CN112778386A - 一种具有免疫抑制活性的化合物Ldj-29及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药用化合物的筛选技术领域，具体公开了一种从药用植物日本蛇根草总生物碱提取物中分离得到的具有免疫抑制活性的化合物Ldj‑29及其制备方法与应用。本发明对提取分离出的化合物Ldj‑29进行了结构鉴定，确证了其结构式；本发明还进一步验证了化合物Ldj‑29的生物活性，结果显示：其非特异性淋巴细胞毒性作用均较小；对ConA诱导的T细胞增殖反应无显著抑制作用，但对于LPS诱导的B细胞增殖反应具有显著的选择性抑制活性，说明该化合物对于丝裂原诱导的B细胞增殖具有选择抑制作用。

Description

一种具有免疫抑制活性的化合物Ldj-29及其应用

技术领域

本发明涉及天然药用化合物的筛选技术领域，具体涉及一种从药用植物日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)总生物碱提取物中分离得到的具有免疫抑制活性的化合物Ldj-29及其制备方法与应用。

背景技术

免疫抑制剂是一类重要药物，用在器官移植抗排斥反应以及治疗多种自身免疫性疾病比如类风湿关节炎、多发性硬化症、银屑病以及自身免疫性溶血贫血等。

天然产物因其结构多样性，是药物研发的重要资源。从天然产物中发现新的、安全有效的免疫抑制活性分子是研发新型免疫抑制剂的有效手段。

常用的免疫抑制剂主要有五类：

(1)糖皮质激素类，如可的松和强的松；

(2)微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；

(3)抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；

(4)多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；

(5)烷化剂类，如环磷酰胺等。

根据合成方法，免疫抑制剂大致可分为：

(1)微生物酵解产物：环孢菌素CsA类、他克莫司Tacrolimus(FK506)、雷帕霉素Rapamycin(RPM)及其衍生物SDZ RAD、Mizoribine(MZ)等；

(2)完全有机合成物：大部分来源于抗肿瘤物，主要有烷化剂和抗代谢药二大类。包括激素类(肾上腺皮质激素、糖皮质激素)、硫唑嘌呤(azathioprine，Aza)、甲氨蝶呤、Leflunomide、breqinar(BQR)等；

(3)半合成化合物：RS61443(mycophenolate mofetil，MMF)、SDZIMMl25、DeoxysPergualin(DSG，脱氧精瓜素)等；

(4)生物制剂：antithymocyte globulin(ATG)、antilymphocyte globulin(ALG)等。

根据其发展状况，免疫抑制剂大致可分为：

第一代：以肾上腺皮质激素(包括肾上腺皮质激素和糖皮质激素等，药品有强的松和甲基强的松龙Methyprednisolone、雷公藤多苷片、硫唑嘌呤、抗淋巴细胞球蛋白即抗淋巴细胞免疫球蛋白ALG)为代表，主要作用为溶解免疫活性细胞，阻断细胞的分化，其特点为非特异性，为广泛的免疫抑制剂，ALG对骨髓没有抑制作用。主要副作用是可引起代谢紊乱、高血糖、高血脂、高血压。目前总的倾向是尽可能减少其用量或停用，但移植界对此尚有争论；

第二代：以环孢素(环孢菌素、环孢菌素A、山地明、赛斯平、环孢多肽A、环孢灵(Cy-A、Cs-A)、新出地明(Neoral)和他克莫司为代表，为细胞因子合成抑制剂，主要作用是阻断免疫活性细胞的白细胞介素2(IL-2)的效应环节，干扰细胞活化，其以淋巴细胞为主而具有相对特异性。CsA和FK506已被FDA批准用于临床，其余药物尚处于临床试验阶段，它们主要的副作用是具有肾毒性；

第三代：以雷帕霉素、霉酚酸脂(Mycophenolate Mofetil，MMF)为代表，对PI3K相关相关信号通路进行抑制，从而抑制免疫细胞增殖和扩增，与第二代制剂有协同作用；

第四代：以抗IL-2受体单克隆抗体、FTYZO等为代表。

根据其临床应用情况，免疫抑制剂分类为：

(1)预防性用药：CsA、FK506、MMF、Aza、Prednisone；

(2)治疗/逆转急性排斥反应(救治用药)：MP(甲基强的松龙)、ALG或ATG、Murononab-CD3或CD4、MMF、FK506等。

(3)诱导性用药(因急性肾小管坏死而出现延迟肾功能、高危病人、二次移植、环孢素肾毒性病人)：ATG或ALG、OKT3或OKT4，Simulect或Zenapax等。

现用的免疫抑制剂的副作用主要有：

一、骨髓抑制，可能发生粒细胞减少或缺乏症；

二、肝功能损害，使转氨酶升高；

三、性功能损害，尤其是男性，等。

目前，临床上有较多的抑制T细胞增殖的免疫抑制药物，但是缺乏安全的、有效的抑制B细胞增殖的免疫抑制剂。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种新化合物Ldj-29，为从药用植物日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)总生物碱提取物中分离得到，其结构主要通过核磁共振(NMR)、高分辨质谱(HRESIMS)等技术确定。

本发明提供的化合物Ldj-29结构式如下(结构中的序号为原子编号)：

该化合物显示出很强的免疫抑制活性，尤其对B细胞增殖反应具有显著的选择性抑制活性。

与现有技术相比，本发明的化合物Ldj-29的优点和有益效果在于：

1、提供了一种新的天然化合物。

2、提供了一种具有选择性抑制B细胞增殖的天然产物—化合物Ldj-29，其对ConA诱导的T细胞增殖反应无显著抑制作用，但对于LPS诱导的B细胞增殖反应具有显著的选择性抑制活性，说明该化合物对于丝裂原诱导的B细胞增殖具有选择抑制作用。

3、提供了一种化合物，其非特异性淋巴细胞毒性作用均较小。

具体实施方式

下面申请人通过具体的实施例对本发明的化合物Ldj-29、其制备方法和药用活性确认作进一步描述，但以下内容不应在任何程度上被理解为对本发明权利要求书请求保护范围的限制。

实施例1、化合物Ldj-29的分离提取及结构确认

化合物的制备分离流程：

湖南野生日本蛇根草风干后，称取10千克粉碎，每次用70v/v％乙醇12升浸泡24小时，共浸泡三次，过滤回收合并三次的浸泡液，减压浓缩后得浸膏。将此浸膏用0.37wt％盐酸稀释并控制pH为2～3，每次用与被萃取的混合液同体积的乙酸乙酯萃取，萃取三次，保留并合并水层；水层用2.8wt％的氨水调节pH为9～10，再每次用与被萃取的混合液同体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，保留合并乙酸乙酯层，浓缩得总生物碱提取物78克。

将上步所得总生物碱提取物经正相硅胶(200～300目)柱层析，使用氯仿/甲醇混合溶剂(氯仿/甲醇体积比依次为90/10、80/20、70/30、60/40、50/50、纯甲醇)洗脱系统进行洗脱，每个比例分别洗脱5升后浓缩回收依次得到六个组分A～F。氯仿/甲醇体积比60/40洗脱出的D组分(7克)经中压色谱进行分离，使用甲醇/水混合溶剂梯度(甲醇/水体积比依次为30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20)进行洗脱，每个比例分别洗脱800毫升浓缩后得到六个亚组分D1～D6。甲醇/水体积比50/50洗脱出的D3组分(0.8克)经高效液相色谱分离，以乙腈/水(体积比从20/80至50/50)为洗脱系统线性洗脱25分钟，在12.3分钟制备得到纯化合物Ldj-29(3毫克)。

所得化合物Ldj-29的核磁共振数据：

化合物Ldj-29的其他理化数据：

外观：透明油状物；比旋光度[α]²⁷ _D-35.0,(c 0.09,MeOH)；红外IR(KBr)ν_max:3425,2973,1702,1610,1648,1474,1351,1278,1096,1029cm^-1；高分辨质谱HRESIMS(positive):m/z 627.2162[M+Na]⁺(calcd for C₂₉H₃₆N₂O₁₂Na,627.2160).

根据上述检测结果判断出本发明化合物Ldj-29的结构式为：

实施例2、化合物Ldj-29的免疫生物活性验证实验

【模型名称】

小鼠淋巴细胞的非特异性毒性作用及增殖反应实验

【实验原理】

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在570nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。可用于细胞毒性分析。

T、B淋巴细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。刀豆蛋白A(ConA)和细菌脂多糖(LPS)分别是一种丝裂原，可分别刺激T、B淋巴细胞发生增殖和分化，这一过程与体内淋巴细胞的活化过程相似，因此，丝裂原诱导的淋巴细胞增殖常被用来作为评价淋巴细胞功能的指标。[³H]-胸腺嘧啶脱氧核苷(³H-TdR)掺入法是一种用来检测细胞增殖的方法，反映细胞DNA的合成。在细胞培养基中加入氚(³H)标记的DNA前身物质胸腺嘧啶核苷(TdR)，则³H-TdR被作为合成DNA的原料被摄入细胞，掺入到新合成的DNA中。根据同位素掺入细胞的量可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位素³H，经液体闪烁测量法测出，将³H每分脉冲数(cpm)加以计算，可反映淋巴细胞增殖的程度。

【实验动物】

来源，种系，品系：BALB/c纯系小鼠，雌性，18-20克，购自中国科学院上海实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0017号。动物饲养于上海药物研究所SPF级动物房，实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2013-0049号，动物至少饲养一周后使用。温度22±1℃，湿度55±5％，12小时光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。

【实验方法】

小鼠脾脏淋巴细胞的制备：

小鼠脱脊椎处死，无菌取其脾脏处理分散于RPMI-1640培养基制备单个细胞悬液，红细胞裂解液去除红细胞，调节细胞浓度。

MTT法检测化合物Ldj-29对小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响：

小鼠脾脏淋巴细胞悬液8×10⁵/孔接种于96孔板，同时加入不同浓度的化合物Ldj-29，采用免疫抑制剂环孢霉素A(cyclosporinA,CsA)作为阳性对照药物，另设相应的溶媒对照(细胞对照)及培养液本底对照(空白对照)，总体积为200μL。37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时。结束培养前4小时加入浓度为5mg/mL的MTT溶液100μL。至培养结束，吸弃上清，每孔加入200μL DMSO溶解紫色结晶，于酶标仪570nm处测定OD值。

³H-TdR掺入法检测化合物Ldj-29对小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖功能的影响：

小鼠脾脏淋巴细胞悬液4×10⁵/孔接种于96孔板，加入ConA(终浓度5μg/mL)或LPS(终浓度10μg/mL)，再加入不同浓度化合物Ldj-29，采用CsA作为阳性对照药物，并设相应的无ConA、LPS细胞对照孔以及无药物刺激对照孔，总体积为200μL。37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时。培养结束前8小时，每孔加入25μL³H-胸腺嘧啶核苷酸(10μCi/mL)。继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪(MicroBeta Trilux，PerkinElmer)读取掺入细胞DNA的³H-TdR量，以cpm值代表细胞增殖的情况。

【结果评定】

注：每组3个样，计算平均值。

选择指数SI＝CC₅₀/IC₅₀，判断样品是否具有生物学意义的活性作用，SI大于2以上被认为具有生物学效应。

【统计方法】

所有各项指标检查结果经Excel 2010和GraphpadPrism 6软件处理。

根据实验结果绘制剂量-反应曲线，计算出CC₅₀值(50％Cytotoxicconcentration)，即对50％的细胞致死毒性浓度，以及IC₅₀值(50％inhibitoryconcentration)，即指具有50％抑制效应时的化合物浓度。

【实验结果】

实验一、化合物细胞毒性及增殖抑制活性初筛。

受试化合物及阳性对照以DMSO溶解，储备液浓度为20mM。对于细胞毒性检测，受试化合物以100μM为最高浓度，16倍梯度稀释，设3个浓度：100、6.25、0.39μM；CsA以5μM为最高浓度，16倍梯度稀释，设3个浓度：5、0.3125、0.0195μM，均以培养液稀释。对于细胞增殖反应检测，受试化合物以50μM为最高浓度，8倍梯度稀释，设3个浓度：50、6.25、0.78μM；CsA以2.5μM为最高浓度，8倍梯度稀释，设3个浓度：2.5、0.3125、0.039μM，均以培养液稀释。各化合物浓度下淋巴细胞存活率及增殖抑制百分比见下表1：

表1.各化合物浓度下淋巴细胞存活率及增殖抑制百分比

实验二、化合物细胞毒性及增殖抑制活性确认。

受试化合物和阳性对照以DMSO溶解，储备液浓度为20mM。对于细胞毒性检测，受试化合物以400μM为最高浓度，2倍梯度稀释，设10个浓度：400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78μM；CsA以5μM为最高浓度，2倍梯度稀释，设10个浓度：5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.15、0.078、0.039、0.019、0.0095μM，均以培养液稀释。对于细胞增殖反应检测，受试化合物以200μM为最高浓度，2倍梯度稀释，设10个浓度：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39μM；CsA以2.5μM为最高浓度，2倍梯度稀释，设10个浓度：2.5、1.25、0.625、0.31、0.15、0.078、0.039、0.019、0.0095、0.00475μM，以培养液稀释。CC₅₀及IC₅₀见下表2：

表2.化合物对于淋巴细胞毒性及增殖抑制活性

【实验小结】

筛选结果显示：

1.化合物Ldj-29的非特异性淋巴细胞毒性作用均较小。

2.化合物Ldj-29对ConA诱导的T细胞增殖反应无显著抑制作用，但对于LPS诱导的B细胞增殖反应具有显著的选择性抑制活性，说明该化合物对于丝裂原诱导的B细胞增殖具有选择抑制作用。

Claims (2)

1.一种化合物Ldj-29，其结构式为：

2.权利要求1所述的化合物Ldj-29在制备抑制B细胞增殖的免疫抑制剂中的应用。