) and 2.29 (2H, m)에서 각각 관찰된다. 또한, 화합물 1과 디하이드로피페르노날린의 올렌핀 프로톤 (H-4 and H-5)의 결합상수(coupling constants)는 각각 11.4, 10.2 Hz와 15.0, 15.3 Hz로 측정되었으며, 기존에 보고된 문헌과 비교하여 디하이드로피페르노날린은 트랜스(trans)로 확인되었다. 따라서 화합물 1은 시스(cis)로 추정되었다. ¹H-¹H NOESY 스펙트럼 결과, 화합물 1의 H-6 과 H-3의 크로스-피크(cross-peak)가 관찰되었으며, 최종적으로 C-4와 C-5의 구조(configuration)를 시스(cis)로 확인하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 21개의 탄소가 관찰되었으며, 프로톤과 탄소는 DEPT, HMQC 및 HMBC 스펙트럼을 통하여 연결하였다. 이상의 기기분석결과 화합물 1의 구조는 (2E, 4Z, 8E)-N-[9-(3, 4-메틸렌 디옥시페놀)-2, 4, 8-노나트리에노일]피페리딘((2E, 4Z, 8E)-N-[9-(3, 4-methylenedioxyphenyl)-2, 4, 8-nonatrienoyl] piperidine)으로 측정되었으며, 필발로부터 자연계에서 처음 발견되는 신물질로 분리되었다.

완전히 분리정제된 화합물 2는 엷은 노란색의 오일로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]⁺가 m/z 364 이었으며, ESI-MS 에서 분자식이 C₂₁H₂₇NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 210 과 268 nm 에서 흡수가 나타났으며, 비율 기록 적외선 분광기 (Bio-Rad Digilab Division, FTS-80)를 이용하여 IR 흡광도를 측정한 결과 카르보닐 그룹 (1656㎝^-1) 의 존재가 확인되었다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험 중에, ¹H-NMR 스펙트럼에서는 4개의 올레핀(olefinic) 프로톤의 시그널이 δ 6.00 (1H, dt, J = 15.9, 6.6 Hz, H-2), 6.80 (1H, dt, J = 15.3, 6.9 Hz, H-3), 6.23 (1H, dt, J = 15.3, 2.1 Hz, H-8) 그리고 6.26 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-9)에서 관찰되었으며, 메틸렌디옥시 프로톤이 δ 5.90 (s)에서 관찰되었다. 또한, 두 개의 아릴릭 메틸렌 프로톤과 피페리딘 (piperidine) 링과 겹쳐지는 5개의 메틸렌 프로톤이 δ 2.12-2.24 (4H, m) 및 δ 1.43-1.68 (10H, m)에서 각각 관찰되었고, 피페리딘 링의 브로드한 두 개의 싱글렛 피크는 N의 영향으로 δ 3.45 및 3.57 (each 2H, br s)의 저자장 영역에서 관찰되었다. 그리고 ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 21개의 탄소가 존재함이 관찰되었다. 카르보닐 탄소, 메틸렌다이옥시 그룹 의 탄소, 4개의 메틸렌 탄소 및 올레핀 탄소 그리고 피페리딘과 벤젠 링의 탄소가 관찰되었다. 이상의 기기분석 스펙트럼 및 기존에 보고된 데이터 (Yang YC, Lee SG, Kim MK, Lee SH, Lee HS. A piperidine amide extracted from Piper longum L. fruit shows activity against Aedes aegypti mosquito larvae. J. Agric. Food Chem. 2002; 50: 3765-3767)와 비교한 결과, 화합물 2는 피페리딘 아마이드계의 화합물인 피페르노날린(pipernonaline)으로 판명되었다.

실시예 3. 아실 코에이 : 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 활성 검정

3-1. 아실 코에이 : 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제의 활성 측정

본 발명자들은 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제의 활성을 측정하기 위해 콜만 등의 방법(Coleman et al, Methods Enzymol., pp98-103, 1992)에 따라 랫트에서 분리한 마이크로좀 단백질을 효소원으로 사용하고, 기질로서 1, 2-디아실글리세롤(Sigma사, D0138)과 [¹⁴C]팔미토일-코에이(Amersham사, CFA583)를 사용하여 효소 반응 후 생성된 [¹⁴C]트리아실글리세롤의 방사능의 양을 측정하였다. 구체적으로, 반응액(175 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 ㎕의 소의 혈청 알부민(10 ㎎/ ㎖), 100 mM의 MgCl₂, 30 μM의 [¹⁴C]팔미토일 코에이(0.02 μCi, Amersham사) 및 200μM 1,2-디올레오일 글리세롤)에 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 시료액 10.0 ㎕을 가하고, 분리한 마이크로좀 단백질을 100 내지 200 ㎍을 넣은 다음 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 1.5 ㎖의 반응 종결액 (2-프로판올 / 헵탄 / 물 = 80 / 20 / 2, v/v/v) 을 가하여 반응을 정지시켰다. 상기 반응으로 생성된 [¹⁴C]트리아실글리세롤을 분리하기 위하여 1 ㎖의 헵탄 및 0.5 ㎖의 증류수를 가하여 진탕한 후 상등액 1 ㎖을 취하고 여기에 2 ㎖의 알칼리성 에탄올 용액(에탄올 / 0.5 N 수산화 나트륨 / 물 = 50 / 10 / 40, v/v/v)을 가하여 진탕하였다. 상기 진탕액의 상층액 0.65 ㎖을 취하여 LSC (liquid scintillation counter)로 방사능의 양을 측정하고 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제의 저해활성은 하기 수학식 1로 계산하였다.

3-2. 필발 추출물과 이로부터 분리된 화학식 1 또는 2의 화합물의 DGAT 저해활성 측정

상기 3-1의 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 활성 측정 방법에 따라 실시예 1에서 제조되는 필발의 에탄올 추출물 및 클로로포름 분획과 물분획을 각각 100과 50ug/ml의 농도로 첨가하여 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 효소 저해 활성을 측정하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

필발 에탄올 추출물 및 그의 클로로포름, 물 분획의 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해활성

	농도 (㎍/㎖)	DGAT 저해율 (%)
에탄올 추출물	100	55.6
에탄올 추출물	50	28.3
클로로포름 분획	100	72.5
클로로포름 분획	50	56.6
물분획	100	10.5
물분획	50	-

에탄올 추출물의 용매분획 결과 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 효소저해 활성물질은 클로로포름 분획으로 이행되었음을 알 수 있었다.

이 분획으로부터 활성물질을 분리, 정제하기 위해 컬럼 크로마토그래피를 수행하였고, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해제로 분리·정제된 활성물질인 화학식 1 또는 2의 화합물을 농도별로 첨가하여 DGAT 효소저해 활성 및 IC₅₀을 측정하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

화합물 1 및 2 화합물의 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 효소 저해활성

농도 화합물	DGAT 저해율 (%)					IC₅₀ (ug/ml)
농도 화합물	100 (ug/ml)	30	10	3	1	IC₅₀ (ug/ml)
화합물 1	95.7	88.6	48.2	13.6	2.3	10.1
화합물 2	97.3	93.5	42.9	22.0	13.4	12.7

실시예 4. 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

본 발명의 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2마리씩의 동물에 본 발명의 화합물을 각각 1g/kg/㎖의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명의 화합물은 모두 랫트에서 1g/kg까지도 독성변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소치사향(LD₅₀)은 화합물 1g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화학식 1 또는 2의 아미이드계 화합물은 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제를 효과적으로 저해하여 비만 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

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아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 갖는 하기 화학식 1 또는 2의 아마이드계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 비만 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

화학식 1

화학식 2
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