KR20220051154A - 양파 외피로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 포함하는 항당뇨 조성물 - Google Patents

양파 외피로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 포함하는 항당뇨 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양파 외피로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 포함하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 화합물 5~12, 14(세파플라바 A~I)의 신규 화합물 9종과 기존에 알려진 화합물 1~4, 13, 15의 6종을 포함하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로, 이를 통해, 산화 스트레스와 당뇨병의 치료 및 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

양파 외피로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 포함하는 항당뇨 조성물{Antidiabetic Composition comprising flovonoid derivatives isolated from outer skins of Allium cepa}
본 발명은 양파 외피로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 포함하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로 더욱 구체적으로는 세파플라바 A~I의 신규 화합물 9종과 기존에 알려진 6종을 포함하는 화합물1~15를 포함하는 항당뇨 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 암, 심혈관 및 만성 폐 질환과 함께 전염성이 없는 4 가지 주요 질병 중 하나로 2015년에만 160만 명의 사망자를 내었다. 또한 당뇨병은 실명, 신부전, 심장 마비 및 뇌졸중의 주요 원인이 되는 심각한 만성 장애이며, 아울러 세계적으로 2015년 한 해에만 최대 1조 3천억 달러의 경제적 부담의 원인이기도 하다.
모든 당뇨병 사례의 90 % 이상을 차지하는 제 2 형 당뇨병은 일반적으로 성인에서 발생하며 과체중, 비만 및 신체 활동과 밀접한 관련이 있다. 제 2 형 당뇨병에서 신체는 인슐린을 적절하게 사용하지 못해 비정상적으로 높은 혈당 수치를 유발한다. 일반적으로 포도당 수치가 증가하면 췌장 β- 세포에서 인슐린을 방출하여 인슐린 분비를 유도한다. 인슐린은 원형질막의 수용체에 결합하여 활성화되며, 수용체의 티로신 잔기의 자가인산화를 유발하여 다운 스트림으로 신호 전달을 촉발시킨다.
단백질 티로신 포스파타제 1B (PTP1B)는 인슐린 수용체와 그 기질의 티로신 탈인산화하여 인슐린 신호 전달 경로를 방해한다. 따라서 PTP1B는 비만과 당뇨병과 직접 관련된 렙틴 및 인슐린 신호 전달 경로의 음성 조절자로 간주된다. 기내 실험에서, 래트 지방세포에서의 PTP1B의 과발현은 인슐린-자극 포도당 수송체 Type 4 (GLUT4, Glucose Transporter Type 4)의 이동을 극적으로 억제하였다. 또한, 마우스 모델에서, PTP1B 유전자의 녹아웃은 고지방 식이를 투여한 군에서 인슐린 감수성을 개선시키고 체중 감소를 촉진시켰다. 따라서, PTP1B를 억제하는 화합물은 비만 및 이와 관련된 대사 질환을 위한 유망한 치료제가 될 수 있다.
식후 고혈당증 치료를 위한 또 다른 치료법은 α-글루코시다아제를 억제함으로써 위장관에서 탄수화물 흡수 속도를 감소시키는 것이다. α-글루코시다아제 저해제는 소장 털연변부(brush border)에 위치한 α-글루코시다아제 효소의 탄수화물 결합부위에 경쟁적으로 결합하여 탄수화물 분해를 지연하고 식후 고혈당증을 완화시킨다. 그러나, 이 효소를 표적으로 하는 시판 약물은 일부 위장 부작용을 유발한다.
한편, 양파(Allium cepa)는 백합과(Liliaceae)에 속하는 다년생 식물로, 오랜 재배역사와 더불어 특유의 맛과 향을 적용한 식품, 향신료 및 약재 등으로 이용되고 있다. 양파는 편구형 또는 원형의 인경을 갖는 여러해살이 식물로, 인편엽(鱗片葉)은 건막질(乾膜質)로서 자주빛이 도는 갈색이지만 안쪽의 것은 두껍고 층층이 겹쳐지며 매운 맛이 강하다. 원산지는 서부아시아로 보며 이곳에서 중동을 거쳐 이집트, 이탈리아 등 지중해연안에 이르고, 유럽을 경유해서 15세기경 미국으로 건너갔으며, 우리나라에는 조선 말엽에 미국이나 일본에서 도입된 것으로 알려져 있다. 유황 함유 화합물과 관련된 전형적인 매운 냄새와 여러 가지 식물 영양소의 풍부한 공급원으로 인해 양파는 많은 요리에서 필수적인 주방 야채로 사용되고 있으며, 다양한 심장 질환, 두통, 벌레물림 및 종양에 민간 요법으로 사용되어 왔다. 고대 올림픽 선수들이 체력 보강을 위해 양파즙을 먹었다고 하며, 기름진 음식을 많이 섭취하는 중국인들도 양파를 즐겨 먹어 심장병 발병률이 적다고 알려져 있다.
양파는 항암, 항산화, 항혈소판, 항당뇨, 및 항염 등 다양한 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 생물학적 활성을 갖는 다양한 2차 대사산물 가운데, 사포게닌, 사포닌 및 플라보노이드 등이 주요 성분으로 보고되고 있다. 특히 양파에는 항산화 작용을 나타내는 케르세틴이 다른 야채나 과일에 비해 매우 높게 함유되어 있다. 케르세틴(quercetin)은 식물유래 플라보노이드계(flavonoid)의 페놀화합물로서, 강력한 항산화제(antioxidant)일 뿐만 아니라 항동맥경화, 항균작용, 콜레스테롤 저하, 항암, 항바이러스 및 항알러지 활성을 지니고 있으면서 독성은 거의 나타나지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 케르세틴이 많이 함유되어 있는 식품을 섭취하면 혈압강하와 당뇨, 체중감소 등의 다이어트, 면역기능 강화, DNA 손상억제효과 및 적혈구 막의 지질 과산화 저해효과 등에 효과가 있다.
양파껍질에는 케르세틴을 포함한 플라보노이드화합물이 양파의 가식부위보다 약 10 ~ 100배 높게 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 양파의 외피는 식품산업에서는 폐기되는 부분이나, 이러한 최근 연구 결과들은 양파 외피가 고부가의 기능성 성분의 보고로 활용될 수 있는 가능성을 시사한다.
본 발명자들은 양파 외피에서 분리한 화합물의 생물학적 활성을 연구하는 중, 양파 외피에서 분리한 15 종의 화합물의 항산화, 항당뇨 활성을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 한국등록특허 제1453052호에는 양파껍질 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 혈관질환 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 개시하고 있으나, 본 발명의 화합물은 기재되어 있지 않다.
한국등록특허 제1453052호 및 한국공개특허 제10-2007-0097868호에는 양파로부터 쿼세틴 추출액의 제조방법 및 상기 쿼세틴 추출액의 용도 및 양파껍질 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용조성물이 기재되어 있으나, 역시 본 발명의 화합물은 기재되어 있지 않다.
한국등록특허 제1453052호, 양파껍질 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 혈관질환 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물, 2014. 10. 14. 등록. 한국등록특허 제1300667호, 양파로부터 쿼세틴 추출액의 제조방법 및 상기 쿼세틴 추출액의 용도, 2013. 08. 21. 등록. 한국공개특허 제10-2007-0097868호, 양파껍질 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용조성물, 2007. 10. 05. 공개.
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본 발명의 목적은 양파 외피로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 포함하는 항당뇨 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 하기 [화학식 1]의 화학 구조를 갖는 케르세틴 (quercetin, 화합물 1), 캠퍼롤 (kaempferol, 화합물 2), 이소람네틴 (isorhamnetin, 화합물 3), 케르세틴 4'-O-β-D-글루코피라노시드 (quercetin 4'-O-β-D-glucopyranoside, 화합물 4), 세파플라바 A (Cepaflava A, 화합물 5), 세파플라바 B (Cepaflava B, 화합물 6), 세파플라바 C (Cepaflava C, 화합물 7), 세파플라바 D (Cepaflava D, 화합물 8), 세파플라바 E (Cepaflava E, 화합물 9), 세파플라바 F (Cepaflava F, 화합물 10), 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 11), 세파플라바 H (Cepaflava H, 화합물 12), 1,3,11a- 트리하이드록시-9-(3,5,7- 트리하이드록시-4H-1-벤조피란-4-온-2-일)-5a-[4-(β-D-글루코피라노실옥시)-3-히드록시페닐]-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온 (1,3,11a-trihydroxy-9-(3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on-2-yl)-5a-[4-(β-D-glucopyranosyloxy)-3-hydroxyphenyl]-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-one, 화합물 13), 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 14) 및 1,3,11a-트리히드록시-9-(3,5,7-트리히드록시-4H-1-벤조피란-4-온-2-일)-5a-[1,3,11a-트리히드록시-5a-(3,4-디히드록시페닐)-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온-9-일]-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온 (1,3,11a-trihydroxy-9-(3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on-2-yl)-5a-[1,3,11a-trihydroxy-5a-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-on-9-yl]-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-one, 화합물 15)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 양파 외피 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 양파 외피 추출물은 양파 외피를 물, C1 내지 C4 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 C1 내지 C4 알코올 또는 이들의 혼합 용매이다. 추출시 사용되는 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합용액은 사용되는 양파 외피 중량 대비 1~50배 부피를 사용할 수 있으며 상기 과정을 1~5회 반복하는 것도 가능하다.
상기 추출물의 추출시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 1일 이내에 추출하는 것이 바람직하고, 추출방법은 통상적으로 사용되는 모든 추출방법, 예컨대, 가압 추출, 침지(냉침, 온침), 초음파 추출, 환류 추출법 등을 사용할 수 있으며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.
상기 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으며, 식물체 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용할 수 있다.
또한, 상기 추출물은 상기 추출 과정으로부터 얻은 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성하는 것도 가능하며 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있으나, 바람직하게는 양파 외피 추출물로부터 크로마토그래피로 분획하여 얻는다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography), 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 중에서 선택될 수 있다. 상기 항당뇨 조성물은 항산화 활성을 갖는다. 본 발명의 항당뇨 조성물의 항산화 활성은 DPPH 또는 ABTS
Figure pat00003
+ 소거 활성일 수 있으며, DPPH 또는 ABTS
Figure pat00004
+ 소거 실험을 통하여 항산화 활성을 측정할 수 있다.
상기 항당뇨 조성물은 또한 단백질 티로신 포스파타제 1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 또는 알파-글루코시다제에 대하여 억제활성을 갖는다.
본 발명은 상기 [화학식 1]의 구조를 갖는 케르세틴 (quercetin, 화합물 1), 캠퍼롤 (kaempferol, 화합물 2), 이소람네틴 (isorhamnetin, 화합물 3), 케르세틴 4'-O-β-D-글루코피라노시드 (quercetin 4'-O-β-D-glucopyranoside, 화합물 4), 세파플라바 A (Cepaflava A, 화합물 5), 세파플라바 B (Cepaflava B, 화합물 6), 세파플라바 C (Cepaflava C, 화합물 7), 세파플라바 D (Cepaflava D, 화합물 8), 세파플라바 E (Cepaflava E, 화합물 9), 세파플라바 F (Cepaflava F, 화합물 10), 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 11), 세파플라바 H (Cepaflava H, 화합물 12), 1,3,11a- 트리하이드록시-9-(3,5,7- 트리하이드록시-4H-1-벤조피란-4-온-2-일)-5a-[4-(β-D-글루코피라노실옥시)-3-히드록시페닐]-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온 (1,3,11a-trihydroxy-9-(3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on-2-yl)-5a-[4-(β-D-glucopyranosyloxy)-3-hydroxyphenyl]-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-one, 화합물 13), 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 14) 및 1,3,11a-트리히드록시-9-(3,5,7-트리히드록시-4H-1-벤조피란-4-온-2-일)-5a-[1,3,11a-트리히드록시-5a-(3,4-디히드록시페닐)-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온-9-일]-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온 (1,3,11a-trihydroxy-9-(3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on-2-yl)-5a-[1,3,11a-trihydroxy-5a-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-on-9-yl]-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-one, 화합물 15)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 하기 [화학식 2]의 구조를 갖는 세파플라바 A (Cepaflava A, 화합물 5), 세파플라바 B (Cepaflava B, 화합물 6), 세파플라바 C (Cepaflava C, 화합물 7), 세파플라바 D (Cepaflava D, 화합물 8), 세파플라바 E (Cepaflava E, 화합물 9), 세파플라바 F (Cepaflava F, 화합물 10), 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 11), 세파플라바 H (Cepaflava H, 화합물 12) 및 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 14)를 제공한다. 하기 [화학식 2]의 구조의 화합물은 양파 외피로부터 분리한 신규물질이며, DPPH 또는 ABTS
Figure pat00005
+ 소거 능력을 갖는 항산화 활성 및 단백질 티로신 포스파타제 1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 또는 알파-글루코시다제에 대하여 억제활성을 갖는다.
[화학식 2]
Figure pat00006
상기 항당뇨 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 항당뇨 약학 조성물을 제공한다.
상기 항당뇨 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 조성물의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 항당뇨 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제, 산미제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이며, 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육 또는 피하 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항당뇨 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명은 양파 외피로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 포함하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 세파플라바 A~I의 신규 화합물 9종과 기존에 알려진 6종을 포함하는 화합물1~15를 포함하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로, 이를 통해, 산화 스트레스와 당뇨병의 치료 및 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 양파 외피로부터 분리, 확인한 플라보노이드 유도체의 구조이다.
도 2는 본 발명의 화합물 5, 9, 10, 11 및 14의 주요 HMBC 및 COZY 상관관계를 나타낸 것이다.
도 3은 2 개의 전구체, 케르세틴 및 프로토 카테츄산으로부터 화합물 7의 예상되는 생합성 경로를 도시한 것이다.
도 4는 메탄올에서 화합물 5-12 및 14의 ECD 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5는 화합물 7-9 및 14의 카복시산의 위치를 결정과정을 도시한 것이다. (A) 화합물 7, 8 및 2가지 위치 이성질체 7a, 7b의 구조 (B) 화합물 7, 8의 실험적 1H NMR 스펙트럼 (왼쪽) 및 δH -2''-H-5'' 값에서 7a, 7b의 계산된 1H NMR 스펙트럼(오른쪽) (C) 화합물 9 및 14의 the δH -2''-H-5'' 값 및 구조
도 6은 화합물 7, 8, 14의 구조 결정과정을 도시한 것이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<재료 및 방법>
구조결정 및 크로마토그래피
화합물의 분리 및 구조결정에는 고해상도 전기분무 이온화 질량 스펙트럼 (HRESIMS, High-resolution electrospray ionisation mass spectrometry), 박막 크로마토그래피 (TLC, Thin-Layer Chromatography), 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC, High-performance liquid chromatography), 원편광 이색성 분광분석 등을 사용하였다. 광학 회전은 JASCO P-2000 디지털 편광계를 사용하였다. 전자 원형 이색성 (ECD) 및 UV 스펙트럼은 J-1500 원형 이색성 분광 광도계를 사용하여 기록하였다. IR 스펙트럼은 JASCO FT/IR-4100 분광계를 사용하여 기록하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Unity Inova 400 MHz 및 Bruker Ascend™ 500 MHz 분광계를 사용하여 획득하였다. AB SCIEX TripleTOF™ 5600 분광계를 사용하여 고해상도 전기분무 이온화 질량 스펙트럼 (HRESIMS)을 수행하였다. 고해상도 전자 충격 질량 분석 (HREIMS)은 JEOL JMS-AX 300L 분광계 (Jeol, Akishima, Tokyo, Japan)를 사용하여 수행하였다. 컬럼 크로마토그래피 (CC)는 실리카 겔 60 (Merck, 230-400 메쉬) 및 (RP)-C18 (Merck, 75 메쉬)을 사용하였다. 박막 크로마토그래피 (TLC)는 코팅된 실리카 겔 F254 및 RP-18 F254s 플레이트 머크를 사용하여 수행하였다. 제조된 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 UV 검출기 (UV/VIS-156) 및 YMC Pak ODS-A 컬럼 (20 × 250 mm, 5 μm 입자 크기; YMC Co., Ltd., Japan)을 갖춘 Waters 2487 컨트롤러 시스템을 사용하여 수행하였다.
식물 재료
본 발명에 사용된 양파의 외피는 2017 년 5 월 대한민국 대전 중앙 시장에서 구입한 A. cepa에서 입수하였다. 표본 (CUD-0814-1)은 대구 가톨릭 대학교 약학 대학의 식물 표본실에 보관하였다.
추출 및 분리
공기건조된 양파 (10kg)의 외피를 메탄올 (10L x 3)로 환류 하에서 추출하고, 합한 추출물을 진공에서 농축시켰다. 생성된 추출물 (0.8 kg)을 증류수 (1 L)에 현탁시키고, n- 헥산, CH2Cl2, EtOAc 및 n-BuOH로 연속적으로 분획하였다. 진공 농축 후, EtOAc-가용성 분획 (405 g)을 실리카겔 (CH2Cl2 : MeOH, 10 : 1, v/v)상에서 컬럼 크로마토그래피 (CC)에 적용하여 30 분획 (E1-E30)을 수득하였다. 이 중, 분획 E23 (1 g)을 실리카겔 칼럼 (n-헥산 : EtOAc, 20 : 1, v/v)상에서 크로마토그래피하여 화합물 2 (50 mg)를 얻었다. 또한 분획 E30 (80 g)을 CC (n- 헥산 : EtOAc, 3 : 1, v/v)로 분별하여 15 개의 소분획 (E30.1-E30.15)을 수득하고, 소분획 E30.5 (2.5 g)에 RP-18 실리카겔 CC (MeOH : H2O, 1 : 2, v/v)를 적용하여 화합물 1 (150 mg)을 수득하였다. 소분획 E30.4 (510 mg)를 실리카겔 컬럼 (n- 헥산 : 아세톤, 2 : 1, v/ v)상에서 크로마토그래피하여 화합물 5 (10 mg) 및 화합물 6 (15 mg)을 얻었다. 소분획 E30.8 (3 g)을 실리카겔 CC (CH2Cl2 : MeOH, 20 : 1, v/v)로 분별하여 20 개의 하위 소분획 (E30.8.1-E30.8.20)을 생성하였다. RP-18 실리카겔 컬럼 (MeOH : H2O, 1 : 1, v/v)을 사용하여 하위 소분획 E30.8.8 (136 mg)을 크로마토그래피하여 화합물 3 (10 mg)을 수득하였다. 소분획 E30.11 (6g)을 실리카겔 CC (n-헥산 : 아세톤, 1 : 1, v/v)에 적용하여 화합물 4 (50mg) 및 화합물 13 (80mg)을 수득하였다. 광범위한 제조용 RP-HPLC [Waters 2487 컨트롤러 시스템; YMC Pak ODS-A 컬럼 (섹션 2.1 참조); 210 nm에서 UV 검출]로 이동상으로서 5 mL / 분의 유속으로 MeOH : H2O (60:40, v / v)를 사용하여 하위 소분획 E30.11.18 (450 mg)을 추가 정제하여 ; 화합물 10 (3 mg), 화합물 11 (4 mg) 및 화합물 12 (6 mg)를 수득하였다. 소분획 E30.12 (2.5 g)를 실리카겔 CC (CH2Cl2 : MeOH, 15 : 1, v/v)로 분별하여 20 개의 하위 소분획 (E30.12.1-E30.12.20)을 얻었으며, 광범위한 분취용 RP-HPLC [Waters 2487 컨트롤러 시스템; YMC Pak ODS-A 컬럼 (섹션 2.1 참조); 210 nm에서 UV 검출]에 의해 이동상으로서 5 mL/분의 유속으로 MeOH : H2O (55:45, v/v)를 사용하여 하위 소분획 E30.12.6 (450mg)으로부터 화합물 7 (3mg), 화합물 8 (6mg), 화합물 9 (4mg), 화합물 14 (10mg) 및 화합물 15 (20mg)를 분리하였다.
산 가수 분해
가수분해를 위해, 1 mg의 각 화합물을 칭량한 다음, 3 mL의 2N CF3COOH를 첨가한 후, 95 ℃에서 3 시간 동안 비등시켰다. 용액을 메틸렌클로라이드 (3 x 3 mL)로 분획하였다. 수층을 진공 건조하고, 실리카 겔상에서 TLC (MeOH : CHCl3 : H2O, 5 : 8 : 1)로 분석한 후, 표준과 비교하였다. 동일한 용매 시스템을 갖는 제조용 TLC를 사용하여 단당류 부분을 수득하였다. 당의 광학 회전을 측정하고 D- 글루코스 (positive [α]D)로 확인하였다.
구조결정 및 계산 방법
화합물 5, 6, 11 및 12에 대한 체계적인 구조 검색은 분자역학힘장 (MMFF) 하에서 스파르탄 (Spartan) 14 소프트웨어 (Wavefunction, Inc., Irvine, CA, USA)로 수행하였다. 가우시안 09 패키지 (Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA)를 사용하여 B3LYP/6-31+G(d,p) 레벨에서 밀도 기능 이론 (DFT) 계산에 의해 적합한 컨포머가 최적화로 선택되었고, 최적된 컨포머의 시간-의존적 DFT ECD 계산은 MeOH에서 도체 분 극성 연속체 (CPCM) 용매 모델을 사용하여 CAM-B3LYP / TZVP 레벨에서 수행되었다. 상이한 컨포머의 계산된 ECD 스펙트럼은 0.2-0.3 eV의 반대역폭으로 시뮬레이션하고 ECD 곡선을 SpecDis 1.64 소프트웨어로 생성하였다. 화합물 5, 6, 11 및 12의 ECD 스펙트럼은 UV 보정 후 볼츠만 분포로 가중되었다.
화합물 7-10 및 14의 컨포머는 MMFF 힘 장에서 “혼합 비틀림 / 낮은 모드 샘플링”의 MacroModel (버전 2015-2; Schr
Figure pat00007
dinger LLC, New York, NY, USA) 모듈을 사용하여 발견하였다. 검색은 모든 가능한 컨포머를 탐색하기 위하여 5 kJ/mol 에너지 윈도우 한계와 10,000 개의 최대 단계로 가스 상에서 실시하였다. Polak-Ribi
Figure pat00008
re 접합 구배 방법은 10,000 회 반복 및 RMS (root mean square) 구배에서 0.001 kJ (mol Å) -1 수렴 임계 값의 컨포머를 최소화하기 위하여 사용되었다. CP3 (화합물 7 및 8) 및 DP4 (화합물 14) 분석의 경우, Gaussian 16 패키지를 사용하여 분극성 연속체 모델 (PCM; MeOH)의 mPW1PW91 / 6-311G* 수준에서 기하 최적화없이 컨포머의 화학적 이동을 계산하였다. 계산된 NMR 특성은 각각의 볼츠만 모집단을 기준으로 평균화되었으며 CP3 및 DP4 분석을 위해 http://www-jmg.ch.cam.ac.uk/tools/nmr 에 있는 애플릿으로 분석되었다. 화합물 9의 특정 회전 계산의 경우, 모든 컨포머들은 B3LYP/6-31+G(d, p) 레벨의 기체상에서 기하 최적화를 수행했으며, 1% 이상의 모집단을 가진 컨포머는 B3LYP/6-31+G(d,p)에서 특정 회전 값 계산을 수행하였다. 계산된 특정 회전 값은 각 컨포머의 계산된 깁스 자유 에너지에 기초하여 볼츠만 평균화하였다. ECD 계산을 위해, 모든 컨포머는 BP86/SVP 레벨의 기체 상에서 기하 최적화되었으며, PCM(MeOH)에서 BP86/ aug-cc-pVDZ 레벨에서 여기 에너지, 발진기 강도 및 회전 강도 계산을 수행하였다. ECD 스펙트럼은 각 컨포머의 계산된 깁스 자유 에너지에 기초하여 볼츠만 평균화하였고, σ/γ 값이 0.6 eV인 SpecDis 소프트웨어 (버전 1.71)를 사용하여 시각화되었다.
DPPH 라디칼 소거 분석
DPPH 라디칼 소거 분석은 Thuong 등의 방법 (2006)과 동일한 방법으로 수행되었다. 시료의 메탄올 추출물 5 μl 와 150 μM DPPH 195 μl을 혼합하여 96 well 플레이트에 분주한 후, 실온에 30분간 방치하였다. 그 후, 520 nm에서 반응 혼합물의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 분광광도계(VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. 자유 라디컬 소거 활성은 하기 식과 같이 표현된다.
DPPH 소거 활성 (%) = 100 x [(Ac-As)/(Ac-Ab)]
이때, Ac는 대조군의 흡광도, As는 시료의 흡광도, Ab는 blank(메탄올)의 흡광도이다. 각 시료는 3반복으로 진행하였으며, IC50 값은 생성 라디칼의 50% 소거된 농도로 정의된다.
퍼옥실 ( ABTS
Figure pat00009
+ ) 라디칼 소거 분석
ABTS
Figure pat00010
+ 라디칼 양이온은 ABTS를 칼륨퍼설페이트와 후속 반응으로 반응시켜 생성되었다. ABTS를 10 mL H2O에 7 mM 농도로 용해시킨 후, 60 mm K2S4O8 (최종 농도 2.45 mM) 400 μL를 첨가하고, 그 혼합물을 실온의 암실에서 16시간 보관하였다. 라디칼은 이 형태에서 2일 이상 동안 안정적이었다. ABTS
Figure pat00011
+ 라디칼 용액을 734 nm에서 0.700±0.020의 흡광도가 되도록 물로 희석하였다. 소거 분석을 위하여 희석 ABTS
Figure pat00012
+ 라디칼 용액 990 μL에 테스트 시료 또는 트롤록스 기준품(최종농도 0-20μM) 10 μL를 혼합한 다음 정확히 6분 후에 734 nm에서 흡광도를 측정하고 흡광도 감소율을 계산하였다.
PTP1B 억제 분석
단리된 화합물 (1-15)의 PTP1B (protein-tyrosine phosphatase 1B) 억제 분석은 Kim 등(2017)의 방법과 동일한 방법으로 기질로 p- 니트로 페닐 포스페이트 (p-NPP)를 사용하여 수행되었다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 반응 완충용액으로 희석한 PTP1B 효소, 50 mM citrate (pH 6.0), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA 및 1 mM DTT를 첨가하고, 반응 완충용액에 용해된 2 mM pNPP를 50 μL 첨가하였다. 37℃에서 20 분간 암실에 방치하고, 10 M NaOH 10 μL를 첨가하여 반응을 종료시켰다. pNPP의 효소에 의한 탈인산화로 생성된 p-nitrophenolate의 양은 405 nm에서 흡광도로 측정하였다. 양성 대조군으로 우르솔산을 사용하였으며, {(AC - AS) / AC} × 100의 식으로 저해율(%)을 계산하고, IC50을 계산하였다.
α- 글루코시다제 억제 분석
α-글루코시다아제 억제는 p-니트로페닐 α-D-글루코피라노사이드 (p-NPG)를 기질로 사용하여 분석되었다. α-글루코시다제 활성은 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 405 nm에서 p-NPG의 방출을 측정하여 분석하였다. Acarbose를 양성 대조군으로 사용하였다.
PTP1B를 이용한 효소 동역학 분석
가장 활성이 높은 화합물 13-15의 PTP1B 억제 메커니즘을 결정하기 위해 Kim 등(2017)의 방법과 동일한 방법으로 Lineweaver-Burk 및 Dixon 플롯을 사용하였다.
PTP1B 억제에서의 분자 도킹 시뮬레이션
PTP1B와 화합물 13 및 15의 상호 작용 및 결합 모드를 명확히 하기 위해 AutoDock 4.2 소프트웨어를 사용한 분자 도킹 시뮬레이션을 구현하였다. 도킹 프로토콜은 AutoDock 4.2 프로그램으로 수행하였다.
< 실시예 1. 양파 외피로부터 분리한 플라보노이드 확인 >
양파의 외피를 MeOH로 추출하여 조 추출물을 수득하고, 이를 n-헥산, CH2Cl2, EtOAc 및 n-BuOH로 연속적으로 분배하였다. EtOAc 분획 (405 g)을 실리카겔 및 반-제조 HPLC상에서 분리하여 9 개의 새로운 플라보노이드 (세파플라바 A-I, 화합물 5-12, 14) 및 6 개의 공지 된 화합물 (1-4, 13, 15)을 얻었다 (도 1). 9 개의 새로운 플라보노이드의 1H(400 MHz) 및 13C(100 MHz) NMR 데이터를 표 1 내지 3에 나타내었다.
position 화합물 5 a 화합물 6 a 화합물 14 b
δ H mult.,
(J in Hz)		 δ C, type δ H mult.,
(J in Hz)		 δ C, type δ H mult.,
(J in Hz)		 δ C, type
2 108.8, C 109.4, C 101.8, C
3 79.9, C 80.0, C 91.9, C
4 196.4, C=O 199.0, C=O 189.7, C=O
4a 100.7, C 101.9, C 101.3, C
5 165.5, C 164.4, C 165.3, C
6 5.94, d (2.0) 97.6, CH 5.95, s 97.8, CH 5.93, c d (2.7) 97.4, CH
7 168.4, C 168.3, C 169.7, C
8 5.98, d (2.0) 96.7, CH 6.00, s 97.1, CH 6.00, c d (2.7) 97.4, CH
8a 159.9, C 158.8, C 161.1, C
1' 126.5, C 126.3, C 126.8, C
2' 7.01, d (1.9) 117.3, CH 7.11, s 117.1, CH 7.21, s 116.8, CH
3' 145.9, C 145.8, C 145.8, C
4' 147.5, C 147.5, C 148.0, C
5' 6.80, d (8.2) 115.6, CH 6.80, d (7.8) 115.6, CH 6.69, d (8.4) 115.4, CH
6' 6.87, dd (8.2, 1.9) 121.4, CH 7.02, d (7.8) 121.6, CH 7.03, d (8.4) 121.2, CH
1'' 3.05, d (16.0)
2.25, d (16.0)		 41.3, CH2 2.56, d (13.5)
2.42, d (13.5)		 49.8, CH2
2'' 214.2, C=O 209.3, C=O 101.5, C
3'' 2.23, s 31.9, CH3 1.98, s 32.3, CH3 91.7, C
4'' 189.3, C=O
4''a 101.3, C
5'' 165.5, C
6'' 5.93, c d (2.7) 98.4, CH
7'' 169.9, C
8'' 6.00, c d (2.7) 97.9, CH
8''a 160.8, C
1''' 130.0, C
2''' 7.44, d (2.0) 119.0, CH
3''' 141.7, C
4''' 143.7, C
5''' 6.93, d (8.5) 118.0, CH
6''' 7.34, dd (8.5, 2.0) 123.8, CH
1'''' 126.2, C
2'''' 7.63, s 120.0, CH
3'''' 142.1, C
4'''' 146.1, C
5'''' 7.18, d (8.5) 118.3, CH
6'''' 7.71, d (8.5) 125.5, CH
1''''' 167.7, C=O
2-OCH3 3.12, s 51.4, OCH3 2.98, s 51.4, OCH3
COOCH3 3.88, s 52.6, OCH3
a 1H (400MHz) and 13C (100MHz).
b 1H (500MHz) and 13C (125MHz).
c Overlapped with other signals.
position 화합물 7 화합물 8 화합물 9
δ H mult., (J in Hz) δ C, type δ H mult., (J in Hz) δ C, type δ H mult., (J in Hz) δ C, type
2 101.8, C 101.9, C 101.9, C
3 92.1, C 91.8, C 91.8, C
4 189.6, C=O 189.7, C=O 189.7, C=O
4a 101.3, C 101.3, C 101.3, C
5 165.4, C 165.3, C 165.4, C
6 5.94, d (2.1) 98.0, CH 5.96, s 98.0, CH 5.89, s 98.0, CH
7 169.7, C 169.6, C 169.7, C
8 5.93, d (2.1) 97.3, CH 5.96, s 97.3, CH 5.89, s 97.3, CH
8a 161.1, C 161.0, C 161.0, C
1' 126.7, C 126.6, C 126.5, C
2' 7.23, d (2.3) 116.8, CH 7.24, d (2.2) 116.7, CH 7.17, d (2.0) 116.7, CH
3' 145.8, C 145.7, C 145.8, C
4' 148.1, C 148.0, C 148.1, C
5' 6.69, d (8.5) 115.5, CH 6.71, d (8.5) 115.4, CH 6.64, d (8.4) 115.4, CH
6' 7.05, dd (8.5, 2.3) 121.3, CH 7.07, dd (8.5, 2.2) 121.2, CH 7.00, dd (8.4, 2.0) 121.2, CH
1'' 126.4, C 126.5, C 126.0, C
2'' 7.682, d (2.0) 119.9, CH 7.61, d (1.8) 120.1, CH 7.55, s 119.9, CH
3'' 141.7, C 142.0, C 142.2, C
4'' 146.6, C 146.1, C 146.3, C
5'' 7.02, d (9.0) 118.4, CH 7.12, d (8.5) 118.1, CH 7.08, d (8.5) 118.3, CH
6'' 7.676, dd (9.0, 2.0) 125.8, CH 7.70, dd (8.5, 1.8) 125.6, CH 7.65, d (8.5) 125.4, CH
1''' 169.1, C=O 169.1, C=O 167.8, C=O
2''' 3.84, s 52.6, OCH3
position 화합물 10 화합물 11 화합물 12
δ H mult.,
(J in Hz)		 δ C, type δ H mult.,
(J in Hz)		 δ C, type δ H mult.,
(J in Hz)		 δ C, type
2 119.4, C 93.7, C 93.6, C
3 81.8, C 103.2, C 104.3, C
4 192.6, C=O 186.9, C=O 186.9, C=O
4a 100.2, C 100.2, C 100.2, C
5 165.5, C 166.4, C 166.4, C
6 5.90, s 97.9, CH 5.99, d (2.1) 97.7, CH 5.93, s 97.7, CH
7 169.3, C 170.6, C 170.4, C
8 5.85, s 96.1, CH 6.02, d (2.1) 96.3, CH 5.97, s 96.2, CH
8a 162.6, C 164.3, C 164.3, C
1' 125.7, C 127.1, C 127.1, C
2' 6.95, s 115.3, CH 6.97, d (2.1) 116.9 6.94, d (1.8) 117.0
3' 145.9, C 146.2 146.2
4' 147.6, C 147.0 147.0
5' 6.73, d (8.4) 115.7, CH 6.82, d (8.5) 115.9, CH 6.76, d (8.4) 116.0, CH
6' 6.86, d (8.4) 120.0, CH 6.86, dd (8.5, 2.1) 120.6, CH 6.81, dd (8.4, 1.8) 120.6, CH
2'' 148.4, C 146.9, C 146.9, C
3'' 138.5, C 138.2, C 138.2, C
4'' 177.8, C=O 177.8, C=O 177.8, C=O
4''a 106.7, C 106.3, C 106.3, C
5'' 166.0, C 165.7, C 165.7, C
6'' 6.54, s 95.8, CH 6.44, s 95.5, CH 6.39, s 95.5, CH
7'' 167.3, C 167.6, C 167.6, C
8'' 107.3, C 108.8, C 108.8, C
8''a 153.3, C 153.1, C 153.1, C
1''' 127.2, C 126.8, C 126.8, C
2''' 7.95, s 117.34, CH 7.80, d (2.2) 117.3, CH 7.78, s 117.3, CH
3''' 147.9, C 147.4, C 147.2, C
4''' 148.1, C 148.2, C 148.4, C
5''' 7.29, d (8.2) 117.29, CH 7.02, d (8.8) 117.2, CH 6.99, d (8.8) 117.3, CH
6''' 7.85, d (8.2) 122.1, CH 6.33, dd (8.8, 2.2) 120.8, CH 6.13, d (8.8) 120.8, CH
1'''' 4.92, d (8.6) 103.5, CH 4.90 a 103.1, CH 4.80, d (6.5) 103.6, CH
2'''' 3.50 a 74.8, CH 3.52 a 74.8, CH 3.48 a 74.7, CH
3'''' 3.45 a 78.4, CH 3.54 a 78.4, CH 3.56 a 78.2, CH
4'''' 3.45 a 71.2, CH 3.44, m 71.4, CH 3.38, m 71.5, CH
5'''' 3.50 a 77.5, CH 3.55 a 77.6, CH 3.46 a 77.6, CH
6'''' 3.91, d (12.3)
3.73, dd (12.3, 6.1)		 62.3, CH2 4.06, dd (12.2, 2.1)
3.78, dd (12.2, 5.8)		 62.6, CH2 4.00, d (13.2)
3.73, dd (12.1, 5.9)		 62.7, CH2
a Overlapped with other signals
세파플라바 A ( Cepaflava A, 화합물 5)
적갈색, 비정질 분말;
Figure pat00013
-20.7 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 291 (2.28), 252 (1.75), 198 (2.57) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 200 (2.89), 234 (-0.01), 261 (0.20), 299 (-0.18); IR (KBr) vmax 3324, 2941, 2831, 1637, 1448, 1024; 1H (400MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (100MHz, 메탄올-d 4) 데이터, 표 1 참조; HREIMS m/z 390.0948 ([M]+, calcd for C19H18O9, 390.0951).
화합물 5는 분자식 C19H18O9의 적갈색 비정질 분말로서 분리되고, m/z 390.0948 [M]+ 에서 분자 이온 피크를 나타내는 HREIMS로부터 추론 하였다. UV 스펙트럼은 198, 252 및 291 nm에서 최대 흡수를 나타냈으며, IR 스펙트럼은 하이드록실 (3324 cm-1), 카보닐 (1637 cm-1) 및 이중 결합 작용기 (1448 cm-1)를 나타냈다. 화합물 5의 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 ABX 커플링 시스템 [δH 7.01 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2'), 6.87 (1H, dd, J = 8.2, 1.9 Hz, H-6') 및 6.80 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5')], 2 개의 메타 커플 더블릿 [δH 5.98 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8) 및 5.94 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6)]과 δC 196.4 (C-4)에서 카르보닐 신호를 나타내었으며, 이는 일반적으로 플라바논(flavanone) 골격이 될 수 있다. 그리고, CH2-CO-CH3 단편을 설명하는 메틸 신호 (δH 2.23, s, H3-3''), 메틸렌기 [δH 3.05 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-1''a), 2.25 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-1''b)] 및 카르보닐 탄소 (δC 214.2, C-2 '')가 있었다.
또한, 메톡시기의 싱글릿 δH 3.12 (3H, s, 2-OCH3)가 화합물 5의 1H NMR 스펙트럼에서 검출되었다. 화합물 5의 13C NMR 스펙트럼은 2 개의 카보닐 [δC 214.2 (C-2'') 및 196.4 (C-4)], 케탈 (δC 108.8, C-2), 산소화 (δC 79.9, C-3), 메톡시 (δC 51.4, 2-OCH3), 메틸 (δC 31.9 , C-3''), 메틸렌 (δC 41.3, C-1'') 및 12개의 4 차 탄소를 포함하는 19 개의 신호를 나타냈다. 화합물 5의 NMR 데이터를 에리제로플라바논 (Erigeroflavanone)과 비교한 결과, 에리제로플라바논의 메톡시기 (2''-OCH3)가 화합물 5에서 메틸기 (2''-CH3)로 대체된 것을 제외하고 이들 구조는 매우 유사하였다. 이러한 추론은 에리제로플라바논의 C-2''(δC 171.4)와 비교하여 화합물 5에서 C-2''(δC 214.2)의 다운필드 화학적 이동 및 C-2''(δC 214.2) 및 C-1''(δC 41.3)에 대한 메틸 양성자 H3-3''(δH 2.23), C-2''(δC 214.2)에 대한 H-1''a (δH 3.05) 및 H-1''b (δH 2.25)의 HMBC 상관 관계로 확인할 수 있다 (도 2). 또한, C-2에서 메톡시기 및 C-3에서 아세토닐기의 위치는 H-1''a (δH 3.05) 및 H-1''b (δH 2.25), C-4 (δC 196.4), C-2 (δC 108.8) 및 C-3 (δC 79.9)의 상관관계뿐 아니라, C-2 (δC 108.8)에 대한 H-2'(δH 7.01), H-6'(δH 6.87) 및 2-OCH3(δH 3.12) 각각의 HMBC 상관 관계에 의해 확인되었다 (도 2).
화합물 5의 1D 및 2D NMR 데이터에 기초하여, 5의 평면 구조가 추론되었다. 이러한 C-2와 C-3에서 산소화된 플라보노이드는 사실상 흔하지 않은 구조이다 (도 3).
세파플라바 B ( Cepaflava B, 화합물 6)
담황색, 비정질 분말;
Figure pat00014
-28.8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 290 (2.31), 252 (1.69), 200 (2.66) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 200 (1.40), 236 (-0.35), 260 (-0.17), 293 (-0.61); IR (KBr) vmax 3318, 2942, 2832, 1636, 1448, 1116, 1024; 1H (400MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (100MHz, 메탄올 -d4) 데이터, 표 1 참조; HREIMS m/z 390.0954 ([M]+, calcd for C19H18O9, 390.0951).
세파플라바 B (화합물 6)는 HREIMS 스펙트럼에서 m/z 390.0954의 분자 이온 피크를 기준으로 화합물 5와 동일한 분자식 C19H18O9를 갖는 옅은 황색의 비정질 분말로 수득되었다. 화합물 6의 1H 및 13C NMR 데이터는 H2-1''[δH 2.42 및 2.56 (6) 및 2.25 및 3.05 (5)], C-4 [δC 199.0 (6), 196.4 (5)], C-1''[δC 49.8 (6), 41.3 (5)] 및 C-2''[δC 209.3 (6), 214.2 (5 )]의 화학적 이동의 차이를 제외하고는 화합물 5의 데이터와 매우 유사했다 (표 1). 이는 화합물 5 및 6이 입체 이성질체일 수 있음을 시사한다. 화합물 5 및 6에서 2-OCH3 및 3-OH 그룹의 상대적인 구성은 그들의 13C NMR 화학적 이동을 입체 이성질체, C-2 및 C-3 둘 모두에서 하이드 록실기를 갖는 트랜스-2,5-디하이드록시-6/8-메틸-7-메톡시플라바논 (trans-DMM) 및 cis-DMM DMM)dhk 비교함으로써 결정되었다. trans-DMM (δC 103.7/103.4, 75.4/75.2 및 197.5/197.3)의 13C NMR 화학적 이동 값은 cis-DMM (δC 105.4/104.8, 77.4 및 197.8/197.6)의 값보다 작았다. 동일한 패턴이 화합물 5 및 6 [δC 108.8, 79.9 및 196.4 (5) 및 δC 109.4, 80.0 및 199.0 (6)]에서 관찰되었으며, 이는 화합물 5 및 6이 각각 trans-, cis- 형태의 상대 구조를 갖는 것을 의미한다.
도 4에서 보는 바와 같이, 화합물 5 및 6의 ECD 스펙트럼은 이소아스틸빈(isoastilbin, 2R-form)과 유사하며, 이는 300 nm이하에서 음의 Cotton면 효과를 나타내었다 (도 4). 따라서 화합물 5 및 6의 절대 구성은 (2R, 3R)과 (2R, 3S)로 결정되었으며 각각 cepaflava A와 cepaflava B라고 명명하였다 (도 1).
세파플라바 C ( Cepaflava C, 화합물 7)
녹색, 비정질 분말;
Figure pat00015
-23.8 (c 0.07, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 292 (2.46), 268 (2.20), 209 (2.69) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 299 (0.03), 263 (0.29), 243 (0.25), 203 (3.04); IR (KBr) vmax 3324, 2945, 2831, 1733, 1450, 1116, 1036; 1H (500MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (125MHz, 메탄올-d4) 데이터, 표 2 참조; HRESIMS m/z 477.0436 ([M + Na]+, calcd for C22H14O11Na, 477.0434).
세파플라바 D ( Cepaflava D, 화합물 8)
밝은 갈색, 비정질 분말;
Figure pat00016
-9.4 (c 0.08, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 292 (2.32), 268 (2.05), 209 (2.54) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 299 (-0.51), 261 (-0.14), 248 (-0.21), 203 (3.94); IR (KBr) vmax 3324, 2945, 2831, 1733, 1450, 1116, 1036; 1H (500MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (125MHz, 메탄올-d4) 데이터, 표 2 참조; HRESIMS m/z 477.0436 ([M + Na]+, calcd for C22H14O11Na, 477.0434).
세파플라바스 C (화합물 7) 및 D (화합물 8)는 각각 녹색 및 밝은 갈색의 비정질 분말로서 단리되었다. 화합물 7 및 8의 분자식은 HRESIMS 스펙트럼에서 나트륨 첨가 분자 이온 피크에 기초하여 동일한 C22H14O11 인 것으로 결정되었다. 화합물 7의 1H NMR 데이터는 화합물 8과 유사한 패턴을 보였다. 즉, 화합물 7의 D-링의 [δ H 7.676 (1H, dd, J = 9.0, 2.0 Hz, H-6''), 7.682 (1H, d, J = 2.0, H-2''), 및 7.02 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-5'')] 및 B-링의 [δ H 7.23 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-2'), 7.05 (1H, dd, J = 8.5, 2.3 Hz, H-6'), 및 6.69 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5')]과 화합물 8의 D-링의 [δ H 7.70 (1H, dd, J = 8.5, 1.8 Hz, H-6''), 7.61 (1H, d, J = 1.8, H-2''), 및 7.12 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5'')], B-링의 [δ H 7.24 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2'), 7.07 (1H, dd, J = 8.5, 2.2 Hz, H-6'), 및 6.71 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5')] 및 2개의 meta-커플된 양성자 신호인 화합물 7의 [δ H 5.93 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 5.94 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6)] 및 화합물 8의 [δ H 5.96 (2H, s, H-6 and H-8)] 는 유사한 패턴을 보였다.
13C NMR의 데이터의 분석은 다음을 포함하여 총 22 개의 탄소 공명을 나타냈다. 화합물 7 및 8의 C-1'''에서의 에스테르 카르보닐 신호 (δ C 169.1), C-4에서 케톤 카보닐 신호 즉, 화합물 7은 δ C 189.6, 화합물 8은 189.7, 2개의 4차 탄소 특성 신호 즉, C-3의 경우, 화합물 7은 δ C 92.1, 화합물 8은 91.8, C-2의 경우 화합물 7은 δ C 101.8, 화합물 8은 101.9 및 18개의 방향성 탄소가 탄소 공명을 나타내었다. C-2 및 C-3에서의 이들 2개의 4차 탄소 특성의 신호는 화합물 5 및 6의 2,3-탈산소 플라바논 구조와 유사하였다. 그러나 C-3는 화합물 5 (δ C 79.9) 및 6 (δ C 80.0)과 비교하여 차폐되지 않았다. 화합물 7 및 8의 이러한 NMR 데이터는 2개의 앞서 보고된 위치이성질체와 거의 동일하여, 케르세틴과 프로토카테츄익산에서 추출된 축합 화합물 인 것으로 추정되었다. δ C 169.1에 대한 H-2'' (화합물 7은 δ H 7.682, 화합물 8은 7.61) 및 H-6'' (화합물 7은 δ H 7.676, 화합물 8은 7.70), C-3'' (화합물 7은C 141.7, 화합물 8은 142.0) 및 C-4'' (화합물 7은 δ C 146.6, 화합물 8은 146.1)에 대한 H-5'' (화합물 7은, 화합물 8은 7.12)의 HMBC 상관와 함께, ABX 커플링 시스템, 카르복실기로, 화합물 7 및 8에 프로토카테츄익산 부분이 존재하는 것이 확인되었다. 케르세틴의 C-환의 공액 올레핀 결합(C-2/C-3)과 프로토카테츄익산의 ortho-디하이드록시기 (C-3''/ C-4)의 산화 커플링은 공간 배열로 인해보다 바람직한 cis-형태를 갖는 C2-C4''/C3-C3'' 또는 C2-C3''/C3-C4'' 디옥산 결합을 갖는 2 개의 위치 이성질체를 발생시킨다 (도 3). 따라서 화합물 7 및 8에 대해 총 4 개의 시스-이성질체 (7a, 7b, ent-7a 및 ent-7b)가 가능하다 (도 5A). HMBC 상관 관계가 7a와 7b (또는 ent-7a와 ent-7b)를 구별할 수 없다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 1H와 13C NMR 화학적 이동을 계산하고 실험값과 비교하여 주요 차이점이 H-2'' 및 H-5''에 있음을 밝혀냈다. 그림 5B에서 볼 수 있듯이 실험 δΔH -2''/H-5''는 화합물 7의 경우 0.67, 화합물 8의 경우 0.50이고 계산된 값은 7a의 경우 0.61, 7b의 경우 0.54 이었다. 화합물 7 및 8에 대한 가장 가능한 구조는 각각 7a 및 7b (또는 ent-7a 및 ent-7b)의 구조이다. 화합물 7 및 8 제안된 구조는 98 % 확률로 전체 계산 및 실험 1H 및 13C NMR 화학 이동에 대해 CP3 확률 방법을 사용하는 포괄적인 통계 분석으로 분석되었다. 화합물 7과 8의 절대 구성은 유사한 ECD Cotton 효과와 (2S, 3S) 구조적으로 유사한 구성을 갖는 화합물 9 (8의 메틸 에스테르)의 것과 동일한 음의 특정 회전값을 관찰하여 확인되었다 (도 4). 따라서, 도 1에 도시된 바와 같이 화합물 7 및 8의 구조로 밝혔졌고 각각 세파플라바 C 및 D로 명명하였다.
세파플라바 E ( Cepaflava E, 화합물 9)
회 녹색, 비정질 분말;
Figure pat00017
-11.8 (c 0.09, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 290 (2.58), 252 (2.31), 200 (2.80) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 295 (-0.95), 206 (4.62); IR (KBr) vmax 3324, 2945, 2831, 1733, 1450, 1116, 1036; 1H (500MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (125MHz, 메탄올-d4) 데이터, 표 2 참조; HRESIMS m/z 491.0588 ([M + Na]+, calcd for C23H16O11Na, 491.0590) 및 m/z 469.0763 ([M + H]+, calcd for C23H17O11, 469.0771).
세파플라바 E (화합물 9)를 회녹색의 비정질 분말로 분리하였다. HRESIMS에 의한 m/z 491.0588 [M+Na]+ (C23H16O11Na에 대한 계산치, 491.0590)에서의 나트륨 첨가 분자 이온 피크에 기초하여 화합물 9의 분자식을 C23H16O11로서 확립하였다. 화합물 9의 1H 및 13C NMR 데이터는 메톡시기의 공명 [δH 3.84 (3H, s), δC 52.6] 및 C-1'''에서 차폐된 카르복실 신호의 존재(화합물 8에서 δC 169.1 및 9에서 167.8)를 제외하고는 화합물 8의 데이터와 유사하였다. 이러한 차이는 화합물 9가 화합물 8의 메틸 에스테르 유도체임을 나타낸다.
C-1'''(δC 167.8)의 탄소와 메톡시 양성자 δH 3.84 사이의 HMBC 상관관계는 프로토 카테츄산의 카르복실기에서 메톡시기의 위치를 확인해주었다. 화합물 9 (0.47 ppm)의 비교적 작은 ΔδH -2''/H-5''값은 카르복실 산의 위치가 화합물 8의 위치와 동일함을 나타낸다(도 5C).
화합물 9의 실험적 특정 회전값은 2 개의 가능한 이성질체 (2R, 3R) 및 (2S, 3S)의 계산된 특정 회전값과 비교되었다. (2S, 3S)-9 및 (2R, 3R)-9에 대한 계산된 광학 회전은 B3LYP/6-311+G (d, p) 레벨에서 각각 -276.8 및 +276.8 였으나, 화합물 9의 기록된 값은 -11.8 이었으며, 이는 (2S, 3S) 형태의 계산된 값에 더 가까웠다. 따라서 화합물 9의 절대 구성 (cepaflava E)은 (2S, 3S)로 결정되었다 (도 1).
세파플라바 F ( Cepaflava F, 화합물 10)
청동색, 비정질 분말;
Figure pat00018
-26.3 (c 0.10, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 299 (2.51), 260 (2.46), 203 (2.90) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 319 (7.37), 288 (-2.90), 254 (0.04), 234 (-2.44); IR (KBr) vmax 3316, 2946, 2831, 1450, 1112, 1024; 1H (400MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (100MHz, 메탄올-d4) 데이터, 표 3 참조; HRESIMS m/z 787.1119 ([M + Na]+, calcd for C36H28O19Na, 787.1122) 및 m/z 765.1329 ([M + H]+, calcd for C36H29O19, 765.1303).
세파플라바 F (화합물 10)는 청동-황색 비정질 분말로서 수득되었고, 그의 HRESIMS는 m/z 787.1119 [M+Na]+ (C36H28O19Na에 대한 계산치, 787.1122)에서 나트륨 첨가 분자 이온 피크를 나타내어 분자식 C36H28O19의 분자식을 얻었다.
화합물 10의 1H NMR 스펙트럼은 2 개의 3 치환된 벤젠 고리 세트 [B-ring에 대하여 δH 6.95 (1H, s, H-2'), 6.86 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.73 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5') 및 B'-ring에 대하여 δ H 7.95 (s, 1H, H-2'''), 7.85 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6'''), 7.29 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5''')]; A-ring에 대하여 δH 5.90 (1H, s, H-6) 및 5.85 (1H, s, H-8)에서 2 개의 메타 커플링된 양성자 신호, A'-ring에 대하여 δH 6.54 (1H, s, H-6'')에서 방향족 양성자 신호 및 δH 4.92에 대하여아노머 양성자 (1H, d, J = 8.6Hz, H-1'''')를 나타내었다.
CF3COOH에 의한 화합물 10의 산 가수분해는 D-글루코스를 생성하였으며, 이는 TLC 이동 및 특정 회전을 실제 샘플의 것들과 비교하여 확인하였다. D-글루코스 부분의 β-구조는 아노머 양성자(H-1'''')의 큰 커플링 상수 (J = 8.6 Hz)로부터 추론되었다. 화합물 10의 13C NMR 스펙트럼으로 δC 119.4 (C-2), 81.8 (C-3) 및 192.6 (C-4)에서의 3 개의 특성 신호를 포함하여 30 개의 공명이 아글리콘 모티프와 상관되었다. 이러한 분광 데이터를 알려진 화합물 Lawsonia의 바이플라본 A와 비교한 결과, 화합물 10은 바이플라보노이드일 수 있음을 시사했다. 화합물 10과 Lawsonia 바이플라본 A의 구조적 차이는 D-포도당 부분과 3 치환된 벤젠 고리(B-ring)의 존재로, Lawsonia 바이플라본 A은 대신 2 치환된 벤젠 고리를 갖고 있다. C-4''' (δC 148.1)와 아노머 양성자 H-1'''' (δH 4.92)와의 HMBC 상관 관계는 당 그룹과 아글리콘 사이의 연결을 확인시켜준다 (도 2). 도 3에서 보는 바와 같이, 화합물 7-9의 제안된 생합성 경로에서 케르세틴과 프로토 카테츄산 간의 유리한 syn-첨가와 유사하게, 2 개의 케르세틴 분자의 결합은 syn-첨가를 통해 일어나 화합물 10의 cis-형태를 형성할 수 있다.
(2S, 3S)-구조를 갖는 화합물 10의 계산된 ECD 스펙트럼은 실험 결과와 잘 맞았으며 10의 절대 구성을 확인하였다 (도 4). 따라서, 화합물 10의 구조는 새로운 바이플라보노이드 글루코사이드(세파플라바 F)로 도 1에 도시된 바와 같이 특성화되었다.
세파플라바 G ( Cepaflava G, 화합물 11)
청동색, 비정질 분말;
Figure pat00019
+60.3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 303 (2.39), 255 (2.40), 201 (2.85) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 304 (7.02), 252 (-1.40), 239 (-2.32), 218 (2.10); IR (KBr) vmax 3316, 2946, 2831, 1450, 1112, 1024; 1H (400MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (100MHz, 메탄올-d4) 데이터, 표 3 참조; HRESIMS m/z 787.1119 ([M + Na]+, calcd for C36H28O19Na, 787.1122) 및 m/z 765.1329 ([M + H]+, calcd for C36H29O19, 765.1303).
세파플라바 H ( Cepaflava H, 화합물 12)
청동색, 비정질 분말;
Figure pat00020
-30.0 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 303 (2.38), 255 (2.40), 201 (2.83) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 304 (-4.79), 276 (1.79), 251 (0.69), 239 (1.28), 223 (-2.14), 199 (3.05); IR (KBr) vmax 3316, 2946, 2831, 1450, 1112, 1024; 1H (400MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (100MHz, 메탄올-d4) 데이터, 표 3 참조; HRESIMS m/z 787.1119 ([M + Na]+, C36H28O19Na에 대한 계산치, 787.1122) 및 m/z 765.1329 ([M + H]+, calcd for C36H29O19, 765.1303).
세파플라바 G (화합물 11) 및 H (화합물 12)는 모두 청동-황색 비정질 분말로서 수득되었다. 이 두 화합물은 HRESIMS 데이터 (화합물 11는 m/z 787.1105, 화합물 12[M+Na]+는 787.1115, 계산된 분자식 C36H28O19Na 787.1122)에 기초하여 동일한 분자식 C36H28O19를 공유하였다. 화합물 11 및 12의 1H와 13C NMR 데이터는 서로 매우 유사하지만, ECD 스펙트럼은 거울 이미지 (도 4)로, 한 쌍의 입체 이성질체가 될 수 있음을 시사하였다. 화합물 11 및 12의 1H NMR 스펙트럼을 조사한 결과 두 세트의 ABX 커플 링 시스템 [화합물 11의 B-ring에 대해 δ H 6.97 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2'), 6.86 (1H, dd, J = 8.5, 2.1 Hz, H-6'), 6.82 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5'), B'-ring에 대해 δ H 7.80 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2'''), 6.33 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, H-6'''), 7.02 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5''') 및 화합물 12의 B-ring에 대해 δ H 6.94 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2'), 6.81 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-6'), 6.76 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5') 및 B'-ring에 대해 δ H 7.78 (1H, s, H-2'''), 6.13 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6'''), 6.99 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5''')]; 2 개의 메타 결합된 양성자 신호 [화합물 11의 A-ring에 대해 δ H 5.99 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6) 및 6.02 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 화합물 12의 A-ring에 대해 δ H 5.93 (1H, s, H-6) 및 5.97 (1H, s, H-8)]이 나타났다. 화합물 11 및 12의 13C NMR 스펙트럼은 하나의 카보닐 탄소 (화합물 11 및 12에서 δ C 186.9), 하나의 산소화 탄소 (C-3, 화합물 11은 δ C 103.2, 화합물 12는 104.3) 및 하나의 고도로 차폐되지 않은 케탈 탄소 (C-2, 화합물 11은 δC 93.7, 화합물 12는 93.6)를 나타내었다. 이들 NMR 데이터를 문헌과 비교함으로써, 화합물 11 및 12는 2-[4-(β-D-글루코피라노실옥시)-3-히드록시페닐]-3,5,7-트리 히드록시-9-[2-(3,4-다이하이드록시페닐)-2,3-다이하이드로-2,3-에폭시-5,7-다이하이드록시-4H-1-벤조피란-4-온-8-일]-4H-1-벤조피란-4-온의 2 개의 입체 이성질체인 것으로 확인되었다.
이전의 연구에서, 개별 입체 이성질체는 정제되지 않았으며, 이의 절대 구성은 결정되지 않았었다. 화합물 11 및 12에 존재하는 2,3-에폭사이드의 절대 구성의 할당을 위해, 화합물 11 및 12의 실험적 ECD 스펙트럼을 시뮬레이션된 ECD 스펙트럼과 비교하였다. 도 4에 도시된 결과에 기초하여, 화합물 11 및 12의 절대 구성은 각각 (2S, 3S) 및 (2R, 3R) 형태로 추론되었다. 따라서, 화합물 11 및 12의 구조가 확립되었고 각각 cepaflava G 및 cepaflava H로 명명되었다 (도 1).
세파플라바 I ( Cepaflava I, 화합물 14)
청동색, 비정질 분말;
Figure pat00021
- 23.5 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 299 (2.53), 264 (2.26), 202 (2.87) nm; ECD (MeOH) λmax (Δε) 303 (0.26), 269 (0.49), 241 (0.43), 203 (3.15); IR (KBr) vmax 3324, 2945, 2832, 1684, 1449, 1037; 1H (500MHz, 메탄올-d4) 및 13C NMR (125MHz, 메탄올-d4) 데이터, 표 1 참조; HRESIMS m/z 791.0848 ([M + Na]+, calcd for C38H24O18Na, 791.0860) 및 m/z 769.1047 ([M + H]+, calcd for C38H25O18에 대한 계산치, 769.1041).
세파플라바 I (화합물 14)을 청동색 황색 비정질 분말로서 단리하였다. 분자식은 m/z 791.0848 [M+Na]+ (calcd for C38H24O18Na, 791.0860)에서 HRESIMS에 나트륨 첨가 분자 이온 피크에 의해 27 수준의 불포화를 암시하는 C38H24O18로 결정되었다. 화합물 14의 1H NMR 스펙트럼은 δ H 5.93 (2H, d, J = 2.7 Hz, H-6, H-6'')와 δ H 6.00 (2H, d, J = 2.7 Hz, H-8, H-8'')에서 2 개 세트의 메타-결합 방향족 수소 공명, δ H 3.88 (3H, s)에서 하나의 메톡시기, D-ring에서 [δ H 7.71 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6''''), 7.63 (1H, s, H-2''''), 7.18 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5'''')], B-ring에서 [δ H 7.21 (1H, s, H-2'), 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), and 6.69 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5')], B'-ring에서 [δ H 7.44 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'''), 7.34 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6''')및 6.93 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5''')] 의 3 개의 3 치환된 벤젠 고리의 존재를 나타냈다. 화합물 14의 13C NMR 스펙트럼은 2 개의 카르보닐기 (δC 189.7 및 189.3), 하나의 에스테르 카르보닐기 (δC 167.7), 하나의 메톡시기 (δC 52.6), 4 개의 특징적인 4 차 탄소 신호 (δC 101.8, 101.5, 91.9, 91.7), 12 개의 산소화 방향족 탄소 및 18 개의 sp2 메틴 탄소를 나타내었다. 상기 NMR 데이터는 화합물 14에 추가의 케르세틴 부분이 존재한다는 점을 제외하고는 9와 유사 하였다 (표 1, 2 및 도 5C). 화합물 14에서 C-2/C-2'' 또는 C-3/C-3''의 화학적 이동은 유사하지만, C-3' 및 C-4'는 C-3''' 및 C-4'''의 이동보다 하향장 이동 (~4ppm)하여 추가의 케르세틴 유닛이 C-3' 및 C-4'에 부착될 수 있음을 시사하였다.
C-2'' (δC 101.5) 및 C-3'' (δC 91.7)의 화학적 이동은 각각 C-2 (δC 101.8) 및 C-3 (δC 91.9)의 화학적 이동과 거의 동일했으며, 이러한 유사성은 추가의 케르세틴 유닛이 C-2 및 C-3 에서와 동일한 디옥산 결합을 통해 연결되었음을 암시한다. 화합물 7-9 에 대해 위에서 설명한 것처럼 화합물 14의 모든 디옥산 결합은 시스-형태로 제안되었고, 이러한 데이터를 기반으로 총 8 개의 이성질체가 가능하였다 (14a-14d 및 ent-14a-14d). 화합물 14의 평면 구조 및 상대 구성을 결정하기 위해, 14a-14d의 화학적 이동 (각 이성질체의 거울상 이성질체의 화학적 이동은 동일함)을 계산하고 실험값을 갖는 DP4 분석을 수행 하였다. 통계 결과, 100 % 확률로 화합물 14는 14b와 구조적 동등성을 나타냈다. 실험적 ECD 데이터를 계산된 14b의 ECD 및 그의 거울상 이성질체와 비교함으로써 화합물 14의 절대 구성을 추론하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 화합물 14의 실험적 ECD는 14b의 실험적 ECD와 잘 일치하여, 그 절대 구성이 2R, 3R, 2''S, 3''S로 추측되었고, 이들 데이터로부터, 화합물 14 (세파플라바 I)는 도 1에 나타낸 바와 같이 결정되었다.
분광 데이터의 포괄적 분석 및 문헌과의 비교에 기초하여, 6 개의 공지된 화합물의 화학 구조는 케르세틴 (quercetin, 화합물 1), 캠퍼롤 (kaempferol, 화합물 2), 이소람네틴 (isorhamnetin, 화합물 3), 케르세틴 4'-O-β-D- 글루코피라노시드 (quercetin 4'-O-β-D-glucopyranoside, 화합물 4), 1,3,11a- 트리하이드록시-9-(3,5,7- 트리하이드록시-4H-1-벤조피란-4-온-2-일)-5a-[4-(β-D-글루코피라노실옥시)-3-히드록시페닐]-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온 (1,3,11a-trihydroxy-9-(3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on-2-yl)-5a-[4-(β-D-glucopyranosyloxy)-3-hydroxyphenyl]-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-one, 화합물 13) 및 1,3,11a-트리히드록시-9-(3,5,7-트리히드록시-4H-1-벤조피란-4-온-2-일)-5a-[1,3,11a-트리히드록시-5a-(3,4-디히드록시페닐)-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온-9-일]-5,6,11-헥사히드로-5,6,11-트리옥사나프타센-12-온(1,311a-trihydroxy-9-(3,5,7-trihydroxy-4h-1-benzopyran-4-on-2-yl)-5a-[1,3,11a-trihydroxy-5a-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-on-9-yl]-5,6,11-hexahydro-5,6,11-trioxanaphthacene-12-one, 화합물15)이었다.
< 실시예 2. 항산화 활성>
하기 표 4에 나타낸 바와 같이 농도 의존적 방식으로 2개의 자유 라디칼 DPPH 및 ABTS
Figure pat00022
+ 에 대해 화합물 5-15의 소거 용량을 조사하였다. DPPH 및 ABTS
Figure pat00023
+ 소거에서의 억제 결과를 확인하기 위해 아스코르브산 및 트롤록스를 기준 화합물로 사용하였다.
그 결과, 화합물 5-15은 모두 4.25-47.69 및 7.12-23.45 μM의 IC50 범위를 갖는 우수한 DPPH 및 ABTS
Figure pat00024
+ 억제를 나타냈다. 특히 화합물 10-12는 뛰어난 라디칼 소거 능력을 보였다. 화합물 11의 경우, DPPH 및 ABTS
Figure pat00025
+의 IC50은 각각 4.25 및 7.12 μM로 가장 뛰어난 항산화능을 나타내었으며, 화합물 10은 DPPH 및 ABTS
Figure pat00026
+의 IC50 가 각각 6.27 7.84 μM을, 화합물 12는 각각 8.88 및 8.14 μM의 IC50 을 나타내었다.
compounds IC50 (μM) a enzyme kinetic analysis with PTP1B
DPPH scavenging activity ABTS
Figure pat00027
+ scavenging activity		 PTP1B α-glucosidase K i (μM) h inhibition type g
1 - - 25.34 ± 0.91 20.14 ± 0.92 - -
2 - - 62.42 ± 1.73 61.44 ± 1.16 - -
3 - - 56.36 ± 0.81 17.75 ± 0.02 - -
4 - - ＞100 ＞100 - -
5 12.50 ± 2.18 7.93 ± 0.83 ＞100 74.44 ± 2.60 - -
6 39.87 ± 0.88 9.84 ± 0.79 ＞100 ＞100 - -
7 28.05 ± 1.29 9.13 ± 0.67 ＞100 13.17 ± 0.47 - -
8 13.51 ±3.09 9.87 ± 0.28 22.55 ± 0.71 15.81 ± 1.23 - -
9 14.89 ± 0.11 10.09 ± 0.37 22.33 ± 0.81 12.55 ± 0.06 - -
10 6.27 ± 0.43 7.84 ± 0.41 17.01 ± 0.01 9.71 ± 0.23 - -
11 4.25 ± 3.40 7.12 ± 1.47 24.07 ± 1.74 11.10 ± 0.03 - -
12 8.88 ± 0.12 8.14 ± 0.28 14.29 ± 0.03 10.92 ± 0.16 - -
13 14.53 ± 2.28 8.82 ± 0.35 6.82 ± 0.08 6.80 ± 0.07 3.72 mixed
14 47.69 ± 1.18 23.45 ± 4.67 1.68 ± 0.02 2.30 ± 0.01 1.25 competitive
15 46.65 ± 1.37 9.86 ± 0.29 1.13 ± 0.01 0.89 ± 0.01 2.18 competitive
ascorbic acid b 3.50 ± 0.05 - - -
trolox c - 5.14 ± 0.18 - -
ursolic acid d - - 12.09 ± 0.01 -
sodium orthovanadate e - - 23.2 ± 1.15 -
acarbose f - - - 257.41 ± 0.57
a These data are expressed as the mean ± SEM of triplicate experiments.
b , c Positive controls for DPPH and ABTS
Figure pat00028
+ scavenging assays, respectively.
d , e Positive controls for PTP1B inhibitory assay.
f Positive controls for α-glucosidase inhibitory assay.
g Determined by Lineweaver-Burk plots.
h Determined by Dixon plots.
< 실시예 3. PTP1B 및 α-글루코시다아제 억제 활성>
α-글루코시다아제 및 PTP1B 효소의 억제는 당뇨병 및 비만과 같은 대사 질환을 치료하는 효과적인 전략이다. 화합물 1 내지 15의 PTP1B 및 α-글루코시다아제 억제 활성에 대해 분석한 결과를 상기 표 4에 나타내었다.
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 화합물 1 내지 3 및 8 내지 15의 PTP1B 억제 능력은 IC50이 1.13 내지 62.42 μM 범위로 용량-의존적이었다. 특히, 화합물 15 (IC50 = 1.13 μM), 14 (IC50 = 1.68 μM) 및 13 (IC50 = 6.82 μM)은 강한 PTP1B 억제 능력를 나타내었으며, 두 양성 대조군보다 더 강력했다 [우르솔산 (IC50 = 12.09 μM) 및 나트륨오르토바나데이트 (IC50 = 23.20 μM)]. 화합물 10 및 12 도 각각 17.01 및 14.29 μM의 IC50 값을 나타내었으며, 화합물 8, 9, 11 및 1-3 또한 일정한 PTP1B 억제 활성을 나타냈다.
역시 상기 표 4에서 보는 바와 같이, 화합물 1 내지 3, 5 및 7 내지 15는 0.89-74.44 μM의 IC50 범위에서 α-글루코시다아제 억제 활성을 나타내었으며, 이러한 α-글루코시다아제 억제 활성은 양성 대조군으로 사용한 아카보오스의 활성보다 현저히 높았다 (IC50 = 257.41 μM). 특히, 화합물 14 및 15는 강력한 PTP1B 억제제 활성을 갖고 있으면서 또한 탁월한 α-글루코시다아제 억제 활성을 나타내었으며, 각각 아카보오스보다 100 배 및 250 배 더 높은 활성을 나타내는 것이다. 화합물 13 또한 높은 PTP1B 억제제 활성을 갖고 있으면서 강력한 α-글루코시다아제 억제 활성을 나타내었다 (IC50 = 6.80 μM).
화합물 3 및 7 내지 12도 모두 IC50 값이 20 μM 이하의 높은 α-글루코시다아제 억제 활성을 나타내었으며, 화합물 1 및 2 또한 양성 대조군으로 사용한 아카보오스의 활성보다 현저히 높은 α-글루코시다아제 억제 활성을 나타내었다.
< 실시예 4. PTP1B 억제의 효소 동역학>
라인 위버-버크 및 딕슨 플롯을 사용하여 화합물 13-15의 효소 억제 특성을 결정하였다. 실험 결과, 화합물 14 및 15는 각각의 화합물에 대한 회귀선이 y- 축에서 교차하여 경쟁적 억제제로 확인되었다. 또한, 딕슨 플롯으로부터, 화합물 14 및 15에 대한 억제 상수 (Ki) 값은 각각 1.25 및 2.18 μM으로 결정되었다 (표 4). 또한, 화합물 13의 농도를 증가 시키면 공통 y- 축 절편을 공유하지만 다른 구배를 갖는 일련의 라인이 생성되었으며, 이것으로 화합물 13은 Ki 값이 3.72 μM 인 혼합형 억제제임을 확인하였다 (표 4).
< 실시예 5. PTP1B 억제의 분자 도킹 시뮬레이션>
AutoDock 4.2 소프트웨어를 사용하여 화합물 13 및 15를 PTP1B의 결정 학적 구조의 결합 부위에 도킹하여 이들 활성 화합물의 상호 작용 및 결합 방식을 확인하였다. 도킹 절차를 검증하고 최적화하기 위하여, 본 발명자들은 2 개의 고유한 공동 리간드, 즉 화합물 A (알로스테릭 억제제) 및 화합물 C (촉매 억제제)를 PTP1B의 알로스테릭 및 촉매 부위에 각각 도킹하였다. 이전 연구에 따르면 PTP1B의 α3-α6 나선에 대한 α7 나선의 결합 간섭은 효소 활성의 알로스테릭 억제로 이어질 수 있다. 본 도킹 실험 결과, 알로스테릭 부위의 PTP1B-13 억제제 복합체는 -7.92 kcal/mol의 결합에너지를 나타내었으며, 4 개의 수소결합 상호작용 및 α3 나선의 Ala189, α6 나선의 Glu276, Gly277 및 Lys279 잔기와 상호작용을 갖다. 또한, 화합물 13 및 화합물 A는 같은 알로세트릭 잔기, 즉, 수소 결합 상호 작용을 통해 α6 나선의 Glu276, Van der Waals 상호 작용을 통해 Met282를 공유하였다를 공유하였다. PTP1B에 대한 화합물 13의 촉매 억제 (-6.41 kcal/mol)는 Gln266, Thr263, Gly183, Arg221, Arg24 및 Asp48 잔기와의 6 개의 수소 결합을 나타냈다. 화합물 C와 유사하게, 화합물 13은 또한 주요 촉매 잔기인 Arg221 및 Asp48과의 2 개의 수소 결합 상호 작용과 관련되어 있다. 또한, 화합물 13은 Phe182, Ala27, Gly259, Val49, Ile219, Ala217, Tyr46, Gly220, Asp265 및 Val184와 소수성 상호 작용을 보여 PTP1B와 화합물 13 사이의 단백질-리간드 상호 작용을 강화시켰다. 화합물 15는 -8.01 kcal/mol 결합 에너지로 PTP1B의 촉매 영역에 결합되었으며, 이는 PTP1B 잔기에 대한 높은 친화성을 나타낸다. 예측된 결합 모드는 화합물 15가 히드록시기를 통해 Arg221, Asp48, Gln 262, Arg24 및 Gly183 잔기와 5 개의 수소 결합 상호 작용을 형성함을 보여주었다. 그 중에서도 Arg221은 촉매 억제에 필수적인 PTP1B의 대표적인 잔기이다. 또한 화합물 15와 화합물 C는 소수성 상호 작용을 통해 동일한 잔기 Gln266, Trp179 및 Val49를 공유하고 π-황 상호 작용을 통해 Met258 잔기를 공유하였다. 이와 같은 도킹 결과로부터, 화합물 13 및 15는 각각 PTP1B의 혼합 및 경쟁적 억제제임을 확인하였다.

Claims (5)

  1. 하기 [화학식 1]의 화학 구조를 갖는 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 11) 및 세파플라바 H (Cepaflava H, 화합물 12)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00029
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 11) 또는 세파플라바 H (Cepaflava H, 화합물 12)는 양파 외피를 물, C1 내지 C4 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물로부터 분리한 것임을 특징으로 하는 항당뇨 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 11) 또는 세파플라바 H (Cepaflava H, 화합물 12)는 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항당뇨 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 11) 또는 세파플라바 H (Cepaflava H, 화합물 12)는 단백질 티로신 포스파타제 1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 또는 알파-글루코시다제에 대하여 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항당뇨 조성물.
  5. 하기 [화학식 1]의 화학 구조를 갖는 세파플라바 G (Cepaflava G, 화합물 11) 또는 세파플라바 H (Cepaflava H, 화합물 12).
    [화학식 1]
    Figure pat00030
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