CN1431011A - 用于治疗肝炎的口服药物 - Google Patents

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CN1431011A CN 03117198 CN03117198A CN1431011A CN 1431011 A CN1431011 A CN 1431011A CN 03117198 CN03117198 CN 03117198 CN 03117198 A CN03117198 A CN 03117198A CN 1431011 A CN1431011 A CN 1431011A
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周厚成
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Abstract

本发明涉及的是一种用于治疗肝炎的口服药物，由虎耳草科植物扯根菜的乙醇纯化提取物作为有效药物成分，与常规口服药物可以接受的辅助添加成分共同组成。试验别名，该药物可以比目前以水提醇沉成分作为有效药物成分的药物具有更高的生物利用度和更为理想的疗效。

Description

用于治疗肝炎的口服药物
技术领域
本发明涉及的是一种以天然原料提取物为有效药物成分可用于治疗肝炎的口服药物。
背景技术
“对照药物肝苏颗粒”是一种已有报导和使用的用于治疗肝炎的药物，其有效药物成分是以天然药用植物虎耳草科的扯根菜(Penthorum chinense Pursh)的干燥地上部分为原料，采用水提醇沉方式得到的提取物。即：以常规方法对扯根菜进行煎煮后，合并煎煮液并过滤，滤液浓缩成清膏后，直接接入乙醇至含醇量达60％，过滤和醇洗后将乙醇溶液回收乙醇并浓缩成稠膏，与蔗糖、淀粉等辅料混合均匀后制成为颗粒。试验结果显示，含有以此种方式得到的成分作为有效药物成分的药物的生物利用度及疗效都还未达到令人更为满意的程度。
发明内容
针对上述情况，本发明将提供一种同样以虎耳草科植物扯根菜的乙醇提取物作为有效药物成分的治疗肝炎的药物，并使该药物的生物利用度及疗效都能达到比上述目前方式的同类药物更为令人满意的程度。
本发明用于治疗肝炎的口服药物，是由虎耳草科植物扯根菜的乙醇纯化提取物作为有效药物成分，与常规口服药物可以接受的辅助添加成分共同组成。这里所说的作为有效药物成分的扯根菜乙醇纯化提取物，是指能尽量减少目前存在于提取物中的水溶性高而乙醇溶解低或不溶性的成分和/或尽量增大扯根菜在乙醇提取液中有效成分的溶出含量。
根据这一原则，可以采用的具体方式之一是，在上述药物中所说的作为有效药物成分的扯根菜乙醇纯化提取物，可以先以常规方式得到扯根菜的水煎提取物溶液，再使水煎提取物溶液通过大孔树脂进行吸附进行纯化处理，用水冲洗吸附树脂后再用乙醇进行解吸附洗脱，收集乙醇洗脱液并除去乙醇后，即得到纯化的提取物成分。此种处理方式可以最大限度地除去在乙醇沉淀过程中，沉淀物对有效的醇溶性药物成分的包裹，提高有效药物成分在乙醇溶液中的含量，并能减少混入醇溶性有效成分中的水溶性成分对生物利用度和疗效的干扰。此处所说的用于从吸附树脂上洗脱有效药物成分的乙醇，一般以使用体积含量为～70％的乙醇即可。
在采用上述的大孔树脂处理方式时，所说的用于吸附纯化处理的大孔树脂的孔径选择一般可以在10-500纳米的范围内。
在得到上述所说的作为有效药物成分的扯根菜乙醇纯化提取物时，可以采用的另一种具体方式，不是采用常规先用水煎煮得到水煎提取液，再进行乙醇沉淀的方式，而是用乙醇直接对扯根菜进行回流提取后，收集并除去乙醇回流液的乙醇后所得到的提取物成分，即可被使用。此种直接采用乙醇提取的方式，同样也可以达到最大限度地减少扯根菜中的水溶性高而乙醇溶解度低或醇不溶性成分溶出而混入提取物，并还能尽量地增大扯根菜在乙醇提取液中有效成分的溶出含量。此处进行直接提取时所用的乙醇，一般以也使用体积含量为～70％的乙醇即可。
在采用上述的乙醇直接提取方式时，还可以将所得到的除去乙醇后所得到的乙醇直接提取物成分用水稀释一一例如，一般可以用水稀释至相对密度为1.02-1.05后，第二次加入乙醇至乙醇的体积含量为～90％进行再纯化，将不含沉淀物的乙醇清液除去乙醇后，从而可以得到再纯化的有效药物成分。
得到的上述乙醇纯化提取物作为有效药物成分，与在目前各种常用制剂形式口服药物中可以接受的相应辅助添加成分混合，并作相应的相应处理后，即成为相应制剂形式的本发明口服药物。例如，可以制成为常用的片剂、丸剂、胶囊、各种缓释剂型的固体制剂形式的口服药物；也可以制成为如水剂、糖浆等液体制剂形式的口服药物。这里所说的辅助添加成分，可以根据不同的制剂而有所不同，例如在片剂、丸剂、胶囊剂等固体制剂中常用的各种崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等；又如在水剂或糖浆等液体制剂中常用的增溶剂、乳化剂、润湿剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等。
其中，在制备固体型制剂时特别建议的，是用水将乙醇纯化提取物有效药物成分稀释至相对密度为1.10-1.12后，经喷雾干燥或真空干燥并制成粒径为～0.1毫米的(例如采用常规过140目～150目筛等方式)颗粒后，与常规口服药物可以接受的辅助添加成分共同制成为固体剂型口服药物。
按照上述内容，根据本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，对这些内容还可以有多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是本发明下述实例1的药物与肝苏颗粒的没食子酸血药浓度-时间曲线。
图2是本发明下述实例2的药物与肝苏颗粒的没食子酸血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
实例1  采用大孔树脂方式的扯根菜乙醇纯化提取物有效药物成分
将扯根菜生药原料粉碎成0.5-1.5cm的细段，加水煎煮3次，每次加8倍量水，每次2小时，合并煎液，离心，过市售的D101型大孔吸附树脂柱(树脂粒径0.3-1.3毫米，树脂孔径10-500纳米)，先用水冲洗，弃去水洗液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至药液的相对密度为1.10-1.12，喷雾干燥或真空干燥，过140目筛，得乙醇纯化乙醇提取物浸膏粉。加入适量淀粉，混匀，过筛，装胶囊，得到胶囊制剂形式的药物。将以此方法制备成的生药含量为8.33g/粒的本发明药物用于进行下述的各项试验。
实例2  采用乙醇直接提取方式的扯根菜乙醇纯化提取物有效药物成分
取上述相同量的扯根菜，同样粉碎成0.5-1.5cm的细段，在80℃用70％乙醇回流提取三次，第一次加入8倍量乙醇，第二、三次分别加入6倍量乙醇，每次提取1.5小时，合并醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至药液的相对密度为1.02-1.05，离心，药液浓缩至稠膏状(相对密度1.20，60℃)，加入乙醇使含醇量达90％，静置，滤过，减压回收乙醇至尽，加水稀释至药液的相对密度为1.10-1.12，喷雾干燥或真空干燥，过140目筛，得浸膏粉，加入适量淀粉，混匀，过筛，装胶囊，得到同样形式的胶囊制剂形式药物。将以此方法同样制备成生药含量为8.33g/粒的本发明药物也用于进行下述的各项试验。
分别以上述实例1和实例2方法制备的本发明药物进行下列的主要药效学试验：
一、对照药物肝苏颗粒浸膏粉抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究
(一)材料与方法
试验药物：本发明药物，分别为上述实例1和实例2的胶囊药物。对照药物肝苏颗粒(购于成都市中药材公司成药部，批号010509，每袋9g[含原药材16.7g])；阳性对照药物拉米夫定[商品名：贺普丁](葛兰素威康公司出品，批号010807，压碎成粉末，制成实验所需剂量胶囊)；乙肝宁冲剂(购于成都市中药材公司成药部，批号010306)。
动物模型：采用健康成年的重庆麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔接种0.1mDHBV DNA阳性病毒血清。接种1周后，分别颈外静脉抽血，用地高辛标记DHBV DNA探针(标记药盒购于德国Boehringer Mannheim公司)经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭饲养至3周龄作为实验动物。
实验分组及用药：将DHBV DNA阳性的3周龄鸭77只随机分为7组，每组11只：
(1)病毒对照组：用淀粉胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为200mg.kg-1.D-1。
(2)阳性药物对照组：用拉米夫定胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为50mg-1.D-1。
(3)乙肝宁对照组：每日口腔灌喂1次，剂量为12.5g.Kg-1.D-1(为临床人用剂量的20倍)。
(4)对照药物肝苏颗粒组：每日口腔灌喂1次，剂量为16.67g.Kg-1.D-1(为临床人用剂量的20倍)。
(5)本发明药物(实例1和实例2)大剂量组：每日口腔灌喂1次，剂量为16.67g.Kg-1.D-1(为临床人用剂量的20倍)。
(6)本发明药物(实例1和实例2)中剂量组：每日口腔灌喂1次，剂量为8.33g.Kg-1.D-1(为临床人用剂量的10倍)。
(7)本发明药物(实例1和实例2)小剂量组：每日口腔灌喂1次，剂量为4.17g.Kg-1.D-1(为临床人用剂量的5倍)。
实验用药时间：4周。
(二)观察指标：
1.血清DHBV DNA改变情况：于用药前、用药1周、用药2周、用药3周、周药4周、停药1周分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存等检。采用斑点杂交法，用地高辛探针将用药前后的血清统一对比检测，以与探针同源的质粒DNA倍比稀释后点样于硝酸纤维薄膜上杂交显示的斑点颜色深浅为标准，与待检血清斑点杂交斑点颜色深浅比较来半定量。统计学采用配对t检验。
2.血清DHBsAg改变情况：于用药前、用药1周、用药2周1、用药2周、用药3周、用药4周、停药1周分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。将用药前后的血清统一对比检测，采用ELISA快速法、酶标阅读仪(Bio-TEK公司)490nm读取O.D值。统计学采用配对t检验。
3.停药后1周将部分实验动物剖杀，各取小块肝组织固定于10％甲醛溶液，作常规HE染色病理检查。
4.用药1月、停药1周分别取部分鸭血检测血清中谷丙转氨酶及谷草转氨酶(ALT及AST)的变化情况。检测转氨酶的试剂购自四川迈克科技有限责任公司，批号为2000301。统计学采用组间比较t检验。
(三)结果
1.用药前、中、后血清DHBV DNA滴度改变情况；
除病毒对照组(淀粉胶囊)外，阳性药物(拉米夫定)对照组用药1-4周分别与同组用药前比较，均有DHBV DNA滴度总体水平降低(P＜0.01)，但停药1周有DHBV DNA回升现象。本发明药物(实例1和实例2)大剂量组用药1-4周血清DHBV DNA滴度比同组用药前血清DHBV DNA滴度的差别在统计学上有极显著意义(P＜0.01)且停药1周后DHBV DNA滴度回升现象不明显。此外，本发明药物(实例1和实例2)中剂量组用药1-4周DHBV DNA滴度亦明显降低(P＜0.01)，但停药1周后DHBV DNA滴度与同组用药前比较无显著性差异(P＜0.05)；本发明药物(实例1和实例2)小剂量组用药1-3周DHBV DNA滴度有明显降低(P＜0.01)，但从用药4周及停药1周血清DHBV DNA滴度开始回升；各剂量组呈现良好的量效关系相同剂量的本发明药物(实例1和实例2)比对照药物肝苏颗粒和乙肝宁在给药各阶段具有较强降低滴度作用，且停药后滴度反弹较小。结果如表1所示。
表1  用药前后血清DHBV DNA滴度改变情况( X±S)
组  别                                             logDHBV DNA(pg/μl)
  用药前   用药1周   用药2周   用药3周   用药4周   停药1周
   淀 粉 组 3.82±0.41 3.64±0.67 3.55±0.69 3.72±0.47 3.82 ±0.41 3.64±0.51
拉米夫定组 3.36±0.92 1.00±1.41** 1.64±1.57** 1.18±1.47** 0.46±0.82** 2.73±1.49
乙肝宁组 3.46±0.72 3.06±0.87 2.56±0.93 2.50±1.03** 2.26±0.78* 2.93±1.75
肝苏颗粒组 3.56±1.03 2.10±0.93** 1.99±1.20** 2.21±0.92** 1.97±1.25* 2.65±1.66
实例1药物   大剂量 3.64±0.51 1.73±1.74** 1.55±1.44** 1.91±1.58** 1.55±1.64** 2.07±1.56*
  中剂量 3.36±1.12 1.73±1.74** 1.91±1.64** 1.82±1.54** 1.95±1.51** 2.24±1.70
小剂量 3.36±0.81 2.18±1.54** 2.18±1.54** 2.36±1.43** 2.73±1.19 2.91±1.22
实例2药物   大剂量 3.56±0.54 1.73±1.65** 1.53±1.40** 1.90±1.52** 1.53±1.61** 2.03±1.58*
  中剂量 3.27±1.15 1.74±1.72** 1.96±1.61** 1.79±1.55** 1.85±1.50** 2.25±1.67
小剂量 3.26±0.85 2.15±1.46** 2.16±1.52** 2.33±1.45** 2.70±1.20 2.84±1.20
注：“*”：P＜0.05，“**”：P＜0.01；上表所列为各组DNA滴度的对数平均数及标准差，
统计学采用配对t检验(为用药组不同时间DNA滴度与同组用药前DNA滴度比较)
2.用药前、中、后血清DHBV DNA阴转率情况：
除淀粉组外，各组均有部份鸭用药后血清DHBV DNA滴度转阴，用药前DHBV DNA滴度较低者似乎更容易转明。肝苏各剂量组DHBV DNA阴转率无统计学差异。结果如表2所示。
表2  用药后血清DHBV DNA阴转率(％)
    组  别   用药1周   用药2周   用药3周   用药4周   停药1周
    淀粉组    0.00     0.00     0.00     0.00     0.00
  拉米夫定组 54.55(6/11)   36.36(4/11)   45.46(5/11)   72.73(8/11)   18.18(2/11)
   乙肝宁组 27.27(3/11)   27.27(3/11)   27.27(3/11)   27.27(3/11)   18.18(2/11)
  肝苏颗粒组 36.36(4/11)   36.36(4/11)   36.36(4/11)   27.27(3/11)   27.27(3/11)
实例1药物 大剂量 45.46(5/11)   36.36(4/11)   27.27(3/11)   27.27(4/11)   27.27(3/11)
中剂量 36.36(4/11)   36.36(4/11)   27.27(3/11)   36.36(3/11)   27.27(3/11)
小剂量 27.27(3/11)   27.27(3/11)   18.18(2/11)   9.09(1/11)   9.09(1/11)
实例2药物 大剂量 45.16(5/11)   38.28(4/11)   26.56(3/11)   26.55(4/11)   26.55(3/11)
中剂量 36.87(4/11)   36.87(4/11)   28.47(3/11)   36.87(3/11)   28.47(3/11)
小剂量 27.03(3/11)   27.03(3/11)   17.85(2/11)   9.23(1/11)   9.23(1/11)
3.各组用药前、中、后血清DHBsAg O.D值改变情况：
除病毒对照组(淀粉胶囊)外，阳性药物(拉米夫定)对照组用药1-4周分别与同组用药前比较，均有DHBsAg O.D值总体水平降低(P＜0.05或P＜0.01)，但停药1周有DHBsAg O.D值回升现象。乙肝宁组各时间点未见明显降低作用(P＞0.05)。本发明药物(实例1和实例2)大剂量组用药3、4周血清DHBsAg O.D值比同组用药前血清DHBsAg O.D值的差别在统计学上有显著意义(P＜0.05)且停药1周后DHBsAg O.D值回升现象不明显。相比等剂量的对照药物肝苏颗粒具有较强的作用。此外，本发明药物(实例1和实例2)中剂量组用药1-4周DHBsAgO.D值亦明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，停药1周后DHBsAg O.D值回升不明显；本发明药物(实例1和实例2)小剂量组用药2.4周DHBsAg O.D值有明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，但停药1周后血清DHBsAg O.D值开始回升。试验结果如表3所示。
表3  用药前后血清DHBsAg O.D值改变情况( X±S)
   组  别      用药前   用药1周   用药2周    用药3周   用药4周    停药1周
   淀粉组   1.04±0.59  1.07±0.42   1.03±0.29   1.06±0.24   1.01±0.28   0.89±0.25
  拉米夫定组   0.77±0.37  0.42±0.35**   0.53±0.38*   0.51±0.41*   0.30±0.25**   0.61±0.48
   乙肝宁组   1.01±0.66  0.78±0.67   0.75±0.53   0.67±0.47   0.69±0.59   0 72±0.58
  肝苏颗粒组   0.80±0.63  0.58±0.50   0.60±0.54   0.61±0.47   0.51±0.45*   0.64±0.48*
  例1药物   大剂量   0.81±0.29  0.58±0.52   0.60±0.57   0.45±0.45*   0.47±0.53*   0.50±0.42*
  中剂量   1.08±0.57  0.54±0.47**   0.59±.060*   0.63±0.62*   0.54±0.60*   0.68±0.50*
  小剂量   0.72±0.40  0.61±0.48   0.54±0.39*   0.60±0.46   0.50±0.36**   0.62±0.54
  例2药物   大剂量   0.82±0.37  0.59±0.52   0.59±0.29   0.45±0.50*   0.46±0.53*   0.48±0.38*
  中剂量   1.04±0.87  0.54±0.67**   0.58±.043*   0.62±0.60*   0.54±0.51*   0.62±0.48*
  小剂量   0.71±0.46  0.59±0.84   0.51±0.42*   0.61±0.20   0.49±0.42**   0.60±0.51
注：*P＜0.05 **P＜0.01上表所列为各组DHBsAg O.D值平均数及标准差，统计学采用配对t检验(为用药组不同时间DHBsAg O.D值与同组用药前DHBsAg O.D值比较)。
4.肝脏HE染色病理检查：
各组均有较轻程度肝细胞浊肿或空泡变性，少数可见汇管区、小叶间隔炎症细胞浸润及肝细胞点状坏死现象，这些病理表现用药组无明显差异。
5.用药4周、停药1周血清转氨酶改变情况：
各实验组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)值结果如表4所示。各组间同一时相内ALT及AST比较统计学上无显著性差异。
表4  用药1月、停药1周血清ALT、AST改变情况(U/L， X±S)
组  别                     ALT                        AST
     用药4周       停药1周       用药4周       停药1周
      淀粉组     36.80±8.98     25.80±6.14     38.20±13.66     32.20±13.37
    拉米夫定组     34.20±5.89     27.60±7.09     33.20±10.04     28.80±9.01
     乙肝宁组     35.12±6.88     26.45±5.87     33.54±9.54     27.44±8.81
    肝苏颗粒组     34.86±7.56     24.57±8.55     34.58±10.54     34.54±7.15
实例1药物 中剂量     35.00±12.96     25.80±4.60     32.80±6.57     34.60±9.02
小剂量     36.80±7.92     28.20±7.36     33.60±10.21     46.60±9.21
实例2药物 中剂量     34.20±11.29     26.79±5.50     34.80±7.23     35.62±7.32
小剂量     36.05±7.56     28.02±8.16     34.1 3±11.25     45.26±7.94
由于以DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究人类乙型肝炎发病机理、病毒复制过程及筛选有效的治疗药物，已为国内外学者所公认。1-3日龄雏鸭感染DHBV可维持长期病毒血症而无明显的自然转阴现象，因此，采用1日龄雏鸭经腹腔感染DHBV的方法来建立鸭乙型肝炎动物模型进行肝苏抗病毒作用的考核，作为治疗肝炎病人提供临床前研究资料。
上述的试验结果表明，本发明药物各剂量组(包括实例1和实例2不同方法制备的药物，以下均同)用药后能使血清中DHBV DNA滴度总体水平显著降低或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，停药1周后、小剂量组血清DHBV DNA有明显回升现象，而大剂量组停药1周病毒DNA无明显“反跳”；用药前后血清DHBsAg的O.D值(490nm)的变化与DNA滴度改变相似。说明该药物在体内有抗病毒作用，且抗病毒效果与药物剂量大小有一定的关系。各实验中，本发明药物比同样以扯根菜提取物为有效药物成分的对照药物肝苏颗粒表现出更强的作用，且病毒DNA反弹较小，均优于乙肝宁组。
由于鸭乙肝动物模型自身的特点，即3日龄内雏鸭由于免疫系统发育不完善，在感染DHBV后，仅出现单纯的病毒携带状态，而肝脏组织病变轻微，肝功能无明显异常。实验结果未发现各实验组ALT、AST及肝脏HE染色病理统计学上的差异，可以说明该药在这三种剂量下连续用药4周对肝组织无明显的毒性损害。
二、对CCl4造成大鼠急性肝损伤的影响
试验药物：本发明的药物同上述试验；对照药物肝苏颗粒(购于成都市中药材公司成药部，批号010509)；乙肝宁冲剂(购于成都市中药材公司成药部，批号010306)；联苯双酯滴丸(上海信谊制药公司出品，批号010205)。
实验动物：健康雄性大鼠(由四川华西医科大学动物实验中心提供，实验在成都中医药大学实验动物中心进行)。
实验试剂：谷丙转胺酶(ALT/SGPT)试剂盒(北京中生公司出品)；四氯化碳(CCl4)(成都化学试剂厂出品)。
实验仪器：BeckMan全自动生化仪6000型。
试验方法及结果：用150克左右的健康雄性大鼠，随机分为组，每组10只。正常对照组给予同体积的蒸馏水，选型对照与药物组于实验第1、5天皮下注射50％CCl4菜油悬液5ml/kg，分别灌服水和被试药连续7天，停药24小时眼眶取血，静置1小时后2500rpm离心，取血清，用赖氏法测血清中谷丙转氨酶。结果如表5所示。
表5  对CCl4致大鼠肝损伤血清ALT的影响( X±SD)
     组  别   用药剂量   动物数(n)      ALT(U/L)
    正常对照     -     10     36.43±7.93**
肝损伤模型对照组     -     10     513.08±20.22
    联苯双酯   0.06g/kg     10     210.46±89.25**
    乙肝宁组   25g/kg     10     338.01±81.05
    肝苏颗粒组   16.67g/kg     10     345.12±15.54*
实例1药物   高剂量   16.67g/kg     10     305.00±28.40**
  中剂量   8.33g/kg     10     341.78±15.89*
  低剂量   4.17g/kg     10     490.52±35.00
实例2药物   高剂量   16.67g/kg     10     310.17±26.56**
  中剂量   8.33g/kg     10     335.64±10.49*
  低剂量   4.17g/kg     10     486.86±37.05
      注：与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
表5结果显示，本发明药物的16.67和8.33g/kg两剂量组对大鼠CCl4肝损伤有降低血清谷丙转氨酶作用。等剂量的本发明药物与对照药物肝苏颗粒间的比较虽无统计学意义，但可以看出本发明药物的作用优于对照药物肝苏颗粒。
三、对CCl4致小鼠慢性肝损伤的影响
试验药物：本发明药物同上；对照药物肝苏颗粒(购于成都市中药材公司成药部，批号010509)；乙肝宁冲剂(购于成都市中药材公司成药部，批号010306)；联苯双酯滴丸(上海信谊制药公司出品，批号010205)。
实验动物：健康小鼠(由四川华西医科大学动物实验中心提供，实验在成都中医药大学实验动物中心进行)。
实验试剂：谷丙转胺酶(ALT/SGPT)试剂盒(北京中生公司出品)；四氯化碳(CCl4)(成都化学试剂厂出品)。
实验仪器：BeckMan全自动生化仪6000型。
试验方法及结果：
将小鼠随机分组。除正常对照组，于实验第1、4天腹腔注射0.1％CCl4 10ml/kg，然后每周注射CCl4剂量同前，同时给药，连续25天。于末次给药后16h眼眶取血，2500rpm离心，分离血清，检测血清谷丙胺酸。结果如表6所示。
由表6结果可见，本发明药物的16.67和8.33g/kg两剂量组对大鼠CCl4肝损伤有降低血清谷丙转氨酶作用。等剂量的本发明药物与对照药物肝苏颗粒间的比较虽无统计学意义，但可以看出本发明药物的作用优于对照药物肝苏颗粒。
表6  对CCl4致小鼠慢性肝损伤的作用( X±SD)
     组  别   用药剂量 动物数(n)      ALT(U/L)
    正常对照     -     10     36.43±7.93***
肝损伤模型对照组     -     10     513.08±20.22
    联苯双酯   0.06g/kg     11     210.46±89.25**
    乙肝宁组   25g/kg     10     338.01±81.05
    肝苏颗粒组   16.67g/kg     10     345.12±15.54*
  实例1药物 高剂量   16.67g/kg     11     305.00±28.40**
中剂量   8.33g/kg     10     341.78±15.89*
低剂量   4.17g/kg     10     490.52±35.00
  实例2药物 高剂量   16.67g/kg     11     303.21±24.38**
中剂量   8.33g/kg     10     341.92±13.26*
低剂量   4.17g/kg     10     490.65±30.00
      注：与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
四、对D-半乳糖胺(D-GalN)致小鼠慢性肝损伤的影响
试验药物：本发明药物同上；对照药物肝苏颗粒(购于成都市中药材公司成药部，批号010509)；乙肝宁冲剂(购于成都市中药材公司成药部，批号010306)；联苯双酯滴丸(上海信谊制药公司出品，批号010205)。
实验动物：健康雄性大鼠(由四川华西医科大学动物实验中心提供，实验在成都中医药大学实验动物中心进行)。
实验试剂：谷丙转胺酶(ALT/SGPT)试剂盒(北京中生公司出品)；四氯化碳(CCl4)(成都化学试剂厂出品)。
实验仪器：BeckMan全自动生化仪6000型。
试验方法及结果：
将小鼠随机均匀组，每组10只。除正常对照组，于实验第1、6天腹腔注射D-GalN650mg/kg，同时给药，连续7天。于末饮给药后16h眼眶取血，2500rpm离心，分离血清，检测血清谷丙胺酸。结果如表7所示。
表7  对D-GalN致小鼠慢性肝损伤的作用( X±SD)
    组  别     用药剂量      ALT(U/L)
    正常对照       -     36.43±7.93***
  肝损伤模型对照组       -     513.08±20.22
    联苯双酯     0.06g/kg     210.46±89.25**
    乙肝宁组     25g/kg     338.01±81.05
   肝苏颗粒组     16.67g/kg     345.12±15.54*
  实例1药物     高剂量     16.67g/kg     305.00±28.40**
    中剂量     8.33g/kg     341.78±15.89*
    低剂量     4.17g/kg     490.52±35.00
  实例2药物     高剂量     16.67g/kg     305.06±25.23**
    中剂量     8.33g/kg     338.26±11.56*
    低剂量     4.17g/kg     492.02±35.16
      注：与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
表7结果显示，本发明药物的16.67和8.33g/kg两剂量组对大鼠CCl4肝损伤有降低血清谷丙转氨酶作用。等剂量的本发明药物与对照药物肝苏颗粒间的比较虽无统计学意义，但可以看出本发明药物的作用优于对照药物肝苏颗粒。
五、对动物保肝解毒作用的观察和对四氯化碳中毒小鼠BSP清除的影响
试验药物：本发明药物同上；对照药物肝苏颗粒(购于成都市中药材公司成药部，批号010509)；乙肝宁冲剂(购于成都市中药材公司成药部，批号010306)；联苯双酯滴丸(上海信谊制药公司出品，批号010205)。
实验动物：健康小鼠(由四川华西医科大学动物实验中心提供，实验在成都中医药大学实验动物中心进行)。
实验试剂：磺溴酞钠(上海化学试剂厂出品)；四氯化碳(CCl4)(成都化学试剂厂出品)。
实验仪器：BeckMan全自动生化仪6000型。
试验方法及结果：
将小鼠随机分组。1组：正常对照均不给CCl4和实验药物，每日灌服同等体积的蒸馏水；2组：CCl4肝损伤组于实验开始第6天和第9天灌服0.2％CCl4菜油混悬液10ml/kg；3、4组：于实验开始每日分别灌服被试药物，连续9天。用CCl4肝损伤组同样剂量、时间，染毒。于实验第10天即末次染毒后24小时眼眶取血，取血前20分钟从尾静脉注射磺溴酞钠(BSP)100mg/kg，所取血液作BSP测定。结果如表8所示。
          表8  对CCl4中毒小鼠BSP清除影响( X±SD)
组别     用药剂量     动物数(只)     血清BSP浓度(mg/100g)
    正常对照      -     14     1.32±0.16**
  肝损伤模型对照组      -     10     3.26±1.16
    联苯双酯   0.06g/kg     11     2.98±1.23
    乙肝宁组   25g/kg     10     1.33±0.23**
对照药物肝苏颗粒组   16.67g/kg     10     0.98±0.25**
  实例1药物   高剂量   16.67g/kg     11     0.47±0.21**∧∧
  中剂量   8.33g/kg     10     0.79±0.20**
  低剂量   4.17g/kg     10     0.99±0.70**
  实例2药物   高剂量   16.67g/kg     11     0.47±0.23**∧∧
  中剂量   8.33g/kg     10     0.77±0.59**
  低剂量   4.17g/kg     10     0.97±0.68**
注：与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；
与对照药物肝苏颗粒组比较，∧∧P＜0.01
由表8可见，本发明药物的各剂量组均能降低CCl4中毒小鼠血清BSP20分钟滞留量，提示本发明药物对CCl4肝损伤有一定的保护作用。其中等剂量的本发明药物作用显著强于对照药物肝苏颗粒浸膏组(P＜0.01)。
六、对大白鼠的利胆作用
试验药物：本发明药物同上；对照药物肝苏颗粒(购于成都市中药材公司成药部，批号010509)；乙肝宁冲剂(购于成都市中药材公司成药部，批号010306)；去氧胆酸钠(四川制药厂出品，批号010613)。
实验动物：健康雄性大鼠(由四川华西医科大学动物实验中心提供，实验在成都中医药大学实验动物中心进行)。
实验试剂：苯巴比妥(中国医药进出口公司进口分装)。
实验仪器：BeckMan全自动生化仪6000型。
试验方法及结果：
选体重300g以上的健康雄性大鼠随机分组，实验前禁食一夜。对照组给蒸馏水；药物组给试验药物，均十二指肠给药；阴性对照组静脉注射去氧胆酸钠。实验前均腹腔注射30mg/kg苯巴比妥进行麻醉，剖开腹腔找出总胆管，在十二指肠端结扎，结扎的上方剪一切口，插入导管收集胆液，每半小时记录一次胆液的分泌量，给药前收集一次，给药后收集三次。自身对照经统计学处理。结果如表9所示。
表9  对大白鼠胆液分泌的影响
组  别   动物数(只)   给药剂量   给药前                             给药后
 胆汁分泌量     30′     60′     90′
    对照组   11   25g/kg   0.41±0.03   0.38±0.03     0.39±0.03  0.4±0.04
  去氧胆酸钠   7   5mg/kg   0.38±0.06   0.43±0.05     0.45±0.05  0.51±0.05
乙肝宁组 10 25g/kg 0.33±0.23 0.40±0.03* 0.48±0.03** 0.53±0.04**
肝苏颗粒组 10 16.67g/kg   0.38±0.25** 0.40±0.04 0.47±0.05 0.51±0.03
实例1药物   高剂量   11   16.67g/kg   0.37±0.21   0.48±0.06**     0.6±0.08*  0.62±0.08
  中剂量   10   8.33g/kg   0.39±0.20   0.45±0.05**     0.53±0.03*  0.57±0.03
  低剂量   10   4.17g/kg   0.39±0.70   0.41±0.03**     0.46±0.03*  0.47±0.06
实例2药物   高剂量   11   16.67g/kg   0.37±0.25   0.49±0.12**     0.62±0.08*  0.65±0.08
  中剂量   10   8.33g/kg   0.39±0.30   0.46±0.02**     0.55±0.03*  0.56±0.07
  低剂量   10   4.17g/kg   0.38±0.25  0.40±0.08**     0.45±0.04*  0.46±0.09
      注：与给药前比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
由表9结果可见，本发明药物的4.17g/kg组在十二指肠给药后30分钟均能非常明显增加胆汁的分泌量(P＜0.01)，乙肝宁阳性对照组给药后半小时作用不明显，而60分钟，90分钟均有明显的胆汁分泌增加，本发明药物(实例1和实例2)的作用强度大于阳性对照组。
七、与对照药物肝苏颗粒生物利用度的比较研究
以没食子酸为检测指标，实验比较和研究本发明药物(包括如上述本发明的实例1和实例2两种方法得到药物)和对照药物肝苏颗粒两种口服制剂的生物利用度。
药品与试剂：本发明药物同上；对照药物肝苏颗粒(购自成都市中药材公司，批号010514)；没食子酸酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号0831-9901，供含量测定用)；乙腈，磷酸均为分析纯。
试验动物：SD大鼠，体重250280g，雌雄各半(四川省实验动物养殖中心提供)。
试验方法：试验动物隔夜禁食不禁水，次日灌胃给药，剂量为16.67g(生药)/Kg体重。分别于给药前及给药后15、30、60、90、120、180、240、360、480和600分钟时由股动脉取血，每个血样点6只大鼠。
色谱条件：HP 1100高效液相色谱系统(HPLC)，固定相：Inertsil ODS-3(5um)色谱柱(4.6×250mm)，流动相：乙腈∶0.05％磷酸(4∶97)；流速：1ml/min；检测波长：275nm。
血浆样品预处理：取0.5ml大鼠血浆，置一干净的5ml玻璃具塞锥形离心试管中，加入2ml无水乙醇，涡旋混匀30s，置低速离心机中离心5min，3500rpm/min，吸取上清液，60℃水浴下氮气吹干，再用300ul甲醇复溶，置台式高速离心机中离心5min，吸取上清夜，20ul进样。
标准曲线制作：精密吸取0.5ml空白大鼠血浆于5个玻璃离心试管中，分别加入浓度为0.1，0.5，1.0，2.0，4.0mg/ml的没食子酸标准品溶液10ul，按照样品预处理方法处理测定，以峰面积积分值Y为纵坐标，浓度X为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程得：Y＝-10.6729+22.2187X，r＝0.9999。
药物动力学参数求算采用3P97药动学软件计算。
试验结果：大鼠灌服本发明药物(分别为实例1和实例2药物)和对照药物肝苏颗粒后，血浆中没食子酸的含量如表10所示。
本发明药物和对照药物肝苏颗粒两种药物的生物利用度参数如表11所示。实例1的本发明药物与对照药物肝苏颗粒的没食子酸血药浓度-时间曲线如图1所示；实例2的本发明药物与对照药物肝苏颗粒的没食子酸血药浓度-时间曲线如图2所示。
            表10  大鼠血浆没食子酸浓度变化
时间(min)              血浆没食子酸浓度(ug·ml-1)
  实例1药物   实例2药物   对照药物肝苏颗粒
    15     16.2±4.6     16.8±5.2     5.0±1.8
    30     35.5±10.5     34.2±8.2     8.6±3.2
    60     22.3±4.3     20.9±4.2     17.3±6.2
    90     15.8±4.7     15.1±4.0     11.3±0.69
    120     12.8±2.9     12.5±3.1     7.8±3.7
    180     10.7±2.7     10.6±2.6     4.6±2.5
    240     8.4±2.6     7.9±6.2     2.6±0.92
    360     4.6±1.9     4.8±1.0     1.8±0.76
    480     2.1±1.5     2.2±1.1     0.85±0.54
    600     1.7±0.6     1.2±0.8     0.52±0.21
表11  不同药物没食子酸的生物利用度参数
    药  物                               生物利用度参数
AUC0-24h/(ug·h·L-1) Cmax/(ug·ml-1) Tmax/min
    实例1药物     82.9      23.3     35.6
    实例2药物     77.2      20.8     33.2
对照药物肝苏颗粒     41.2      10.5     66.3
表10和表11的结果显示，本发明药物中的没食子酸的生物利用度均明显大于对照药物肝苏颗粒；灌服本发明药物后，没食子酸体内达到的最高浓度(Cmax)明显高于对照药物肝苏颗粒，而达到最高浓度所需时间(Tmax)也明显小于对照药物肝苏颗粒；图1和图2也清楚显示，对本发明药物的吸收程度也明显增加，表现为图中的本发明药物24小时内的血药浓度-时间曲线下的面积(AUC)可远远大于对照药物肝苏颗粒。
上述的各项试验结果都已充分显示，本发明药物与目前使用的肝苏颗粒中的有效药物成分虽然同为扯根菜的提取物，但无论是采用大孔吸附树脂技术(实例1)，还是采用乙醇直接提取方式(实例2)，均可以使所得到的扯根菜的有效药物成分含量得到富集，并可以使药物与体液的有效接触面积增加。因而，通过其有效药物成分所共同具有的保肝、降酶、退黄、健脾的功能作用，在临床上用于治疗慢性活动性肝炎、乙型肝炎、急性病毒性肝炎方面，本发明药物可比肝苏颗粒具有显著的优越性和更好的应用价值。

Claims (10)

1.用于治疗肝炎的口服药物，其特征是由虎耳草科植物扯根菜的乙醇纯化提取物作为有效药物成分，与常规口服药物可以接受的辅助添加成分共同组成。
2.如权利要求1所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是所说的作为有效药物成分的扯根菜乙醇纯化提取物，为先以常规方式得到扯根菜的水煎提取物溶液，再使水煎提取物溶液通过大孔树脂进行吸附进行纯化处理，用水冲洗吸附树脂后再用乙醇进行解吸附洗脱，收集乙醇洗脱液并除去乙醇后得到的纯化提取物成分。
3.如权利要求2所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是所说的用于吸附纯化处理的大孔树脂的孔径为10-500纳米。
4.如权利要求1所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是所说的作为有效药物成分的扯根菜乙醇纯化提取物，为用乙醇直接对扯根菜进行回流提取后，收集并除去回流液的乙醇后所得到的提取物成分。
5.如权利要求4所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是将所说的除去乙醇后所得到的提取物成分用水稀释，第二次加入乙醇至乙醇的体积含量为～90％进行再纯化，将不含沉淀物的乙醇清液除去乙醇后，得到再纯化的有效药物成分。
6.如权利要求5所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是将所说的除去乙醇后的直接提取物成分用水稀释至相对密度为1.02-1.05后，作第二次乙醇的再纯化处理。
7.如权利要求2或4所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是提取用的乙醇为体积含量为～70％的乙醇。
8.如权利要求2至6之一所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是将所说的乙醇纯化提取物有效药物成分与常规口服药物可以接受的辅助添加成分共同混合制成为固体剂型口服药物。
9.如权利要求8所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是用水将乙醇纯化提取物有效药物成分稀释至相对密度为1.10-1.12后，经喷雾干燥或真空干燥并制成粒径为～0.1毫米的颗粒后，与常规口服药物可以接受的辅助添加成分共同制成为固体剂型口服药物。
10.如权利要求8所述的用于治疗肝炎的口服药物，其特征是将所说的固体剂型口服药物为胶囊制剂。
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