KR900002671B1

KR900002671B1 - 종양면역 증강효과가 있는 단백다당체(리오필란 a)

Info

Publication number: KR900002671B1
Application number: KR1019870010538A
Authority: KR
Inventors: 김병각
Original assignee: 김병각
Priority date: 1987-09-23
Filing date: 1987-09-23
Publication date: 1990-04-23
Also published as: KR890004722A

Abstract

내용 없음.

Description

종양면역 증강효과가 있는 단백다당체(리오필란 A)

제 1 도는 세파로스 4B상에서 리오필럼 데카스테스의 추출물 중 리오필란 A의 분리를 나타내며,

제 2 도는 리오필란 A의 IR 스펙트럼을 나타내며,

제 3 도는 L5178 Y세포에 대한 리오필란 A의 직접적인 효과를 나타내는 그라프이고,

제 4 도는 ICR계 마우스의 복강세포수에 미치는 리오필란 A의 효과를 나타내는 그라프이다.

본 발명은 탁월한 종양면역 증강효과가 있는 신규의 단백다당체(蛋白多糖體)(이하 "리오필란 A"라 한다)에 관한 것이다.

특히 본 발명은 버섯의 일종인 리오필럼 데카스테스(Lyophyllum decastes)로부터 분리된 신규의 리오필란 A의 종양면역 증강효과 및 그 면역학적 작용기전을 밝혀, 신규의 종양면역 증강제를 제공하는데 있다.

담자균류에서 발견된 렌티난(lentinan), 쉬조필란(schizophyllan), 효모의 세포벽 지모산(zymosan)과 효모의 글루칸, 세균제제인 BCG 및 코리네 박테리움 팔붐(Corynebacterium parvum), 방선균류의 하나인 노카르디아 루브라(Nocardia rubra)의 세포벽성분등이 강력한 항암작용을 갖고 있다고 보고 되고 있다. 그러나 이들중에서도 세균제제인 BCG나 프로인트 전보조액(Freund's complete adjuvant)과 같은 면역보조제가 생체내에서 종종 복잡한 부작용을 나타내기 때문에 종양면역을 증가시키기 위한 보조제로 사용할 때에는 지장이 있다고 밝혀지고 있다. [Schwarzenberg, L., Simmler, M. C. and Pico, J. L. : Cancer Immunol. Immunotherapy 1, 69 (1976)]. 반면에 담자균류에서 분리한 다당체 성분은 숙주에 대해 독작용을 수반하지 않으면서 종양억제작용을 나타내는 것으로 발표되었다. [Sugiura, M. and Ito, H. Tokyo Yakka Daigaku Kenkyu Nempo 27, 722(1977)].

담자균류의 항암성분에 대한 연구는 칼바티아 기간테아(Calvatia gigantea)로부터 칼바신이 분리된 후 활발히 진행되어, 렌티누스 에도데스(Lentinus edodes)로부터의 다당체인 렌티난, 단백다당체(蛋白多糖體)인 KS-2, 코리오루스 베르시콜로(Coriolus versicolor)로부터의 단백다당체인 PS-K등이 보고 되었다.

최근에는 보다 우수한 종양억제 효과가 있는 성분을 분리하려는 연구는 물론이고, 그 종양억제 작용의 기전을 구명하려는 연구가 진행되고 있다. 이러한 면역 증강제의 작용기전을 밝히기 위해 체액성면역 및 세포성면역에 대한 영향, 대식세포(macrophage)에 대한 영향, 보체계에 대한 영향등에 대한 연구가 수행되고 있다. 렌티난, 지모산등이 흉선을 절제한 신생마우스에 대해서는 육종 180에 대한 종양억제작용을 전혀 나타내지 않았으므로 이의 종양억제효과에는 흉선이 뚜렷한 역할을 함이 입증되었다. 또한 렌티난은 생체내에서 대식세포를 활성화시켜 암세포에 대해 독성작용을 나타냄이 보고되었으며, 렌티난 투여시 혈청단백질 성분의 독특한 증가도 보고 되었다.

한국산 담자균류의 항암성분에 대한 연구는, 구름버섯, 표고버섯, 느타리버섯등의 자실체에서 추출한 고분자물질이 육종(sarcoma) 180에 대해 강력한 종양억제작용이 있음을 보고함으로써 시작되어, 노랑다발자실체, 덕다리버섯, 뽕나무버섯, 애기졸각버섯 및 리오필럼 데카스테스의 배양균사의 항종양 성분등이 보고된 바 있다. 그러나 이러한 항암성분의 작용기전에 대해서는 자세히 밝혀진 바가 없다.

본 발명에서는 리오필럼 데카스테스의 배양균사로부터 분리된, 신규의 단백다당체 리오필란 A의 면역학적 작용기전을 구명하여 그 항종양 작용을 확인하였다. 이를 위하여 본 발명자들은, 면역관련 장기중량의 변화, 리오필란 A의 암세포에 대한 직접작용, 마우스의 용혈반형성세포수에 미치는 영향, 마우스의 복강세포군에 미치는 영향, 육종 180의 생체내 성장에 미치는 복강세포의 영향 및 활성화된 세포독성 대식세포의 유도등을 측정하였으며, 그 결과 리오필란 A가 종양에 대한 면역효과를 증강시킴을 확인하였다.

이하에 실시예 및 실험예로 본 발명을 설명한다.

[실시예]

리오필란 A의 분리

1) 균주 : 리오필럼 데카스테스(Lyophyllum decastes(Fr.) Singer)균주는 농업진흥청 농업기술연구소로부터 분양받았다.

2) 배지 : 감자 덱스트로스 한천(PDA)경사배지 : 박토 감자 덱스트로스 한천(Difco Lab., U.S.A.) 39g을 증류수에 녹여 1ℓ로 하고, 121℃에서 20분간 고압멸균한 후, 경사배지로 만들었다.

액내배양용 배지Ⅰ: 포도당 50g, 펩톤 10g, 효모 추출물 10g, KH₂PO₄0.87g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, CaCl₂0.3g, FeSO₄·7H₂0 10mg, MnCl₂·4H₂O 7mg, ZnSO₄·7H₂O 4mg 및 CuSO₄·5H₂O 1mg에 증류수를 가해 1ℓ로 하였다. 이의 pH를 5.0으로 조정하여 121℃, 20분간 고압증기 멸균하였다.

액내 배양용 배치 Ⅱ : 액내배양용 배지 Ⅰ에서 효모추출물대신 옥수수 침적액(corn steep liquor)30㎖를 사용하여 액내배양용 배지 Ⅰ과 마찬가지로 제조하였다.

3) 배양 : 분양받은 균주를 PDA 경사배지에 이식하여 26±1℃에서 7일간 성장시킨 후 발육된 균사를 무균적으로 분리하여 액내배양용 배지Ⅰ 100㎖와 15초간 웨어링 미세분쇄기(Waring microblender)로 분쇄하였다. 이를 500㎖용 삼각플라스크에 옮기고 26±1℃에서 180rpm으로 균사체가 직경 2-5㎜의 성숙한 균괴를 이룰때까지 10-15일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균괴를 미세분쇄기로 15초간 분쇄한 후, 액내배양용 배지Ⅰ 100㎖가 든 500㎖용 삼각플라스크에 20V/V %씩 접종하고 상기 조건과 동일한 조건으로 배양균사가 플라스크내에서 성숙할 때까지 7-10일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균사배양물을 다시 15초간 분쇄하여 종균으로 하고, 액내 배양용 배지Ⅱ 100㎖를 500㎖용 삼각 플라스크내에 넣고 종균을 10V/V %농도로 접종하였다. 26±1℃의 온도에서 오비탈 진탕배양기(회전반경 1인치, Gallenkamp)를 사용하여 180회전/분으로 9일간 진탕 배양하였다.

4) 단백다당류의 추출 및 분리

상기 배양물을 흡인 여과하여 배양여액과 균사를 분리한 후 균사를 증류수로 3회 세척한 후, 이 배양균사를 증류수와 함께 미세 분쇄기로 5분간 균질화하고 121℃, 2기압에서 30분간 3회 반복 추출하였다. 감압여과하여 추출액을 분리하고 감압농축하였다. 여기에 3배량의 95% 에탄올을 가하고, 4℃에서 24시간 방치하여 침전을 완결시켰다. 완결된 침전은 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 분리한 후, 증류수에 용해시키고 비스킹 튜브(visking tube)에 넣어 4℃ 증류수로 7일간 투석하였다. 투석 후 원심분리하여 상징액과 불용성 침전을 분리한 다음, 상징액은 농축 및 동결건조하여 담갈색 건조 분말을 분리하였다.

5) 단백다당류인 리오필란 A의 정제

상기의 건조분말을 0.01M 인산 나트륨 완충액(pH 7.2)에 용해시킨 후 세파로스 4B(pharmacia Co.)가 충진된 칼람(2.4×80㎝)에 적용시켰다. 0.01M 인산나트륨 완충액(0.3M 염화나트륨 포함, pH 7.2)을 사용하여 15㎖/시간의 속도로 용출시켰으며, 20분 간격으로 분획을 모아 각 분획 0.1㎖를 증류수로 10배 희석한 후 안트론시약과 반응시켜 625nm에서의 흡광도를 측정하여 다당체를 확인하였다. 이중 안트론반응 양성을 나타낸 피이크에 속한 용출분획 35㎖부터 165㎖까지의 130㎖를 얻었다. 이를 비스킹 튜브에 넣어 4℃에서 증류수로 7일간 투석하고, 동결건조하여 건조분말인 리오필란 A를 얻었다. 이의 화학적 분석을 위해 다당체 함량측정(Herbert의 방법, 안트론 발색 625nm UV 측정), 단당류분석(Mitruka의 방법), 단백질 함량측정(Lowry의 방법), 아미노산 분석(아미노산 자동분석기[Hitachi KLA-89] 사용) 및 IR분석등을 시행하였고, 이 결과를 표 1 내지 3 및 제 1 도, 제 2 에 나타내었다.

[표 1] 리오필란 A의 다당류 및 단백질 총함량

[표 2] 리오필란 A의 다당류부분중 단당류의 함량

[표 3] 리오필란 A의 단백질부분 중 총 아미노산 하량

[실험예 1]

면역관련 장기중량의 변화

ICR계 웅성 마우스를 대조군(N), 시료투여군(L), 육종 180 세포를 오른쪽 옆구리에 피하이식한 군(T) 및 육종 180 세포를 옆구리에 피하이식 후 3일부터 시료를 투여한 군(TL)등으로 분류하여 실험하였다. L군과 TL군에는 리오필란 A 40mg/kg을 5일간 연속으로 복강내 투여하였고, N군과 T군에는 시료대신 생리식염수를 투여하였다. 시료투여 후 7일이 지난 다음 실험동물의 중량을 측정한 후 치사시켜 간, 비장, 흉선을 적출하여 중량을 측정하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 체중의 변화는 없었으나, 간, 비장 및 흉선의 중량은 특히 TL군에 있어서 상당한 증가를 나타내었다. 이 결과를 표 4 내지 7에 나타내었다.

[표 4] ICR마우스의 체중에 미치는 리오필란 A의 영향(평균 ±표준편차)

[표 5] ICR마우스의 면역기관에 미치는 리오필란 A의 영향(평균 ±표준편차)

p는 유의성이고,^*; p〈0.001,^**; p〈0.01,^***; p〈0.05,⁼;유의성없음.

[실험예 2]

암세포에 대한 직접적 작용

1) 육종 180 세포에 대한 리오필란 A의 직접적 효과

복수형 육종 180 세포(2×10⁵세포/㎖)를 리오필란 A 각각 0.08㎎/㎖, 0.16㎎/㎖ 및 0.40㎎/㎖가 포함된 로스웰 파크 기념기관 배지번호 1640(RPMI 1640, 기브코연구소)배지에서 배양하였다. 이 배지에는 20% 태생소혈청(FBS, Irvine Scientific)을 미리 첨가하였다. 배양 후 0.2% 트리판 블루액으로 염색하여, 배양된 세포중의 생존세포수를 혈구계(hemacytometer)로 측정하였다. 그 결과, 대조군 및 실험군의 생육도는 유사하였다.

[표 6] 리오필란 A를 함유하는 배양배지중에서 육종-180세포의 생육도

2)L5178 Y세포에 대한 리오필란 A의 직접적 효과

L5178 Y세포는 일본국 동경대학 응용미생물연구소의 다나까 신오(田中信男)교수로부터 분양 받았다.

L5178 Y세포(1×10⁵세포/㎖)를 리오필란 A(0.08, 0.16, 0.40㎎/㎖)가 포함된 RPMI 1640배지(10% FBS포함)에서 배양하였다. 5% CO₂가 유지된 37℃ 배양기에서 배양하고, 24, 48, 72시간에 각각 0.2% 트리판 블루염색하여 살아있는 세포의 수를 혈구계로 측정하였다. 그 결과 대조군과 유의성있는 차이가 없었으며, 이를 제 3 도에 나타내었다. 이들로부터 리오필란 A는 종양세포에 대한 직접적인 세포 파괴효과 또는 세포정지효과를 나타내지 않음을 알 수 있었다.

[실험예 3]

마우스의 용혈반 형성세포수에 미치는 영향

1) 실험 동물로는 웅성 ICR계 마우스(체중 20-25g)을 한군을 5마리로 하여 사용하였다. 대조군에는 생리식염수를, 처치군에는 리오필란 A 40㎎/㎏씩을 연속적으로 5일동안 복강내에 주사하였다. 최종시료투여일로부터 7일후에 면양적혈구 1×10⁷세포를 복강내 주사하여 면역시켰다. 5일후, 마우스를 치사시켜 비장을 적출하고, 적출한 비장을 빙냉의 평형 염용액과 함께 분쇄하여 비장세포를 유리시켰다. 이를 400×g에서 5분간 원심분리하여, 상징액을 제거하고 37℃의 0.83% 염화암모늄용액에 부유시켜 3분간 방치하였다. 이에 의해 적혈구가 용해되면, 다시 원심분리하여 빙냉의 평형염 용액에 부유시킨 후, 적혈구제거 비장세포수를 혈구계로 측정하였다.

2) 알세베르용액[포도당 20.5g, 염화나트륨 4.2g, 구연산나트륨 8.0g을, 11의 증류수에 용해시킨 후 밀리포아여과기(0.45μm)로 여과하였다.]에 현탁된 면양적혈구를 생리식염수로 4회 세척하고(400×g, 5분), 마지막 세척 후 20v/v %가 되도록 생리식염수에 부유시켰다. 20v/v % 면양적혈구 250μ1와 보체 [국립보건원에서 역가를 조정한 기니아 픽 보체] 500μ1를 혼합한 후, 빙욕상에서 30분 방치하여 이를 보체-면양적혈구로 하였다.

3) 2)의 보체-면양적혈구 150μ1와 1)의 비장세포 부유액 650μ1를 잘 혼합하여 마이크로챔버(micro-chamber, 쿠닝햄 챔버, 타까하시 기켄 글라스 76×26㎜)에 100μ1씩 주입하였다. 이 상자를 왁스-바셀린(1:1)으로 밀봉하여 37℃에서 1시간 배양 후 형성된 용혈반 형성세포(plaque-forming cells, PFC)갯수를 측정하였다. 100만개의 비장세포중 용혈반 형성세포수(PFC/10⁶비장세포) 및 비장세포전체중의 용혈반 형성세포수(PFC/비장)를 다음식에 따라 계산하였다.

단,

(배양혼합액중의 비장세포 부유액의 비율), N : 마이크로 챔버내에서 관찰된 용혈반의 수, C:1㎖ 비장세포 현탁액중의 비장세포계산치, Vm: 마이크로 챔버에 채워진 배양혼합물의 용량(㎖), Vs: 비장세포 현탁액의 총용량(㎖) 그 결과 리오필란 A 투여군의 PFC는 대조군에 비해 14배 증가되었으며, 이를 표 7에 나타내었다.

[표 7]

면양적혈구로 면역화된 ICR 마우스 비장내의 용혈반 형성세포에 미치는 리오필란 A의 효과(평균 ±표준편차, 한군 5마리)]

[실험예 4]

마우스의 복강 세포군에 미치는 영향

1) 복강세포의 측정

18-20g의 웅성 ICR계 마우스에 리오필란 A 50㎎/㎏을 1회 복강내 투여하였다. 약물투여 후 1일, 3일, 5일, 7일에 실험동물을 치사시키고, 복강을 빙냉의 평형염용액으로 세척하여 복강세포를 얻었다. 혈구계로 총복강세포수를 측정하였다. 그 결과, 처치군은 특히 1일에 현저한 세포증가를 나타내었으나, 3, 5, 7일이 되면서 점차 감소하였다. 이를 표 8 및 제 4 도에 나타내었다.

[표 8] 복강세포수에 미치는 리오필란 A의 영향(평균 ±표준편차)

2) 임파구 및 다형핵 백혈구의 측정

1)의 복강세포액을 4℃, 400×g에서 10분간 원심분리하여 세포 침전물을 얻고, 이를 0.2㎖ 정도의 평형염용액에 현탁시켜 슬라이드 글라스상에 도말, 건조시켰다. 건조된 도말표본을 100% 메탄올로 5분간 고정한 후, 김사(Giemsa)염색액을 가하여 실온에서 30분간 염색하였다. 염색 후 과잉의 염색액을 따라내고 95% 에탄올로 세척액이 맑아질 때까지 탈색하였다. 시더(cedar)유를 봉입용액으로 하여 1000배로 관찰하였다. 세포모양이 둥글고 크기가 고르며, 전체가 진한 청색으로 염색된 것을 임파구로, 진하게 염색된 여러개로 보이는 핵 또는 도너츠모양으로 생긴 핵을 지닌 세포를 다형핵백혈구로 보았다. 그 결과 임파구수에는 별다른 변화가 없었고, 다형핵백혈구의 경우는 대조군에서는 관찰되지 않았으며, 투여군의 경우, 투여 후 1일에 1.9×10⁶세포/마우스임이 관찰되었으나, 그 후에는 관찰되지 않았다. 이를 제 4 도에 나타내었다.

3) 대식세포의 측정

2)의 방법으로 자연건조된 복강세포 도말표본을 빙욕상에서 빙냉아세톤으로 5분간 고정시킨 후, 대식세포의 특징적 효소인 비특이성에스테라아제(NSE)를 확인하는 방법으로 NSE염색을 시행하였다. 즉 고정 후 상수로 세척하고 NSE 염색용액에 세포도말면을 하향하여 넣고 37℃에서 30분간 염색하였다.

상수로 세척한 후 1% 말라키트 그린으로 역염색(counter staining)하고 다시 세척한 다음, 글리세롤을 봉입용액으로 하여 관찰하였다. 말라키트 그린에 의해 염색된 반달말굽모양의 핵을 가지며, 세포질내에 NSE 염색에 의해 염색된 적색입자를 지닌 세포를 대식세포로 하였다. 그 결과 투여군에서 대조군보다 투여 1일 후에 대식세포의 증가가 보였으나, 그 후 점점 감소하였고, 이를 제 4 도에 나타내었다.

[실험예 5]

육종 180의 생체내 성장에 미치는 복강세포의 영향

리오필란 A 투여 후 복강내 세포를 분리하여 육종180과 혼합하여 육종 180 세포의 성장에 대한 복강세포의 영향을 측정하였다. 20-23g 웅성 ICR계 마우스를 한군 10마리로 하여 실험예 1과 마찬가지로 N,L,T,TL군으로 분류,처리하였다.

L군은 리오필란 A 40㎎/㎏을 연속적으로 5회 복강내 투여하고 시료투여 후 1일에 복강세포를 취한 것을 L-1군, 7일에 취한것을 L-7군으로 하였다. TL 또한 실험예 1의 방법으로 처리한 후 1일에 취한 복강세포군을 TL-1군, 7일의 것을 TL-7군으로 하였다. T군도 TL군과 같은 시기에 복강세포를 취했다. 각 마우스는 경동맥을 절제하여 출혈시켜서 복강세포에 적혈구가 혼합되는 것을 막았으며, 빙냉의 생리식염수로 복강세포액을 취해 세척하였다.

상기와 같이 제조한 각군의 복강세포 8×10⁶개를 7일된 복수형 육종 180세포 1×10⁶개와 상온에서 혼합하여 20-25g 되는 ICR계 웅성 마우스 옆구리에 피하이식하였다. 각 군 5마리의 동물을 사용하였으며, 이식 후 30일이 지난 다음 치사시켜 유발된 고형암을 적출, 그 중량을 측정하였다. 대조군은 육종180(1×10⁶세포)만을 이식한 것으로 하였다.

그 결과 담암동물에 리오필란 A를 투여하여 7일 후에 분리해낸 복강세포와 육종 180 세포와 혼합하여 실험한 TL-7군의 종양무게는 대조군의 3%밖에 되지 않아 높은 종양저지 효과가 있음을 알 수 있었다. TL-1군도 대조군의 41%로서 유의성 있는 종양저지효과가 있었다. L-7군은 대조군의 58%로서 유의성있는 종양억제효과가 있었으나, L-1 및 T-1군은 각각 대조군의 70%, 86%였으나, 유의성은 없었다. 이를 표 9에 나타내었다.

[표 9] 마우스 복강세포와 혼합한 육종180의 성장저해효과(평균±표준편차)

[실험예 6]

활성화된 세포독성 대식세포의 유도

1) 대식세포 분리용 플라스크의 제조

HeLa세포는 일본국립 암센타 연구소 닛따 와오(新田和男)박사로부터 분양받았고, 배양용 플라스크는 25㎠/50㎖ 앵글드 넥(angled neck (Nunc) 플라스크)를 사용하였다. 5×10⁵HeLa세포는 10% 태생소혈청(FBS)을 첨가한 이글(Eagle)의 최소필수배지(MEM)[MEM 분말 9.4g을 2차 증류수 1ℓ에 녹인 후 중탄산 나트륨을 첨가하여 pH를 7.1-7.4로 조절한 다음, 가나마이신 50㎎, 글루타민 0.292g을 가해 잘 용해시키고 밀리포아 여과(0.45μm)하였다.]에서 37℃ 7일간 배양하였다. 7일 후 세포가 충분히 성장하면 상징액은 버리고 인산염완충액 NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄1.15g, KH₂PO₄0.2g을 2차 증류수 1C에 용해시켰다. (-)는 Ca²⁺와 Mg²⁺를 포함하지 않는 것이다.]으로 세척한 다음 0.02% EDTA를 가해 37℃에서 10분간 배양하였다. 배양플라스크의 기벽에 부착되었던 세포가 기벽으로부터 분리된다. 플라스크내의 세포는 모두 제거하고, 0.02% EDTA용액으로 세척한 후, 인산염완충액(-)으로 3회 세척하였다. 이 플라스크는 기벽에 일부 단백질, 효소 및 HeLa세포의 대사산물등이 부착되어 있다.

2) 복강세포의 제조

20-25g 웅성 ICR계 마우스를 사용하여 실험예 5와 마찬가지로 N,L-1, L-7,T-1, T-7, TL-1 및 TL-7의 복강세포를 분리하였다. 헤파린 2단위/㎖를 가한 빙냉의 행크 평형염용액 [HBSS, HBSS 시약용 분말 9.8g을 2차 증류수에 녹여 1ℓ가 되도록 한 후 중탄산 나트륨 0.2-0.35g을 가해 pH를 7.4로 조정하였다. 가나마이신 50㎎(50μg/㎖)을 가하고 용해시킨 후 밀리포아 여과(0.45μm)하였다.

5-6㎖를 복강내에 주사하였다. 복부의 피부를 잘 제거하고, 주사기로 복강세포를 취하였다.

3) 대식세포의 제조

상기 복강세포를 4℃, 400×g으로 10분 원심분리하여 행크평형염용액으로 세척하고 원심분리 후 10%의 태생소혈청을 가한 RPMI 1640세포 배양용 배지 [이 배지 10.4g을 2차 증류수 1ℓ에 녹이고, 2.0g 중탄산나트륨을 가한 후 1N HCl을 사용하여 pH를 6.9-7.2로 조절하였다. 가나마이신 50㎎을 가하고, 밀리포아 여과하였다.]에 부유시켰다. 1)에서 제조한 플라스크에 2)의 복강세포를 가하였다. 37℃에서 1시간 배양한 후 상징액을 제거하고 행크평형염용액으로 3회 세척하였다.RPMI 1640 2.4㎖와 10mM EDTA 0.5㎖를 가하고 37℃에서 45분간 배양하였다.

플라스크내의 대식세포를 모두취해 원심분리하고 행크평형염용액으로 2회 세척한 후, RPMI 1640에 부유시켰다.

4) 표적세포

연속적으로 10%의 태생소혈청을 가한 RPMI1640 배치에서 배양하고 있는 L5178 Y세포를 사용하였다.

5) 대식세포의 세포독성실험

표적 L5178 Y세포 5×10⁴세포와 10배, 20배(주효체(effector)/표적)의 대식세포를 혼합하여 [팔콘 #2054 시험관사용]37℃, 5% CO₂기체 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 400×g, 10분동안 원심분리하여 상징액을 제거하고 RPMI 1640(10%태생소혈청포함)을 가하였다.

잘 혼합하여 [메틸-3H] 티미딘(톡이활성, 20.0μCi/mmol) 1μCi/㎖씩을 가하고 37℃에서 1-1.5시간 배양하여 살아있는 세포의 DNA에 표지시켰다. 0.1㎖를 여과지 디스크에 흡수시킨 후, 살아있는 세포의 융합된 3_H-TdR을 빙냉 5% TCA(트리카르복실산)로, 1회에 15분씩 3회 흡수시켰다. 에탄올로 지방을 제거하고 에탄올:에텔(1:1)용액으로 TCA를 제거하였다. 이를 건조시킨 후 카운팅바이알(counting vial)에 넣고, 5㎖의 카운팅 칵테일을 가한 후 리퀴드 신틸레이션 스팩트로포토미터[Packard, 모델 3385]로 방사능(cpm)을 측정하였다. 측정된 cpm의 평균치를 구해 세포용해 활성도(g)를 구하였다.

이 결과를 표 10에 나타내었다.

[표 10] 리오필란 A에 의해 유발된 대식세포의 종양세포독성(평균±표준편차)

이상의 실험예들은 리오필란 A가 ICR계 마우스의 간과 비장의 중량을 감소시켰으며, 담암동물에서 현저히 감소한 흉선중량을 회복시켜 주었고, 생체내에서 L517B Y세포 및 육종 180 세포에 대한 직접적인 세포독성을 보이지 않음을 입증하고 있다. 또한 리오필란 A는 면양적혈구에 대한 용혈반 형성세포수와 복강세포수를 증가시켰다. 이들 결과로부터, 복강세포와 육종 180 세포를 혼합하여 생체내 실험을 한 결과, 리오필란 A가 강력한 종양억제효과를 나타내고가시켰다. 이들 결과로부터, 복강세포와 육종 180 세포를 혼합하여 생체내 실험을 한 결과, 리오필란 A가 강력한 종양억제효과를 나타내고 대식세포의 세포독성활성도를 증가시켜줌을 알수 있었다.

Claims

리오필럼 데카스테스를 배양하고 이로부터 분리된, 당성분으로서 글로코스, 푸코스, 크실로스, 만노스 및 갈락토스를 함유하고 단백성분으로서 트립토판, 리진, 히스티딘, 아르기닌,아스파라김, 트레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 글라이신, 알라닌, 바린, 메치오닌, 이소로이신, 로이신, 타이로신, 페닐알라닌을 함유하고, 종양면역증강효과를 가지는 단백다당체(리오필란 A).