JPS6018680B2 - 新規なる糖蛋白質ｐｒｆ，その製造法および該糖蛋白質を有効成分として含有する制癌剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明（以下、本発明という）は制嬢性を示し、少量
の糖を含有する新規な糖蛋白質ＰＲＦに関するものであ
る。 さらに詳細には、本発明は担子菌類であるえのきたけ属
に属する菌種が生産する糟蛋白質ＰＲＦと、その製造法
並びに癌治療への使用を目的とした該糠蛋白質ＰＲＦを
有効成分として含有する制癌剤に関する。 本発明者らは、エノキタケの生産する制競性物質を鋭意
研究した結果、えのきたけ属に属する担子菌類の培養菌
糸体から得られた抽出物が実験動物移植癌に対して経口
投与法によって著しい制漣効果を示すことを確認し、そ
の有効物質は１０％以下の糖を含有することを特徴とす
る糠蛋白質であるこをを見出し、本発明を完成した。 本発明の制損性糖蛋白質ＰＲＦ（以下本物質という）は
以下に記述する理化学的諸性質を有する。 ｛１｝ 元素分析： Ｃ：４４〜４８％、Ｈ：５．５〜７．５％Ｎ：１３〜１
５％、Ｓ：０．５〜２％ 灰分：１〜７％

【２｝ 分子量： ゲル猿過法（バイオゲルＰ−１０並びにセフアデツクス
Ｇ一５０）により６０００〜３００００を示し、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により８０００〜
２００００を与える。 【３’融点： ２５０ｑＣ附近から褐変し、２８ぴ○附近で分解する。 ｛４’比碇光度：〔Ｑ〕８０＝一４０ｏ 〜一８００（
Ｃ＝０．１、０．１ＮＮａＯＨ）‘５ー 紫外部吸収ス
ペクトル： 第１図に示す通り。 ■ 赤外部吸収スペクトル： 第２図に示す通り。 ‘７ー 溶解度： ｐＨ５以上の水には可溶であるが、ｐＨ５以下の水には
やや溶けにくい。 酷酸、ギ酸、アンモニア水には可溶である。アルコール
、アセトン、ピリジン、酷酸エチル、クロロホルムなど
には不熔である。■ 呈色反応： ラィドン．スミス試薬、ビュレツト反応、フオリンーチ
オカルト反応並びに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応
による蛋白質並びにアミノ酸の呈色反応はいずれも陽性
である。 フェノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応並びにモーリ
ッシュ反応による糖の呈色反応はいずれも陰性である。
■ 等電点： 本願蛋白質について、等露点沈澱法により溶解度とｐＨ
の関係を調べた結果は第３図の通りであり、等電点はｐ
Ｈ３．８±０．２である。 従って酸性蛋白質である。‘１瓜・蛋白質部分 ・ 蛋白質部分は本願糖蛋白質ＰＲＨこおいて９０％（
牛血清ァルブミソ換算値：フオリン・ローリー法による
）以上を占め、それを構成するアミノ酸の種類とそのモ
ル比は次の通りである。 アスパラギン酸 ９〜１２スレオニン
４〜６セリン
６〜８ グルタミン １３〜１６プ
ロリン ７〜９グリシン
５〜７ アラニン ９〜１１バリン
３〜５メチオニン
１〜３ イソロイシン １〜３ ロイシン ３〜６ チロシン １〜２ フユニルアラニン １〜３リジン
４〜６ ヒスチジン １〜２ アルギニン １〜３本願糖蛋白
質ＰＲＦはグルタミン酸、アスパラギン酸の酸性アミノ
酸を多く含有し、リジン、アルギニン、ヒスチジンの塩
基性アミノ酸は少量しか含有していないことからも蛋白
質部分は酸性蛋白質である。 １１ 糖部分： 糠部分は本願糖蛋白質ＰＲＦにおいて１０％（グルコー
ス換算値；フェノール硫酸法による）以下である。 またメタノリシスを行い、次いでトリメチルシリル化物
としてガスクロマトグラフィ一法により糖の分析を行う
と、構成糖とその比は次の通りである。グルコース：マ
ンノース：ガラクトース ＝１：１：１ 乃至 ３：２：１ １２ 均一性： ７．５％ポリアクリルアミドゲル、ＰＨ８の電気泳動分
析法により、マーカーであるブロモフヱノールフル一に
近接した位置に単一バンドを与える。 また０．１％ＳＯＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル上
、ｐＨ７．５の霞気泳敷分析法により、分子量８０００
〜２００００に相当する位置に単一バンドを与える。１
３ ＰＨ： その１％水溶液は微酸性である。 １４ 物質の色： 淡黄茶色乃至淡褐色を呈する。 以上説明した通り、糖蛋白質ＰＲＦは１０％以下の糖を
含有することを特徴とする新規な酸性糖蛋白質であるこ
とが明らかである。 一般に糖蛋白質はその構造が明らかにされたものは殆ん
どないといわれるが、本物質も複雑な高分子であるので
構造を明瞭に示すことは難しい。しかし、本物質の同定
はさきに規定した理化学的諸性質を確認すれば容易であ
る。本発明の制癌性物質である糟蛋白質ＰＲＦを製造す
るには、えのきたけ属に属する損子菌類である糖蛋白質
ＰＲＦ生産菌を栄養源培地で培養して得られる培養菌糸
体を熱水および／または熱希薄アルカリ水で抽出し、こ
の抽出液をそのままかまたは中和処理したあと‘１’
塩基性イオン交換樹脂と接触せしめて吸着処理し、溶鱗
剤により塔から糖蛋白質ＰＲＦを溶酸処理する精製工程
、【２｝ 酸性イオン交≠剣箇脂と接触せしめて吸着処
理し、続いて溶離剤により塔から礎蛋白質ＰＲＦを港鱗
処理する精製工程、【３’半透明を用いる分子量分画処
理により精製する工程、からなる三種の精製工程を前後
任意に組み合わせて精製することにより実施される。 本発明に用いる坦子菌類の菌名・分類は、保育社発行、
今関六也・本郷次雄共著「原色日本菌類図鑑」（昭和５
２年）によるものとし、糖蛋白質ＰＲＦの生産に使用す
る菌糸体としては、例えばえのきたけ属に属する菌種、
エノキタケ：フラムリナ・ベルテイベス（Ｆｌａｍｍｕ
ｌｉ佃ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）ＩＦ０４９０１があり、日
本微生物株保存機関連盟で保存されている。 しかし本発明の実施にあたっては特定の菌殊に限る必要
はなく、人工栽培された市販の子実体、或いは本邦にも
広く分布する天然のエノキタケ子実体からも容易にその
菌糸体を得ることが出来る。即ち天然乃至は人工栽培さ
れた新鮮なェノ‐キタケの子実体を前記図鑑により同定
確認の上無菌的に子実体組織の一部を採取し、適当な条
件下での無菌培養により菌糸体を得ることが出来るし、
或いは胞子紋分離法によってもその菌糸体を分離するこ
とが出来る。このようにして得られる菌糸体の培養には
、通常菌類の培養に用いるすべての培地が使用出来る。 培地成分には、炭素源として例えばグルコ−ス、フラク
トース、転化糖、競糖、麦芽糖、乳糖、デキストリン、
澱粉、ビートやケィンの廃糖蜜などの炭水化物、さらに
はｎ−アルカン類やアルコール類並びにクエン酸やマレ
ィン酸などの有機酸類の如き非炭水化物も使用出来る。
また、例えばコーンスチープリカー、大豆粉、酵母エキ
ス、肉エキス、ベプトン、尿素、アミノ酸類および硫酸
アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類の如き
有機態、無機態の窒素源、並びに硫酸マグネシウム、硫
酸マンガン、リン酸カリなど少量の無機塩類などが挙げ
られる。必要に応じニコチン酸、ビオチンその他のビタ
ミン・桶酵素類等の徴量成分を添加も出来る。なお担子
菌類は元来自然の環境条件下で生育してきたから、さま
ざまの無機、有機の化合物とその増殖・生育に利用出来
る。従ってエノキタケ菌糸体の培養といえども上記成分
だけに限定をうけるものではない。培養は温度２０℃〜
３０午０、好ましくは２４ｑｏ〜２８ｑｏ、母４〜８で
実施され、通常振鐘培養または深部通気燈梓培養が好適
である。培養時間は培養条件により、また菌株により異
るが通常３〜２０日間必要である。本発明によって得ら
れる制建性の有効物質は培養菌糸体の中に含まれている
。 即ち、まず、上記の諸条件で培養かれた培養液から櫨過
または遠心分離の処理により培養菌糸体を得る。この菌
糸体から本物質を抽出するには、培養菌糸体に２〜２０
倍量の水または０．１規定乃至０．９規定のアルカリ水
を加え〜８０〜１００００、１乃至２餌時間加熱損拝し
て抽出処理する。次いでこの抽出処理物をそのままかま
たは中和処理したあと、糠過または遠心分離処理により
菌糸体残澄を分離除去して抽出液を得る。この抽出液は
そのままか、或いは必要によっては中和処理を加えた後
、前記｛１｝から（４）の四種の精製工程を前後適当に
組み合わせて構成される全精製工程を経ることによって
精製処理を実施する。ところでエノキタケ菌糸体の生産
する制癖性の有効物質をイオン交≠剣樹脂に吸着せしめ
、続いて溶離を行った例かこれ迄にない。 エノキタケ菌糸体から抽出される本物質は、本来両性物
質であるところの蛋白質を主体としており、これをイオ
ン交≠剣樹脂で、しかも塩基性イオン交換樹脂と酸性イ
オン交換樹脂を用いる個々に独立した精製工程からなる
組み合わせにより分離精製することは本発明方法の特徴
の一つである。この方法の適用により高度の精製が行わ
れ品質の優れた制癌性糖蛋白質ＰＲＦが得られるので、
工業的規模での製造には極めて有利な方法を提供するも
のである。塩基性イオン交換樹脂としてはアンバーライ
トＩＲＡ−４０ｕ ダウエツクス１×２、ダイヤイオン
ＰＡ−３００同ＰＡ−３０８同ＳＡＩｌＢ、同ＳＡ２１
Ｂ、同ＰＡ−４０８などが用いられ、酸性イオン交換樹
脂としてはアンバーライトＩＲＣ−５０、同ＣＧ−５０
、同ＩＲ−１２止 ダウエツクス５０Ｗ×４、ダイヤイ
オンＷＫ−１０、同ＷＫ−１庇、同ＷＫ−２０、同ＳＫ
−１０４などが使用される。これらイオン交換樹脂を有
効物資の精製工程において使用するに際しては、塩基性
イオン交換樹脂では遊離型、アセテード型、クロル型な
どとして用いられ、好ましくは遊離型が使用されるそ、
酸性イオン交モ製樹脂では遊離型、ナトリウム型、アン
モニウム型などとして用いられ、好ましくは同様に遊離
型が使用される。使用するイオン交換樹脂は適当な塔に
充填したうえ、これに有効物質を含有する溶液を負荷、
通液し、続いてこの充填塔を水洗した後、溶離剤を通液
することによって有効物質を樹脂から溶離させる方法が
有利である。この際の温度は０乃至５０Ｃ○、通常は室
温で実施され、流速はＳＶ（ＳｐａｃｅＶｅｌｏｃｉｔ
ｙ）が０．２〜５であり、特に吸着および水洗の操作で
は１〜４、溶離の操作では０．５〜２のＳＶが好ましい
。熔離剤としては塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、硝酸カリウム並びにリン酸アンモニ
ウムなどの無機塩、ギ酸アンモニウム、酷酸ナトリウム
並びに酷酸アンモニウムなどの有機塩、アンモニア、ピ
リジン並びにトリェチルアミンなどの塩基、並びにギ酸
、硝酸などの酸を含有する水溶液が用いられる。溶離剤
の濃度は０．１〜３ｈｏｌ／その範囲が適当である。さ
らに本発明方法を構成する精製工程の一つとして、半透
膜を使用した限外炉過処理による分子量分画を行うこと
も本発明の特徴の一つであり、本発明によって得られる
制癌性糖蛋白質ＰＲＦの品質を高めるのに極めて大きな
効果がある。 限外櫨過の操作・処理条件について述べると、圧力差は
０．２〜１０ｋ９／地の範囲で操作され、半透膜は１０
Ａから１仏の範囲の孔径を有するものの中から適当に選
択されるが、通常、一般的に利用出来るものは分画分子
量が規格となっている。ダイアフロー膜その他の仕様に
は分画分子量１００００（例えばＵＭ−１０、ＰＭ−１
０、ＵＫ−１０など）や分画分子量１０００（例えばＵ
Ｈ−１）のものがあり、また中空糸状膜のモジュール標
準仕様の中にはカタログ表示で分画分子量６０００のも
のがある（例えばＳＩＰ−１０１３同３０１３ＭＬ−４
０１１）。本発明方法の特徴は、塩基性イオン交換樹脂
、酸性イオン交≠剣樹脂並びに半透膜をそれぞれ使用す
る個々の独立した四種の精製工程を前後適当に組み合わ
せて構成される成精製工程を以つて、本発明の目的とす
る制癌性糖蛋白質ＰＲＦを得るための精製処理がなされ
るところにある。 かかる方法によって有効物質を含有するエノキタケ培養
菌糸体またはその処理物から工業的規模で本物費を得る
ための高度の精製が実施される。場合に応じてあらゆる
組み合わせの方法が可能であるが、例えば有効物質を含
有する抽出液を、まず（１｝塩基性イオン交換樹脂を用
いる精製工程、次いで｛３｝半透膜を用いる精製工程、
続いて‘２）酸性イオン交換樹脂工程、最後に更に‘３
’半透膜を用いる精製工程の如き組み合わせにより精製
が実施される。本発明方法により得られた糖蛋白質ＰＲ
Ｆについて、次の制癖作用、免疫増強作用などの試験を
行った。 ＩＣＲマウスの腹腔内で継代維持されている肉腫１８鎌
曲砲２×１ぴ個をＩＣＲ雌マウスの皮下に移植して固型
腫傷化した。移植翌日から１日１回、連続１０日間本物
質の各量を一群６〜９匹のマウスに経口投与または腹腔
内在射した。腫場移植２８日後に腰場をとり出し、本物
質投与群および対照群（本物質の代りに滅菌生理食塩水
を投与）それぞれにおける平境腫湯重量から種傷増殖阻
止率を求めた。結果は表１に示す。表１ またＢＤＦ，マウスの皮下で継代維持されているＢ１６
メラノーマ細胞をとり出し、細切後トリプシン処理によ
り分散細胞とした。 その１ぴ個をＢＤＦ，マウスの皮下に移植した。移植翌
日から１日１回、連続１０日間本物費の各量を一群６〜
９匹のマウスに経口投与し、表２に示す結果を得た。表
２さらに担癌によって低下した体液性免疫館の回復が本
物質の経口投与によって認められるか否かを、Ｃｕｎｎ
ｉｎかａｎ等の方法に準じ羊赤血球に対するマウス腰臓
の抗体産性細胞の数を指標として実験した。 一群５匹のＩＣＲ雌マウスの皮下に２×１ぴ個の肉腫１
８概曲砲を移植し、その１０日后に羊赤血球１ぴ個を尾
静脈に注射し免疫を施した。移植１０日后から１３日目
迄１日１回、４日間本物質の各量を経口投与し、移植の
１４日后にマウスから健勝を摘出し抗体産生細胞数を測
定した。結果は表３に示す。表３ なお本物質の毒性は認められなかった。 その急性毒性試験結果を示すと表４の通りである。表４
本物質には細胞毒性は認められていない。 先述の如く本物質が強い免疫増強作用を有することから
、その制癌効果は宿主を仲介したものと考えられる。Ｂ
ＤＦ，マウスにおいてＢ１６メラノーマ細胞など同系腫
湯に対し生存日数の顕著な延長が認められたことも本物
質の重要な意義を示すものであり、経口投与が可能で、
蓬性の認められない制癌剤として腰傷免疫療法に極めて
有用な物質を提供するものである。実施例 １ エノキタケ：フラムリナ・ベルテイベス ＩＦ０４９０
１のしよう油・玉ねぎエキス寒天斜面塔地に培養した新
鮮な菌糸をグルコース３％、コーンスチープリカー２．
６％、ＫＨ２Ｐ４及びＫ２ＨＰ０４各０．０３％、Ｍｇ
Ｓ０４・７日２０ ０．０２％からなる組成の種母培地
（ｐＨ５．７に調整）１００の‘を分注、１殺菌した５
００私客フラスコに接種し、２が○、７日間振縁培養し
た。 この一次種母をコーンスターチ３．２％、コーンスチー
プリカー５％、ＫＨ２Ｐ０４及びＫ２ＨＰ０４各０．０
３％、ＭｇＳ０４・７日２００．０２％の組成の種母培
地（斑６０に調整）を含む小型ステンレス製培養槽に接
種（接種量は培地に対し１０％）し、２８℃にて４日間
通気蝿梓培養した。得られた二次種母をコーンスターチ
３．２％、グルコース１％、コーンスチープリカー５％
、ベブトン０．５％、ＫＨ２Ｐ０４及びＫ２ＨＰ０４各
０．０３％、Ｍが０４・７＆００．０２％からなる組成
の生産培地（ｐＨ５．８）を入れた培養槽に移液（接種
量は培地に対し５％）し、２７〜２８ｏｏ、５日間通気
培養を行った。この培養液２２５〆をフィルタープレス
にて菌糸体と穣液に分離し、得られた菌糸体を水１７０
夕と混合し、４時間９０〜９５℃に加熱、腿拝して抽出
処理を行った。 このスラリーを４０〜５０℃に冷却し、櫨週により菌糸
体部と櫨液部に分離し、菌糸体は温水にて洗練、かくし
て得られた漣液と洗液を合して抽出液２１７〆を得た（
菌糸体残澄は実施例２に移す）。これをダイヤイオンＰ
Ａ−３０６（ＯＨ型）１８夕を充填した塔に室温にてＳ
Ｖ＝２の流速で通液し、引き続いて塔を十分水洗した。
この塔に１．８ｈｏ夕／その塩化ナトリウム溶液を通液
（ＳＶ＝１）して溶雛処理した。この際流出液中の蛋白
質をフオリン・ローリー法によりモニターして蛋白質画
分３６そを集めた。これを希塩酸で中和した後、分画分
子量６０００の半透膜ＳＩＰ−１０１３を用いて限外櫨
過処理して脱塩、濃縮を行った。次いでこの濃縮液をダ
イヤイオンＷＫ−１庇（日型、５夕）の塔に通液（室温
、ＳＶ＝１）し、さらに水洗した。この塔に洲 アンモ
ニア水を通液（ＳＶ＝１）して蛋白質画分５そを得た。
これを希塩酸により中和し、半透膜ＳＩＰ−１０１３（
分画分子量６０００）にて限外櫨過処理して脱塩、濃縮
をした。これをガラス繊維渡紙により嫌過した後、凍結
乾燥により淡褐色粉末状の糖蛋白質ＰＲＦ１４．鶴を得
た。糖舎量８．２％（グルコース換算値）、全窒素舎量
１３．５％（ミクロ・キェルダール法）、比旋光度〔Ｑ
〕啓一５０．〆（ＣＯ．１、０．１ＮＮａＯＨ），乾燥
滅失量 ６．３％（１０５ｏｏ、３時間）、ｐＨ５．４
（１％水溶液）、強熱残分 １．７％（灰化法、硫酸塩
として測定）、分子量 ８０００〜２００００（０．１
％ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドゲル
上、斑７．４ ３時間の蟹気泳動による）実施例 ２ 実施例１において菌糸体残澄を０．１ 水酸化ナトリウ
ム溶液９０そと混合し、９０〜９５ｑｏにて３時間鷹拝
して抽出処理を行った。 スラリーを４０〜５００Ｃに冷却后、希硫酸で中和し、
猿過助剤（／・ィフロスーパーセル）を加え、フイルタ
ープレスによる猿過処理で抽出液１３４そを得た。これ
を半透膜山Ｌ−４０１１による限外燈過処理にかけて分
子量６０００以下の低分子物質を除去し、さらにこの処
理液をダイヤオンＷＫ−１０（日型）３０その塔に通液
（ＳＶ＝１．５）した。この塔を水洗してから刈アンモ
ニア水を通液（ＳＶ＝１）して熔離処理し、蛋白質画分
４３夕を得た。これを真空蒸溜することにより過剰のア
ンモニアを除去した。かくして得られた濃縮液をアンバ
ーライトＩＲＡ−４００（ＯＨ型）７その塔に通液（Ｓ
Ｖ＝２）し、さらに水洗してから１．５ｍｏ〆／その塩
化ナトリウム溶液を通液（ＳＶ＝１）し蛋白質画分１１
．７夕を集めた。希塩酸でこれを中和し、半透膿ＳＭ−
１０１３による限外櫨過にかけて脱塩、濃縮し、次いで
ガラス繊維鷹紙によって櫨過し、最後に凍結乾燥によっ
て淡褐色粉末状のＰＲＦ３５．３ｇを得た。糖含量 １
．９％、全窒素含量 １４．１％、〔Ｑ〕色。−５３．
８０（ＣＯ．１、０．１Ｎ、ＮａＯＨ）、乾燥滅失量５
．８％、ｐＨ６．３華黄熟残分 ２．６％、分子量 ８
０００〜２００００実施例 ３ 市販エノキタケの新鮮子実体から無菌的に組織の一部を
切り出し、これを蕗糖、トマトジュース並びにしよう油
の各５％、寒天１．５％の寒天平板渚地（ｐＨ５．２）
上で、２５００にて培養してエノキ夕ケ菌糸体を分離し
た。 同じ培地で平板培養を２回繰り返した後、得られた菌糸
体を使用して実施例１と同様に培養した。培養液１７０
０夕から様別した菌糸体に水８００そを加え、９０〜９
５ｏｏに加熱して４時間壇拝した。 スラリーは４０〜５０℃に冷却し、フィルタープレスで
菌糸体残澄と抽出猿液に分離し、前者は０．１Ｎ水酸化
ナトリウム溶液５００そと混合し、９０〜９５℃にて３
虫時間鷹拝して抽出処理した。このスラリーは再び令却
してから中和し、同様に残糟と抽出渡液とに分離し、残
澄の方は温水で洗総した。そのようにして得られた熱水
抽出猿液、希アルカリ抽出渡液および洗液を合して抽出
液１１８０〆を得た。この抽出液をダイヤイオンＳＡＩ
ｌＢ（ＯＨ型）の充填塔（４１０夕）に通液（室温、Ｓ
Ｖ＝２）し水洗の後、１．靴ｏｌ／その塩化ナトリウム
溶液をこの塔に通液（ＳＶ＝１）し、熔離してきた蛋白
質画分７６０夕を得た。これを一旦中和した後、工業用
大型の半透膜ＳＩＰ−３０１３により限外櫨過を行い脱
塩、濃縮して濃縮液９２そとした。ダイヤイオンＷＫ−
２０（日型）７０そを充填した塔にこの液を通液（ＳＶ
＝１）し、さらに水洗した。次いでこの塔に洲 アンモ
ニア水を通液することにより蛋白質画分５２．５そを集
めた。これを中和し、さらに半透脂ＳＩＰ−３０１３で
限外濠過処理にかけて精製濃縮液１１．３夕とした。最
後に、これをポアサィズ０．２２ムのフィルターで猿過
し、その猿液を凍結乾燥処理して淡褐色粉末状のＰＲＦ
３５７ｇを得た。糠含量 ３．９％、全窒素含量 １４
．５％、〔Ｑ〕色。−５７．３ｏ（ＣＯ．１、０．１Ｎ
、ＮａＯＨ）、乾燥滅失量５．１％、ｐＨ５．３強熱残
分 １．８％、分子量 ８０００〜２００００実施例
４ 実施例１前段と同様の方法で種母培養、次いで生産培養
を行って得た培養液２４０そから、フィルタープレスで
菌糸体を分離し、これを０．１Ｎ 水酸化ナトリウム溶
液１２０夕と混合し、９０〜９５℃にて３時間半蝿拝し
て抽出処理を行った。 スラリーは冷却してから希硫酸により中和し、菌体残澄
と抽出櫨液に櫨別し、残澄の方は温水６０でで洗総した
。このアルカリ抽出櫨液と洗糠とを合して、実施例１の
後段と同様に、しかし塩基性イオン交換樹脂としてはダ
イヤイオンＰＡ−３雌（ＯＨ型、４０夕）を、酸性イオ
ン交換樹脂としてはアンバーラィトＩＲＯ−５０（日型
、４そ）を、そして半透膜としてはラボモジュールＳＩ
Ｐ−１０１３をそれぞれ使用して精製処理することによ
り濃縮液１そを得た。これを凍結乾燥処理して淡褐色粉
末状ＰＲＦＩＩ．舷を得た。糠舎量４．４％、全窒素舎
量 １３８％〔Ｑ〕色０一５７．００（ＣＯ．１、０．
１ＮＮａＯＨ），乾燥滅失量 ６４％、ｐＨ５．６、強
熱残分 ３．１％、分子量 ８０００〜２００００実施
例 ５ 実施例１で得られたＰＲＦ３００雌を蒸溜水２０の‘に
溶解し、バイオゲル Ｐ−１０９５０の‘のカラム（直
径４６肋、長さ斑仇吻）上部に負荷し、展開剤として蒸
溜水を用いてゲルクロマトグラフィ一を行った。 流出液の蛋白質をフオリン・ローリー法によりモニター
し蛋白質画分を集め、減圧濃縮したあと凍結乾燥処理を
行って粉末状物質２４０の９を得た。この糖蛋白質ＰＲ
Ｆの理化学的諸性質は次の通りであった。（１｝ 元素
分析値 Ｃ：４５．７％、Ｈ：６．４３％、Ｎ：１３．
９４％、Ｓ：０．７２％、灰分：２．５％‘２ー分子量
６０００〜３００００（ゲル櫨過法による）、８００
０〜２００００（ＳＤＳ電気泳動法による）‘３１ 融
点 明瞭な融点を示さず、２５０ｑＣ附近から褐変し、
２８０ｏｏ附近で分解。 【４１ 比旋光度 〔Ｑ〕姿−５２．５ｏ（Ｃ＝０．１
、０．１ＮＮａＯＨ）‘５１ 紫外部吸収スペクトル
第１図の通りであった。 ‘６’ 赤外部吸収スペクトル 第２図の通りであった
。 （７｝ 熔解度 ｐＨ５以上の水、酷酸、ギ酸、アンモ
ニア水に可溶であった。 ｐＨ５以下の水にはやや溶けにくく、アルコール、アセ
トン、ピリジン、酷酸エチル、クロロホルムに不溶であ
った。【８｝ 呈色反応 ラィドン・スミス試薬、ピュ
レツト反応、フオリン−チオカルト反応並び塩酸加水分
解後のニンヒドリン反応による蛋白質並びにアミノ酸の
呈色反応はいずれも陽性であった。 フェノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応並びにモーリ
ッシュ反応による糖の呈色反応では陽性であった。‘９
｝ 等電点 等電点沈澱法を利用して等露点を求めた結
果、ＰＲＦの等函点はｐＨ３．８±０．２であった。 冊と溶解度との関係は第３図の通りであった。００ ア
ミノ酸組成 ＰＲＦ５肌９を磯 塩酸０．５の‘と混合
し、封管中、１０５午○、１母時間加水分解処理した。 分解液を濃縮してから、ｐＨ２．２の緩衝液４の‘に溶
解し、これを日立０３４一２Ｕ型によって一般アミノ酸
分析法に準じて分析した。アミ／酸の種類とその量（ム
ｍｏｌｅｓ）は以下の通りでだつた。アスパラギン酸
０．３４い、スレオニン ０．１６７、セリン ０．２
２９ グルタミン酸 ０．４６７、プロリン ０．２路
、グリシン ０．２１０、アラニン０．３３７、バリ
ン ０．１３３ メチオニン ０．０３１、イソロイシ
ン ０．０７１、ロイシン ０．１５６、チロシン ０
．０２９ フエニルアラニン ０‐０４９、リジン０．
１１７７、ヒスチジン ０．０４２、アルギニン０．
０７＄アンモア ０．２５１１１ 糠含量と 構成糖
糖舎量は７．５％（フェノール硫酸法によるグルコース
換算値）であった。 構成糖は次の通り。グルコース：マン／−ス：ガラクト
ース ＝２６：１．３：１．０ １２ 露気泳動 ｛ａ｝ ７．５％ポリアクリルアミドゲル上、ＰＨ８．
０ １時間の蟹気泳動分析の結果、マーカーとして用い
たブロモフェノールフル−に近接した位置に単一バンド
を与えた。 （ｂ）０．１１％ソジウム．ドデジル．サルフエートを
含有する１５％ポリアクリルアミドゲル上、ＰＨ７．４
、３時間の露気泳動分析の結果、分子量８０００〜２０
０００に相当する位置に単一バンドを与えた。 １３ ＰＨ その１％水溶液は微酸性であった（ｐＨ５
．６＞。 １４ 物質の色 淡褐色を呈していた。 糠蛋白質ＰＲＦは安全性が高く、宿主介在性の制癖効果
が優れていることは先述の通りである。 本物質を有効成分として含有する制癌剤の投与形態は経
口剤、注射剤、坐剤、洋腸剤などのいずれでもよい。経
口用固型製剤を調製する場合は、本物質原末に例えば結
晶セルロース、乳糖、或いはマンニットなどの賦形剤、
されに必要に応じカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ
）、ヒドロキシプ。 ピルセルロース（ＨＰＣ）、アラビアゴム、ゼラチンな
どの結合剤、デンプンやＣＭＣカルシウムなどの崩壊剤
、その他の適当な添加剤を加えて均等に混和した后、常
法により錠剤、額粒剤、紬粒剤、散剤、カプセル剤など
をそれぞれ製造することが出釆る。その際必要によって
は白糠その他の鱈味剤、香料や食用色素などを使用する
ことも出来る。これらの製剤に関連した、例えば腸溶性
化を目的として剤皮を施した錠剤、顎粒、細粒、或いは
同じく剤皮を施した粒状物を充填したカプセル剤の調製
も可能である。この皮膜用材費には例えば酷酸フタル酸
セルロースとかヒドロキシプロピルメチルセルロースフ
タレートなどが使用出来る。経口用液状製剤を調整する
場合には、白糠、その他の糟類若しくは甘味剤の溶液に
本物費原末を添加、溶解、混和し、さらに必要に応じク
エン酸ソーダなどの安定化剤、安息香酸ソーダやパラオ
キシ安息香酸ェステル類などの保存剤、ラゥリル硫酸ソ
ーダなどの分散剤、着色剤や香料などを加えて、常法に
よりシロップ剤を調製することが出釆る。 本物質原末に白糠や適当な添加剤、必要ならば結合剤、
増粘剤、着色剤、芳香剤などを加え、用時溶解出来る粉
末状又は粒状のドライシロップ剤とするのもよい。注射
剤を調整するには溶媒として水性溶剤が通しており、注
射用蒸溜水、生理食塩水、リンゲル液などが使用出来る
。 本物質原末の一定量をこれら水性溶剤にかき混ぜ溶解す
る。この際必要に応じりん酸塩、クエン酸塩の如き緩衝
剤、塩化ナトリウムの如き等脹剤、パラオキシ安息香酸
ェステル類、或いは塩化ペンゼトニウムの如き保存剤な
どを添加する。かくして調製された溶液はメンフランフ
イルターを利用したマイクロフィルトレーションにより
不溶性異物及び微生物を除去し、常法により皮下、筋肉
内、静脈内用の注射剤を調製することが出来る。なお用
時溶解して用いる注射剤の調製には、本物質原末に例え
ば上述の如き緩衝剤、等脹剤、保存剤その他適当な賦形
剤を加え無菌操作法と凍結乾燥法により無菌の粉末状薬
剤を製造し、必要ならば粒度を調節してからその一定量
をバィアルに無菌的に充填して密封するか、本物質を水
落性剤に他の適当な添加剤と共に溶解させ、メンプラン
フィルターにより無菌化した後、バィアルにその一定量
を分注する。しかる後、これを凍結乾燥させてから密封
する。坐剤を調製する場合には、カカオ脂、マグロゴー
ルまたは重合度の異なるマクロゴールの混合物などから
基剤を選択出来る。 本物質原末を加熱、融解した基剤に加え均等に混和し、
常法により坐剤を製造することが出来る。その際に必要
ならばパラオキシ安息香酸ェステル類などの保存剤、ポ
リソルベート８０などの界面活性剤を添加するのもよい
。洋腸剤を調製するには必要に応じリン酸塩、クエン酸
塩などの緩衝剤、塩化ナトリウムなどの等腸剤、パラオ
キシ安息香酸ェステル類などの保存剤その他の添加剤を
本物質原末と共に注射用蒸溜水に溶解させ、さらにメン
ブランフィルターを使用した無菌炉過処理を施すなど常
法によって洋腸剤を製造することが出来る。 制癌剤としての本物質の投与量は患者各々の症状、年令
、体重、投与方法などにより異なるが、通常、成人患者
に対する一日投与量は１０〜３０００のｏ、好ましくは
５０〜９００のｏであり、一日一回、或いは症状、投与
方法などによっては一日二乃至三回、または数回に分与
するのもよい。 以下に本発明の具体的な製剤例を示す。 製剤例 １（カプセル剤） 本物質原末ｌｋ９、マンニットｌｋ９、ＨＰＣ５０ｇ、
コ−ンスターチ５００ｇを混合後、蒸溜水を加えて練合
した。 この練合物を１０メッシュのふるいを通し、６０ｑｏに
て乾燥する。得られた乾燥物を２０メッシュスクリーン
付きオシレッター型類粒機または破砕型整粒機で整粒し
、ステアリン酸マグネシウム５腿を加えて１０分間混合
しカプセル用の額粒を得た。これを２６０のｐ宛日局ゼ
ラチンカプセルＮｏ．２に充填し、１カプセル当り本物
質原末１００ｍｐを含有するカプセル剤約１０００の固
を製造した。製剤例 ２（類粒剤）本物質原末６０雌、
結晶セル。 −ス１３２雌、乳糖４岬０幼）らなる混合物にエタノー
ルと水の鷹液】．１そを加え練合した。その練合物を円
筒型造粒機または押出し式造粒機で造粒した後乾燥した
。得られた乾燥物を２０メッシュのふるいを用いて整粒
し糖蛋白質ＰＲＦ類粒剤約６ｋ９が得られた。これを分
包して一包当り類粒剤１ｇ（本物質原末１００の９）が
含まれるようにした。製剤例 ３（注射剤） 注射用蒸溜水１８００叫にパラオキシ安息香酸メチル２
．略、パラオキシ安息香酸プロピル０．２礎を加えて加
熱、縄拝しながら溶解させた。 これに本物質原末５０ｇを加えて鷹梓、溶解させた後、
クエン酸ソーダを用いてｐＨ６．６に調整し、さらに注
射用蒸溜水を加えて全量を２０００私とした。この溶液
を０．４５仏のメンプラソフィルターにて櫨遇しへ次い
で０．２２仏のメンブランフィルターにて猿過して無菌
化した。この２の【をアンプル１本当りに本物質原末が
５０の９合まれるよう分注、充填した後、熔封、密閉し
た（５０Ｍ／２の‘）。製剤例 ４（注腸剤）注射用蒸
溜水３６００の‘にパラオキシ安息香酸メチル４．８ｇ
、パラオキシ安息香酸プロピル０．５雄を加えて加熱、
蝿拝しながら溶解させた。 これに本物質原末６雌を加えて蝿拝、溶解させた後、注
射用蒸溜水を加えて４０００凧【とした。この溶液をま
ず０．４５ムのメンブランフィルターに櫨過し、さらに
０．２２山のメンブランフィルターにて櫨過した。これ
を３０汎Ｚ客の注腸剤用栓付バィアル１本当り有効成分
として３００のｏ含まれるよう充填した後（３００の９
／２０泌）。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＲＦの紫外部吸収スペクトル図で、ＰＲＦの
濃度は０．２５雌／私、溶媒は１、日２０２０．１Ｎは
Ｓ０４ ３、０．１ＮＮａＯＨである。 第２図はＰＲＦの赤外部吸収スペクトル図。第３図はＰ
ＲＦの溶解度とｐＨの関係を示す図である。オ１図 ザ２図 ナ３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の理化学的諸性質を示し、１０％以下の糖を含
   有することを特徴とする糖蛋白質ＰＲＦ。 （ａ）元素分析：Ｃ：４４〜４８％、Ｈ：５．５〜７．
   ５％Ｎ：１３〜１５％、Ｓ：０．５〜１％ 灰分：１〜５％ （ｂ）分子量： ゲル濾過法により６０００〜３００００ 電気泳動法により８０００〜２００００ （ｃ）融点： ２５０℃附近から褐変し、２８０℃附近で分解する。 （ｄ）比旋光度：〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝−４０°〜−８
   ０°（Ｃ＝０．１、０．１ＮＮａＯＨ）（ｅ）紫外部吸
   収スペクトル： 第１図に示す通り。 （ｆ）赤外部吸収スペクトル： 第２図に示す通り。 ｇ 溶解度： ｐＨ５以上の水には可溶であるが、ｐＨ５以下の水には
   やや溶けにくい。 醋酸、ギ酸、アンモニア水には可溶である。アルコール
   、アセトン、ピリジン、醋酸エチル、クロロホルムなど
   には不溶である。ｈ 呈色反応： ライドン．スミス試薬、ビユレツト反応、フオリン−チ
   オカルト反応並びに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応
   による蛋白質並びにアミノ酸の呈色反応はいずれも陽性
   である。 フエノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応並びにモーリ
   ツシユ反応による呈色反応はいずれも陽性である。ｉ
   等電点： 等電点ｐＨ３．８±０．２の酸性蛋白質である（第３図
   ）。 ｊ 蛋白質部分： 蛋白質部分は本願糖蛋白質ＰＲＦにおいて９０％（牛血
   清アルブミン換算値：フオリン・ローリー法による）以
   上を占め、それを構成するアミノ酸の種類とそのモル比
   は次の通りである。 アスパラギン酸９〜１２スレオニン４〜６ セリン６〜８ グルタミン酸１３〜１６ プロリン７〜９ グリシン５〜７ アラニン９〜１１ バリン３〜５ メチオニン１〜３ イソロイシン１〜３ ロイシン３〜６ チロシン１〜２ フエニルアラニン１〜３ リジン４〜６ ヒスチジン１〜２ アルギニン１〜３ ｋ糖部分： 糖部分は本願糖蛋白質ＰＲＦにおいて１０％（グルコー
   ス換算値；フエノール硫酸法による）以下で、糖の種類
   とその比は次の通りである。 グルコース：マンノース：ガラクトース＝１：１：１乃
   至３：２：１ ｌ 均一性： ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析法により、マーカ
   ーであるブロモフエノールブルーに近接した位置に単一
   バンドを与える。 ｍ ｐＨ： その１％水溶液は微酸性である。 ｎ 物質の色： 淡黄茶色乃至淡褐色を呈する。 ２ えのきたけ属に属する担子菌類である蛋白質ＰＲＦ
   生産菌を栄養源培地で培養して得られる培養菌糸体を熱
   水および／または熱希薄アルカリ水で抽出し、この抽出
   液をそのままかまたは中和処理したあと（ａ）塩基性イ
   オン交換樹脂と接触せしめて吸着処理し、続いて溶離剤
   により塔から糖蛋白質ＰＲＦを溶離処理する精製工程、 （ｂ）酸性イオン交換樹脂と接触せしめて吸着処理し、
   続いて溶離剤により塔から糖蛋白質ＰＲＦを溶離処理す
   る精製行程、（ｃ）半透膜を用いる分子量分画処理によ
   り精製する工程、からなる四種の精製工程を前後任意に
   組み合わせて構成される全精製工程によつて精製するこ
   とを特徴とする糖蛋白質ＰＲＦの製造法。 ３ 糖蛋白質ＰＲＦを有効成分として含有する制癌剤。