CN107488162B - 一类双环醇类衍生物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐，以及该类衍生物的制备方法、及其在制备预防和/或治疗肝病等方面药物中的应用。

Description

一类双环醇类衍生物及其制备和应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种治疗双环醇类衍生物及其制备和应用，尤其是在治疗和/或预防肝病以及相关疾病方面的用途。

背景技术

肝病是世界性疾病，我国是肝病大国。当前我国各种原因引起的肝损伤及肝脏炎症患者数量众多，以病毒性肝炎为主，具统计，我国每年因慢性肝炎(包括后期导致的肝硬化、肝癌)直接经济损失达9000亿人民币。近年来，药物性肝病、酒精性及非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病发病率亦呈逐年增加趋势。寻找安全有效的防治肝病相关药物一直都是全世界各大研究院所及制药公司研发的热点。近年来，国外多个相关药物上市或正在开展临床研究，包括telaprevir、boceprevir等以蛋白酶为靶点的小分子抗丙型肝炎药物，其上市结束了临床长期以来对丙型肝炎仅有干扰素和利巴韦林治疗的历史，抗乙肝病毒药物替诺福韦2008年上市，另有多个抗肝纤维化的药物在进行临床试验。国内肝病研究主要集中在临床，十一五重大传染病专项--病毒性肝炎重大研究专项的启动对病毒性肝炎的临床治疗起到了很大的推动作用，但相比而言，国内肝脏疾病相关药物研究相对落后，亟需加强。

双环醇是中国医学科学院药物研究所研发的第一个拥有我国自主知识产权的化学一类治疗肝炎药物^[1](结构式见图1)，临床具有良好的保肝降酶作用和一定的抗肝炎病毒活性，服用方便，无明显不良反应^[2]，药理活性广泛^[3-6]。双环醇相关研究成果先后获得多个奖项，包括“九五”优秀科研攻关成果奖(2002年)，2002年中国医药十大新闻，北京市科技进步一等奖(2005年)和国家科技进步二等奖(2007年)等，已获得美国、欧盟、日本、韩国等16个国家和台湾地区的化合物发明专利保护，产品远销乌克兰等国。自2001年11月在人民大会堂召开新闻发布会宣布上市，双环醇已为国家创造了巨大的社会效益和经济效益。

但双环醇生物利用度低，水溶性差，不能制成注射制剂，在一定程度上影响了其在临床上的应用。目前对于双环醇的研究多偏重于其作用机理、临床疗效以及于其他药物联合治疗方面的研究。而以双环醇为先导物，进行药物分子设计和结构改造合成有关类似物的报道较少。在这一方面，多以联苯双酯为先导化合物，设计合成相关新化合物(大部分为联苯单酯类衍生物)，并进行了相关的定量构效关系的研究。此外，YaKche等(Martin K，Chunxiao Ying，Remco L，Mol Pharmacol，2001，60(3)：521-527)尝试将联苯双酯设计成固体分散剂、包合物等新剂型，以期提高药物的生物利用度。但是，较少具体涉及双环醇。因此，以双环醇为先导，进行水溶性药物分子的设计和合成对目前新的乙肝药物的开发具有一定的研究价值和前景。

本发明以双环醇这一现有的抗HBV药物或保肝药物为先导化合物，针对其分子中缺少可以成盐的官能团、水溶性差，口服生物利用度低、不能制成注射剂型等不足，以前药理论为指导，对其2-位羟甲基进行结构修饰，改变其理化性质，发现了具有良好活性和药代动力学性质的一类双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐，并对其进行了药效学评价。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一类双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐、其制备方法以及在制备预防和/或治疗与肝脏有关疾病的药物中的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了一种双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐，具有如下的结构式：

其中，药物上可接受的酸加合盐可从无机酸和有机酸制备。X选自无机酸、有机酸；无机酸选自氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、醋酸、硫酸、磷酸；所述的有机酸选自乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸。

本发明技术方案的第二方面是提供了第一方面所述双环醇类衍生物及其药学上可接受盐的制备方法。

本发明的化合物可通过以下步骤获得：a)双环醇与二氯亚砜反应得到氯代产物化合物2；b)化合物2与吗啡啉作用得到化合物3；c)化合物3与酸成盐得到目标产物。

其中，X的定义和第一方面的定义相同。

本发明技术方案的第三方面提供了一种药物组合物，其包含治疗和/或预防有效量的本发明第一方面所述双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐，以及任选的一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。

该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助溶剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助溶剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助溶剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助溶剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-5mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明技术方案的第四方面是提供了第一方面所述双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐以及第三方面所述药物组合物在制备预防和/或治疗与肝脏有关疾病的药物中的应用。其中所述的与肝脏有关疾病选自肝损伤相关疾病、肝炎相关疾病，具体而言，选自病毒性肝炎、化学品或药物引发的肝损伤等肝病，包括：甲肝、乙肝、丙肝、药物性肝病、酒精性肝病、非酒精性肝病、自身免疫性肝病、肝病进展的肝纤维化、肝硬化、肝衰竭。

有益技术效果

本发明的双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐灌胃及注射给药对CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤均有显著保护作用(0.1mg/kg即显示良好疗效)，能显著降低血清肝功能指标ALT、AST水平，降低肝组织过氧化产物丙二醛(MDA)含量，升高肝组织抗氧化物质超氧化物歧化酶(SOD)含量，同时改善肝组织病理损伤，降低肝细胞坏死、变性及肝间质炎性浸润程度。此类化合物灌胃及注射给药对Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤和急性肝衰竭亦均具显著保护作用，其能显著降低血清ALT、AST及LDH水平，改善ConA造成的肝组织病理损伤，降低肝细胞坏死、肝间质炎症浸润及肝窦扩张和充血程度。此类化合物注射给药对ConA引起的小鼠急性肝衰竭亦有明显防治作用，小鼠死亡率显著降低，存活时间明显延长。这些保护作用是通过减少肝细胞坏死和变性、抗炎以及抗氧化来实现的。此外，体外实验也表明，本发明的双环醇类衍生物对对乙酰氨基酚(APAP)及雷公藤甲素(TPL)引起的药物性肝损伤亦有显著抑制作用，能提高肝细胞存活率，10nM浓度即显示良好药效。多个实验结果均表明，本发明的化合物具有良好的肝保护活性，且在本实验条件下，多数活性结果优于阳性对照药双环醇和甘利欣。

附图说明

图1：WLP-S-17对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤保护作用的肝组织病理图(H.E.×200)

图2：WLP-S-17对ConA诱导的小鼠急性免疫性肝损伤保护作用的肝组织病理图(H.E.×200)

图3：WLP-S-17对ConA引起小鼠急性肝衰竭动物死亡时间的影响

具体实施方式

本发明提供了一种治疗乙型肝炎的双环醇类衍生物及其制备和应用。下面列举实施例进一步对本发明予以说明，但不以任何方式限制本发明。

本发明提供的双环醇衍生物的熔点用日本Bristoscope显微熔点仪测定，核磁共振谱用Varain Mercury-300核磁共振仪测定，TMS为内标，质谱用ZAB-2F质谱仪测定。

实施例1化合物WLP-S-17的合成

a.SOCl₂/DMF；b.TEA/CH₂Cl₂or CH₃COCH₃；c.CH₃SO₃H/CH₃OH

5.1g(13.1mmol)化合物1(即双环醇)置于100ml带有磁力搅拌和温度计的三口瓶中，加入50ml干燥DMF，固体完全溶解，冰浴冷却至0℃后，缓慢滴加4.5ml(61.8mmol)的SOCl₂，控制体系温度不超过5℃。滴加完毕后冰浴反应30min至TLC显示原料反应完全。将反应体系倒在约100g碎冰中，充分搅拌，析出大量白色固体，过滤，滤饼依次用少量蒸馏水、乙醚洗，抽干。自然晾干，称重，得到白色固体(化合物2)共4.9g，收率：91.7％。MS-FAB：[M+2H]+＝410.0，M+＝408.1；NMR-H1(CDCl3)：7.405(1H)，6.732(1H)，6.047-6.023(2H)，5.946(2H)，4.355(2H)，3.980-3.941(6H)，3.676(3H)。

1.28g(14.7mmol)吗啡啉置于50ml的圆底烧瓶中，加入25ml丙酮和2.2ml的三乙氨，室温搅拌下加入2.76g(6.8mmol)化合物2，室温反应5h，静置过夜，TLC显示原料反应完全，体系有粉色不溶固体生成，过滤，滤液减压蒸去溶剂，所得黄色油状物减压柱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)，收集产物组分，共得到无色油状物(化合物3)3.1g，收率：92.3％。MS-FAB：[M+3H]⁺＝462.1，[M+H]⁺＝460.1

称取化合物3 2.5g(5.4mmol)，溶于适量甲醇，搅拌下滴加0.52g(5.4mmol)甲磺酸，产生大量白色固体，过滤收集产物，自然晾干，称重，共得白色固体3.1g，收率：100％。MS-FAB：[M-CH₃SO₃H+H]⁺＝460.2；NMR-H¹(DMSO)：7.292(1H)，7.037(1H)，6.111-6.082(2H)，5.952-5.892(2H)，3.910(6H)，3.633(3H)，3.387-3.357(10H)，2.292-2.259(3H)。

药理实验

实验例1利用CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤模型对实施例化合物检测

1 CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤模型建立及给药方法

SPF级雄性ICR小鼠(20～22g)，适应环境后随机分为14组，空白对照组，CCl₄模型组，WLP-S-17尾静脉0.5mg/kg组，WLP-S-17尾静脉1.6mg/kg组，WLP-S-17尾静脉5mg/kg组、WLP-S-17尾静脉16mg/kg组、WLP-S-17尾静脉50mg/kg组、WLP-S-17口服1mg/kg组、WLP-S-17口服3.2mg/kg组、WLP-S-17口服10mg/kg组、WLP-S-17口服32mg/kg组、WLP-S-17口服100mg/kg组、双环醇200mg/kg组及甘利欣100mg/kg组，每组8-10只。WLP-S-17各尾静脉给药组及甘利欣注射液组于造模前3天开始尾静脉给药，每天给药1次，共给药3天，双环醇组及WLP-S-17口服组于造模前一天的下午，当天的上、下午各灌胃给药一次，空白对照组及CCl₄模型组动物给予相同量的0.5％CMC-Na。于末次给药后2h，各组小鼠腹腔注射0.2％CCl₄花生油溶液一次。给药量均为10mL/kg。小鼠禁食不禁水16h后，处死动物。

2生化指标测定

小鼠断头取血，血液样本室温静置1h，4000rmp离心10min，分离血清，全自动生化分析仪检测检测血清中ALT、AST含量。

3抗氧化活性测定

取肝脏，用4℃生理盐水冲洗，剪取小块肝组织，制备成10％肝组织匀浆，4℃3500rmp离心15min，取上清液，根据检测试剂盒说明书方法测定肝组织MDA、T-SOD含量。

4肝脏病理检测

取相同部位肝大叶标本，经10％甲醛固定，常规脱水透明、石蜡包埋、切片后，进行H.E.染色，光镜检查肝脏病理状态并照相。

5统计学分析

数据以均数平均值±标准差

表示。组间比较用t检验，以p＜0.05表示有显著性差异。

6.实验结果

6.1 WLP-S-17对CCl₄引起的急性肝损伤小鼠血清ALT、AST含量的影响

分组及动物的初始体重、终末体重见表1，在目前的实验方案和给药剂量下，WLP-S-17未显示明显毒性，动物体重无明显降低。血清ALT、AST含量结果见表2。结果显示，CCl₄能引起小鼠明显的急性肝损伤，血清ALT、AST含量较空白对照组显著升高。除尾静脉5mg/kg组和口服10mg/kg组，WLP-S-17其他各组对CCl₄引起血清ALT、AST升高均有一定降低活性，其中WLP-S-17尾静脉0.5mg/kg组、16mg/kg组、50mg/kg组能显著降低血清中ALT、AST含量，与模型组比较有统计学差异，其对AST的降低活性优于阳性对照药双环醇和甘利欣，WLP-S-17尾静脉16mg/kg组无论对AST还是ALT的降低作用均优于双环醇和甘利欣。WLP-S-17口服32mg/kg、100mg/kg能显著降低血清中ALT含量，对AST含量也有降低趋势，但与模型组比较无显著性差异。阳性对照药甘利欣100mg/kg尾静脉给药在本次实验中对CCl₄引起的血清ALT和AST升高仅有降低的趋势，与模型组比较无统计学差异。阳性对照药双环醇显著降低CCl₄引起的血清ALT升高，对AST含量仅有降低趋势。

表1 CCl₄急性肝损伤模型分组及动物初始体重、终末体重情况(n＝8-10)。

表2 WLP-S-17对CCl₄引起小鼠急性肝损伤模型血清中ALT、AST含量的影响(n＝8-10)。

^###P＜0.001，与空白对照组比较；^*P＜0.05，^***P＜0.001，与模型组比较。

6.2 WLP-S-17对CCl₄诱导急性肝损伤小鼠肝组织匀浆MDA、SOD含量的影响

结果见表3，CCl₄作用小鼠后，肝组织匀浆中MDA含量较空白对照组显著升高，SOD含量较模型组显著降低。WLP-S-17 5mg/kg、16mg/kg、50mg/kg尾静脉提前给药3次，能显著降低CCl₄引起的肝组织MDA升高，5mg/kg、50mg/kg尾静脉给药亦能显著升高肝组织SOD含量。WLP-S-17 32mg/kg和100mg/kg提前灌胃给药3次，能显著降低肝组织MDA含量，10mg/kg和100mg/kg灌胃给药能显著升高肝组织SOD含量，与模型组比较均有统计学差异。阳性对照药甘利欣能显著升高肝组织匀浆中SOD含量，但MDA含量未见明显减少。阳性对照药双环醇有降低肝组织匀浆中MDA含量、增加SOD含量的趋势，但与模型组比较无统计学差异。提示WLP-S-17对CCl₄引起肝损伤的保护作用可能与其抗氧化活性有关，其抗氧化活性在目前的实验方案下优于阳性对照药双环醇和甘利欣。

表3 WLP-S-17对CCl₄诱导小鼠急性肝损伤肝组织中MDA、SOD含量的影响(n＝8-10)

^#P＜0.05，^###P＜0.001，与空白对照组比较；^*P＜0.05，^***P＜0.01，与模型组比较。

6.3 WLP-S-17对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学观察

各组动物肝脏病理变化发生例数和程度观察表见表4-6，有代表性的病理图片整合图见图1。空白对照组动物肝小叶结构完成，肝细胞索排列规则，结构清晰，肝中央静脉及汇管区结构形态正常，肝细胞未见变性和坏死。CCl₄模型组动物肝细胞以中央静脉为中心呈现明显变性和坏死，肝细胞气泡样变，细胞边界不清，有明显的点、灶状坏死，炎细胞呈中度浸润，同时坏死肝小叶汇管区结构破坏。WLP-S-17灌胃及静脉给药各剂量组对CCl₄引起肝脏组织病理学改变均有一定程度的改善作用，肝细胞变性和坏死减轻，炎症细胞侵润缓解。WLP-S-17灌胃给药10，32，100mg/kg组改善CCl₄引起的肝脏病理损伤显示一定的量效关系。WLP-S-17静脉注射给药组未显示良好的剂量效应关系，其中以WLP-S-17静脉给药50mg/kg组、16mg/kg组、0.5mg/kg组效果最优，其次为WLP-S-17静脉给药1.6mg/kg组，再次为WLP-S-17静脉给药5mg/kg组。结果与生化结果一致。阳性对照药双环醇和甘利欣对CCl₄引起的肝脏病理损伤亦均有明显的改善作用。

表4 CCl₄诱导急性肝损伤模型各组动物肝细胞变性发生例数和程度表

^a注：肝细胞变性表现为肝细胞浊肿、脂肪变或空泡变性。根据同一视野中观察到的肝细胞变性程度分为四级：无肝细胞变性(-)；病变范围在肝小叶＜1/3为轻度(+)；病变占肝小叶2/3左右为中度(++)；病变＞肝小叶2/3为重度(+++)。

表5 CCl₄诱导急性肝损伤模型各组动物肝细胞坏死发生例数和程度表

^a注：肝细胞坏死细胞学特征改变为胞浆着色呈浅粉红色，胞浆空虚，胞膜薄，胞核多崩解，碎裂或降解，呈液化性坏死，部分肝细胞固缩胞浆深红染，胞核固缩，呈凝固性坏死。病变范围在肝小叶＜1/3为轻度(+)，病变占肝小叶2/3左右为中度(++)；病变＞肝小叶2/3为重度(+++)。

表6 CCl₄诱导急性肝损伤模型各组动物肝间质炎性浸润发生例数和程度表

^a注：肝淋巴细胞浸润灶：多见于肝小叶内肝窦淋巴细胞灶或斑片状淋巴细胞浸润

实验例2利用ConA诱导的小鼠急性免疫性肝损伤模型对实施例化合物进行检测

1.ConA诱导的小鼠急性免疫性肝损伤模型建立及给药方法

SPF级雄性ICR小鼠(20～22g)，适应环境后随机分为9组，空白对照组，模型组，WLP-S-17灌胃100mg/kg组，WLP-S-17灌胃50mg/kg组，WLP-S-17尾静脉50mg/kg组，WLP-S-17尾静脉25mg/kg组，WLP-S-17尾静脉12.5mg/kg组，阳性对照药双环醇200mg/kg组，阳性对照药甘利欣100mg/kg组。每组动物9-10只。WLP-S-17各尾静脉给药组及甘利欣注射液组于造模前3天开始尾静脉给药，每天给药1次，共给药3天，双环醇组及WLP-S-17灌胃给药组于造模前一天的下午，当天的上、下午各灌胃给药一次，空白对照组及模型组动物给予相同量的0.5％CMC-Na。于末次给药后2h，除空白对照组，各组小鼠尾静脉注射20mg·kg-1Con A一次。小鼠禁食不禁水16h后，处死。

2生化指标测定

小鼠断头取血，血液样本室温静置1h，4000rmp离心10min，分离血清，全自动生化分析仪检测检测血清中ALT、AST、LDH含量。

3肝脏病理检测

取相同部位肝大叶标本，经10％甲醛固定，常规脱水透明、石蜡包埋、切片后，进行H.E.染色，光镜检查肝脏病理状态并照相。

4统计学分析

数据以均数平均值±标准差

表示。组间比较用t检验，以p＜0.05表示有显著性差异。

5实验结果

5.1 WLP-S-17对ConA诱导的急性免疫性肝损伤小鼠血清肝功能指标的影响

分组及动物的初始体重、终末体重见表7，在目前的实验方案和给药剂量下，WLP-S-17未显示明显毒性，动物体重无明显降低。血清ALT、AST、LDH含量结果见表8。结果显示，Con A能引起小鼠急性肝损伤，血清ALT、AST、LDH含量较空白对照组显著升高。除口服50mg/kg组，WLP-S-17其他各组对ConA引起血清ALT、AST、LDH升高均有显著降低活性，与模型组比较有统计学差异，并且对血清中ALT、AST、LDH的降低活性优于阳性药双环醇和甘利欣，其中口服100mg/kg组效果最好，其给药后血清中ALT水平甚至与空白对照组相当。口服50mg/kg组能显著降低血清中ALT、AST含量，与模型组比较有统计学差异，其对ALT的降低活性优于阳性对照药双环醇和甘利欣，其对AST的降低活性优于双环醇弱于甘利欣，其对血清中LDH含量也有降低趋势，但与模型组比较无统计学差异。阳性对照药甘利欣100mg/kg尾静脉给药在本次实验中能显著降低Con A引起的血清ALT和AST含量，与模型组比较有统计学差异，但对血清中LDH含量仅有降低的趋势，与模型组比较无统计学差异。阳性对照药双环醇显著降低Con A引起的血清ALT、LDH的升高，对AST含量仅有降低趋势。

表7 Con A模型分组及动物初始体重、终末体重(n＝9-10)

n表示每组动物9-10只。

表8 WSP-L-17对ConA引起肝损伤后小鼠血清中ALT、AST、LDH含量(n＝9-10)

^#P＜0.05，^###P＜0.01，与空白对照组比较；^*P＜0.05，^***P＜0.01，与模型组比较；n表示每组动物9-10只。

5.2 WLP-S-17对ConA诱导的急性免疫性肝损伤小鼠肝脏病理组织学观察

各组动物肝脏病理变化发生例数和程度观察表见表9-11，有代表性的病理图片整合图见附图2。空白对照组动物肝小叶结构完成，肝细胞索排列规则，结构清晰，肝中央静脉及汇管区结构形态正常，肝细胞未见变性和坏死。ConA模型组动物肝细胞呈大片凋亡样坏死，肝细胞固缩、胞浆深、红染、胞核固缩，有的可见凋亡小体。坏死区肝窦扩张充血，同时肝间质炎细胞呈中度浸润。WLP-S-17灌胃及静脉给药各剂量组对ConA引起肝脏组织病理学改变均有一定程度的改善作用，肝细胞变性和坏死减轻，坏死区肝组织肝窦扩张充血减轻。阳性对照药双环醇和甘利欣对ConA引起的肝脏病理损伤亦均有明显的改善作用。

表9 ConA引起小鼠急性肝损伤各组动物肝细胞坏死发生例数和程度表

^a注：肝细胞坏死细胞学特征改变为胞浆着色呈浅粉红色，胞浆空虚，胞膜薄，胞核多崩解，碎裂或降解，呈液化性坏死，部分肝细胞固缩胞浆深红染，胞核固缩，呈凝固性坏死。病变范围在肝小叶＜1/3为轻度(+)，病变占肝小叶2/3左右为中度(++)；病变＞肝小叶2/3为重度(+++)。

表10 ConA引起小鼠急性肝损伤各组动物肝间质炎性浸润发生例数和程度表

a注：多见于肝小叶内肝窦淋巴细胞灶或斑片状淋巴细胞浸润灶，以肝门静脉周围为主为轻度(+)，除肝门静周围其它区域有灶或斑片状淋巴细胞浸润为中度(++)，肝脏组织内广泛的炎细胞浸润为重度(+++)。正常动物偶尔有灶状淋巴细胞浸润一般为动物自发病，不属于病变行为。

表11 ConA引起小鼠急性肝损伤各组动物肝窦扩张和充血发生例数和程度表

a注：肝窦扩张充血主要表现为：病变区域肝窦扩张或/和充血，以坏死区为主。

实验例3利用Con A诱导的小鼠急性肝衰竭模型对实施例化合物的检测

1.ConA诱导的小鼠急性肝衰竭模型建立及给药方法

SPF级雄性ICR小鼠(20～22g)，适应环境后随机分为3组，每组10只。WLP-S-1720mg/kg、WLP-S-17 40mg/kg组于造模前一天的下午，当天的上、下午各尾静脉注射给药一次，模型组动物给予相同量的生理盐水。于末次给药后2h，各组小鼠尾静脉注射40mg·kg^{- 1}Con A一次。给药量均为10mL/kg。小鼠禁食不禁水16h后，给予食物，观察小鼠的死亡率。

2实验结果

WLP-S-17对ConA引起肝衰竭小鼠死亡时间及存活率见表12及图3，在ConA注射给药16h时，ConA模型组6只小鼠死亡，20h时ConA模型组共有7只小鼠死亡，30h时ConA模型组小鼠全部死亡。WLP-S-17尾静脉20mg/kg、WLP-S-17尾静脉40mg/kg均不同程度降低Con A引起小鼠的死亡率。在ConA注射给药16h时，WLP-S-17尾静脉20mg/kg组仅2只小鼠死亡，WLP-S-17尾静脉40mg/kg组4只小鼠死亡，在ConA注射给药30h时，WLP-S-17尾静脉20mg/kg组共有3只小鼠死亡，WLP-S-17尾静脉40mg/kg组共有5只小鼠死亡。在本次实验中，WLP-S-17尾静脉20mg/kg组降低ConA引起小鼠死亡率效果优于WLP-S-17尾静脉40mg/kg组，提示低剂量WLP-S-17活性更优。

表12 WLP-S-17对ConA引起小鼠死亡时间的影响(n＝10)

实验例4利用CCl₄诱导的急性肝损伤模型对实施例化合物小剂量保肝活性进行进一步检测

在实验例1、实验例2及实验例3中均发现，低剂量WLP-S-17尾静脉给药亦显示良好活性，因此进一步利用CCl4诱导的急性肝损伤模型考察小剂量WLP-S-17的保肝活性。

1 CCl₄诱导的急性肝损伤模型的建立及给药方式

SPF级雄性ICR小鼠(20～22g)，适应环境后随机分为7组，空白对照组，CCl₄模型组，WLP-S-17腹腔注射0.1mg/kg组，WLP-S-17腹腔注射0.3mg/kg组、WLP-S-17腹腔注射1mg/kg组、阳性对照药双环醇200mg/kg组及甘利欣100mg/kg组，每组10-11只。各给药组均于造模前一天的下午，当天的上、下午各腹腔注射给药1次，空白对照组及CCl₄模型组动物给予相同量的0.5％CMC-Na。于末次给药后2h，各组小鼠腹腔注射0.15％CCl₄花生油溶液一次。给药量均为10mL/kg。小鼠禁食不禁水16h后，处死动物。

2生化指标测定

小鼠断头取血，血液样本室温静置1h，4000rmp离心10min，分离血清，全自动生化分析仪检测检测血清中ALT、AST、LDH含量

3统计学分析

数据以均数平均值±标准差

表示。组间比较用t检验，以p＜0.05表示有显著性差异。

4实验结果

4.1 WLP-S-17小剂量对CCl₄引起的急性肝损伤小鼠血清肝功能指标的影响

CCl₄模型分组及动物的初始体重、终末体重见表13，在目前的实验方案和给药剂量下，WLP-S-17未显示明显毒性。血清ALT、AST、LDH含量结果见表14。结果显示，CCl₄能引起小鼠明显的急性肝损伤，血清ALT、AST、LDH含量较空白对照组显著升高。小剂量WLP-S-170.1mg/kg，0.3mg/kg和1mg/kg对CCl₄引起血清ALT、AST、LDH升高均有显著的降低活性，与模型组比较均有统计学差异，其中WLP-S-17腹腔注射0.1m/kg和1mg/kg对AST、LDH的降低活性优于阳性对照药双环醇，WLP-S-17腹腔注射1mg/kg对AST、LDH的降低活性亦优于阳性对照药甘利欣。阳性对照药甘利欣100mg/kg及双环醇200mg/kg显著降低CCl₄引起的血清ALT、AST、LDH含量升高。

表13分组及动物初始体重、终末体重(n＝10-11)。

表14 WSP-L-17对CCl₄引起肝损伤后小鼠血清中ALT、AST、LDH含量(n＝10-11)。

^###P＜0.001，与空白对照组比较；^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001，与模型组比较。

实验例5利用对乙酰氨基酚诱导的体外肝损伤模型对实施例化合物进行检测

1细胞培养

人肝癌HepG₂细胞，该细胞较好的保留了人正常肝细胞的特性。在含10％胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)中生长，培养条件为37℃、5％CO₂，饱和湿度。用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA液消化传代。

2 WLP-S-17对HepG₂细胞的细胞毒性

采用MTT方法。HepG₂细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入0.1-50μMWLP-S-17，同时设溶剂对照组，每个浓度设3个平行孔。WLP-S-17作用细胞48h后，弃去培养液，每孔加入MTT(0.5mg/mL)液100μL，继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入DMSO 150μL，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。细胞存活率(％)＝(给药细胞OD平均值/溶剂对照细胞OD平均值)×100％。

3 WLP-S-17对对乙酰氨基酚引起体外肝细胞损伤的保护作用

采用MTT方法。HepG₂细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的WLP-S-17及对乙酰氨基酚(APAP，终浓度8mM)，同时设阳性药物对照药双环醇组、阳性对照药甘利欣组、溶剂空白对照组及模型组。继续作用细胞48h。弃去培养液，每孔加入MTT(0.5mg/mL)液100μL，继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入DMSO 150μL，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。细胞存活率(％)＝(给药组OD平均值/溶剂对照组OD平均值)×100％。

4统计学分析

数据以均数平均值±标准差

表示。组间比较用t检验，以p＜0.05表示有显著性差异。

5实验结果

0.1-50μM WLP-S-17作用于HepG₂细胞48h的细胞存活率见表15，如表所示，50μM内的WLP-S-17对HepG₂细胞无明显毒性。WLP-S-17对APAP损伤HepG₂细胞的保护作用见表16，8mM APAP可显著损伤HepG₂细胞，细胞存活率均为空白对照组的56.88％。WLP-S-17各剂量组对APAP引起的体外肝细胞损伤均有一定改善作用，能提高细胞存活率，其中0.05，0.1，1，5μM的WLP-S-17能显著提高细胞存活率，与模型组比较有统计学差异，作用优于10μM双环醇。阳性对照药双环醇和甘利欣亦能显著抑制APAP引起的肝细胞损伤。

表15 WLP-S-17作用于HepG2细胞48小时的细胞存活率

表16 WLP-S-17对APAP体外损伤肝细胞的保护作用

^###P＜0.001，与空白对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与模型组比较。

实验例6利用雷公藤甲素诱导的体外肝损伤模型对实施例化合物进行检测

1细胞培养

人肝癌HepG₂细胞，该细胞较好的保留了人正常肝细胞的特性。在含10％胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)中生长，培养条件为37℃、5％CO₂，饱和湿度。用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA液消化传代。

2 WLP-S-17对雷公藤甲素引起体外肝细胞损伤的保护作用

采用MTT方法。HepG₂细胞5×10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的WLP-S-17及雷公藤甲素(TPL，终浓度180nM)，同时设阳性对照药双环醇组、阳性对照药甘利欣组、溶剂空白对照组及模型组。继续作用细胞24h。每孔加入MTT(0.5mg/mL)液100μL，继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入DMSO 150μL，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。细胞存活率(％)＝(给药组OD平均值/溶剂对照组OD平均值)×100％。

3统计学分析

数据以均数平均值±标准差

表示。组间比较用t检验，以p＜0.05表示有显著性差异。

4实验结果

4.1 WLP-S-17对雷公藤甲素作用于HepG2细胞24h细胞存活率的影响

结果见表17，180nM雷公藤甲素作用HepG₂24h，对肝细胞造成明显损伤，细胞存活率显著降低。WLP-S-17 10nM浓度即对雷公藤甲素引起的肝细胞损伤有显著保护作用，25nM，50nM，100nM及5μM，10μM，50μM浓度WLP-S-17对雷公藤甲素损伤的肝细胞亦显示显著保护保护，与模型组比较均有统计学差异。与阳性对照药双环醇活性相当，甚至优于双环醇。阳性对照药甘利欣对雷公藤甲素引起的体外肝损伤已有显著保护作用。

表17 WLP-S-17对雷公藤甲素体外损伤肝细胞细胞存活率的影响

^###P＜0.001，与空白对照组比较；^*P＜0.05，^***P＜0.001，与模型组比较。

Claims (7)

1.一种双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，该双环醇类衍生物的结构如化合物3所示，其药学上可接受的盐具有式I所述的结构式：

其中，X选自无机酸、有机酸。

2.根据权利要求1的双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，无机酸选自氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、醋酸、硫酸、磷酸；所述的有机酸选自乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸。

3.权利要求1-2任一项所述的双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)双环醇与二氯亚砜反应得到氯代产物化合物2；

b)化合物2与吗啡啉作用得到化合物3；

任选的，c)化合物3与酸成盐得到结构式I所示的化合物；

其中，X的定义和权利要求1-2任一项相同。

4.一种药物组合物，其特征在于，包含预防和/或治疗有效量的权利要求1-2任一项所述的双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

5.权利要求1-2任一项所述双环醇类衍生物及其药学上可接受的盐或者权利要求4所述药物组合物在制备预防和/或治疗与肝脏有关疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述的与肝脏有关疾病包括肝损伤相关疾病、肝炎相关疾病。

7.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述的与肝脏有关疾病选自甲肝、乙肝、丙肝、药物性肝病、酒精性肝病、非酒精性肝病、自身免疫性肝病、肝病进展的肝纤维化、肝硬化、肝衰竭。

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