MXPA01008280A - Extractos, de alto peso molecular, de convolvulus arvensis (enredadera silvestre). - Google Patents

Abstract

Se emplea un extracto purificado de la enredadera silvestre para inhibir el crecimiento de celulas de tumores, inhibir el crecimiento de vasos sanguineos y aumentar la funcion inmunologica. Este extracto de la enredadera silvestre se prepara removiendo los componentes toxicos, de bajo peso molecular, de la Convolvulus arvensis.

Description

EXTRACTOS. DE ALTO PESO MOLECULAR. DE CONVOLVULUS ARVENSIS (ENREDADERA SILVESTRE) CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la obtención de extractos purificados de la enredadera silvestre, por la recolección de componentes de alto peso molecular de una solución acuosa homogeneizada de un material de la enredadera silvestre. Estos extractos de alto peso molecular se ha mostrado, inesperadamente, inhiben el crecimiento de dos diferentes tipos de tumores virulentos en ratones. Los extractos poseen efectos inmunopotenciadores, como es evidente por la infiltración de tumores por los leucocitos en los tumores de los animales tratados, y la inducción de la proliferación de linfocitos. Ellos además poseen propiedades anti-angiogénicas, como se demostró en el ensayo de membrana corioalantóica del pollo. El método de extracción permite la remoción de moléculas pequeñas, que incluyen los alcaloides, desde el material de la planta, que se sabe es tóxico. Los extractos de la enredadera silvestre tienen utilidad como drogas contra el cáncer, de baja toxicidad, para su uso en humanos y animales.

• ' - ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Recientemente, el concepto de usar modificadores de la respuesta biológica ("BRM") se ha considerado para el tratamiento del cáncer. Algunos BRM no son citotóxicos 5 directamente a las células de tumores, pero poseen cualidades que cambian el ambiente del organismo. El estímulo e inhibición inmunológica del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos son dos estrategias de modificación de la respuesta biológica, con potencial en el tratamiento del 10 cáncer. Ejemplos de estimuladores inmunológicos con actividad anti-tumor conocida son los Polisacáridos K, beta 1,3 -glucano y la vacuna de Maruyama . Todos los cuales contienen polisacáridos y/o proteínas de alto peso molecular. Ejemplos de moléculas que inhiben la angiogénesis 15 incluyen la TMP-470 y la angiostatina, que han demostrado actividad anti-tumor. Mientras se investigaron los extractos de la enredadera silvestre para la actividad anti-tumor, nosotros tratamos inicialmente de aislar alcaloides de bajo peso molecular, que se sabe son tóxicos, y que sospechamos 20 tienen una actividad quimioterapéutica tradicional o actividad citotóxica de tumores. Se ha encontrado que los extractos de bajo peso molecular, que contienen los alcaloides tóxicos, exhiben poca actividad anti-tumor, mientras los extractos de alto 25 peso molecular, que excluyen los alcaloides tóxicos, ltHa..ri-ttH-1-ll-IIIÍ-l? contienen una actividad anti-tumor significante, por su acción como modificadores de la respuesta biológica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN 5 Un objeto de la invención es suministrar una sustancia farmacéutica que consta de extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre ( Convolvulus arvensis) , que tenga baja toxicidad hacia las células normales e induzca efectos anti-tumor en animales, inhiba el 10 crecimiento de los vasos sanguíneos y aumente la función inmunológica en los mamíferos. Preferiblemente, estos extractos de alto peso molecular, que tienen componentes menores de aproximadamente 500 Daltons, son removidos. Más preferiblemente, los componentes removidos son menores de 15 aproximadamente 1,000 Daltons. Aún más preferiblemente, los componentes removidos son menores de aproximadamente 3,000 Daltons. Todavía más preferiblemente, los componentes removidos son menores de aproximadamente 5,000 Daltons y especialmente de 10,000 Daltons. 20 Una modalidad de la invención es aislar los extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre ( Convolvulus arvensis) , usando un filtro de peso molecular o alternativamente la precipitación con el sulfato de amonio. jgg^&í Un objeto más de la presente invención es suministrar un método para aislar los extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre (Convolvulus arvensis) que tienen baja toxicidad, en virtud de la remoción de los 5 componentes tóxicos de bajo peso molecular de un extracto crudo. Preferiblemente, los componentes menores de aproximadamente 3000 Daltons se remueven. Más preferiblemente, los componentes menores de unos 6,500 Daltons se remueven. Aún más preferiblemente, los 10 componentes menores de aproximadamente 10,000 Daltons se remueven . Una modalidad de la invención es remover los extractos de bajo peso molecular de la enredadera silvestre ( Convolvulus arvensis) , usando un filtro del peso molecular 15 o alternativamente la precipitación con el sulfato de amonio . Un objeto más de la presente invención es suministrar un método para el uso de extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre ( Convolvulus arvensis) , 20 que tengan baja toxicidad a las células normales e induzcan efectos anti-tumor en animales. Un objeto más de la presente invención es suministrar un método para el uso de extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre ( Convolvulus arvensis) , 5 que inhiba el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. (¡ík^^^^rt-h Otro objeto más de la presente invención es suministrar un método para el uso de extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre ( Convolvulus arvensis) , que exhiban efectos inmunológicos aumentados en animales. Estos y otros objetos de la invención, llegarán a ser aparentes con referencia a los materiales y métodos señalados más adelante.

DESCRIPCIÓN DETALLADAA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Hemos descubierto que un extracto de alto peso molecular de la enredadera silvestre que, sorprendentemente, tiene baja toxicidad a las células normales e induce efectos anti-tumor, inhibe el crecimiento de vasos sanguíneos, y aumenta la función inmunológica en mamíferos. Hemos encontrado también que los componentes de bajo peso molecular de los alcaloides contenidos en el extracto de la enredadera silvestre, del orden de 300 a 500 Daltons, son tóxicos tanto a células normales como a células de tumores. Con el fin de remover los componentes tóxicos de bajo peso molecular, usamos un tamiz del peso molecular. En general, el método de la invención en obtener los extractos de alto peso molecular de la Convolvulus arvensis consiste de hervir la enredadera silvestre, fresca o envejecida, en una solución acuosa, para obtener una mezcla de tipo té castaño. Esta mezcla es luego centrifugada o filtrada, para remover el material sólido para crear una solución. Es sólo necesario remover el componente de peso molecular de 300 a 500 Daltons, para remover la toxicidad a las células normales. Sin embargo, encontramos que los componentes de bajo peso molecular, pueden unirse no específicamente a la membrana y volver a soltarse. Por lo tanto, preferiblemente, un tamiz de peso molecular más grande se usa, del orden de 1000 Daltons, más preferiblemente de 3000 Daltons, aún más preferiblemente de 5000 Daltons. Encontramos que aún cuando los componentes de peso molecular de hasta 10,000 Daltons se remuevan, el extracto retiene sus efectos anti-tumor en animales, su habilidad de inhibir el crecimiento de los vasos sanguíneos, y su capacidad de aumentar la función inmune en los mamíferos. En los Ejemplos siguientes, después de hervir la enredadera silvestre, fresca o envejecida, en una solución molecular, para obtener una mezcla de tipo té de color castaño, la solución es luego pasada a través de un dispositivo de filtro del peso molecular, para obtener un retenado de alto peso molecular (BWR) , o precipitada usando el sulfato de amonio, para aislar un precipitado de alto peso molecular (B P) . En seguida, el extracto de alto peso molecular se liofiliza, o se concentra de otra manera. El extracto se ensaya subsiguientemente para la actividad aumentada inmunológica anti-tumor y contra la angiogénesis.

Luego se usan los ensayos SDS-Page, IEF y de proteínas, con el fin de caracterizar además los componentes del extracto. Este extracto es también ensayado para el peso molecular, usando una columna Superosel2-HR de clasificación de tamaño (Pharmacia Biotech) , que emplea los estándares conocidos del peso molecular. Características y ventajas ulteriores de la presente invención llegarán a ser evidentes a los expertos en la materia, en vista de la descripción detallada de las modalidades preferidas que siguen, cuando se consideran junto con los dibujos adjuntos y las reivindicaciones. Aunque se pueden usar otros materiales y métodos, similares o equivalentes, a los descritos aquí, en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describirán ahora. El Ejemplo 1 describe las etapas requeridas para preparar los extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre.

EJEMPL01 Preparación de los extractos, de alto peso molecular, de la enredadera silvestre Hemos aislado los extractos de alto peso molecular de Convolvulus arvensis, como sigue: Se cosechó la Convolvulus arvensis, fresca y se descartaron las semillas y flores. Estas porciones de las plantas se homogeneizaron usando una licuadora Waring. Al material de la planta homogeneizado, se agregaron 3 volúmenes de agua destilada, para crear una mezcla. Esta mezcla luego se hirvió durante 5 30 minutos, para obtener un té. Los sólidos se removieron desde el té por filtración, y el sobrenadante retenido. Este sobrenadante se enfrió y de él se prepararon dos aislados de alto peso molecular. Algo del sobrenadante del té se procesó en un concentrador CH2 , equipado con un cartucho de 3,000 10 Daltons o mayor. El retenado del concentrador (que contiene sólo moléculas mayores de 3,000 Daltons) se retuvo, y se liofilizó, y se denomina aquí como el BWR. Alternativamente, algo del sobrenadante del té se combinó con el sulfato de amonio para suministrar una saturación final de sulfato de 15 amonio al 50%. Esto resultó en la precipitación de algo de los componentes del sobrenadante del té. Los componentes precipitados luego se recogieron después de la centrifugación a 25,000G durante 30 minutos y se resuspendieron en una solución salina regulada con fosfato, 20 para formar una nueva solución. Esta nueva solución luego se pasó a través de un dispositivo de ultrafiltración, usando una membrana de 3,000 Daltons. El retenado se recogió, y se liofilizó, y aquí se denomina como el BWP. Este BWP y el BWR se almacenaron a 4°C en un desecador, antes de usar en la j^^^^^^^^^É^I caracterización y los estudios de parámetros anti-tumor, anti-angiogénesis e inmunológico. En los Ejemplos 2 y 3, los extractos de alto peso molecular se caracterizaron y probaron en su toxicidad. 5 EJEMPLO 2 Caracterización de los extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre El análisis del SDS-Page del BWR y BWP, ambos 10 mostraron un patrón grasoso generalizado, el cual es una característica del polisacárido, con bandas de proteína ocasionales en varios intervalos de los pesos moleculares mayores de 200,000 Daltons hasta 6,500 Daltons. Ambos extractos fueron positivos para la reacción de Molish, que 15 indica la presencia de partes de azúcar. Y ambos fueron fuertemente positivos para la proteína, usando el ensayo del ácido bioincronínico. Lo anterior lleva a la conclusión que el BWP y el BWR contienen tanto proteína como sacáridos. La cromatografía de FPLC del BWR y BWP, usando una columna 20 Superosel2-HR de clasificación de tamaño, demostró que sólo crestas de peso molecular alto sin detección de moléculas menores de 10,000 Daltons. 25 ^^jU ?fc EJEMPLO 3 Caracterización de la toxicidad de los extractos de alto peso molecular de la enredadera silvestre La clasificación de quimioterapia estándar para los agentes anti-tumor citotóxicos, selecciona agentes con actividad citotóxica con una concentración de 5 mcg/ml. Ambos extractos de la enredadera silvestre fueron sólo tóxicos a las células de tumor cultivadas a una concentración de 1000 mcg/ml, o mayor, demostrando así baja toxicidad. En los Ejemplos 4 a 10, los efectos de los extractos de alto peso molecular, BWR y BWP se analizaron en la actividad anti-angiogénesis, actividad anti-tumor y efecto en la función inmunológica.

EJEMPLO 4 Actividad anti-angiogénesis del BWR Los extractos que contienen el sacárido/proteína de alto peso molecular, de la enredadera silvestre, se prepararon de acuerdo con los métodos antes mencionados. La actividad anti-angiogénesis del BWR se examinó. La angiogénesis se indujo en las membranas corioalantóicas de huevos de gallinas, colocando un disco de 2 mm de metilcelulosa que contiene 10 mcg de heparina, sobre las membranas corioalantóicas de huevos de gallina de 11 días de edad. Dosis de 200, 100 y 50 mcg del BWR se agregaron concomitantemente al disco que contiene heparina en los tres conjuntos de 6 huevos cada uno. Estos 6 huevos sirvieron como controles. Después de 4 días, se creó una ventana grande sobre las membranas corioalantóicas, y los números de los nuevos vasos sanguíneos en cada huevo se contaron. Se obtuvo el porcentaje de inhibición en la angiogénesis, de acuerdo con la siguiente ecuación: Inhibición de la angiogénesis (%) = (1 - número promedio de nuevos vasos sanguíneos del grupo de prueba / número promedio de nuevos vasos sanguíneos del grupo de control) x 100.

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente Tabla. Se puede ver que la angiogénesis, o la inducción de nuevos vasos sanguíneos fue inhibida significantemente por la administración del BWR, en una manera dependiente de la dosis.

Tabla 1 Inhibición de la angiogénesis EJEMPLO 5 Actividad antitumor del BWR Los efectos antitumor del BWR, preparado como se describió antes, se examinaron. Diez ratones Kun Ming, de género mixto, de 8 semanas de edad, por grupo se usaron como los animales de prueba. Células de fibrosarcoma S-180 se transplantaron subcutáneamente en la región inguinal izquierda. Diariamente, durante 14 días, el BWR se inyectó subcutáneamente en la región inguinal derecha. Al 15 días después del transplante, el tumor se extirpó y se pesó. Una inhibición en por ciento en el crecimiento del tumor se obtuvo de acuerdo con la siguiente ecuación: Inhibición del crecimiento del tumor (%) = (1 - peso promedio del tumor del grupo de prueba / peso promedio del tumor del grupo de control) x 100.

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente Tabla 2. Se ve que el crecimiento del tumor fue inhibido significantemente por la administración del BWR.

Tabla 2 EJEMPLO 6 Efectos antitumor del BWP Adicionalmente, se examinaron los efectos antitumor del BWP. Diez ratones Kun Ming, de género mixto, de 8 semanas de edad, por grupo, se usaron como los animales de prueba. Las células S-180 se transplantaron subcutáneamente a la región inguinal izquierda. Diariamente, durante 14 días, el BWP se inyectó subcutáneamente en la región inguinal derecha. En el día 15 después del transplante, el tumor se extirpó y se pesó. Una inhibición en por ciento en el crecimiento del tumor se obtuvo de acuerdo con la siguiente ecuación: Inhibición del crecimiento del tumor (%) = (1 - peso promedio del tumor del grupo de prueba / peso promedio del tumor del grupo de control) x 100.

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla 3. Se ve que el crecimiento del tumor fue inhibido significantemente por la administración del BWP.

Tabla 3 EJEMPLO 7 Efectos antitumor ulteriores del BWP Los efectos antitumor del BWP se examinaron ulteriormente. Diez ratones, de género mixto, CS7, de 6 semanas de edad, por grupo, se usaron como los animales de prueba. Células del carcinoma del pulmón LLC Lewis, se transplantaron subcutáneamente en la región inguinal izquierda. Diariamente, durante 21 días, se inyectó subcutáneamente el BWP en la región inguinal izquierda. En B«IH^-l>-a HMMiÁH.H-. el día 22, después del transplante, el tumor se extirpó y se pesó. La inhibición en por ciento en el crecimiento del tumor, se obtuvo, de acuerdo con la siguiente ecuación: 5 Inhibición del crecimiento del tumor (%) = (1 - peso promedio del tumor del grupo de prueba / peso promedio del tumor del grupo de control) x 100 Los resultados obtenidos se muestran en la 10 siguiente Tabla 4. Se verá que el crecimiento del tumor se inhibió significantemente por la administración del BWP.

Tabla 4 15 EJEMPLO 8 Efectos ulteriores antitumor del BWR Los efectos antitumores del BWR se examinaron 20 ulteriormente. Diez ratones Kun Ming, de género mixto, de 6 ^jjgfó^^j^ semanas de edad, por grupo, se usaron como los animales de prueba. Células S-180 se transplantaron subcutáneamente en la región inguinal izquierda. Diariamente, durante 14 días, El BWP se inyectó intraperitonealmente. En el día 15 después del transplante, el tumor se extirpó y se pesó. La inhibición en por ciento en el crecimiento del tumor se obtuvo, de acuerdo con la siguiente ecuación: Inhibición del crecimiento del tumor (%) = (1 - peso promedio del tumor del grupo de prueba / peso promedio del tumor del grupo de control) x 100.

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente Tabla 5. Se verá que el crecimiento del tumor se inhibió significantemente por la administración del BWR.

Tabla 5 Los tumores de este estudio se incrustaron en parafina, se tiñeron, y se examinaron microscópicamente. Se encontró que los tumores extirpados del grupo tratado contenían números grandes de linfocitos y monocitos, y solamente el 10% del tejido del tumor. El peso del tejido del tumor en los grupos tratados fue, por lo tanto, sólo del 10% de aquél registrado, o de 0.08 gramos, más bien que 0.8 gramos. Por consiguiente, la inhibición real fue del 98.8%. Estos resultados también demuestran que el BWR contiene una cualidad que aumenta la respuesta inmunológica al tejido del tumor . 10 EJEMPLO 9 Efecto del BWR y el BWP en el crecimiento de linfocitos humanos Los efectos del BWR y el BWP en el crecimiento de 15 linfocitos humanos en cultivos, se examinaron. Los linfocitos humanos se recogieron usando la venipunctura y en seguida se aislaron por el uso de un gradiente de densidad centrifugado. Luego se incubaron en un medio de cultivo comercial de linfocitos (AIM V, que contiene interleucina 2 20 y 2-mercaptoetanol) en una atmósfera que contiene el 95% de aire, 5% de dióxido de carbono, a 37°C, durante 3 días. Los linfocitos luego se contaron usando un citómetro de flujo Coulter Apics XL. Un aumento en el porcentaje del crecimiento de linfocitos se obtuvo, de acuerdo con la 25 siguiente ecuación: gg¡^¡ágj^M^rtrt^^^^^^^^^^^*^É-^^*iii^*__ÉÉ¡ .^^»^^^_— • .. iíf-,- Aumento del crecimiento de linfocitos (%) = (número promedio de linfocitos del grupo de prueba / número promedio de linfocitos del grupo de control x 100) . 100.

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente Tabla 6. Se verá que el BWR y el BWP indujeron la proliferación de linfocitos en una manera dependiente de la dosis . 10 Tabla 6 EJEMPLO 10 15 Efectos del BWR y BWP en la actividad fagocítica humana Se examinaron los efectos del BWR y el BWP en la actividad de fagocitos humana. Dos muestras de un recubrimiento de piel se prepararon por centrifugar tubos que contienen sangre humana anti -coagulada de dos sujetos. 20 Las muestras luego se dividieron en dos. Al primer ^|^¿ ^ recubrimiento de piel de cada sujeto, 2 microgramos de BWR y BWP se agregaron. Un recubrimiento de piel de cada sujeto sirvió como control . Todas las muestras se incubaron durante 5 horas. Luego, 30 miligramos de levadura de panadería 5 rehidratada se agregaron a todas las muestras. Después de una hora, una solución de carga 2x del tinte de naranja de acridina se agregó a cada muestra. Una parte alícuota de cada muestra se colocó en un portaobjetos de microscopio. El porcentaje de la levadura de panadería intracelular que 10 contiene fagocitos de cada muestra, se registró. Los resultados revelaron un aumento promedio del 85% en el porcentaje de la levadura de panadería intracelular, que contiene fagocitos en las muestras tratadas en comparación de los controles. Esto explica otro 15 mecanismo por el cual el BWE y el VWP estimulan el sistema inmunológico . ^^^¡ ^^^^^^^^^^^^^^^—^iMMi^r , iilH-M

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica para tratar el cáncer, que inhibe el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, y/o aumenta la función inmunológica en un 5 mamífero, dicha composición comprende: una cantidad efectiva de un extracto de Convolvulus arvensis desde el cual se han removido los componentes de peso molecular menores de aproximadamente 500 Daltons, y un vehículo aceptable farmacéuticamente . 10
2. 2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en que los componentes de peso molecular menor de aproximadamente 1000 Daltons, se han removido.
3. 3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en que los componentes de peso molecular 15 menor de aproximadamente 3000 Daltons se han removido.
4. 4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en que los componentes de peso molecular menor de aproximadamente 5000 Daltons se han removido.
5. 5. La composición farmacéutica de la 20 reivindicación 4, en que los componentes de peso molecular menor de aproximadamente 10,000 Daltons se han removido.
6. 6. Un método para preparar extractos, no tóxicos, de Convolvulus arvensis, que consiste de: remover los componentes con un peso molecular menor de aproximadamente 500 Daltons.
7. 7. El método de la reivindicación 6, en que los componentes con un peso molecular menor de aproximadamente 5 1000 Daltons se remueven.
8. 8. El método de la reivindicación 7, en que los componentes con un peso molecular menor de aproximadamente 3000 Daltons se remueven.
9. 9. El método de la reivindicación 8, en que los 10 componentes con un peso molecular menor de aproximadamente 5000 Daltons se remueven.
10. 10. El método de la reivindicación 9, en que los componentes con un peso molecular menor de aproximadamente 10,000 Daltons se remueven. 15
11. 11. El método de la reivindicación 6, en que dichos componentes se remueven usando un filtro del peso molecular.
12. 12. El método de la reivindicación 6, en que dichos componentes se remueven por precipitación con el 20 sulfato de amonio.
13. 13. El empleo de la composición de la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
14. 14. El empleo de la composición de la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para disminuir o detener el crecimiento de los vasos sanguíneos.
15. 15. El empleo de la composición de la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para aumentar la función inmunológica en un mamífero.
16. 16. El empleo de la reivindicación 15, en que la función inmunológica se selecciona del grupo que consta del crecimiento de linfocitos y la actividad de los fagocitos.