CN101273984B - 黄酮化合物作为钾通道抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种使用抑制超快激活的延迟整流钾电流(I_kur或I_Ksus)，瞬间外向钾电流(I_to)，以及乙酰胆碱活化钾电流(I_KAch)的先导黄酮化合物刺槐素，以及其衍生物和类似物治疗或预防人类房性心律失常(纤颤)的方法。

Description

黄酮化合物作为钾通道抑制剂的用途

交叉参考相关申请 

本申请要求享有2007年3月2日递交的系列号60/892,556的美国临时申请权益。 

技术领域

本发明涉及黄酮化合物刺槐素及其衍生物和类似物作为钾通道抑制剂和作为抗心房颤动剂的用途。 

背景技术

心心房颤动的(AF)是心律失常的最常见的形式。AF的发病率随年龄而增加：患病率从50岁人群的0.5％，增加了65岁以上人群的5％，并至80岁以上人群的接近10％(Benjamin等，1998；Wang等，2003)。由于AF增加了死亡、充血性心力衰竭和包括中风在内的栓塞现象的危险，其为发病率和死亡率的一个主要原因(Benjamin等，1998；Wang等，2003)。AF被认为是在老龄人群中的一个影响寿命的威胁，并且因此成为一种主要的公共健康忧虑(Lloyd-Jones等，2004；Lip和Tse，2007)。 

抗心律失常药物疗法仍然是抑制AF和其复发的主要方法。第III类抗心律失常药在治疗AF方面有效(Nademanee，1992；Roden，1993)，但具有重要的缺陷，例如诱发严重的室性心律失常(例如，长期QT综合症)(Roden和Anderson，2006)。因此，目前抑制AF的策略中的一个主要目标是研发优先作用于房性而非室性电参数的抗心律失常药(Burashnikov等，2007；Blaauw等，2004)。 

第III类抗心律失常药是选择性延长心肌动作电位持续时间而没有明显的心脏抑制的药物。目前已有的药物例如索他洛尔和胺碘酮具有第III类性质(Sharma等，1999；Nattel和Singh，1999)，但是它们也有其他作用。索他洛尔也具有导致心脏抑制的第II类作用(β-肾上腺素受体阻断)，并且在某些易感 患者中禁用(D’Aloia等，2005；DeWitt和Waksman，2004)。胺碘酮具有多种电生理学活性，并且由于副作用而受到限制(Nademanee，1992)。 

其他第III类抗心律失常药包括多非利特(UK-68，798)，阿莫兰特(H234/09)和E-4031。这些化合物，包括索他洛尔，显示了I_kr的突出的阻断作用。然而，胺碘酮是I_ks的阻断剂(Balser等，1991)，并且也阻断I_Na和Ica。 

因为I_kr同时存在于人类心脏的心房和心室中(Wang等，1994；Li等，1996b)，I_kr阻断剂增加心房和心室中的动作电位持续时间和不应性。理论上，它们代表了用于治疗比如AF的心律失常的可能有用的试剂；然而，这些药物由于其具有在低心率时增加心律失常危险而具有易患性。例如，当使用这些化合物时观察到尖端扭转型室性心动过速(torsades de points)(Roden和Anderson，2006)。在低心率时的该增强的作用被称为“逆向频率依赖性”，其不同于频率不依赖性或者频率依赖性作用(Hondeghem，1992)。 

在完整的人类心房肌细胞中，已经鉴别了一种超快激活的延迟整流K⁺电流I_kur，也称为持续外向K⁺电流(I_ksus或者I_so)(Wang等，1993)。这种电流具有与那些在HEK293细胞中稳定表达的克隆的人类心脏K⁺通道hKv1.5类似的性质和动力学(Fedida等，1993)。这种超快激活的延迟整流I_kur被发现功能性存在于人类心脏的心房中，但不存在于心室中(Li等，1996b)。因为I_kur是快速活化的，并且具有有限的慢速失活，I_kur被认为对人类心房的复极化很重要。I_kur 的阻断将会选择性地减慢在人类心房中复极化和延长不应性，而不会引起心室复极化的延迟。一种选择性I_kur阻断剂在去极化后将不会产生心律失常和在用现有第III类药物治疗时观察到的获得性长期QT综合症。因此，人类心房I_kur和/或人类Kv1.5被认为是研发选择性抗心房颤动药物的潜在靶点(Brendel和Peukert，2003；Peukert等，2003)。然而，目前并没有这种市售可获得的药物。 

发明简述 

本发明提供黄酮化合物和它们作为钾通道功能抑制剂的用途。在一个实施方案中，本发明提供抑制作为治疗房性心律失常的靶点的人类心房I_kur和I_to的化合物。 

在一个具体实施方案中，本发明涉及刺槐素用于及相关的化合物治疗心房颤动(AF)的用途。 

刺槐素具有优良的性质，使其作为一个优选的I_kur通道阻断剂特别有用。本发明的这些化合物可用于治疗哺乳动物包括人类中的疾病，并且特别用于治疗人类AF。 

附图说明

图1A和1B显示了XLH-I对代表性人类心房肌细胞的瞬变外向钾电流(I_to，图1A)和持续钾电流(I_Kur，图1B)的作用。 

图2A，2B，2C显示了刺槐素对I_Kur的作用。图2A.刺槐素对I_Kur的时间依赖型作用，以及对清除(washout)恢复(97％)的抑制作用。图2B.被3、10和30μM刺槐素抑制的电压依赖型I_Kur。图2C.刺槐素在+40mV(n＝8-20个试验)抑制I_Kur的浓度响应关系。 

图3A，3B，3C显示了刺槐素对人类心房肌细胞中I_to的作用。图3A.在代表性细胞中刺槐素对I_to的时间依赖型作用。在3μM时刺槐素可逆地同时降低了I_to和I_Kur。图3B.用在插图中显示的方案记录电压依赖型I_to。用10μM维拉帕米抑制I_Kur至阻断I_Kur，并且用3和10μM刺槐素降低剩余的I_to。图3C.刺槐素在+40mV(n＝7-16个试验)抑制I_to的浓度响应关系。 

图4A和4B显示了刺槐素对I_to动力学的作用。图4A.稳态(steady-sate)活化和失活的电压依赖型不变10μM刺槐素的影响。图4B.刺槐素减慢I_to从失活的恢复。 

图5A、5B、和5C显示了刺槐素对人类心房肌细胞的动作电位的作用。图5A.在代表性细胞中(左侧)用5和10μM刺槐素，和在另一种细胞(右侧)中用50μM的4-AP在2Hz时记录的动作电位。图5B.在50％、75％和90％复极化时的动作电位平均值(APD₅₀，APD₇₅和APD₉₀)。n＝6*P＜0.05；P＜0.01对对照组。图5C.刺槐素(10μM)引起APD的轻度依赖型延长(n＝7，P＝NS，0.5Hz对2Hz)。 

图6A、6B和6C显示了刺槐素对在豚鼠心房肌细胞中I_{K_ACh}的抑制。图6A.在豚鼠心房肌细胞中细胞膜电流用2s的变速从-120到+50mV记录。5μM卡巴胆碱显著地增加了细胞膜电导率。3μM刺槐素降低了升高的电导率。图6B.细胞膜电流用300ms电压步骤方案记录。图6C.在有和没有刺槐素时卡巴胆碱诱导的I_{K_ACh}的I-V关系。3和10μM刺槐素实质上阻断了I_{K_ACh}(n＝5，在-100到-80mV，在-50到+60mV时P＜0.01)。 

图7A-7F显示了刺槐素对在豚鼠心室肌细胞中I_Na，I_CaL和I_K1没有作用。图7A.在代表性细胞中记录的I_Na迹线。图7B.在有和没有30和100μM(n＝5-6)刺槐素时的I_Na的I-V关系。图7C.心脏细胞中记录的I_CaL迹线。图7D.在有和没有30和100μM刺槐素时(n＝5-7)的I_CaL的I-V关系。图7E.在代表性细胞中用插图中显示的电压方案记录的I_K1迹线。图7F.在有和没有30和100μM刺槐素(n＝6)时的I_K1的I-V关系。 

图8A、8B、8C和8D显示了刺槐素对在HEK293细胞中稳定表达的I_hERG和I_ks的作用。图8A 30μM刺槐素可逆地抑制电压依赖型I_hERG。图8B刺槐素阻断I_hERGtail的浓度响应关系(+40mV，n＝8-14个试验)。图8C在稳定表达hKCNQ1/hKCNE1基因的HEK293细胞中，用30μM刺槐素抑制电压依赖型I_ks。图8D用+40mV(n＝7-12试验)刺槐素抑制I_Ks.step的浓度响应关系。 

图9A、9B、9C和9D显示了刺槐素和奎尼丁对离体兔心脏的心率和ECG的QTc间期的作用。图9A.30μM刺槐素不影响ECG参数。图9B.10μM奎尼丁降低心率，并且延长ECG的QTc间期。图9C.在30μM刺槐素或10μM奎尼丁前后的心率平均值(相对处理前P＜0.01)。图9D.30μM刺槐素或10μM奎尼丁前后的ECG的QTc间期的平均值(相对处理前P＜0.01)。 

图10A、10B和10C显示了麻醉狗中的用于测定左右心房ERP和S2诱导AF的单相动作电位(MAPs)被刺槐素阻止。图10A.用S1和S2刺激的ERP测定。图10B.当在200msBCL测量右心房ERP时，S2触发持续的AF。图10C.用5mg/kg刺槐素处理2h后不再触发AF。 

图11A、11B、11C显示了刺槐素和索他洛尔对麻醉狗中左心房ERP和QTc的作用。图11A.相对于基础水平(在十二指肠内给药前，相对载体，ANOVA*P＜0.05)250和200ms的BCLs对左心房ERP的改变百分比。图11B.索他洛尔，而非刺槐素，显示了ERP的“可逆速率依赖性”延长(数据来自给药后三小时)。图11C.索他洛尔，而非刺槐素，在麻醉狗中延长了QTc间期(P＜0.05)。 

图12A和12B显示了麻醉狗中的AF诱导作用。图12A.代表性的记录显示使用分别引入右心房和左心室的MAP记录和起搏导管记录的ECG(线II)和MAP迹线。图12B.用伴有连续两侧迷走神经刺激和心室起搏的100msBCL 的S1-S2刺激(箭头)产生AF。ECG符合心室起搏节律。 

图13A和13B显示了麻醉狗中AF的发生率和药物对AF诱导的作用。图13A.2.5、5和10mg/kg刺槐素，而非赋形剂，在十二指肠内给药后1.5-2.5h降低了AF发生率。索他洛尔也在麻醉狗中降低了AF发生率。图13B.5和10mg/kg刺槐素显著地抑制了AF(相对赋形剂^*P＜0.05，Fisher精确检验)。 

发明详述 

本发明提供黄酮化合物和它们作为钾通道功能抑制剂的用途。在一个实施方案中，本发明提供抑制用作房性心律失常治疗靶点的人类心房I_Kur和I_to的化合物。 

在本文阐述的一个具体实施方案中，黄酮化合物被用于治疗心房颤动。在一个优选的实施方案中，刺槐素被用于治疗人类心房颤动。 

根据本发明，发现天然黄酮刺槐素是一种用于治疗AF的新的、口服有效的、心房选择性的、抗心律失常的药物。有利地，发现刺槐素优选地抑制I_Kur 和I_to，延长人类心房肌细胞中的APD，延长ERP，和预防麻醉狗中的AF诱导。除了阻断心房I_Kur，I_to和I_{K_ACh}以外，刺槐素的抗过氧化作用和抗炎作用也是有益的。 

研究了来自中文称为“雪莲花”(Saussurea laniceps的全草)的Snow-Lotus-Flowers的乙醇提取物对人类心房肌细胞的心脏细胞膜电流的作用。乙醇提取物的氯仿部分提取物(XLH-1)显示了对人类心房肌细胞的I_Kur和I_to 的基本抑制(图1)。然后，从XLH-I提取物中分离出一些化合物(化合物A、B、C和D)。在人类心房肌细胞中的一系列实验后，发现化合物A具有对人类心房肌细胞的I_Kur和I_to的阻断作用。然后，化合物A的化学结构被鉴定为刺槐素。 

刺槐素是一种黄酮化合物(5，7-二羟基-4’-甲氧黄酮)，广泛分布在植物色素中，通常存在于维管植物中，并且与自然界中的大部分颜色有关(Cody，1988)。刺槐素被报道具有抗过氧化、抗炎和抗疟活性(Liao等，1999；Kraft等，2003)，增强HL-60细胞中的分化诱导活性(Kawaii等，2000)，和对一些种类的癌症产生抗癌作用，所述癌症包括人类前列腺癌、肺癌和HepG2(Singh等，2005；Pan等，2006；Hsu等，2004)。另外，刺槐素也可抑制谷胱甘肽降解、细胞色 素P450和拓扑异构酶I-催化DNA再连接(Zhang等，1997；Doostdar等，2000)。 

除了刺槐素，本发明还涉及其衍生物、类似物、盐、苷、酯、酰胺和/或立体异构体的用途。 

根据本发明，刺槐素抑制I_Kur和I_to，延长人类心房肌细胞的动作电位持续时间，且阻断豚鼠心房细胞中的I_{K_Ach}。这种化合物对豚鼠的心室肌细胞I_Na，I_CaL 和I_K1没有作用，并且显示对在HEK293细胞中稳定表达的hERG通道和I_Ks通道有弱抑制作用。重要地，刺槐素不会增加麻醉狗和离体兔心脏的EGC的QTc间期。 

人们普遍认为心脏复极化和不应性由内向Ca²⁺和外向K⁺电流的平衡来决定。I_Kur和I_to是人类心房的主要外向电流，并因此在人类心房复极化中起重要作用(Courtemanche等，1999)。从前的研究证实I_Kur功能地存在于人类心脏的心房中，但是不存在于心室中(Li等，1996b)。因此，I_Kur是选择性抗AF药物的很有吸引力的靶点(Nattel等，2002)。 

根据本发明，发现刺槐素以浓度依赖性方式抑制人类心房的I_Kur，IC₅₀为3.2μM(图2)。该浓度比以前在抗过氧化、抗炎和抗诱变研究中的低(Pan等，2006；Cholbi等，1991；Kraft等，2003)。另外，刺槐素阻断I_to，IC₅₀为9.2μM(图3)，并且在不影响电流的电压依赖性下减慢I_to从失活的恢复(图4)。刺槐素对I_to的抑制作用也有助于延长人类心房的APD。5和10μM的刺槐素显著延长了APD在0.5、1.0和2.0Hz的复极化50％、75％和90％(图5)。APD的延长增加了有效不应期和终止了AF。 

迷走神经刺激缩短了心房APD和有效不应期，因此迷走神经紧张在AF中起重要作用(Schauerte等，2000；Zipes等，1974)。乙酰胆碱活化的钾电流I_{K_Ach} 终由毒蕈碱M受体活化调节大多数迷走神经刺激的心脏反应(Hashimoto等，2006；Liu和Nattel，1997)。I_{K_Ach}和/或M受体表达在AF患者中(Bosch等，1999)和在狗的实验性心衰诱导的AF中被上调(Shi等，2004)。因此，I_{K_Ach} 的阻断将终止增加迷走神经紧张诱导的AF。选择性I_{K_Ach}阻断剂tertiapin，一种蜂毒多肽，终止了由刺激狗迷走神经而引起的AF(Hashimoto等，2006)。 

根据本发明，发现3和10μM刺槐素基本上抑制了豚鼠心房肌细胞的卡巴胆碱诱发的I_{K_Ach}(图6)，表明刺槐素对终止I_{K_Ach}活化诱导的AF有效。 

30-100μM刺槐素显示对豚鼠心室肌细胞的心脏I_Na、I_CaL和I_K1没有抑制作 用(图7)。这些结果表明刺槐素将不会降低心脏传导速度或收缩性，并且将不会如在第I和第II类抗心律失常药中观察到的一样使细胞膜去极化。 

另一方面，刺槐素抑制I_hERG，在HEK293细胞系中的IC₅₀为32.4μM，并且也抑制I_Ks，在稳定表达hKCNQ1/hKCNE1通道的HEK293细胞中的IC₅₀为81.4μM(图8)。然而，刺槐素(30μM)，相对于奎尼丁(10μM)，不影响离体低血钾兔心脏中的心率，且不会造成QTc延长(图9)。 

已经提议过快延迟整流电流I_kur(或Kv1.5)的阻断作为一种用于研究更安全和可能更有效地心房抗心律失常药物的一个新靶点(Pecini等，2005)。有四种结构不同的合成的抗心律失常药物已被描述具有I_kur阻断作用，以及描述了它们的作用范围部分：NIP-141(Seki等，2002)，AVE0118(de Haan等，2006；Gogelein等，2004)，RSD1235(Fedida等，2005)，和DPO-1(Regan等，2006)。 

如上讨论的，确定刺槐素，一种I_kur阻断剂，也阻断I_to和I_{K_Ach}。这些性质对于终止AF是有利的。 

刺槐素(5mg/kg)在十二指肠内给药后的麻醉狗中显著延长了心房ERP而不延长QTc间期(图10&11，表1&2)，不同于索他洛尔，因为索他洛尔同时延长了心房ERP和QTc。这些结果表明刺槐素具有抗AF潜在作用而没有致心律失常潜在性。实际上，在麻醉狗中证实了抗AF效果，因为5和10mg/kg刺槐素显著地避免了AF诱发(图13)。 

另外，在两周的观察期间，在用刺槐素最大口服剂量(900mg/kg)的小鼠中没有发现动物死亡，表明刺槐素具有低急性毒性或没有急性毒性。 

最后，一个比较研究(表3)表明所研究的衍生物/类似物对于Kv1.5和hERG通道具有较小的离子通道选择性(A-2)或者对于Kv1.5具有较少的作用(A-4、A-5、A-6、A-2-11、A-2-12、A-2-13、A-2-14)或没有作用(A-9、A-10、A-11、A-12)。 

表1显示刺槐素和索他洛尔对麻醉狗中右心房ERP的作用 

^*相对于处理前P＜0.05 

表2显示刺槐素和索他洛尔对麻醉狗中左心房ERP的作用 

^*相对于P＜0.05处理前 

表3显示刺槐素与其衍生物/类似物对Kv1.5和hERG通道阻断作用的比较观察 

注：NE，无效；NT，没有测定；WE，作用弱(100μM时抑制作用＜50％) 

刺槐素及其衍生物和类似物

刺槐素的结构 

合成的衍生物 

              R₁                 R₂    R₃

A             OH                 H     OH 

A-02-11-11    CH₃COO             H     OH 

A-02-11-12    苯甲酸酯           H     OH 

A-02-11-13    CH₃O               H     OH 

A-02-11-14    CH₃CH₂O            H     OH 

A-2           OH                 H     对甲氧基苯甲酸酯 

A-3           对甲氧基苯甲酸酯   H     OH 

A-4           H                  H     H 

A-5           H                  Cl    H 

A-6           H                  CH₃   H 

自然来源的类似物 

刺槐素及其衍生物的物理数据

刺槐素 

刺槐素：一种浅黄色粉末；C₁₆H₁₂O₅；MW.284；mp 263℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.82(s，H-3)，6.47(d，J＝1.9Hz，H-8)，6.18(d，J＝1.9Hz，H-6)，7.98(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，7.07(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.85(s，4’-OCH₃)。 

合成的衍生物 

A-02-11-11：一种浅黄色粉末；C₁₈H₁₄O₆；MW.326；mp 279℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.82(s，H-3)，6.45(d，J＝1.9Hz，H-8)，6.12(d，J＝1.9Hz，H-6)，7.98(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，7.07(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.85(s，4’-OCH₃)，2.01(s)。 

A-02-11-12：一种浅黄色粉末；C₂₃H₁₆O₆；MW.388；mp 282℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.81(s，H-3)，6.43(d，J＝1.9Hz，H-8)，6.16(d，J＝1.9Hz，H-6)，7.97(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，7.02(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.85(s，4’-OCH₃)，7.20～7.42(m)。 

A-02-11-13：一种浅黄色粉末；C₁₇H₁₄O₅；MW.298；mp 174℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.80(s，H-3)，6.46(d，J＝1.9Hz，H-8)，6.16(d，J＝1.9Hz，H-6)，7.97(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，7.02(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.86(s，4’-OCH₃)，3.84(s，7-OCH₃)。 

A-02-11-14：一种浅黄色粉末；C₁₈H₁₆O₅；MW.312；mp 165℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.80(s，H-3)，6.45(d，J＝1.9Hz，H-8)，6.17(d，J＝1.9Hz，H-6)，7.96(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，7.01(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.83(s，4’-OCH₃)，3.89(dd，J＝5.0Hz)，1.33(t，J＝5.1Hz)。 

A-2：一种浅黄色粉末；C₂₄H₁₈O₇；MW.418；mp 275℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.80(s，H-3)，6.42(d，J＝1.9Hz，H-8)，6.13(d，J＝1.9Hz，H-6)，7.93(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，7.01(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.85(s，4’-OCH₃)，7.79(d，J＝8.2Hz，2H)，6.92(d，J＝8.2Hz，2H)，3.74(s，-OCH₃)。 

A-3：一种浅黄色粉末；C₂₄H₁₈O₇；MW.418；mp 265℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.85(s，H-3)，632(d，J＝1.9Hz，H-8)，6.21(d，J＝1.9Hz，H-6)， 7.92(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，7.03(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.85(s，4’-OCH₃)，7.75(d，J＝8.2Hz，2H)，6.99(d，J＝8.2Hz，2H)，3.82(s，-OCH₃)。 

A-4：一种浅黄色粉末；C₁₆H₁₂O₃；MW.252；mp 164℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.71(s，H-3)，6.92-7.64(m，H-5，6，7，8)，7.86(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，6.82(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.73(s，4’-OCH₃)。 

A-5：一种浅黄色粉末；C₁₆H₁₁ClO₃；MW.286；mp 194℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.67(s，H-3)，7.34(d，J＝1.2Hz，H-5)，7.12(m，H-7)，6.89(m，H-8)，7.56(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，6.82(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.75(s，4’-OCH₃)。 

A-6：一种浅黄色粉末；C₁₇H₁₄O₃；MW.266；mp 179℃；¹H-NMR(400MHz，DMSO)：6.73(s，H-3)，7.21(d，J＝1.2Hz，H-5)，7.02(m，H-7)，6.72(m，H-8)，7.83(d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)，6.80(d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，3.71(s，4’-OCH₃)，2.35(s，6-CH₃)。 

自然来源的类似物 

A-9：一种白色非晶形粉末；C₁₅H₁₄O₆；m.p.246-247℃；[α]²⁰ _D 52.3°(c 0.128，在MeOH中)；LC-MS：290[M]⁺；¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)：6.92(1H，d，J＝2.0Hz，2’-H)，6.69(1H，d，J＝8.0Hz，5’-H)，6.74(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz，6’-H)，5.88(1H，d，J＝2.0Hz，8’-H)，5.86(1H，d，J＝2.0Hz，6-H)，4.76(1H，s，2-H)，4.11(1H，m，3-H)，2.80(1H，dd，J＝17.0，4.5Hz，4-H)，2.68(1H，dd，J＝17.0，3.0Hz，4-H)。 

A-10：白色针状物；C₂₁H₂₂O₁₁；LC-MS：466[M]⁺；m.p.166-168℃；[α]²⁵ _d：+110.5°(0.15，MeOH)；¹H-NMR(DMSO，400MHz)：12.60(1H，s，5-OH)，10.5(1H，s，7-OH)，7.13(1H，Ar-H)，6.85(2H，m，Ar-H)，5.93(2H，s，6，8-H)，5.30(1H，d，J＝10Hz，2-H)，4.97(1H，d，J＝10Hz，3-H)，4.70(1H，d，J＝7Hz，1”-H)。 

A-11：一种黄色粉末；C₂₄H₁₆O₉；m.p.190-192℃；LC-MS：610[M]⁺；¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)：6.13(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，6.32(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)，7.61(1H，d，J＝2.1Hz，H-2’)，6.81(1H，d，8.4Hz，H-5’)，7.57(1H， dd，J＝2.1，8.4Hz，H-6’)，5.05(1H，d，J＝7.2Hz，H-1”)；4.47(1H，s，H-1”’)，1.07(3H，d，J＝6Hz，CH₃-6”’)。 

A-12：一种黄色粉末；C₁₅H₁₀O₅；mp.273-275℃；LC-MS：270[M]⁺；¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)：12.70(1H，s，C₅-OH)，10.60(1H，s，C₇-OH)，8.48(1H，s，C₆-OH)，8.04(2H，m，C_2’，6’-H)，7.57(3H，m，C_{3’，4’，5’}-H)，6.91(1H，s，C₃-H)，6.62(1H，s，C₈-H)。 

盐

盐也在本发明的范围内。除非另有说明，提及本发明的黄酮类化合物应理解为包括提及其盐。如本文使用的术语“盐”表示用无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐。另外，当一个化合物同时包含碱部分和酸部分时，可以形成两性离子(“内盐”)并且被包括在如本文使用的术语“盐”中。 

药学上可接受的(例如，无毒，生理可接受的)盐是优选的，尽管其他盐也用于例如制备期间可能使用的分离或纯化步骤。例如，可以通过将化合物与一定量比如等量的酸或碱在一种比如盐在其中沉淀的介质中或在一种随后冻干的水介质中反应形成所述化合物的盐。 

根据本发明涉及的盐包括那些在申请号为2007/0203157的US专利中描述的，将其以其全部引入本文作为参考。 

立体异构体

本发明化合物的所有立体异构体，例如由于不对称碳原子可存在的那些，包括对映体形式(其可以在没有不对称碳原子的情况下存在)和非对映体形式，都包括在本发明的范围内。本发明化合物的独立的立体异构体可以，例如，基本上不含有其他异构体(即大于90％，并且优选大于95％)，或者可以例如，作为外消旋化合物或与所有其他的，或其他选择性的立体异构体的混合物。本发明的手性中心可以具有如IUPAC1974建议定义的S或R构型。 

药物组合物

本发明也提供药物组合物，其包含至少一种能够预防或治疗一种或多种前述病症的有效量的黄酮化合物或其盐和药学上可接受的赋形剂或稀释剂。本发 明的组合物可以包含其他下述的治疗剂，并且可以根据比如药物制剂领域中众所周知的那些技术例如，使用常规的固体或液体赋形剂或稀释剂，以及适于所需给药方式的一类药物添加剂(例如，赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、芳香剂等)制剂。 

除非另有上下文或明确语言说明，如本文使用的“药用载体”或“药用赋形剂”或其他这样的术语排除了在自然界中与刺槐素相关的化合物和材料。如此，除非另有上下文或明确语言说明，“药用载体”或“药用赋形剂”将不会包括，例如，自然界中的与黄酮有关的植物或自然未改变的(unaltered)植物材料。本文涉及“分离的”刺槐素(或其他“分离的”化合物)指合成制备的或在其天然存在于其中的一些或所有其他化合物中除去分离出来的刺槐素(或其他化合物)。 

本发明的化合物可以用任何合适的方式给药，例如，口服，例如以片剂、胶囊、颗粒剂或粉末剂的形式；舌下给药；含服；非肠道给药，例如通过皮下、静脉、肌内或胸骨内注射或输注技术(例如，灭菌可注射的含水或非水体溶液或混悬液)；经鼻给药例如通过吸入喷雾剂；局部给药，例如以乳膏或软膏的形式；或者经直肠给药例如以栓剂的形式；以包含无毒、药学可接受赋形剂或稀释剂的剂量单位制剂形式。 

本发明的化合物可以，例如，以适于速释或缓释的方式给药。速释或缓释可以通过使用包含本发明的化合物的合适药物组合物获得，或者，特别在缓释的情况下，通过使用比如皮下植入物或渗透泵的装置获得。在其中给药所述化合物来预防或治疗心律失常的情况下，可以给药所述化合物以获得向正常窦性心律的化学转化，或者可以可任选地与电复律(electrical cardioconversion)合用。 

用于口服给药的示例性组合物包括混悬液，其可包含，例如，赋予体积的微晶纤维素来，作为混悬剂的海藻酸或海藻酸钠，作为粘度增强剂的甲基纤维素，以及本领域公知的甜味剂或矫味剂；和速释片剂，其可包含，例如，微晶纤维素、磷酸氢钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其它本领域公知的赋形剂、粘合剂、膨胀剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。所述化合物也可以通过舌下和/或含服给药方式经口腔递送。模制片、压制片剂或冻干片剂是可以使用的示例性形式。 

示例性组合物包括本发明的化合物与比如甘露醇、乳糖、蔗糖和/或环糊精 的快速溶解稀释剂制剂而成的那些。而且，在这些制剂中包括的可以是高分子量赋形剂比如纤维素(微晶粉末纤维素)或聚乙二醇(PEG)。这种制剂也可以包括帮助粘膜粘附的赋形剂，比如羟丙基纤维素(HPC)、羟丙甲纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酸酐共聚物(例如，Gantrez)，以及控制释放的物质，比如聚丙烯酸共聚物(例如，卡波姆934)。为了制备和使用，也可加入润滑剂、助流剂、芳香剂、着色剂和稳定剂。 

用于鼻用气溶胶或吸入制剂的示例性组合物包括盐水溶液，其可包含，例如苯甲醇或其他适当的防腐剂，用于提高生物利用度的吸收促进剂，和/或其他本领域已知的增溶剂或分散剂。 

用于胃肠外给药的示例性组合物包括注射液或混悬液，其可包含，例如适当的无毒的肠胃外可以接受的稀释剂或溶剂，比如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格溶液，等渗氯化钠溶液，或其他适当的分散剂或润湿剂和混悬剂，包括合成的甘油单酯或甘油二酯和包括油酸的脂肪酸。 

用于直肠制剂的示例性组合物包括栓剂，其可包含，例如，适当的非刺激性赋形剂，例如常温下为固态但在直肠腔中液化和/或融解以释放药物的可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇。 

用于局部给药的示例性组合物包括局部载体，例如Plastibase(与聚乙烯凝胶的矿物油)。 

本发明化合物的有效量可以由本领域普通技术人员来确定，包括对于成年人示例性的剂量为每天大约0.001到100mg/kg体重的活性药物，其可以以单一剂量或以比如从1到4次每天的独立分开剂量的形式给药。应当理解对于任何特定患者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且取决于多种因素，所述因素包括所使用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和活性作用的时长、受试者的种族、年龄、体重、基本健康状态、性别和饮食、给药方式和时间、排泄速度、药物组合、以及特定病症的严重程度。用于治疗的优选受试者包括动物，最优选比如人类的哺乳动物，以及驯养动物比如狗、猫等，前述病症的受试者。 

本发明的化合物可以单独使用或与彼此和/或其他适当的用于治疗上述病症或其他病症的治疗剂联合使用，所述其它治疗剂包括：其他抗心律失常药，例如第I类药物(例如，普罗帕酮)，第II类药物(例如，carvadiol和普萘洛尔)， 第III类药物(例如，索他洛尔、多非利特、胺碘酮、阿齐利特和伊步利特)，第IV类药物(例如，地尔硫卓和维拉帕米)，5HT拮抗剂(例如，舒兰色罗，serraline和tropsetron)；钙通道阻滞剂；环氧合酶抑制剂(即COX-1和/或COX-2抑制剂)例如阿司匹林、吲哚美欣、布洛芬、吡罗昔康、萘普生.RTM.、西乐葆RTM、万络RTM和NSAID；抗血小板剂；利尿剂(diruetics)；以及在申请号2007-0203157A1的美国公开专利中阐述的其他药物，将其从其全部引入本文作为参考。 

上述其他治疗剂，当与本发明化合物组合使用时，可以例如，以在Physicians’s Desk Reference(PDR)中所标明的或其他通过本领域普通技术人员所决定的那些剂量使用。 

材料与方法 

1.1人类心肌细胞的制备 

从进行了冠状动脉旁路移植术的患者(56.1±4.7岁)中得到的人类右心耳样本中分离出心房细胞。得到人类组织的过程在患者同意的基础上被香港大学伦理委员会批准。所有患者没有室上性心律失常，并且心房在手术时很正常。在切除后，迅速将样本浸入充氧的、普通无Ca²⁺心脏麻痹溶液以运至实验室。被像如前所述(Tian等，2006；Gao等，2004)酶解分离心房心肌细胞。简单地，切碎心房组织，并且在无Ca²⁺的蒂罗德液中用100％O₂通过连续起泡轻轻搅拌15分钟(新配溶液中5分钟一次)，然后在包含150-200U/ml胶原酶(CLSII，Worthington Biochemical，Freehold，NJ，UAS)、0.2mg/ml的蛋白酶(XXIV类，Sigma-Aldrich Chemical，St Louis，MO，USA)和1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)的类似溶液中培养50分钟。然后，在相同组分但不含蛋白酶的新配酶溶液中再培养该组块。在显微镜下监测分离细胞的质量和数量。当细胞产量接近最佳时，将该组块悬浮于一种包含(mM)10 KCl、120 K-谷氨酸、10 KH₂PO₄、1.8 MgSO₄、10牛磺酸、10 HEPES、0.5 EGTA、20葡萄糖、10甘露醇，pH用KOH调节为7.3的高K⁺培养基中，并且用移液管轻轻地吹。使用前，将分离出的肌细胞在培养基中于室温下保存至少一小时。 

1.2.豚鼠心肌细胞的制备 

在用苯巴比妥(40mg/kg，i.p.)麻醉后通过颈椎骨折脱位的方法处死任何性别的豚鼠(250-300g)。在本发明中，涉及使用动物的过程由the Animal Care andUse Committee for Teaching and Research of University of Hong Kong根据theGuide for the Care and Use of Laboratory Animals(Institute of Laboratory AnimalResources，Commission on Life Sciences，National Research Council，1996)批准。如前所述(Li等，2002a)酶解分离豚鼠心的左心房和心室肌细胞，并且将分离的肌细胞保存在K⁺贮存培养基中。 

1.3.细胞系培养 

将所建立的稳定表达hERG通道基因、Kv1.5(Tang等，2007)或者重组人类心脏KCNQ1/KCNE1通道电流(I_Ks)(Dong等，2006)的HEK293细胞系单独保存在补充了10％胎牛血清并且包含400μg/ml G418(用于hERG或Kv1.5通道)或100μg/ml潮霉素(用于I_Ks)的达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco′s modified eagle medium)(invitrogen)中。 

1.4.溶液和药物 

用于样品转运的无Ca²⁺心脏麻痹溶液包含(mM)50 KH₂PO₄、8 MgSO₄、5腺苷、10 HEPES、140葡萄糖、100甘露醇、10牛磺酸、pH用KOH调至7.3。蒂罗德溶液包含(mM)140 NaCl、5.4 KCl、1 MgCl₂、1 CaCl₂、0.33 NaH₂PO₄、10 HEPES、10葡萄糖、pH用NaOH调至7.4。移液管溶液包含(mM)20 KCl、1 10K-天冬氨酸、1 MgCl₂、10 HEPES、5 EGTA、0.1 GTP、5 Na₂-磷酸肌酸，和5Mg₂-ATP，pH用KOH调至7.2。为了记录I_to和I_Kur，将BaCl₂(200μM)和CdCl₂(200μM)加入混悬液中以阻断I_K1和I_CaL。使用阿托品(1.0μM)最小化在电流记录中的可能的I_K.Ach污染(contamination)。为了记录I_CaL，用CsCl替换移液管中的K⁺和蒂罗德溶液。如前所述(Li等，2002a)，在移液管和表面灌流溶液中无K⁺和一个对称的Na⁺(5mM)的情况下记录I_Na。 

刺槐素最初从TCM雪莲花(Saussurea tridactyla)中分离出和纯化，然后如上述对化合物A的化学研究的部分中所述在实验室中合成。在DMSO中制备一种100mM刺槐素或其衍生物/类似物的储存溶液，储存在4℃下。 

1.5.数据采集和分析 

将一个包含分离细胞的溶液的小等分部分置于一个固定在反向显微镜的载物台上的开口灌注室(1-ml)中。使肌细胞附着在容器底部5-10分钟，并且用蒂罗德溶液以2-3ml/min表面灌流。仅仅使用有清晰的交叉条纹的静止杆状细胞。对于电流记录在室温(21-22℃)下进行该研究或对于动作电位记录在36℃下进行该研究。 

对于电生理记录使用整体细胞膜片钳技术。用Brown-Flaming钳拉入(模型P-97，Sutter Instrument Co，Novato，CA，UAS)硅酸硼玻璃电极(1.2mm OD)，当装满移液管溶液时其具有2-3MΩ的端阻力。细胞膜电流采用EPC-9放大器和Pulse软件(HEKA，Lambrecht，Germany)以电压钳模式记录。使用3-M KCl琼脂盐桥作为对比电极。在移液管接触细胞前补偿端电位。在获得千兆欧姆密封时，通过轻轻抽吸使细胞膜破裂以形成全细胞结构(configuration)。用Pulse软件的锁进模块(lock-in module)直接测量细胞膜电容(pF)，并且用于标准化各个细胞中的电流。串联电阻(Rs)为3-5MΩ，通过补偿50-70％以最小化电压误差。使用多孔膜片结构结构记录人类心房细胞中的动作电位和HEK293细胞中的I_Ks，如前所述(Li等，2002b；Dong等，2006)。电流信号在5kHz被低通滤过，并且储存在IBM兼容计算机的硬盘中。 

1.6.离体兔心脏的制备 

用苯巴比妥(30mg/kg，i.v.)麻醉任意性别的新西兰白兔(2-3kg)，将其心脏迅速移出并放于充氧的蒂罗德溶液中，心脏固定于Langendorff系统上，并且用包含(mM)129 NaCl、3.0 KCl、1 MgCl₂、1.5 CaCl₂、20 NaHCO₃、0.9 NaH₂PO₄、10葡萄糖(pH7.3-7.4)的37℃充氧(95％O₂-5％CO₂)蒂罗德溶液灌注。用Powerlab记录系统经两个分别装在心脏的心底和心尖的电极记录ECG。根据Vande Water方程：QTc＝QT-87×[(60/心率)-1]用心率(Q-Tc间期)矫正来自三个兔心脏ECG的测量的QT间期的平均QT间期，如前所述(Spence等，1998)。 

1.7.整体动物实验 

该研究遵照the US National Institutes of Health分布的the Guide for the Careand Use of Laboratory Animals(NIH出版号85-23，修订1996)，并且被the Institutional Ethic Committee批准。 

1.7.1.麻醉狗的体内电生理 

用苯巴比妥(30mg/kg，i.v.)麻醉成年杂交狗(12-15kg)，在实验中当需要时补充苯巴比妥。给该动物插管并通入室内空气。用体温控制系统保持体温在37-38℃。将导管插入左股静脉以维持麻醉，并向右心房导入单相动作电位记录-和起搏导管(Boston Scientific Ltd)。分离并分开颈部的迷走神经。为了阻断心脏β-肾上腺作用，每2小时以0.25mg/kg i.v.，接着以0.125mg/kg i.v.给药纳多络尔。在第四肋间隙进行左胸开胸术，并且切开心包以提供至左心房的入口用于导入MAP导管。使用该导管分别记录左右心房的MAP，并且用于测量有效不应期(ERP)。另外，引入塑料管(～0.8×12cm)以通过胃部幽门给药至十二指肠，因为刺槐素对于注射应用是水不溶性的。用厚棉绳结扎幽门以防止可能的十二指肠内容物反流。 

在30分钟平衡期和用2-ms持续刺激测量心房兴奋阀后，先用一系列8次基本刺激(S1，两次-舒张期震颤)然后用相同过早刺激(S2)来测定心房ERP。将200，250和300ms的基础循环时间(BCL)同时应用于左右心房。最初，S2在舒张晚期以5-ms递减传递直到应答不被在MAP记录上拍出的S2引出(elicited)。ERP被定义为无法扩布反应的最长的S1-S2间期，对于每次测量重复该过程三次。连续监测MAP、ECG和血压信号并且使用多通道数据获得系统(RM-6280C，Chengdu Instrument Ltd，Chengdu，China)将其储存于IBM兼容PC电脑中。 

在测量左右心房的ERP后，将10％PVP 400(Sigma-Aldrich，与2ml DMSO一起20ml)作赋形剂对照或20ml包含5mg/kg刺槐素的10％PVP400(处理组)或20ml包含5mg/kg索他洛尔的10％PVP 400(阳性组)通过给药管注入十二指肠。然后给药后每小时重复测量ERP 6小时。在每次ERP测量前检验左右心房的兴奋阀。 

1.7.2.麻醉狗的实验性AF 

迷走神经在AF的发生中起重要作用(Chiou等，1997；Ziper等，1974；Liu和Nattel，1997)，因此，迷走神经过敏的AF模型一般被用来研究AF和抗 纤维颤动。通过将两个MAP导管分别引入右心房和左心室并刺激颈内分开的两侧迷走神经的刺激而在麻醉狗中产生持续的迷走神经过敏AF。使用一个15Hz，0.2ms持续电压阶跃(60％阀值)的双极电极刺激迷走神经以诱导心率降低75％。当连续刺激迷走神经时以2ms电压脉冲(2.5Hz，150％舒张期震颤)进行心室起搏。通过先用BCL 100-ms S1然后用S2持续10分钟产生AF。在迷走神经持续刺激期间没有AF发生或者AF持续时间缩短被认为有效预防了在十二指肠给药后0.5-4小时内AF产生期的某个时间点的AF。可以重复产生持续性AF并且通过停止迷走神经刺激而终止。在十二指肠给药前成给药的不同的时间点(0.5、1、1.5、2、3和4小时)记录AF发生率和AF持续时间。 

1.8.急性毒性评价 

用昆明小鼠(18-20g，50％雌性和50％雄性)测定刺槐素的急性毒性。在DMSO中制备刺槐素最大浓度(263mg/ml)贮存液，然后与10％PVP400混合以制备刺槐素口服混悬液。密切观察动物在两周的持续期内的死亡数和活动性。 

1.9.统计分析 

组数据以平均值±S.E.M.表示。用成对或不成对观察的Student’st检验来进行统计分析以评价两组平均值之间的显著性差异，和多组的ANOVA。用Fisher精确检验来分析定量数据。采用双边P＜0.05表示统计显著性差异。用Pulsefit(HEKA)和Sigmaplot(SPSS，Chicago，IL)进行非线性曲线拟合。 

将本文涉及和引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物以其全部，包括所有的图和表格，引入作为参考至它们与本说明书的明确教导不矛盾的程度。 

下面是阐述实施发明的过程的实施例。这些实施例不应该被解释为限制。除非另有说明，所有的百分比为以重量计，并且所有的溶剂混合物比例为以体积计。 

实施例1-刺槐素对人类心房肌细胞的I_kur、I_to和动作电位的作用 

为了测定刺槐素对I_kur的作用，在有和没有刺槐素的情况下，在代表性人类心房细胞中先用100ms前脉冲至+40mV以部分失活I_to，接着10ms间隔期后从 -50至+50mV，然后至-30mV的160ms测试脉冲(Tian等，2006；Gao等，2004)记录电流的时间过程(图2A)。3μM刺槐素在8分钟暴露时逐渐抑制I_kur，该作用在清除时恢复(94％)。图2B显示插图中显示的通过电压方案引出的电压依赖型I_kur。3、10和30μM刺槐素基本上抑制了末端电流和阶跃电流。在+40mV评价从0.3到100μM刺槐素对I_kur抑制的浓度响应关系(图2C)。将数据拟合成Hill方程：E＝E_max/[1+(IC₅₀/C)^b]，其中E是在浓度C时电流的抑制百分数，E_max是完全抑制，IC₅₀是达到最大活性一半时的浓度，且b是Hill系数。刺槐素抑制I_kur的IC₅₀是3.2μM，它的Hill系数是0.8。 

为了检查刺槐素对I_to的作用，在有和没有刺槐素的情况下，在一个代表性实验中记录I_to的时间过程(图3A)。3μM刺槐素降低I_to，该作用在清除时恢复(95％)。然而，刺槐素同时也降低持续电流(即I_kur)。尽管所测的I_to为准稳态水平的峰值，我们怀疑对于刺槐素对I_to效应的评价可能不准确。我们最近已经发现维拉帕米抑制I_kur而不降低I_to振幅，同时它诱导在人类心房肌细胞中所测I_to的增加(Gao等，2004)。因此，使用10μM维拉帕米分离I_to，如图3B所示。维拉帕米实际上增加I_to振幅。3和10μM刺槐素基本上抑制电压依赖性I_to(图3B)。刺槐素对I_to的抑制效应是浓度依赖性的，IC₅₀为9.3μM(图3C)，Hill系数为0.9。 

10μM刺槐素不影响电压依赖性的I_to的稳态失活和活化(图4A)。然而，10μM刺槐素显著增加了I_to的恢复时间常数(τ：对照组中102±12ms；刺槐素组中136±17ms，P＜0.01)(图4B)，表明刺槐素减慢了I_to从失活的恢复。 

刺槐素对I_kur和I_to的抑制表示该化合物延长人类心房肌细胞中动作电位持续时间(APD)。因此，我们用具有多孔膜片结构以电流钳模式在36℃记录动作电位，以测定刺槐素对人类心房APD的作用。图5A说明了在有和没有刺槐素或4-AP(一种已知的I_kur阻断剂)(Li等，1996b)的情况下，在代表性人类心房肌细胞中以2Hz记录的动作电位。5或10μM刺槐素以平行对照方式延长APD而不影响静息细胞膜电位或动作电位振幅。该作用在清除时恢复。以50％、75％和90％复极化的APD显著增加(图5B)。刺槐素诱导APD₅₀、APD₇₅和APD₉₀的微小速率依赖性升高。50μM 4-AP比APD₉₀更延长APD₅₀(图5A的右图)，并且诱导APD₅₀、APD₇₅和APD₉₀的可逆速率依赖性延长(数据未显示)。这些结果表明刺槐素对人类心房APD的延长很可能不限于对I_kur和I_to的抑制。 

实施例2-刺槐素对豚鼠心房肌细胞的乙酰胆碱活化钾通道的作用 

在来自豚鼠心房肌细胞的左心房肌细胞中研究刺槐素对乙酰胆碱活化(I_{K_ACh})的作用，因为在该物种的心房中没有表达I_kur(Kv1.5)和I_to通道。用变速(ramp)方案(图6A)和电压阶跃方案(图6B)记录的细胞膜电流显示出5μM卡巴胆碱增加细胞膜电导率，且3μM刺槐素显著逆转了增加的电导率。图6C显示通过在卡巴胆碱和卡巴胆碱加刺槐素前后的电流数字减影引起的卡巴胆碱活化的I_K.ACh的I-V关系。3和10μM刺槐素基本上阻断了I_K.ACh(在-100至-80mV以及+50至+60mV P＜0.01。在-100和+50mV的测定电位下，对照组的I_{K_ACh}从-338.3±61.5pA和147.2±30.1降低至-180.2±36.7 3μM刺槐素降低至87.8±36.1(P＜0.01，n＝5)，10μM刺槐素降低至-75.6±21.1和55.7±26.2pA(P＜0.01，n＝6)。 

实施例3-刺槐素对其他心脏离子电流的作用 

用豚鼠心室肌细胞研究刺槐素对其他心脏离子电流例如，I_Na、I_CaL和I_K1的作用。图7图解了在使用如图所示的电压方案的不同细胞中记录的I_Na、I_CaL和I_K1结果。30和100μM刺槐素对I_Na、I_CaL和I_K1没有作用。 

在稳定表达hERG通道(人类心脏I_kr的α-亚单位)或I_Ks通道(hKCNQ1/hKCNE1)的HEK293细胞中测定刺槐素对I_Kr和I_Ks的效应。30μM刺槐素抑制在代表性细胞中由电压方案引发的hERG通道电流的振幅(插图，图8A)，并且该作用在清除时消失(图8A)。刺槐素抑制I_hERGtail的IC₅₀为32.4μM(图8B)，且它的Hill系数为0.9。 

图8C显示了刺槐素对在HEK293细胞系中稳定表达的I_Ks的作用。30μM刺槐素显著抑制了I_Ks的振幅，并且该效应清除时部分恢复(83％)。刺槐素以浓度依赖性方式降低在+20到+60mV的I_Ks。刺槐素抑制I_Ks(+40mV)的IC₅₀ 为81.4μM(图8D)且它的Hill系数为0.8。 

实施例4-刺槐素对在离体兔心中ECG的QTc间期的作用 

上述抑制I_hERG和I_Ks的结果表明刺槐素可能具有延长ECG的QTc间期的潜力。兔心脏显著地表达I_Kr通道(Salata等，1996)，并且已被用来评价心脏活性 剂的致心律失常作用(Milberg等，2004；Weissenburger等，1993；Cahill和Gross，2004)。因此，该离体兔心脏用于研究刺槐素是否增加QTc。用低血钾溶液(3mMK⁺)灌注该心脏。对于刺槐素有代表性的ECG记录显示在图9A，且对于奎尼丁显示在图9B中。30μM刺槐素对心率或ECG的QTc间期没有作用，而10μM奎尼丁降低心率并且显著增加QTc间期。心率和ECG的QTc间期的平均值图解在图9C&9D中。这些结果表明刺槐素在低血钾情况下不会延长离体兔心脏的ECG的QTc间期。 

实施例5-刺槐素对麻醉狗的心房不应期的作用 

使用通过程序化的心脏刺激器引入S1-S2而得300、250和200ms的BCLs来测定麻醉狗的ERPs(图10A)。我们发现在十二指肠给药刺槐素(5mg/kg)或索他洛尔(5mg/kg)后，在300、250和200ms的基础循环时间(BCL)的4小时观察期内，左右心房ERP显著延长了(表1和2)。图11A显示左心房ERP的改变百分比的平均值的实例。在给药组中的心房ERP增加了10-25％，但是在照组中没有增加。 

发现当在麻醉狗中用200msBCL测量右ERP时S2触发持续性AF(持续＞1分钟)。在刺槐素组的一个动物中，给药前S2诱导AF(图10B)，但是在刺槐素给药的两小时后没有(图10C)。在赋形剂组的另一个动物中，当在观察期内测定右心房ERP时，被S2总诱导AF。这表明刺槐素可能具有抗AF作用。 

如之前报道的(Nademanee，1992；Roden，1993)，5mg/kg索他洛尔显示可逆的速率依赖性延长ERP和增加QTc间期。然而，刺槐素没有这种对ERP的可逆的速率依赖性作用(图11B)，并且不会延长QTc间期(图11C)。这些结果表明刺槐素可能是一种不会导致QTc延长的抗AF剂。 

实施例6-刺槐素对麻醉狗心房颤动的作用 

然后，在麻醉狗中评价刺槐素对实验性AF的效应。在十二指肠给药后0.5到4小时期间的某个时间点，从100msBCL对双侧迷走神经刺激的S1-S2刺激(参见方法和图12)诱导AF。AF持续10分钟，一旦迷走神经刺激停止就终止。在连续迷走神经刺激期间没有AF发生或者AF持续时间缩短被认为是代表抑制了AF。药物治疗组的AF的发生率降低(图13A)。在赋形剂的每次AF诱 导实验中，在100％的动物中(n＝5)观察到持续性AF，但是在2.5、5和10mg/kg刺槐素组中，在50％(6中3)，57％(7中4)和57％(7中4)的动物中和在索他洛尔组(5mg/kg)中在40％(5中2)的动物中没有观察到。 

另外，在5mg/kg刺槐素组中，两只狗在给药后两小时显示出AF的持续时间缩短(一只持续5分钟31秒，另一只持续6分12秒)。在10mg/kg刺槐素组中，在一个动物中AF持续4分钟30秒，在另一个动物中AF持续7分钟11秒。在索他洛尔组中，在一个动物中观察到AF持续时间缩短(8分钟5秒)。在赋形剂组、2.5mg/kg刺槐素组、5mg/kg刺槐素组(P＜0.05)、10mg/kg刺槐素组(P＜0.05)和5mg/kg索他洛尔组中总的抗AF功效分别为0％、50％、85.7％、85.7％和60％(图13B)。这些结果表明刺槐素在麻醉狗中抑制了AF诱导。 

实施例7-在小鼠中的急性毒性 

在动物禁食14小时后，用在最大体积的混悬液得到的最大刺槐素浓度评价在小鼠中体内急性毒性。以1.5小时的间隔给药三次0.3g/kg剂量的刺槐素。在两周的观察期内没有发生动物死亡，与赋形剂对照动物相比较，不存在异常活动。这一结果表明口服给药刺槐素具有低的急性毒性或没有急性毒性。 

实施例8-刺槐素及其衍生物/类似物对Kv1.5和hERG通道的作用的比较研究 

在稳定表达这些通道基因的HEK293细胞中分别进行刺槐素及其衍生物/类似物对Kv1.5和hERG通道的效应的比较研究。如表3所述，刺槐素阻断Kv1.5通道的IC₅₀(3.4μM)接近人类心房的I_kur(3.2μM)(图2)。尽管衍生物A-2对于阻断Kv1.5通道具有较小的IC₅₀(2.04μM)，其对hERG通道的阻断也比刺槐素更强。A-4、A-5和A-6的IC₅₀s比刺槐素的更大。其他衍生物/类似物研究对Kv1.5没有抑制效应或抑制作用弱。这些结果表明刺槐素是研发人类抗AF研究的理想化合物，尽管可能不排除其他衍生物/类似物可能更好的作用。 

实施例9-刺槐素和其衍生物的制备 

刺槐素的合成 

反应方案： 

制备过程： 

向80ml无水吡啶溶液中连续加入9.62g 2’，4’，6’-三羟基苯乙酮和30g无水K₂CO₃和31g 4-甲氧基苯甲酰氯，然后当将其在120℃油浴中回流3小时后用氯仿萃取反应溶液，并且用水(100ml)洗涤氯仿萃取液，用无水K₂CO₃干燥氯仿液并用活性碳去色，然后真空浓缩。将残余物用60ml无水乙醇溶解，其沉淀在溶液中，过滤，得到13.53g中间体。 

向50ml甲醇溶液中加入6.3g上述中间体和6％KOH溶液，搅拌并回流20小时，然后真空中回收大部分甲醇，并且用氯仿萃取以除去一些无关成分，在用10％乙酸酸化水相为pH9后获得沉淀物，过滤，水洗，干燥，最后得到1.83g刺槐素。 

A-02-11-11的制备 

向0.75ml吡啶中加入30mg刺槐素和0.50ml醋酸酐，室温搅拌2小时，层析残余物，并用石油醚∶丙酮＝2∶1洗脱，得到A-02-11-11。 

A-02-11-12的制备 

向0.75ml吡啶中加入30mg刺槐素和0.50ml苯甲酸酐，室温搅拌2小时，层析残余物，并用石油醚∶丙酮＝2∶1洗脱，得到A-02-11-12。 

A-02-11-13的制备 

向0.75ml吡啶中加入30mg刺槐素和几滴碘甲烷，室温搅拌2小时，层析残余物，并用石油醚∶丙酮＝2∶1洗脱，得到A-02-11-13。 

A-02-11-14的制备 

向0.75ml吡啶中加入30mg刺槐素和几滴溴乙烷，室温搅拌24小时，层析残余物，并用石油醚∶丙酮＝2∶1洗脱，得到A-02-11-14。 

A-2和A-3的制备 

向80ml无水吡啶溶液中连续加入9.62g 2’，4’，6’-三羟基苯乙酮和30g无水K₂CO₃和31g 4-甲氧基苯甲酰氯，然后当将其在120℃油浴中回流3小时后，用氯仿萃取反应溶液，并用水(100ml)洗涤氯仿萃取液，用无水K₂CO₃干燥氯仿液并用活性碳去色，然后真空浓缩。将残余物用60ml无水乙醇溶解，其沉淀在溶液中，过滤，得到13.53g中间体。用TLC分析残余物有三个点，然后层析，并用石油醚∶丙酮＝2∶1洗脱，得到A-2(203mg)、A-3(50mg)和刺槐素(1.83g)。 

A-4的制备 

向0.8ml无水吡啶溶液中连续加入100mg 2’-羟基苯乙酮和300mg无水K₂CO₃和125mg 4-甲氧基苯甲酰氯，然后当将其在120℃油浴中回流3小时后，用氯仿萃取反应溶液，并用水(5ml)洗涤氯仿萃取液(10ml)，用无水K₂CO₃ 干燥氯仿液并用活性碳去色，然后真空浓缩。将残余物用3ml无水乙醇溶解，其沉淀在溶液中，过滤，得到31mg A-4。 

A-5的制备 

向0.8ml无水吡啶溶液中连续加入100mg 5’-氯-2’-羟基苯乙酮和300mg无水K₂CO₃和100mg 4-甲氧基苯甲酰氯，然后当将其在120℃油浴中回流3小时后，用氯仿萃取反应溶液，并用水(5ml)洗涤氯仿萃取液(10ml)，用无水K₂CO₃ 干燥氯仿液并用活性碳去色，然后真空浓缩。残余物用3ml无水乙醇溶解，其沉淀在溶液中，过滤，得到35mg A-5。 

A-6的制备 

向0.8ml无水吡啶溶液中连续加入100mg 2’-羟基-5’-甲基苯乙酮和300mg无水K₂CO₃和100mg 4-甲氧基苯甲酰氯，然后将其在120℃油浴中回流3小时后，用氯仿萃取反应溶液，并用水(5ml)洗涤氯仿萃取液(10ml)，用无水K₂CO₃ 干燥氯仿并用活性碳去色，然后真空浓缩。将残余物用3ml无水乙醇溶解，其沉淀在溶液中，过滤，得到25mg A-6。 

应当理解到本文描述的实施例和实施方案仅仅是用于说明的目的，本领域技术人员将根据其会提出多种变型和改变，并且其包括在本申请的精神和范围内。 

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Claims (13)

1.有效量的分离的化合物或其药学活性盐在制备用于治疗患者心房颤动的药物中的用途，其中所述分离的化合物具有下式

2.根据权利要求1的用途，其中所述分离的化合物从植物来源中分离。

3.根据权利要求1的用途，其中所述分离的化合物从化学合成获得。

4.根据权利要求1的用途，其中所述分离的化合物是分离的刺槐素。

5.根据权利要求1的用途，其中所述患者是人类。

6.有效量的分离的刺槐素或其药学活性盐在制备药物中的用途，所述药物用于抑制患者中的心脏钾通道I_Kur、I_KACh、和I_to。

7.根据权利要求6的用途，其中所述分离的化合物从植物来源中分离。

8.根据权利要求6的用途，其中所述分离的化合物从化学合成获得。

9.根据权利要求6的用途，其中所述患者是人类。

10.有效量的分离的化合物或其药学活性盐在制备药物中的用途，所述药物用于抑制患者中的心脏钾通道I_Kur，其中所述分离的化合物具有下式

11.根据权利要求10的用途，其中所述分离的化合物从植物来源中分离。

12.根据权利要求10的用途，其中所述分离的化合物从化学合成获得。

13.根据权利要求10的用途，其中所述患者是人类。

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