CN102000073B - 黄连碱在制备预防和治疗心肌缺血性疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄连碱或其生理上可接受的盐在制备预防和治疗心肌缺血性疾病的药物中的应用。黄连碱或其生理上可接受的盐具有保护心肌缺血损伤、预防和治疗心肌缺血性疾病的药理作用；具有保护心肌线粒体功能的作用；具有清除超氧阴离子自由基、保护心肌细胞免受自由基损伤的药理作用。本发明还公开了含有黄连碱或其生理上可接受的盐和药学可接受的载体和/或辅料的组合物。黄连碱为从黄连等多种常用中药或民间草药中提取的单体化合物，具有毒性低，原材料资源广阔的优点。

Description

黄连碱在制备预防和治疗心肌缺血性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及天然药物化学和黄连碱新的药理作用，具体涉及黄连碱或其生理上可接受的盐在预防和治疗心肌缺血性疾病中的应用。

技术背景

众所周知，心脑血管疾病是全球死亡率最高的疾病。缺血性心肌病属于冠心病的一种特殊类型或晚期阶段，是指由冠状动脉粥样硬化引起长期心肌缺血，导致心肌弥漫性纤维化，引起心脏扩大或僵硬、充血性心力衰竭、心律失常等一系列临床表现的综合征。随着冠心病发病率的不断增加，缺血性心肌病对人类健康所造成的危害也日渐严重。

心肌缺血可致心肌功能紊乱，伴有严重的心肌细胞损伤。研究发现，自由基的产生及脂质过氧化物反应增强与心肌缺血损伤的病理改变关系密切。心肌缺血时，自由基的产生增多，而自由基清除酶的活性降低，导致体内大量自由基堆积，进而使生物膜产生脂质过氧化反应，导致细胞膜的结构和功能损伤，从而加剧缺血心肌的组织损伤及功能障碍。

生物膜损伤是心肌细胞由可逆性损伤向不可逆损伤转变的早期重要的特征和标志。线粒体是细胞内能量代谢的重要场所。近年来研究认为，能量代谢障碍可能是心肌缺血损伤的始动因素，观察线粒体的变化能较客观地反映缺血损伤心肌细胞能量代谢的状况，线粒体膜损伤的研究已成为心肌缺血损伤防治的重要方面之一。

黄连碱(coptisine)的结构见式1，是由毛茛科植物黄连Coptischinensis Franch.中提取的异喹啉类生物碱。在黄连中，其与小檗碱、 巴马亭、表小檗碱、药根碱等其他结构类似的异喹啉类生物碱均以盐酸盐的形式共存。此外，文献报道黄连碱也存在于毛茛科植物日本黄连Coptis japonica Makino、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng etHsiao、云连Coptis teeta Wall.、罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang、白屈菜Chelidonium majus Linn.、丽春花Papaver rhoeasL.节裂角茴香Hypecoum leptocarpum Hook.f.et Thoms.棣棠草Hypecoum japonicum(Thunk.)Prantl，荷包牡丹Dicentra spectabilis(L.)Lem.深山紫堇Corydalis pallida(Thunb)Pers.刻叶紫堇Corydalisincise(Thunb.)Pers.等多种植物中。

盐酸黄连碱在黄连中的含量小于盐酸小檗碱(盐酸小檗碱含量达7％以上)，与盐酸巴马亭接近，达1％以上，也是含量较高的生物碱。但由于黄连碱的含量低于小檗碱(目前的研究报道还未发现有黄连碱含量如同小檗碱一样或接近的天然植物)，因此目前国内外对黄连碱的药理活性研究还不深入，仅有少量文献报道，主要涉及细胞毒性、抑制血管平滑肌细胞增殖活性、抗微生物活性、对SIN-1-引起的细胞损伤的保护活性、A型单胺氧化酶活性抑制和胃粘膜保护活性等。迄今为止，我们没有查到黄连碱对心肌缺血性疾病相关的报道。

对现有的文献报道总结如下：

(1)Lin CC Ng LT Hsu FF Shieh DE Chiang LC，Cytotoxiceffects of Coptis chinensis and Epimedium sagittatum extracts and their maj or constituents(berberine，coptisine and icariin)on hepatoma andleukaemia cell growth.，Clinical and Experimental Pharmacology &Physiology，2004，31(1/2)：65-69

在用体外实验评价黄连提取物、Epimedium sagittatum提取物以及它们的主要成分(小檗碱、黄连碱、淫羊藿苷)对肝癌和白血病细胞生长的抑制作用中，观测到小檗碱和黄连碱对人肝癌和白血病细胞增殖有抑制作用，IC₅₀ values分别为1.4～15.2microg(μg)/mL和0.6～14.1micro g/mL。

(2)Tanabe H Suzuki H Nagatsu A Mizukami H OgiharaY Inoue M.S elective inhibition of vascular smooth muscle cellproliferation by coptisine isolated from Coptis rhizoma，one of the crudedrugs composing Kampo medicines Unsei-in.Phytomedicine，2006，13(5)：334-342

该篇文献从10g黄连的水提取物中分离得到4mg的黄连碱，用于评价其抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用，并讨论了目前对黄连和黄连碱的研究现状。黄连的许多生物活性已有报道，如抗食道癌及其它肿瘤作用、抗菌作用、抗溃疡作用、止泻作用、以及抗恶病质作用等；在多数研究中，鉴定了小檗碱为主要的活性成分；而对其中的黄连碱的生物活性的研究报道很少。生物活性追踪分析表明，黄连根茎的生物碱成分-黄连碱具有显著的抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用(细胞实验)，GI₅₀(半数生长抑制浓度50％growth inhibitoryconcentration)值为3.3μM(1.2μg/ml)。研究发现，小檗碱具有同样作用，但GI₅₀值为95.1μM(35.4μg/ml)，而巴马汀没有类似作用(体外实验)。并且黄连碱的抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用具有显著的选择性。

(3)YAN Dan JIN Cheng XIAO XiaoHe.Investigation of theeffect of berberines alkaloids in Coptis chinensis Franch on Bacillusshigae(志贺氏杆菌(Bacillus，shigae))growth by microcalorimetry，Science in China.Series B，Chemistry，2007 50(5)：638-642

报道黄连中5种生物碱具有抗微生物活性，5种生物碱的作用强弱为：小檗碱＞黄连碱＞巴马汀＞表小檗碱＞药根碱

(4)Li HL Zhang WD Zhang C Liu RH WangXW Wang XL Zhu JB Chen CL Bioavailabilty andpharmacokinetics of four active alkaloids of traditional Chinese medicineYanhuanglian in rats following intravenous and oral administration，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006，41(4)：1342-1346.

大鼠口服和静注给药体内实验，结合血药浓度和尿药浓度的HPLC-MS分析的药物动力学研究结果表明，中药岩黄连中的四种活性生物碱(包括黄连碱)在口服给药时具有良好的体内吸收和分布。

(5)Yokozawa T Satoh A Cho EJ Kashiwada Y Ikeshiro Y.Protective role of Coptidis Rhizoma alkaloids againstperoxynitrite-induced damage to renal tubular epithelial cells.Journal ofPharmacy and Pharmacology 2005，57(3)：367-374

研究结果表明，黄连提取物及其所含生物碱具有显著的改善与ONOO(-)有关的肾小管LLCPK(1)细胞损伤，黄连碱在保护SIN-1-引起的细胞损伤方面的作用较黄连中其他生物碱作用强。

(6)Tanabe H Suzuki H Mizukami H Inoue M.Doubleblockade of cell cycle progression by coptisine in vascular smooth musclecells.Biochemical Pharmacology，2005，70(8)：1176-1184

研究结果表明，异喹啉生物碱结构上的细微差别产生了生物活性方面较大的差别，而黄连碱显示了特别的抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的双重阻滞(需药理解释)作用。

(7)Yokozawa T Ishida A Kashiwada Y Cho EJ KimHY Ikeshiro Y.Coptidis Rhizoma：protective effects againstperoxynitrite-induced oxidative damage and elucidation of its activecomponents.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2004，56(4)：547-556

研究表明，黄连生物碱成分具有抗氧化活性，但黄连碱不是主要的活性成分，小檗碱是最主要且活性最强的成分。

(8)Shigeta K Ootaki K Tatemoto H Nakanishi T InadaA Muto N，Potentiation of nerve growth factor-induced neuriteoutgrowth in PC12 cells by a Coptidis Rhizoma extract andprotoberberine alkaloids，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2002，66(11)，2491-2494.

黄连的甲醇提取物可增强由神经生长因子引起的轴索在PC12细胞中的生长，其中小檗碱是主要的作用成分，而黄连碱仅有轻微的作用。

(9)Ro，JS Lee，SS Lee，KS Lee，MK，Inhibition of type Amonoamine oxidase by coptisine in mouse brain.Life sciences，2001，70(6)：639-645

黄连碱在2μM浓度时显示出54.3％的A型单胺氧化酶活性抑制作用，抑制作用是可逆的。表明黄连碱是一个潜在的A型单胺氧化酶活性抑制剂。

(10)Hiroyuki Hirano Eriko Osawa YumikoYamaoka Toshio Yokoi，Gastric-Mucous Membrane Protection Activityof Coptisine Derivatives，Biological & pharmaceutical bulletin，2001，24(11)：1277-1281

从黄连中分离到黄连碱和8-氧化黄连碱，具有比西咪替丁(甲氰咪胍泰胃美)Cimetidine和硫糖铝(sucralfate)作用更强的胃粘膜保护活性(口服给药ED₅₀黄连碱为0.1mg/kg，8-氧化黄连碱为1.0mg/kg)。作者合成了一些具有部分黄连碱结构的衍生物，对这些化合物进行了胃粘膜保护活性的筛选，研究了构效关系，结果表明，邻苯二酚结构与活性有关。

发明内容

本发明的一个方面，涉及式1所示的黄连碱在制备用于预防、 缓解和/或治疗心血管疾病和/或心血管疾病引发的症状的药物中的应用。

所述的心血管疾病选自由各种原因引起的心肌损伤。尤其是由心肌缺血引起的心肌损伤。特别包括冠心病。

在本发明中，所述预防、缓解和/或治疗心肌缺血和/或心肌缺血引发的疾病或症状选自改善心肌缺血引起的大鼠心电图变化，明显缩小心肌缺血范围，降低心肌细胞缺血时受损程度，减少心肌损伤标志酶的漏出，所述的心肌损伤标志酶选自肌酸激酶、乳酸脱氢酶和天门冬氨酸氨基转移酶，提高抗氧化相关酶，减少脂质过氧化，缓解心肌收缩性能和舒张性能障碍；改善心肌缺血大鼠的心肌线粒体损伤。

本发明是通过如下技术方案来实现：通过皮下注射异丙肾上腺素建立动物心肌缺血损伤模型，观察动物心电图的变化，测定动物血清酶、心肌缺血范围、心肌线粒体的代谢及功能变化以及组织形态学观察，判定黄连碱对大鼠心肌缺血损伤的保护作用及对心肌缺血性疾病的预防和治疗作用。

整体动物药效评价实验结果表明，与心肌缺血损伤模型组比较，黄连碱预防给药能够降低异丙肾上腺索引起的血清酶CK、LDH和AST的升高，提高抗氧化相关酶，减少脂质过氧化，缓解心肌收缩性能和舒张性能障碍。心肌缺血范围明显缩小，大鼠心肌纤维排列整齐，肌膜平整光滑，线粒体嵴密集、排列整齐，肿胀及空泡明显减轻，提 示其对心肌细胞超微结构有保护作用，尤其是线粒体，黄连碱对抗心肌缺血可能是通过保护心肌线粒体结构，加强和恢复其氧化磷酸化功能，从而改善缺血心肌能量代谢和功能损伤。

本发明的另一方面，涉及一种用于预防、缓解和/或治疗心肌缺血和/或心肌缺血引发的疾病或症状的药物组合物，其含有预防或治疗有效量的黄连碱，以及任选的药学可接受的载体和/或辅料。

在本发明中，根据施用途径，所述黄连碱药物组合物可呈选自如下的剂型：溶液、悬液、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。

本发明的黄连碱药物组合物可以用已知的方法配制，使用几种途径对受试者施用，包括但不限于肠胃外、经口、局部、皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、鼻内途径。

本发明中黄连碱可通过市售或已知方法制备得到。

本发明的黄连碱药物组合物任选的可以通过任何常规方法用一种或多种药学可接受的载体和/或赋形剂来配制。因此，黄连碱和它们的药学可接受的盐和溶剂化物可以特别配制为例如吸入或吹入(通过口或鼻)或经口、含化、肠胃外或直肠给药。黄连碱可以采用带电荷的、中性和/或其他药学可接受的盐的形式。药学可接受的载体的例子包括但不限于REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES(A.R.Gennaro，Ed.)，20th edition，Williams & WilkinsPA，USA(2000)中所述的那些。

黄连碱药物组合物也可以采用溶液、悬液、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂等形式。这些制剂将含有治疗有效量的黄连碱，优选为纯化形式，以及适量的载体，以提供对患者适当给药的形式。制剂应当适合给药方式。

在本发明中，所述纯化形式的黄连碱是指基本上纯的黄连碱，尤其是纯度大于80％，优选的大于85％，特别优选的大于90％， 甚至更优选的大于95％的黄连碱。具体的，所述纯化形式的黄连碱纯度范围可以是例如90％-96％。

肠胃外给药

黄连碱药物组合物可以配制为通过注射例如通过推注来肠胃外给药。用于注射的制剂可以以单位剂型存在于含有任选添加的防腐剂的安瓿或多剂量容器中。肠胃外制剂可以包含在由玻璃、塑料等制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。制剂可以采用诸如在油性或水性载体中的悬液、溶液或乳剂的形式，并且可以含有辅剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

例如，肠胃外制剂可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬液(例如，1，3-丁二醇中的溶液)。可接受的载体和可以使用的溶剂包括水、林格液和等渗氯化钠溶液。另外，常规使用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油一酯和甘油二酯。另外，在肠胃外制剂中也可以使用脂肪酸如油酸。

此外，黄连碱药物组合物也可以配制为粉末形式，以在使用前用适合的载体如无热原的无菌水重建。例如，适合肠胃外给药的黄连碱药物组合物可以包括无菌等渗盐水溶液，其中含有每体积0.1％至90％重量的黄连碱。例如，溶液可以含有约5％至约20％，更优选地约5％至约17％，更优选约8％至约14％，再更优选约10％的黄连碱。溶液或粉末制剂也可含有增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以便减轻注射部位的疼痛。其他肠胃外化合物给药方法是本领域已知的，并且在本发明的范围内。

经口给药

对于经口给药，黄连碱药物组合物可以采用片剂或胶囊的形式，其通过常规方法用药学可接受的赋形剂如粘合剂、填料、润滑剂和崩解剂制备。

A.粘合剂

粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、西黄蓍胶粉、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶凝淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如，Nos.2208，2906，2910)、微晶纤维素及其混合物。合适的微晶纤维素的形式包括，例如，以AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103和AVICEL-PH-105出售的材料(可来自FMC Corporation，American ViscoseDivision，Avicel Sales，Marcus Hook，Pennsylvania，USA)。合适的粘合剂的一个例子是FMC Corporation以AVICEL RC-581销售的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的混合物。

B.填料

填料包括但不限于滑石、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、乳糖、微晶纤维素、粉状纤维素、葡聚糖结合剂(dextrates)、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶凝淀粉及其混合物。

C.润滑剂

润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醇、硬脂酸、硫酸月桂酯钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。另外的润滑剂包括，例如，固态硅胶(AEROSIL 200，Baltimore，Maryland，USA的W.R.Grace Co.生产)、合成硅的凝结气溶胶(Deaussa Co.of Plano，Texas，USA销售)、CAB-O-SIL(Boston，Massachusetts，USA的Cabot Co.销售的一种致热二氧化硅产品)及其混合物。

D.崩解剂

崩解剂包括但不限于琼脂-琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚克立林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶凝淀粉、其他淀粉、粘土、 其他藻胶、其他纤维素、树胶及其混合物。

片剂或胶囊可以任选地用本领域公知的方法包衣。如果本发明的黄连碱药物组合物使用粘合剂和/或填料，则它们一般配制成约50％至约99％重量的化合物。一方面，约0.5％至约15％重量的崩解剂，特别是约1％至约5％重量的崩解剂，可以与黄连碱组合使用。任选地可以添加润滑剂，其量一般不到黄连碱的约1％重量。制备固体口服剂型的技术和药学可接受的添加剂在Marshall，SOLIDORAL DOSAGE FORMS，Modern Pharmaceutics(Banker和Rhodes，Eds.)，7：359-427(1979)中描述。其他较不典型的制剂是本领域公知的。

用于口服的液体制剂可以采用溶液、糖浆或悬液的形式。或者，液体制剂可以为干制品的形式，在使用前用水或合适的载体重建。这些液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)、乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)、非水载体(例如，杏仁油、油状酯、乙醇或分馏植物油)、和/或防腐剂(例如，甲基或丙基对羟基苯甲酸脂或山梨酸)来制备。这些制剂也可以含有适当的缓冲盐、调味剂、着色剂、芳香剂和甜味剂。用于口服的制剂也可以配制为实现化合物的控制释放。口服制剂优选地含有10％至95％的化合物。另外，本发明的黄连碱药物组合物也可以用常规方法配制为用于含化给药的片剂或锭剂。黄连碱药物组合物的其他经口给药方法是本领域技术人员公知的，并且在本发明的范围内。

控制释放给药

为了延长黄连碱的活性和减少给药频率，可以配制控制释放(或持续释放)制剂。控制释放制剂也可以用来影响起效时间或其他特征，如血液化合物水平，从而影响副作用的产生。

控制释放制剂可以设计为最初释放产生所需疗效的一定量的黄连碱，逐渐且连续地释放另外含量的黄连碱，以便在长时间内保持疗效水平。为了在体内保持接近恒定的化合物水平，黄连碱可以以一定的速度从剂型中释放出来，代替从体内代谢和/或分泌 出去的黄连碱。黄连碱的控制释放可以由多种诱导因素来刺激，如，pH变化，温度变化，酶，水，或其他生理条件或分子。

控制释放系统可以包括，例如，输注泵，其可以用来以类似于向特定器官或肿瘤输送胰岛素或化疗剂的方式施用化合物。使用这种系统，黄连碱一般与生物可降解的、生物相容的聚合植入体组合施用，其在选择的部位在控制的时间内释放黄连碱。聚合材料的例子包括聚酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙烯乙酸酯及其共聚物和组合。另外，控释系统可以置于治疗目标附近，因此只需要全身剂量的一部分。

本发明的黄连碱可以用本领域技术人员公知的其他控制释放方法或给药装置来施用。包括，例如，羟丙基甲基纤维素、其他聚合基质、凝胶、可透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球等，或者任何上述的组合，以不同的比例提供所需的释放谱。黄连碱的其他控制释放给药方法是本领域技术人员公知的，并且在本发明的范围内。

吸入给药

黄连碱也可以通过吸入直接向肺施用。对于吸入给药，可以通过许多不同的装置方便地将黄连碱输送到肺。例如，计量吸入器(″MDI″)，其使用的罐含有合适的低沸点抛射剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，可以用来直接向肺输送化合物。MDI装置可以从许多供应者处获得，例如3M Corporation、Aventis、Boehringer Ingleheim、Forest Laboratories、Glaxo-Wellcome、Schering Plough和Vectura。

此外，也可以使用干粉吸入器(DPI)装置向肺施用化合物。DPI装置一般使用一种机构，例如，爆发的气体，在容器内产生云状干粉，然后可以被患者吸入。DPI装置也是本领域公知的，可以购自许多供应商，包括，例如，Fisons、Glaxo-Wellcome、InhaleTherapeutic Systems、ML Laboratories、Qdose和Vectura。一 种普及的变化形式是多剂量DPI(″MDDPI″)系统，它允许施用一个以上的治疗剂量。MDDPI装置可以从诸如AstraZeneca、GlaxoWellcome、IVAX、Schering Plough、SkyePharma和Vectura这样的公司获得。例如，用于吸入器和吹入器的明胶胶囊和药筒可以配制为含有黄连碱和适用于该系统的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

可以用于向肺施用化合物的另外一种类型的装置是例如Aradigm Corporation提供的液体喷雾装置。液体喷雾系统使用极小的喷嘴来使液体化合物雾化，然后可以被直接吸入到肺中。例如，可以使用雾化器装置向肺施用化合物。雾化器例如通过使用超声能，由液体化合物制剂产生气溶胶，形成易于吸入的细颗粒。雾化器的例子包括Sheffield/Systemic Pulmonary DeliveryLtd.、Aventis和Batelle Pulmonary Therapeutics提供的装置。

在另外一个实施例中，可以使用电流体力学(″EHD″)气溶胶装置向肺施用化合物。EHD气溶胶装置使用电能将液体化合物溶液或悬液雾化。当用EHD气溶胶装置向肺施用该化合物时，化合物制剂的电化学性质是将要优化的重要参数。这种优化由本领域技术人员常规进行。黄连碱的其他肺内给药方法是本领域技术人员公知的，并且在本发明的范围内。

适用于雾化器和液体喷雾装置和EHD气溶胶装置的液体黄连碱制剂一般包含黄连碱和药学可接受的载体。在一个代表性实施方案中，药学可接受的载体是一种液体，如醇、水、聚乙二醇或全氟碳。任选地，可以加入另外一种物质来改变化合物溶液或悬液的气溶胶性质。例如，这种物质可以是液体，如醇、二醇、聚乙二醇或脂肪酸。配制适用于气溶胶装置的液体化合物溶液或悬液的其他方法是本领域技术人员公知的。

贮库型给药

黄连碱也可以配制为贮库型制剂。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉注射给药。因此，化合物可 以与合适的聚合或疏水性材料一起配制，如在可接受的油或离子交换树脂中的乳剂，或者作为微溶性的衍生物如微溶性的盐。黄连碱的其他贮库型给药方法是本领域技术人员公知的，并且在本发明的范围内。

局部给药

对于局部给药，黄连碱可以与载体组合，以便递送有效剂量，根据所需活性，有效剂量为例如1.0μM至1.0mM。在本发明的一个方面，局部给药的药物组合物可以应用于皮肤。载体可以是，例如但不限于软膏、乳膏、凝胶、糊状物、泡沫、气溶胶、栓剂、垫或胶凝棒的形式。

局部制剂也可以在眼科可接受的赋形剂如缓冲盐水、矿物油、植物油如玉米油或花生油、凡士林、Miglyol 182、醇溶液或脂质体或脂质体样产品中包含治疗有效量的化合物。任何这些化合物也可以包含防腐剂、抗氧化剂、抗生素、免疫抑制剂和其他对该化合物没有有害作用的生物学或药学有效的药剂。黄连碱的其他局部给药方法是本领域技术人员公知的，并且在本发明的范围内。

其他给药系统

各种其他给药系统是本领域公知的，可以用来施用本发明的化合物。而且，这些和其他给药系统可以联合和/或改变，来优化本发明的黄连碱的给药。

本发明的另一方面还涉及一种食品，其含有黄连碱。

本发明的再一方面涉及一种预防、缓解和/或治疗脑缺血和/或脑缺血引发的疾病或症状的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的黄连碱或含有治疗有效量的黄连碱的药物组合物。

在本发明中，所述治疗有效量的黄连碱可以为0.5-200mg/kg体重之间的任一量，优选为1-150mg/kg体重，更优选为2-100mg/kg体重，更优选为3-50mg/kg体重，更优选为4-35mg/kg体重，更优选为5-20mg/kg体重之间的任一量。

治疗有效剂量的确定原则

黄连碱的毒性和疗效可以通过在细胞培养物或实验动物中用于测定LD₅₀(50％群体致死剂量)和ED₅₀(50％群体有效治疗剂量)的标准药学方法来确定。毒性和疗效之间的剂量比是一个治疗指数，可以表示为比值LD₅₀/ED₅₀。。

从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可以在配制用于人类和其他哺乳动物的剂量范围中使用。黄连碱的剂量优选地在具有极小毒性或没有毒性的包括ED₅₀的循环血浆或其他体液浓度的范围内。

该剂量可能在该范围内变化，取决于所使用的剂型和给药途径。对于本发明的黄连碱，治疗有效剂量可以在开始时根据细胞培养试验来估计。可以在动物模型中设计剂量，以达到在细胞培养中测定的包括IC₅₀(达到半数最大症状抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。可以利用这些信息更精确地确定在人类和其他哺乳动物中有用的剂量。血浆中的黄连碱水平例如可以通过高效液相层析来测定。

可与药学可接受的载体组合产生单剂型的黄连碱的量根据所治疗的宿主和具体给药模式而不同。本领域技术人员应当理解，每个剂型的个别剂量中所含的黄连碱的单位含量不需要本身构成治疗有效量，因为可以通过施用多个个别剂量来达到需要的治疗有效量。剂量的选择取决于使用的剂型、所治疗的疾病和根据本领域技术人员的决定所要达到的具体目的。

用本发明的黄连碱治疗疾病或病症的剂量方案根据多种因素来选择，包括患者的类型、年龄、体重、性别、饮食和医学状况，给药途径，药理学考虑因素，如活性、有效性、所使用的具体化合物的药物代谢动力学和毒理学分布，是否使用黄连碱给药系统。因此，实际使用的剂量方案可能在受试者与受试者之间非常不同。

本发明的有益技术效果：

黄连碱为常用中药中提取的单体化合物，具有毒性低、提取工艺简单等优点；

其原材料资源广阔，具有很好的应用与开发前景，是一种比较理想的新型的治疗心脑血管疾病的中药。

黄连碱具有保护心肌缺血损伤的药理作用，具有保护缺血心肌线粒体功能的作用，具有清除心肌超氧阴离子自由基、保护心肌细胞免受自由基损伤的药理作用，具有预防和治疗心肌缺血性疾病的药理作用。

附图说明

图1、黄连碱对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血损伤大鼠心电图的影响。A-正常对照组；B-心肌缺血模型对照组；C-法舒地尔；D-硝酸异山梨酯；E-黄连碱(25mg/kg)；F-黄连碱(50mg/kg)；G-黄连碱(100mg/kg)。

图2黄连碱对心肌缺血损伤大鼠心肌酶活性的影响。A-肌酸激酶(ceatine phosphokinase，CK)、B-天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST)、C-乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)

图3黄连碱对心肌缺血损伤大鼠心肌超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)活力的影响。A-超氧化物歧化酶(SOD)、B-丙二醛(MDA)、C-谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、D-过氧化氢酶(CAT)

图4病理组织观察HE染色，观察心肌的组织结构变化A-正常对照组；B-心肌缺血模型对照组；C-法舒地尔；D-硝酸异山梨酯；E-黄连碱(25mg/kg)；F-黄连碱(50mg/kg)；G-黄连碱(100mg/kg)。

图5黄连碱对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血损伤大鼠超微结构中线 粒体、肌节、肌丝的影响。A-正常对照组；B-心肌缺血模型对照组；C-法舒地尔；D-硝酸异山梨酯；E-黄连碱(25mg/kg)；F-黄连碱(50mg/kg)；G-黄连碱(100mg/kg)。

图6黄连碱对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血损伤大鼠超微结构中血管的影响。A-正常对照组；B-心肌缺血模型对照组；C-法舒地尔；D-硝酸异山梨酯；E-黄连碱(25mg/kg)；F-黄连碱(50mg/kg)；G-黄连碱(100mg/kg)。

具体实施方式

下面结合本发明进一步说明黄连碱的制备过程及其在体内对抗心肌缺血性疾病的药理作用与应用。下述实施例更详细地举例说明本发明，并不是对本发明的任何限制。

实施例1：中药单体黄连碱的制备方法。

取黄连3.95kg，用95％乙醇水浴回流提取7次，合并乙醇提取液，回收溶剂至约2000ml，加水350ml，用石油醚萃取2次，回收下层溶剂成膏状，加水溶解，用乙酸乙酯萃取3次，水溶液加适量NaCl，有黄色沉淀析出，滤出此沉淀，加甲醇约4500ml热溶，抽滤，重结晶，滤出固体，母液蒸干得固体240。此固体用甲醇溶解，拌入适量硅胶(硅胶分次拌入，量较多，没有称量)，通过200～300目硅胶进行柱色谱分离，以氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)进行梯度洗脱。合并洗脱剂比例为氯仿-甲醇＝15∶1的83～95流份共9g，加硅胶18g拌样，进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(25∶1～10∶1)进行梯度洗脱，34流份至36流份析出的橙黄色粉末140mg，为黄连碱(纯度大于96％)。经甲醇重结晶，得到纯品盐酸黄连碱，纯度大于98％，得率约为0.00354％。

盐酸黄连碱(Coptisine hydrochloride；Coptisine chloride)：分子式为C₁₉H₁₄ClNO₄，橘黄色结晶性粉末(甲醇)。

结构确证数据：ESIMS m/z：320[C₁₉H₁₄NO₄]+。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：3.19(2H，t，J＝6Hz，H-5)，4.87(2H，t，J＝6Hz，H-6)，6.16(2H，s，O-CH₂-O)，6.53(2H，s，O-CH₂-O)，7.07(1H，s，H-5)，7.78(1H，s，H-8)，7.81(1H，d，J＝8.8Hz，H-14)，8.03(1H，d，J＝8.8Hz，H-13)，8.95(1H，s，H-15)，9.94(1H，s，H-16)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ：149.7，147.7，147.0，144.5，143.8，136.8，132.3，130.5，121.7，121.0，120.9，120.5，111.6，108.4，105.3，104.5，102.1，55.0，26.2。IR(KBr)vmax cm-1：3399(结晶水)，3039，2917，1645，1619，1605，1574，1506，1476，1390，1323，1286，1215，1138，1056，1035，927，896，824，802，773，748，706，615。

药理实验

实验例1：心肌缺血损伤大鼠模型的建立。

异丙肾上腺素(Isoproterenol，简称Iso)可增强心肌收缩力，加速心率，增加心肌耗氧量，连续使用可形成实验性心肌损伤。本实施例通过腹腔注射Iso造成大鼠心肌缺血损伤的动物模型，观察大鼠的心电图，测定实验大鼠血清酶、心肌缺血范围、心肌线粒体的损伤程度以及组织形态学观察，判定黄连碱对大鼠心肌缺血的保护作用及预防和治疗心肌缺血性疾病的药理作用及应用。

实验动物选用雄性SD大鼠105只，体重200～220g，随机分为7组，每组15只，正常对照组、心肌缺血模型对照组、硝酸异山梨酯(5mg/kg，灌胃给药)、法舒地尔(10mg/kg，腹腔注射)、黄连碱低、中、高剂量组(25、50、100mg/kg，灌胃给药)，连续给药21天，每天一次。除正常对照组皮下注射同体积生理盐水外，其余各组均于给药第20、21天皮下注射Iso 85mg/kg，制备大鼠心肌缺血损伤模型。末次给药后各组大鼠均禁食过夜，于第二天戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，前后肢皮下插入针状电极记录II导联心电图，观察心电图ST段的变化情况。实验结束后，颈总动脉取血，断头处死，部分心肌用于提取线粒体和酶的测定，部分心肌用于测定心肌缺血范围大小和心肌 组织超微结构变化。

实验例2：黄连碱对心肌缺血损伤大鼠心电图的改善作用。

上述各组大鼠于末次给药后均禁食过夜，于第二天戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，前后肢皮下插入针状电极，记录大鼠II导联心电图，观察心电图ST段的变化情况。结果显示(附图1)，正常大鼠心电图呈正常状态，异丙肾上腺素引起大鼠心电图ST段移位，T波抬高，出现心肌缺血性改变。法舒地尔、硝酸异山梨酯两个阳性药物，能明显改善异丙肾上腺素引起的大鼠心电图变化，黄连碱能够改善异丙肾上腺素引起的大鼠心电图变化，明显缩小心肌缺血范围，且呈剂量依赖性，说明黄连碱对异丙肾上腺素引起的大鼠心肌缺血损伤具有良好的保护作用。

实验例3：黄连碱对心肌缺血大鼠心肌酶活性的影响

心电图观察结束后，经颈总动脉取血，室温凝聚，离心分离血清，测定心肌酶谱，包括肌酸激酶(ceatine phosphokinase，CPK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)。结果显示(附图2)，与正常对照组比较，心肌缺血损伤模型组的大鼠血清的心肌损伤标志酶CK、LDH和AST显著升高(p＜0.05)。黄连碱预防给药能够减少心肌损伤标志酶的漏出，降低血清酶水平。血清中CK、LDH和AST活性间接反映了心肌损伤程度，当心肌细胞缺血受损时，细胞膜通透性增加，细胞内CK、LDH和AST外漏而致血中CK、LDH和AST升高。本研究发现，黄连碱预防给药能够降低异丙肾上腺索引起的血清酶CK、LDH和AST的升高，表明黄连碱对异丙肾上腺素引起的心肌缺血损伤具有保护作用。结果见附图2。

实验例4：黄连碱对心肌缺血损伤大鼠线粒体功能的改善作用。

动物处死后速取心脏，去大血管、心房及结缔组织，用预冷的生 理盐水冲洗干净，置于冰冷的分离介质(蔗糖250mM，Na2EDTA 1mM，Tris-HCl 10mM(HCl)，BSA 1g/L，调节pH＝7.4)中剪碎。按照5mL～8mL/g组织的用量加入分离介质，将剪好的组织转移到预冷的手动玻璃匀浆器中，上下均匀匀浆制备心肌匀浆。将匀浆液离心，1000rpm4℃离心10min；取上清，10000g 4℃离心10min。弃去上清，加入新的分离液，至离心管2/3处，掉转离心管180度，使线粒体贴附位置位于离心机的内侧，于10000g 4℃离心10min。弃去上清，小心的获得沉淀，即为粗制线粒体；取少量提取介质，将沉淀悬浮起来，用Tips缓慢的吹打均匀，取样测定蛋白浓度。

仪器标定灵敏度后加入呼吸反应液，使仪器稳定一段时间。加入线粒体悬液，终浓度为1mg/mL，记录一段基线。约1min后加入适量呼吸底物，出现II态呼吸。底物一(2M谷氨酸+0.8M苹果酸)均各5μL，底物二(1M琥珀酸二钠)5μL。斜率稳定后，加入50mM ADP 5μL，出现较大的斜率，代表ADP刺激下的线粒体呼吸速率，称为III态呼吸。反应足够长时间，待ADP耗尽后，线粒体呼吸速率又降低，称为IV态呼吸。

呼吸控制率(Respiratory Control Ratio，RCR)加入ADP时(III态)的呼吸速率与ADP耗竭后(IV态)的呼吸速率之比，即RCR＝V3/V4。是表征线粒体结构、功能完整性及氧化磷酸化效率的指标。P/O值指线粒体每吸收单位氧的同时，生成ATP的量，即P/O＝ADP(nmol)/O(nmol)ADP：每次反应中所加入的ADP量(nmol)；O：加入ADP后线粒体氧化磷酸化所消耗的氧原子它反映线粒体的能量转化效率。

与正常对照组比较，异丙肾上腺素处理的心肌缺血损伤模型组大鼠线粒体功能损伤明显，加入底物I(谷氨酸和苹果酸)时的线粒体呼吸控制率具有显著性差异(p＜0.05)，表明黄连碱预防给药能够减少线粒体损伤，线粒体呼吸控制率增加，线粒体结构完整性增加，功能增强。加入底物II(琥珀酸钠)时，线粒体3态和4态呼吸速率与正常对照组有显著差异(p＜0.05)，表明黄连碱预防给药能够减少 线粒体损伤，线粒体呼吸速率增加，线粒体活性增强。本研究发现，黄连碱能降低异丙肾上腺索引起的线粒体损伤，表明预防给药黄连碱对异丙肾上腺素引起的心肌缺血大鼠的心肌线粒体损伤具有良好的保护作用。

表1黄连碱对心肌缺血大鼠的线粒体呼吸功能的作用(加入10mM谷氨酸+5mM苹果酸为底物)

Mean±SD；n＝6；与正常组比较：^aP＜0.05；与ISO组比较：^bP＜0.05

表2黄连碱对心肌缺血大鼠的线粒体呼吸功能的作用(加入10mM琥珀酸钠为底物)

Mean±SD；n＝6；与正常组比较：^aP＜0.05；与ISO组比较：^bP＜0.05

实验例5：黄连碱对心肌缺血大鼠心肌超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT) 的作用。

处死大鼠，迅速剪下心脏，预冷的生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，剪取心室肌精确称重，以1：9比例加入预冷的生理盐水制备10％心肌匀浆，3000rpm离心10min，取上清，测定心肌组织中的酶活力。

结果显示，心肌缺血模型组与空白对照组比较血清中SOD、CAT和GSH-PX活力明显降低，MDA含量明显升高；结果表明，黄连碱给药组可明显升高SOD、CAT和GSH-PX活力，降低MDA含量。说明黄连碱对心肌缺血损伤大鼠的氧化与抗氧化平衡起着重要作用，并能清除超氧阴离子自由基。结果见附图3。

实验例6：病理组织学观察黄连碱对心肌缺血大鼠的影响

取心脏中下1/3处的部分心肌，用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，HE染色，光镜下观察病理改变，CCD记录图像。

缺血组织病理学检查发现，心肌缺血模型组心肌细胞结构紊乱，局灶性坏死，细胞间隙明显水肿，有明显的空泡变性。应用黄连碱能够呈剂量依赖性减少坏死程度，保持心肌细胞结构正常。结果见附图4。

实验例7：黄连碱对心肌缺血大鼠的心肌超微结构的影响

取心脏中下1/3处的部分心肌，用手术刀切成1mm³的小块，放入电镜固定液中4℃固定2h，用预冷的PBS洗3次，每次10min。送样进行电镜染色，拍照。

电镜结果表明，心肌缺血模型组细胞坏死严重，毛细血管扩张、破裂，大量炎细胞浸润；线粒体增生肿胀；脂肪变性。应用黄连碱能够呈剂量依赖性减少坏死程度，保持心肌细胞结构正常，心肌肌节、肌丝排列整齐，减少炎细胞浸润，稳定线粒体膜结构，线粒体嵴清晰可见。结果见附图5和附图6。

综上所述，黄连碱具有预防和治疗心肌缺血性疾病的作用；保护缺血心肌线粒体损伤，改善缺血心肌能量代谢和功能损伤；清除超氧阴离子自由基、保护心肌细胞免受自由基损伤；能对抗心肌缺血损伤。

Claims (6)

1.如式1所示的黄连碱或其生理上可接受的盐在制备预防、缓解和/或治疗由心肌缺血引起的心肌损伤疾病或症状的产品中的应用，

其中，X^-代表无机或有机酸根，无机酸根包含盐酸根、硫酸根、硫酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根和硝酸根；有机酸根包括含2-18个碳原子的长链脂肪酸根以及酒石酸根、马来酸根、富马酸根、枸橼酸根、苹果酸根、肉桂酸根、苯甲酸根、丙二酸根、丁二酸根、戊二酸根、己二酸根。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述预防、缓解和/或治疗由心肌缺血引起的心肌损伤疾病或症状选自改善心肌缺血引起的大鼠心电图变化；明显缩小心肌缺血范围；缓解心肌收缩性能和舒张性能障碍；降低心肌细胞缺血时受损程度。

3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述预防、缓解和/或治疗由心肌缺血引起的心肌损伤疾病或症状选自减少心肌损伤标志酶的漏出；提高抗氧化相关酶，减少脂质过氧化；改善心肌缺血大鼠的心肌线粒体损伤。

4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述的心肌损伤标志酶选自肌酸激酶、乳酸脱氢酶和天门冬氨酸氨基转移酶。

5.如式1所示的黄连碱或其生理上可接受的盐在制备预防、缓解和/或治疗冠心病的产品中的应用，

其中，X^-代表无机或有机酸根，无机酸根包含盐酸根、硫酸根、硫酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根和硝酸根；有机酸根包括含2-18个碳原子的长链脂肪酸根以及酒石酸根、马来酸根、富马酸根、枸橼酸根、苹果酸根、肉桂酸根、苯甲酸根、丙二酸根、丁二酸根、戊二酸根、己二酸根。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于，所述的产品包括药品、保健品。