CN109295125B - 安莎霉素类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了安莎霉素类化合物及其制备方法和应用。本发明从一株柳珊瑚共附生放线菌Streptomyces sp.SCSGAA0027的发酵液中分离得到新的具有抑制热休克蛋白90αH活性的herbimycin G、具有抗肿瘤活性的herbimycins H‑K、以及具有抗HSV‑1病毒活性的herbimycin M，可用于抗肿瘤药物、热休克蛋白90α抑制剂、以及抗病毒药物先导化合物的研究。

Description

安莎霉素类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及海洋生物领域，具体涉及安莎霉素类化合物herbimycins G-K、herbimycin M及其制备方法与应用。
背景技术
海洋微生物资源丰富，其次生代谢产物类型多样、结构新颖，且许多代谢产物具有显著的生物活性，是天然药物研究的热点。安莎霉素类化合物是放线菌代谢产物中的一类重要的聚酮类化合物，其中的许多化合物结构新颖、且具有显著抗肿瘤、抑制热休克蛋白90α、抗菌等活性，比如geldanamycin、17-O-demethylgeldanamycin、ansalactam A、natalamycin A、juanlimycins等，并以geldanamycin的抗肿瘤活性为最强，但geldanamycin对肿瘤细胞和正常细胞的毒性都很强，其衍生物17-O-demethylgeldanamycin的细胞毒活性虽然比geldanamycin弱，但由于细胞毒活性的选择性相对较好，目前已作为抗肿瘤药物进行临床试验阶段。
虽然后续发现的新安莎霉素类化合物的细胞毒活性和抑制热休克蛋白90α的活性均比geldanamycin和17-O-demethylgeldanamycin弱，但由于安莎霉素类化合物的结构多样性和新颖性、以及显著的多样化生物活性，至今仍吸引了许多有机化学家和药理学家开展安莎霉素类化合物的新发现、全合成、生物合成、以及药理实验等，期望能发现新型安莎霉素类化合物、以及其更广泛的生物活性和更好的细胞毒选择性。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供六个新的安莎霉素类化合物herbimycins G-K、herbimycin M，所述的化合物herbimycins G-K、herbimycin M的结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0001822064000000021
其中，化合物1为herbimycin G；化合物2为herbimycin H；化合物3为herbimycinI；化合物4为herbimycin J；化合物5为herbimycin K；化合物6为herbimycin M。
本发明的第二个目的在于提供一种安莎霉素类化合物herbimycins G-K、herbimycin M的制备方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备放线菌Streptomyces sp.SCSGAA 0027的发酵液；
(b)将步骤(a)得到的发酵液的菌液和菌体分离，菌液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿萃取，菌体用丙酮萃取，萃取液浓缩后分别得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物、氯仿提取物和丙酮提取物；
(c)分别将步骤(b)得到的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物、氯仿提取物和/或丙酮提取物过反相硅胶柱层析柱，依次用甲醇体积分数为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的甲醇-水系统梯度洗脱，分别收集流份，其中用50％MeOH/H2O洗脱的流份经过反相硅胶柱层析得到粗品，经HPLC纯化，分别得到六个安莎霉素化合物herbimycinsG-K、herbimycin M。
所述的50％MeOH/H2O洗脱的流份经过反相硅胶柱层析得到粗品，经HPLC纯化，分别得到六个安莎霉素化合物herbimycins G-K、herbimycin M。优选为50％MeOH/H2O洗脱的流份，将流分经过反相硅胶柱层析，用体积分数为20～60％乙腈-水溶液进行梯度洗脱，得到四个流分F-1～F-4；将流分F-1采用半制备高效液相色谱仪，在YMC-Pack ODS柱,流速5mL/min，流动相为体积比38:62的乙腈-水溶液的色谱条件进行纯化，收集保留时间为19min的组分，得到化合物herbimycin G，收集保留时间为28min的组分，得到化合物herbimycin H；将流分F-2采用半制备高效液相色谱仪，在YMC-Pack ODS柱，流速5mL/min，流动相为体积比40:60的乙腈-水溶液的色谱条件进行纯化，收集保留时间为26min的组分，得到化合物herbimycin I，收集保留时间为30min的组分，得到化合物herbimycin J，收集保留时间为35min的组分，得到化合物herbimycin K；将流分F-3过常压硅胶柱层析分离，用二氯甲烷/丙酮以体积比为9:1,8:2,7:3,6:4,1:1进行梯度洗脱，顺序得到5个小组分F-3-1,F-3-2,F-3-3,F-3-4,F-3-5；将用二氯甲烷/丙酮体积比为7:3洗脱得到的流份F-3-3采用半制备高效液相色谱仪，在YMC-Pack ODS柱，流速5mL/min，流动相为体积比48:52的乙腈-水溶液的色谱条件进行纯化，收集保留时间为45min的组分，得到化合物herbimycin M。
步骤(a)中所述的发酵液可通过以下方法制备：将放线菌Streptomycessp.SCSGAA0027接种到放线菌适用的培养基中，在通常的发酵条件下制得，优选通过以下方法制备得到：将放线菌Streptomyces sp.SCSGAA 0027接种到ISP2培养基中，待细菌生长至培养液变浑浊后，将细菌培养液接种到ISP2培养基中，于摇床200rpm/min，28℃培养5天后，收取发酵液；所述的ISP2培养基每升含酵母膏0.4g、麦芽膏0.5g、葡萄糖0.4g、海盐1.5g、维生素B1 0.01g、维生素B6 0.01g、维生素B2 0.01g、烟酸0.01g、维生素H0.01g、苯丙氨酸0.01g、丙氨酸0.03g，溶剂为水，pH至7.2-7.4。
经相关实验发现，本发明的化合物herbimycin G具有抑制热休克蛋白90α的活性，IC50值为96.1μM；化合物herbimycin H、herbimycin I、herbimycin J或herbimycin K具有抗肿瘤活性，它们抑制四种人肿瘤细胞K562、HL60、A549、MCF-7生长的IC50值分别为：化合物herbimycin H的IC50值分别为43.0、86.0、65.8、70.3μM；化合物herbimycin I的IC50值分别为14.0、27.4、16.8、20.0μM；化合物herbimycin J的IC50值分别为43.5、35.0、37.2、36.2μM；化合物herbimycin K的IC50值分别为18.3、48.0、13.0、35.5μM；化合物herbimycin M具有抗HSV-1病毒活性，IC50值为18.7μM。
因此，本发明的第三个目的在于提供化合物herbimycin G在制备热休克蛋白90α抑制剂药物中的应用。提供化合物herbimycin H、herbimycin I、herbimycin J或herbimycin K在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物优选为抗肺癌、抗白血病或抗乳腺癌药物。提供化合物herbimycin M在制备抗HSV-1病毒药物中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种热休克蛋白90α抑制剂药物，该药物含有化合物herbimycin G作为活性成分。提供一种抗肿瘤药物，该药物含有化合物herbimycin H、herbimycin I、herbimycin J或herbimycin K中的一种以上作为活性成分，所述的抗肿瘤药物优选为抗肺癌、抗白血病或抗乳腺癌药物。提供一种抗HSV-1病毒药物，该药物含有化合物herbimycin M作为活性成分。
本发明的第五个目的在于提供放线菌Streptomyces sp.SCSGAA 0027在制备安莎霉素类化合物herbimycins G-K、herbimycins M中的应用。
与现有技术相比，本发明的创新性和有益效果在于：
本发明从一株柳珊瑚共附生放线菌Streptomyces sp.SCSGAA 0027的发酵液中分离得到六个新的安莎霉素类化合物herbimycins G-K、herbimycins M，其中化合物herbimycin G具有抑制热休克蛋白90α的活性，化合物herbimycin H、herbimycin I、herbimycin J或herbimycin K具有抗肿瘤活性，化合物herbimycin M具有抗HSV-1病毒活性，可以分别开发为抗HSV-1病毒药物、抗肿瘤药物、热休克蛋白90α抑制剂药物的先导化合物。
本发明的放线菌Streptomyces sp.SCSGAA0027，于2018年9月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国.广州.广东省微生物研究所，其保藏编号为：GDMCC NO：60447。
附图说明
图1为化合物1,3,7的关键HMBC
Figure BDA0001822064000000051
和COSY(-)相关信号。
图2为化合物1的关键NOESY相关信号。
图3为化合物1的四种异构体1a,ent-1a,1b,ent-1b的理论计算ECD和实测ECD谱的比较。
图4为化合物3的四种异构体3a,ent-3a,3b,ent-3b的理论计算ECD和实测ECD谱的比较。
图5为化合物4的两种异构体(6S,7S)-4,(6R,7R)-4的理论计算ECD和实测ECD谱的比较。
图6为化合物5的两种异构体(6S,7S)-5,(6R,7R)-5的理论计算ECD和实测ECD谱的比较。
图7为化合物6的关键NOESY相关信号。
图8为化合物6的两种异构体(1R,2R,5R)-6和(1S,2S,5S)-6的理论计算ECD和实测ECD谱的比较。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
(1)使用改良的ISP2培养基发酵，ISP2培养基的组成为每升含酵母膏0.4g、麦芽膏0.5g、葡萄糖0.4g、海盐1.5g、维生素B1 0.01g、维生素B6 0.01g、维生素B2 0.01g、烟酸0.01g、维生素H 0.01g、苯丙氨酸0.01g、丙氨酸0.03g；每L配制方法为：称取配方量的各组分，混合，用水定容到1L，调节pH至7.2～7.4，得到1L培养基，按照此方式配置培养基。将该培养基装入约2500个500mL的三角烧瓶中，每瓶约120mL，在115℃高压蒸汽灭菌25分钟。
(2)将放线菌Streptomyces sp.SCSGAA 0027接种到ISP2培养基的平板中生长，待菌落生长后，用竹签将菌落从平板上移至装有ISP2培养基的三角瓶中，于摇床200rpm/min,28℃培养至培养液浑浊，再用移液枪将细菌培养液分别接种到2500个盛有120mL ISP2培养基的500mL三角瓶中，于摇床200rpm/min，28℃培养5天后，收取发酵液，得到发酵液300L。
(3)将步骤(2)得到的300L发酵液中的菌液和菌丝体过滤分离，菌液用乙酸乙酯萃取，菌丝体用丙酮萃取，分别得到乙酸乙酯提取物和丙酮提取物；将乙酸乙酯提取物和丙酮提取物减压浓缩后合并得到总粗提物50g。将粗提物(50g)过反相硅胶玻璃层析柱(YMC-gelODS-A)，经常温减压柱层析(RP-MPLC)，依次用甲醇体积分数为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的甲醇-水溶液梯度洗脱(每3000mL变换一次甲醇比例)。回收洗脱溶剂，蒸干溶剂得到不同的流分。将用甲醇体积分数为50％的甲醇-水溶液洗脱得到的流分(8g)进一步采用中压反相硅胶柱层析(RP-MPLC)，用乙腈体积分数为20～60％乙腈-水溶液梯度洗脱，流速20mL/min，得到四个细流分，分别为用流动相体积比38:62的乙腈-水洗脱得到的F-1、用流动相体积比40:60的乙腈-水洗脱得到的F-2、用流动相体积比48:52的乙腈-水洗脱得到的F-3、用流动相体积比55:45的乙腈-水洗脱得到的F-4。将流分F-1采用半制备高效液相色谱仪，在YMC-Pack ODS柱(250×20mm i.d.,S-5μm)，流速5mL/min，流动相为体积比38:62的乙腈-水的色谱条件进行纯化，收集保留时间为19min的组分，得到化合物1(化合物herbimycin G，2mg)，收集保留时间为28min的组分，得到化合物2(化合物herbimycin H，2mg)；将流分F-2采用半制备高效液相色谱仪，在YMC-Pack ODS柱(250×20mm i.d.,S-5μm)，流速5mL/min，流动相为体积比40:60的乙腈-水溶液的色谱条件进行纯化，收集保留时间为26min的组分，得到化合物3(化合物herbimycin I，3mg)，收集保留时间为30min的组分，得到化合物4(化合物herbimycin J，2mg)，收集保留时间为35min的组分，得到化合物5(化合物herbimycin K，2mg)；将流分F-3过常压硅胶柱层析分离(直径3cm，柱长60cm，含H细硅胶填料)，用二氯甲烷/丙酮以体积比为9:1,8:2,7:3,6:4,1:1进行梯度洗脱，顺序得到5个小组分F-3-1,F-3-2,F-3-3,F-3-4,F-3-5；将用二氯甲烷/丙酮体积比为7:3洗脱得到的流份F-3-3采用半制备高效液相色谱仪，在YMC-Pack ODS柱(250×20mm i.d.,S-5μm)，流速5mL/min，流动相为体积比48:52的乙腈-水溶液的色谱条件进行纯化，收集保留时间为45min的组分，得到化合物6(化合物herbimycin M，2mg)。
结果推定：
化合物1(化合物herbimycin G)，分子式为C29H42N2O9。氢谱(表1)显示一个活泼氢(δH 9.35)，3个次甲基烯氢(δH 6.98,6.45,5.33)，4个被氧化次甲基氢(δH 4.79,4.49,3.56,3.32)，3个氧甲基基团(δH 3.74,3.36,3.34)，4个甲基(δH 2.14,1.36,0.96,0.79)。碳谱(表2)显示2个酰胺化羰基(δC 163.3,155.9)，8个次甲基[包括3个烯化次甲基(δC 139.3,136.2,103.0)和5个被氧化次甲基(δC 83.8,81.5,77.1,72.7,63.6)]，3个氧甲基(δC 60.5,59.7,56.5)，4个甲基(δC 20.9,15.6,12.9,11.3)。这些核磁数据和化合物ACDL3172的核磁数据很相似，主要区别是在化合物1中额外出现一个被氧化次甲基(δC 63.6)和一个酰胺化羰基(-OCONH2,δC 155.9)，而缺少一个亚甲基1，这结果分析得到2D NMR数据的论证(图1)。在HMBC谱图中观察到H-7和-OCONH2相关信号，说明多余的-OCONH2基团位于C-7上；H-H COSY谱图中H-4和H-3/H-5相关，说明是H-4被氧化为次甲基。因此，化合物1的结构如式(Ⅰ)中的1所示。
根据Me-22、Me-23的化学位移δC 12.9,11.3推测双键Δ2,3andΔ8,9的构型均为E。化合物1的相对构型通过NOE和偶合常数得到确定。在NOESY谱中(图2)可观察到H-11和H-14相关、H-12和H3-24相关，结合耦合常数J10,11＝3.0Hz和J11,12＝8.5Hz，暗示H-10/H-11/H-14在同侧，而H-12在另侧。耦合常数J6,7＝9.0Hz说明H-6和H-7w间是syn构向。H-6和H-4间NOE相关说明H-4/H-6/H-7在同侧。但从C-1到C-7间的片段和从C-8到C-15间的片段两者间相对构型难以通过NOE相关信号确定。在这两个片段间存在四种相对构型的结构(1a,1b,ent-1b,ent-1a)。因此，化合物1的绝对构型被进一步通过ECD计算和NOE相关来确定。为节省计算时间，两种可能的结构1a(4S,6S,7S,10S,11R,12S,14R-1)和1b(4R,6R,7S,10S,11R,12S,14R-1)被用于分别采用MMFF构型搜索及密度功能理论构象优化。化合物1的实测CD谱和结构ent-1b(4S,6S,7R,10R,11S,12R,14S-1)的相似度比1a(4S,6S,7S,10S,11R,12S,14R-1)更高(图3)。因此，推测化合物1的绝对构型是1b所示，其中C-4和C-6的绝对构型为R。
化合物2(化合物herbimycin H)的分子式为C29H42N2O8。1H和13C NMR谱(表1和表2)和化合物1的很相似，唯一区别是化合物2中缺少一个被氧化的次甲基而多了一个亚甲基。2D NMR谱论证了化合物2是化合物1的脱羟基化合物。在COSY谱中，H2-4和H-3/H2-5相关，说明是C-4上脱羟基化。Δ2,3和Δ8,9也都是E构型。基于NOE相关信号和它们非常相似的1H和13CNMR数据，推测化合物2和化合物1的相对构型相同，化合物2的结构如式(Ⅰ)中的2所示。
化合物3(化合物herbimycin I)的分子式为C29H40N2O8。1H和13C NMR(表1和表2)数据和化合物2非常相似，主要区别是多了2个低场烯次甲基而缺了2个高场亚甲基。2D NMR数据分析表明化合物3是化合物2中C-4和C-5(–CH2-CH2-)两个亚甲基脱氢为一对双键。该推测得到COSY谱显示连续的H-3/H-4/H-5/H-6之间相关信号和HMBC谱显示H-6和C-4/C-5相关(图2)的论证。基于低场迁移的Me-22和Me-23的化学位移，Δ2,3和Δ8,9的构型也被推测为E。基于H-4和H-5之间耦合常数为10.0Hz，推测Δ4,5为Z构型。化合物3的相对构型被推测为和化合物1相同。在NOESY谱中，H-12和H3-24/H3-25间有NOE相关，H-11和H-14间有NOE相关，再加上耦合常数J10,11＝9.0Hz和J11,12＝2.0Hz，推测H-10/H-11/H-14在同侧，而H-12在另侧。类似化合物1，化合物3也有四种可能的构型。因此，化合物3的绝对构型也通过类似化合物1的ECD计算方法得到确定。比较化合物3的实测ECD谱和四种构型(6S,7S,10S,11R,12S,14R)-3(3a),(6R,7R,10R,11S,12R,14S)-3(ent-3a),(6R,7R,10S,11R,12S,14R)-3(3b),(6S,7S,10R,11S,12R,14S)-3(ent-3b)的理论计算ECD谱(图4)，实测ECD谱和构型ent-3b的理论计算ECD谱最相似，因此，推测C-6和C-7的构型为S，C-10/C-11/C-12/C-14的绝对构型确定为R/S/R/S。化合物3的结构如式(Ⅰ)中的3所示。
化合物4(化合物herbimycin J)和化合物3的分子式相同，两者的1H和13C NMR数据非常相似(表1和表2)。主要区别是H-4和H-5间的耦合常数。耦合常数J4,5＝15.0Hz暗示Δ4,5为E构型。类似地，基于低场迁移的甲基碳信号，Δ2,3和Δ8,9的构型推测为E。化合物4的部分相对构型和化合物3相同。H-12和H3-24/H3-25间有NOE相关，H-11和H-14间有NOE相关，再加上耦合常数J10,11＝9.0Hz、J11,12＝2.0Hz，暗示H-10/H-11/H-14在同侧，而H-12在异侧。基于类似其它herbimycin类衍生物中相同片段的小耦合常数，推测C-6和C-7间相对构型为tran。C-6和C-7的绝对构型通过ECD计算得到确定。节省计算时间，计算了两种异构体(6S,7S)-4and(6R,7R)-4的ECD谱，其中C-10/C-11/C-12/C-14的构型被降解没考虑。结果显示(6S,7S)-4的理论计算ECD谱和实测谱最相似(图5)。基于相同的NOE相关信号和非常相似的1H和13C NMR数据，推测化合物4中手性碳C-10/C-11/C-12/C-14的构型和化合物3中相同。化合物4的结构如式(Ⅰ)中的4所示。
化合物5(化合物herbimycin K)的分子式和化合物3、4相同，化合物5和化合物4的1H和13C NMR谱数据几乎相同(表1和表2)，唯一的区别是一个甲基的化学位移。2D NMR显示甲基Me-22出现在高场δC21.1，暗示Δ2,3为Z构型；而甲基Me-23出现在δC13.0说明Δ8,9为E构型；J4,5的耦合常数和化合物3中相同，推测Δ4,5为Z构型。化合物5的部分相对构型和化合物4相同。H-12和H3-24/H3-25间有NOE相关，H-11和H-14间有NOE相关，再加上耦合常数J10,11＝9.0Hz、J11,12＝2.0Hz，暗示H-10/H-11/H-14在同侧，而H-12在异侧。化合物5中耦合常数JH-6,H-7和化合物4中相同，推测C-6和C-7间构型为E。类似化合物4，化合物5的两种可能异构体(6S,7S)-5和(6R,7R)-5的理论ECD谱被计算。结果显示，异构体(6S,7S)-5的理论计算ECD谱和实测ECD更相似(图6)。基于相同的NOE相关信号和非常相似的1H和13C NMR数据，推测化合物4中手性碳C-10/C-11/C-12/C-14的构型和化合物3中相同。化合物5的结构如式(Ⅰ)中的5所示。
化合物6(化合物herbimycin M)的分子式为C28H35NO8。1H NMR和13C NMR数据如表3所示，这些数据和化合物divergolide A、E-H的NMR数据很相似。仔细分析化合物6的1D和2DNMR数据表明化合物6的平面结构和divergolide A、E-H的几乎相同，唯一的区别是化合物6中C-11上的取代基是一个被氧化的乙基，而不是一个被氧化的异戊基。该推测得到COSY中连续的H-10/H-11/H-12/H-13相关和HMBC中H3-13和C-11/C-12相关(图1)的论证。化合物6的绝对构型通过ECD计算、NOESY谱、以及耦合常数得到确定。H-2和H-4ax间有NOE相关(图7)，说明从C-1到C-5的O-六元环为椅式构型，其中H-2和H-4ax为直立键方向。小的耦合常数JH-1,H-2＝5.0Hz说明H-1为平铺键方向。化合物6的理论ECD计算方法和上述化合物4和5相同，理论计算的ECD谱和实测ECD、以及化合物divergolide A的很相似(图8)。因此，C-1/C-2/C-5的绝对构型被推测为1S,2S,5S,C-12的绝对构型被推测为S，化合物6的结构被推测为如式(Ⅰ)中的6所示。
Figure BDA0001822064000000131
表1化合物1-5的1H-NMR数据(500MHz,J Hz,δppm)
Figure BDA0001822064000000132
Figure BDA0001822064000000141
arecorded at 700MHz；brecorded at 500MHz；crecorded in methanol-d4；drecorded in DMSO-d6。
表2化合物1-5的1C-NMR数据(125MHz,δppm)
Figure BDA0001822064000000151
Figure BDA0001822064000000161
arecorded at 175MHz；brecorded at 125MHz；crecorded in methanol-d4；drecorded in DMSO-d6。
表3化合物6的1H-NMR(δin ppm,J in Hz,700MHz)和13C-NMR(δin ppm,type,175MHz)
Figure BDA0001822064000000162
Figure BDA0001822064000000171
aMeasured in methanol-d4.bMeasured in DMSO-d6.
实施例2化合物herbimycin M的抗HSV-1病毒活性测试
通过采用MTT法观察化合物herbimycin M对Vero细胞的细胞毒性，以及采用细胞病变效应法(CPE法)测试化合物herbimycin M对单纯疱疹病毒(HSV-1 15577)菌株、阿昔洛韦耐药菌株HSV-1-106、以及阿昔洛韦耐药菌株HSV-1-153所致细胞病变的抑制作用，了解化合物herbimycin M的抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)作用。细胞病变效应法简述如下：(1)Vero细胞以1.5×105个/mL接种于96孔细胞培养板中，100ug/孔，置37℃，5％CO2，培养24h长成单层。(2)弃生长培养液，将不同浓度的化合物herbimycin M与HSV-1病毒稀释液(100TCID50)等体积混合后加至单层细胞，每个浓度设4个复孔，同时设阳性药物阿昔洛韦(ACV)对照组、正常细胞对照组及病毒对照组。(3)37℃，5％CO2继续培养48h。(4)48h后，光镜下观察，记录细胞病变效应(CPE)。细胞病变程度评价：0～25％为+，26％～50％为++，51％～75％为+++，76％～100％为++++。详细实验方法参考文献(J.Ethnopharm.2002,79,205–211)所述。
实验结果显示，细胞毒活性测试表明化合物herbimycin M抑制宿主Vero细胞生长的最大无毒浓度TC0为164.6μM；在最大无毒浓度下，化合物herbimycin M抗HSV-1病毒的IC50值为18.7μM。阳性药物阿昔洛韦的IC50值为3μM。阿昔洛韦是核苷类药物，在临床用药上已突显耐性性等缺点，herbimycin M是不同于阿昔洛韦的大环内酰胺类化合物，作用机制将有别于阿昔洛韦。由此可见化合物herbimycin M具有较好抗HSV-1病毒活性。
实施例4化合物herbimycins G-K的体外抗肿瘤活性筛选实验
分别收集对数生长期的白血病细胞株K562、胃乳腺癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞A549、急性粒细胞白血病细胞株HL-60，用含10％血清的1640培养基使其悬浮，再接种于96孔培养板，每孔细胞数为5000个/80μL，置于5％CO2培养箱37℃培养。用含10％血清的1640培养基分别将化合物herbimycins G、herbimycins H、herbimycins I、herbimycins J、herbimycins K(化合物1-5)稀释成不同浓度的实验溶液，分别为3.125μg/mL，6.25μg/mL，12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL的实验溶液。并以化合物geldanamycin和17-O-demethylgeldanamycin作为阳性对照。次日于不同的实验组的培养板中分别加入浓度为3.125μg/mL,6.25μg/mL，12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL的实验溶液20μL，并使每孔中的终浓度达到测试要求(实验组浓度采用倍比稀释)。另外阴性对照组中加入等量的含10％血清的1640培养基，48h后，吸弃实验组和对照组中的培养液，每孔加入MTT 20μL(2.5mg/mL)，继续培养4h，再每孔加入DMSO 100μL终止反应，37℃放置20min，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度A值，计算细胞生长抑制率。细胞生长率＝(实验组OD/对照组OD)×100％。
实验结果显示，式(I)所示的化合物herbimycins H、herbimycins I、herbimycinsJ、herbimycins K(化合物2-5)能抑制白血病细胞株K562、胃乳腺癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞A549、急性粒细胞白血病细胞株HL-60的生长，它们的IC50值如表4所示。因此，本发明的如式(I)所示的化合物2-5能用于制备抗肿瘤药物。
表4化合物1-5对肿瘤细胞毒的活性
Figure BDA0001822064000000191
aNA＝No Activity。
实施例5 herbimycins G-K的抑制热休克蛋白90α的实验
原理：FITC标记的格尔德霉素与HSP90结合后，会使产生荧光偏振，如果化合物能与格尔德霉素竞争性抑制HSP90酶，则检测不到荧光偏振。
分别检测化合物herbimycins G、herbimycins H、herbimycins I、herbimycinsJ、herbimycins K(化合物1-5)抑制热休克蛋白90α的活性，并以化合物geldanamycin和17-O-demethylgeldanamycin作为阳性对照。每个化合物均设置多个不同剂量组，高剂量组配置成母液，剩余剂量组依次三倍比稀释至最低剂量组，全部样品溶入DMSO中并于-20℃下保存备用。实验缓冲液含有20mmol/L HEPES，5mmol/L KCl，5mmol/L MgCl，20mmol/L Na2MoO4和0.01％NP40，pH为7.3。每次实验前加入5μL含40mM DTT和2mg/mL BSA的反应缓冲液，再加入2.5μL FITC标记的格尔德霉素(反应浓度5nM)。然后利用化合物转移仪器将10nL 1000×梯度浓度稀择好的化合物加入到反应液中，最后加入2.5μL HSP90酶溶液(反应浓度35ng/μL)。室温轻微振荡反应2小时，最后用微孔板读板仪测定读数，激发光为485nm，发射光为530nm，数据用Graphpad Prism 5软件处理。
实验结果显示，式(I)所示的化合物1(化合物herbimycins G)有显著抑制热休克蛋白90α的活性，IC50值如表5所示，但化合物2-5几乎无活性。因此本发明的如式(I)所示的化合物1能用于制备热休克蛋白90α抑制剂药物。
表5化合物1-5抑制热休克蛋白90α的活性
Figure BDA0001822064000000201
Figure BDA0001822064000000211
aNA＝No Activity。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.安莎霉素类化合物，其结构式如式(Ⅰ)中的任一所示：
Figure FDA0002604708600000011
其中，1为化合物herbimycin G、2为化合物herbimycin H、3为化合物herbimycin I、4为化合物herbimycin J、5为化合物herbimycin K、6为化合物herbimycin M。
2.一种权利要求1中所述的安莎霉素类化合物herbimycins G-K、herbimycin M的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)制备放线菌Streptomyces sp.SCSGAA 0027的发酵液；
(b)将步骤(a)得到的发酵液的菌液和菌体分离，菌液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿萃取，菌体用丙酮萃取，分别得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物、氯仿提取物和丙酮提取物；
(c)分别将步骤(b)得到的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物和丙酮提取物合并后经过反相硅胶柱层析，依次用甲醇体积分数为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的甲醇-水系统梯度洗脱，分别收集流份，其中用50％MeOH/H2O洗脱的流份经过反相硅胶柱层析得到粗品，经HPLC纯化，分别得到六个安莎霉素化合物herbimycinsG-K、herbimycin M。
3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)的发酵液是通过以下方法制备得到：将放线菌Streptomyces sp.SCSGAA 0027接种到ISP2培养基中，待细菌生长至培养液变浑浊后，将细菌培养液接种到ISP2培养基中，于摇床200rpm/min，28℃培养5天后，收取发酵液；所述的ISP2培养基每升含酵母膏0.4g、麦芽膏0.5g、葡萄糖0.4g、海盐1.5g、维生素B1 0.01g、维生素B6 0.01g、维生素B2 0.01g、烟酸0.01g、维生素H 0.01g、苯丙氨酸0.01g、丙氨酸0.03g，溶剂为水。
4.权利要求1所述的化合物herbimycin G在制备热休克蛋白90α抑制剂药物中的应用。
5.权利要求1所述的化合物herbimycin H、herbimycin I、herbimycin J或herbimycinK在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求1所述的化合物herbimycin M在制备抗HSV-1病毒药物中的应用。
7.一种热休克蛋白90α抑制剂药物，其特征在于，含有化合物herbimycin G作为活性成分。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，含有化合物herbimycin H、herbimycin I、herbimycin J或herbimycin K中的一种以上作为活性成分。
9.一种抗HSV-1病毒药物，其特征在于，含有化合物herbimycin M作为活性成分。
10.放线菌Streptomyces sp.SCSGAA 0027在制备权利要求1所述的安莎霉素类化合物中的应用。
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