CS200503B2 - Method of preparation of the antigall substances - Google Patents

Description

Tento vynález se týká výhodného způsobu přípravy protinádorové látky extrakcí hub třídy Basidiomycetes, patřících do rodu Coriolus, vodným rozpouštědlem za určitých specifikovaných podmínek.

Je dobře známo, že se protinádorové látky složené z polysacharidů mohou připravit ráfinací extraktu získaného extrakcí hub Basidiomycetes vodným rozpouštědlem za normálního tlaku. Závažným nedostatkem tohoto známého způsobu je skutečnost, že extrakční způsob je nepřípustně špatný se zřetelem na extrakční účinnost aktivní složky. Tato nízká extrakční účinnost se zřetelem na aktivní složku vede k závažné ztrátě aktivní složky, jelikož aktivní složka zůstává ve velkém množství v extrakčním zbytku. To je velmi nežádoucí nejen se zřetelem na produktivitu protinádorové látky, ale i z průmyslového hlediska, jelikož taková ztráta vede ke znehodnocování hodnotných materiálů a vzniká také problém zpracování odpadních látek.

Při studiu eliminace právě uvedených nedostatků při přípravě protinádorových látek extrakcí hub třídy Basidiomycetes vodným rozpouštědlem se zjistilo, že se látka na bázi polysacharidů obsahující dusík s vynikající protinádorovou účinností může získat ve vysokém výtěžku, jestliže se hou2 ba Basidiomycetes, příslušící do rodu Coriolus, extrahuje vodným rozpouštědlem pod tlakem a při teplotě 120 až 200 °C.

Výrazem „Basidiomycete houba (nebo krátce Basidiomycetes), patřící do rodu Coriolus” se zde míní houba třídy Basidiomycetes patřící do rodu Coriolus rodiny Polyporaceae klasifikace rostlin в takové Bašidiomycetes jsou známy a zahrnují například:

Coriolus versicolor (Fr.) Quěl,

Coriolus Hirsutus (Fr.) Quěl,

Coriolus consors (Besh.) imaz,

Coriolus conchifer (Schw.) Pat,

Coriolus pubescens (Fr.) Quěl,

Coriolus Pargamenus (Fr.) Pat a

Coriolus biformis (Klotz.) Pat (viz Coloured illustrations of fungi of Japan — Barevné ilustrace hub Japonska — Rokuya Imazeki a Tsuguo Hongo, svazky I, 1974 а II, 1975).

Používaným výrazem „Basidiomycetes patřící do rodu Coriolus” se míní jak mycelium, tak plodnice hub této třídy.

Vynález se tedy týká způsobu přípravy látek s vynikající protinádorovou aktivitou ve vysokém výtěžku extrací mycelia a/nebo plodnic Basidiomycetes patřících do rodu Coriolus.

Předmětem vynálezu je . způsob přípravy protinádorové látky na bázi polysacharidu obsahujícího dusík · extrakcí hub třídy Basidiomycetes · vodným rozpouštědlem a ·. rafinací získaného extraktu, který je vyznačen tím, · že se houba patřící· do rodu Coriolus rodiny Polyporaceae extrahuje vodným rozpouštědlem za tlaku 0,18 až 2,0 MPa při teplotě 120 až 200 °C.

Obecně se soudí' že za podmínek extrakce Basidiomycetes .za vysokých teplot, například za teploty 120 až 200. °C, se aktivní složka houby rozkládá, takže jakkoliv je možno zvýšit . celkovou extrakci, je sotva možné zlepšit výtěžek se zřetelem na žádanou protinádorovou látku.

Při způsobu podlé vynálezu se však proti očekávání zjistilo, že se žádaná protinádorová látka může získat ve vysokém výtěžku, zcela na rozdíl od očekávání, jestliže se extrakce za právě uvedených teplot provádí pod tlakem.

Při provádění extrace pod tlakem způsobem podle vynálezu se výchozí · materiál, mycelium a/nebo plodnlce Basidiomycetes, patřící do rodu Coriolus, vnesou do tlakové nádoby, jako je například autokláv vsázkového. typu, nebo trubkový extraktor průtokového typu, spolu s vodným rozpouštědlem a materiál se · extrahuje při teplotě · 120 až . 200 °C. Tlak při extrakci odpovídá celkovému tlaku par vodného rozpouštědla v nádobě. Zpravidla není tlak vyšší než 2,0 MPa, s výhodou je menší než 1,6 MPa, avšak nemá být nižší než 0,18 MPa. Doba extrakce se má vhodně upravit v závislosti na použité teplotě, je však zpravidla s výhodou 5 až 360 · minut. · Vhodná extrakční doba .se tedy..· ,volí; v. · .uvedeném . časovém rozmezí v závislosti tíá použité teplotě v .rozmezí .120 až 200 °C. ·. Když. · je · teplota: .při extrakci nižší . než ,120 °C, · nedosáhne se dostatečné eixtrak^čr^i..:.účÍnnosti,· zatímco při. · teplotě · nad 200 oC.jmůže jdojít ·k .rozkladu · aktivní · složky, Cí^i^šej-s^cg proces; stane.. nevhodným. Připomíná · ·se·že ··.e^j^tir^lkční · doba · kratší než 5 minut · vede k nedostatečně účinné extrakci, zatímco extrakční doba delší než 360 minut může ' způsobit. rozklad účinné látky. ... . · .: .

Při provádění · způsobu · .podle, .vynálezu · se extrakce· může provádět opakovaně · za · podmínek již uvedených nebo · .se. : výchozí materiál (Basidiómycetes) může · namáčet do vodného rozpouštědla o teplotě nižší než .100 · °C · před vlastní e^ť^ral^tor^í. operací nebo se na druhé straně může· získaný extrakt promýt vodným rozpouštědlem · po. extrakci, přičemž vodné · rozpouštědlo · má. teplotu nižší než 100 °C. , .

Vodným rozpouštědlem použitým při způsobu podle· vynálezu může být vodné rozpouštědlo typu · běžně používaného při známých způsobech, jako je například čistá voda, vodný kyselý nebo alkalický · roztok, vadný roztok, močoviny. · · a . aminokyseliny. Takového vodného rozpouštědla se · .běžně používá v poměru několikanásobném až· stonásobném, · s výhodou hmotnostně desetinásobném až padesátinásobném se zřetelem na výchozí materiál. Nejvýhodnějším vodným rozpouštědlem při způsobu podle vynálezu je voda · nebo zředěný roztok alkálií méně· než · 1 normální.

Takto získaný extrakt se pak čistí ultrafiltrací, vysolením, dialýzou, reversní osmózou nebo jinými způsoby, které se .''mohou použít jednotlivě nebo · v kombinaci k odstranění nízkomolekulárních podílů z extraktu (podílů s molekulární váhou pod 5000). Touto rafinací se získá polyšacharid obsahující dusík s vynikající protinádorovou aktivitou.

Látky na bázi polysacharidů obsahujících dusík, připravené způsobem podle vynálezu, vykazují vynikající protinádorovou účinnost s obzvláště vysokým inhibičním působením proti „Sarcoma—180 solid bance?” nejen při iontraperitoneálním podání, avšak také při perorálním podání myším. To znamená, že polysacharidy s obsahem dusíku připravené způsobem podle tohoto vynálezu mohou být vynikajícím protirakovinovým lékem, což bylo potvrzeno četnými pokusy. Použití látky připravené podle Vynálezu není omezeno na · perorální podání pro dosažení protinádorového působení; tyto látky stimulují také imunitní odezvu. Obzvláště bylo zjištěno, že jsou tyto · látky účinné nejen pro · prevenci · vedlejších jevů při chemické terapii pacientů s · nádorem a vykazují vzrůstající účinek radioterapie, ale kontrolují také pokles imunity nebo fyzické napětí pacienta · způsobené operací nebo transfúzí.krve, nebo propůjčují odolnost proti virové, · nebo bakteriální infekci, · jestliže imunita ·· nebo, fyzické napětí · pacienta, · je špatné. ZjistiLo' se také,, že perorální · podání látky připravené způsobem podle vynálezu . zlepšuje vynikajícím způsobem. hepatlckou funkci, povzbuzuje.· chuť k jídlu,· odstraňuje .zažívací poruchy a · podpor'u.je.:.urinaci.· Látky jsou také účinné · při léčení. · lepry........ 2 -. .· ·....

jak ..již · bylo uvedeno, způsobem podle vynálezu je..možno získat ve vysokém výtěžku polysacharidy s obsahem dusíku, které: · mají. vynikající protinádorové působení nejen · ·.při. intraperitoneálním podání, ale také' při.' perorálním podání, kromě· dalšího shora ...uvedeného · příznivého působení, ·· a · to poměrně jednoduchým způsobem. Způsob podle vynálezu představuje.tedy velký · technický přínos průmyslové výrobě protinádorových látek z Basidiomycetes. . .

V následujcích příkladech je způsob podle vynálezu podrobně popsán.

P.říklad 1

Mycelium Coriolus · versicolor (Fr.) Quél, připravené umělou kultivací, · se vysuší na obsah vody. 10 % · a rozdělí · se na pět dílů a · -pak · se · · každý · · tento; . díL .smíchá · s · hmot б

nostně 12,5-násobkem vody a zavede se do autoklávu, kde - se extrahuje za extrakčních podmínek uvedených v tabulce 2. Extrakt z každého podílu se pak filtruje k frakcionaci samotného extrakčního- roztoku a získaný extrakční - roztok se podrobí po dobu 72 hodin běžné dialýze vodou při teplotě 5 °C za použití dialysní trubice - Visking Tube společnosti Union Carbide Corp., běžným způsobem. Tímto dialytickým zpracováním se z extraktu odstraní nízkomolekulární látky, to jest látky s molekulární hmotnostní nižší než 5000. Roztok dialyzátu se pak koncentruje na játrově - hnědý prášek s obsahem vody 7 °/o. Tento práškový materiál má střední molekulární hmotnost větší než 10 000 a výsledky elementární analýzy a různých zkoušek barevných reakcí jsou v tabulce 1 a potvrzují, že materiálem je polysacharid obsahující dusík.

T ab u 1 k a 1

Zkoušky barevných reakcí

Barevná reakce	Barva	Poznámka
reakce w-naftol-kyselina sírová [MúliSiiúva reakce ] reakce indol-kyselina sírová (misková reakce) reakce antron-kyselina sírová reakce fenol-kyselina sírová reakce trypto-fan-kyselina sírová Lowry-Folinův proces ninhydrinová reakce po hydrolýze kyselinou chlorovodíkovou	purpurová hnědá zeleno-modrá hnědá purpurově hnědá modrá purpurově modrá	sacharid zjištěn sacharid, zjištěn sacharid zjištěn sacharid zjištěn sacharid zjištěn potvrzena peptid-ová vazba potvrzena «-aminokyselina

Z výsledků zkoušek vyplývá, že látkami připravenými způsobem podle vynálezu jsou polysacharidy obsahující primárně peptidově vázaný dusík.

Pro stanovení protinádorového působení polysacharidů o-bsahujících dusík, připravených způsobem podle vynálezu, provedena tato zkouška. .

Buňky nádoru Sarcoma—180 transplantovány do břišní dutiny myší a za sedm dní (po dostatečném rozmnožení buněk) 10⁶ buněk transplantováno do subkutanních oblastí axillae jiné skupiny myší k vývoji nádorů. 24 hodiny po transplantaci započato s intraperitoneálním podáváním látky připravené způsobem podle vynálezu. Látka podána deseekrát jednou denně avšak kaž dý den v dávce 10 mg/kg na jedno podání pro celkové množství 0,2 ml/20 g (hmotnost myšího těla). 25. den po transplantaci nádor z každé myši vyňat - a zvážen. Inhibiční protinádorová účinnost látky připravené způsobem podle vynálezu vypočtena ze střední hmotnosti nádorů skupiny myší, kterým byla látka připravená způsobem podle vynálezu podána, a ze střední hmotnosti nádorů kontrolních myší.

Výsledky měření jsou v souhrnné formě v tabulce 2. Zvláštnosti - přípravy vzorků použitých při zkoušce, to znamená množství vodného- rozpouštědla (vody), teplota a doba extrakce, stupeň extrakce, selektivita a výtěžek, jsou v tabulce 2 rovněž uvedeny.

Tabulka2

Vzorek Množství vody Teplota Čas Tlak Extrakční Selektivita Výtěžek Inhibice Obsah dusíku (hmot, poměr (°C) (min) (MPa) výtěžek (%) (’%) z houby (%) Sarcoma—180 (%) к houbě) (%)

T-i 07 CM СО СО r4 cd o o* cf o o

CD CD СО (Э CD co

CD T-Γ co KtT cd

CO CD CD CD 0O —^J ** C2 O oo l> (N o o cd гЧ CM tO гЧ

CM^IO CD CD^CD cm cm co σΓ o t< ЮЮ CDID s to in oo CO CO ’Ф Т-Г см oo o г-T CO tO CD CD 00 CM

CO CM CM CM to CD O a o o o t-ч o o o o o o CD CD CD CO CM CD co co

CD O O to O 00 см Ю CD CD 00 CD r-4_ г—I гЧ гЧ тЧ гЧ CM

Poznámky k tabulce 2

1) Srovnávacím příkladem je vzorek připravený za použití téže Basidiomycete' jako u vzorků 1 až 5 připravených způsobem podle vynálezu, etrakce se však provádí za normálního tlaku jako u způsobu podle stavu techniky.

2) „Extrakční výtěžek” je rozpuštěný podíl houby použité jakožto výchozí materiál, vyjádřený hmotnostně v procentech.

3j Selektivita je procentní výtěžek polysacharidů obsahujících dusík s molekulární hmotností větší než 10 000, získaných z extraktu.

4] „Výtěžek z houby je procentní výtěžek se zřetelem na veškerou zavedenou houbu polysacharidů obsahujících dusík s molekulární hmotností větší než 10 000.

Z výsledků uvedených v tabulce 2 vyplývá, že při zkouškách na myších, kterým byly subkutánně transplantovány buňky nádoru Sarcoma—180, každý z polyšacharidů obsahujících dusík, připravený způsobem podle vynálezu, měl stejné nebo vyšší protinádorové působení ve srovnání s podobnými přípravky získanými za běžných extrakčních podmínek · a zvláště se připomíná, že výtěžek se zřetelem na množství použité houby je značně zlepšen.

P ř í k 1 a d 2

Mycellum téže . Basidiomycete, jakého se použilo při způsobu podle příkladu 1, se rozdělí na osm podílů a každý podíl se vnese do autoklávu s 12,5násobkem, se zřetelem na váhu mycelia, alkalického nebo neutrálního vodného roztoku uvedeného v tabulce .3 a extrahuje se pod tlakem za teploty uvedené v tabulce 3. Po extrakci se materiál v autoklávu neutralizuje a ' filtruje se k frakcionaci extrakčního roztoku oddělením nerozpustných podílů jakožto extrakčního zbytku. Extrakční roztok se podrobí dialytickému zpracování popsanému v příkladu 1 k získání látky se střední molekulární hmotnostní větší než 10 000.' Při zkoušeni těchto látek různými barevnými zkouškami uvedenými v tabulce 1 potvrzeno, že jde o polysacharidy obsahující dusík.

Pro stanovení protinádorové účinnosti takto připravených polyšacharidů obsahujících dusík se vzorky 1 až 8 těchto látek podávají myším, kterým byl subkutánně transplantován nádor Sarcoma—180. Výsledky ukazují, že připravené látky mají stejné nebo, vyšší protinádorové působení než polysacharidy obsahující dusík připravené způsobem podle stavu techniky extrakcí horkou vodou za normálního tlaku.

см см ш см ю о о см т-ч С£ г£ С££ г£ С\Г С£ О£ М^ м^ м^ со см т—Г с<Г ΙΌ со Mí

смосмсмоогчм^о -ОТ ОТ 07 ОТ О? ОТ ОТ О) ОТ

>N ·>,

5

0£ О_Л О~ СО М^ г£ OJ О7_Л 1Л г-i L> χρ 07 Cxj СО τ—ί О 0Э CMCMCMCMMíCOCMM¹

Л й >

-м

ф

О' О' 00^ ОТ' Č0 О' О г-£ гН со со согч о о oid СО 1ПСОМ11П1П1ЛСП1ПСО со cd

Г—4 ítí ^Г4Э ctí н

о Mí М^ СО СО ОТ' г£ СО о Mí О bx Mí см со ю см ^t>lf)lDcONCOĎ3N

Л Cd Ctí рц hS

СО СО СМ О см ю с£ 0^ 0^ 0^ гП' 0^ ОО' Ю' О о: О гЧ т-< гЧ гЧ гЧ

о о о о о О О О оо СМООСОООООООО гЧгЧг±гЧСМгЧгЧСМ

ооооооооо

СОСОСОСМСМСОСОгЧСО >ф Ч-» >СЛ § Л

гЧ СМ

СО Mí Ю СО Ьч

200303

Poznámky k tabulce 3

1) Srovnávacím' příkladem je vzorek připravený za použití téže Basidiomycete jako u vzorků 1 až 8 připravených způsobem podle vynálezu, extrakce se však provádí hor-

Claims (4)

1. Způsob přípravy protinádorových látek na ' bázi polysacharidu obsahujícího* dusík extrakcí hub třídy Basidiomycetes vodným rozpouštědlem a rafinací získaného extraktu, vyznačený tím, že se houba patřící do rodu Coriolus čeledi Polypo-raceae extrahuje vodným rozpouštědlem za tlaku 0,18 až 2,0 MPa při teplotě 120 až 200 °C.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že houba je vybrána ze skupiny zahrnující houby Coriolus biformis, Coriolus conchifer, kou vodou a za · normálního, tlaku podle stavu techniky.

2. Význam ostatních pojmů je tentýž jako v tabulce 2.

ynAlezu

Coriolus consora, Coriolus Hirsutus, Coriolus pargamenus, Coriolus pubescens a Coriolus Versicolor.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se· · etrakce provádí po dobu 5 až 360 minut.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že vodnvm rozpouštědlem ie voda nebo zředěný roztok alkálie o koncentraci nižší než 1 normální.