CH669386A5 - - Google Patents
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Description
DESCRIPTION
La présente invention concerne des acylglycannes extraits de Klebsiella, leur procédé d'obtention et les compositions les renfermant.
Un certain nombre de brevets français ont décrit des glycoprotéi-nes extraites de corps microbiens lysés de Klebsiella et/ou leur procédé de préparation. Il en est ainsi, par exemple, des brevets français 2.043.475, 2.088.112, 2.171.907, 2.462.477, 2.490.495, 2.490.496 et 2.540.136.
Le présent brevet concerne de nouveaux extraits bactériens, et a ainsi pour objet des acylglycannes extraits de Klebsiella, caractérisés en ce qu'ils sont essentiellement constitués d'environ 80% d'osés neutres et 20% de lipides, renferment moins de 2% de protéines et ont un poids moléculaire d'environ 12 500.
On désigne par oses neutres des oses qui ne comportent pas de reste basique ou acide, notamment des hexoses neutres tels que le glucose, le galactose ou le mannose.
Ils sont dosés par la méthode de Tillmans et Philippi («Biochem. Z.», 1929, 215, 36) modifiée par Rimington («Biochem. J.», 1931, 25,1062).
Les protéines sont dosées par la méthode de Lowry (« J. Biol. Chem.», 1951,193, 265-273).
Les lipides sont dosés par Chromatographie en phase vapeur après méthanolyse.
Le poids moléculaire des acylglycannes selon l'invention a été estimé par filtration sur gel hydrophile et insoluble à base de dex-trane tel que le Séphadex®, de seuil de Chromatographie égal à 50 000.
Des acylglycannes préférés sont ceux pour lesquels les oses sont présents dans les proportions relatives approximatives suivantes, pour 1 glucose: environ 4 galactoses, environ 1 mannose et environ 1 heptose. Cette détermination peut, par exemple, être effectuée par Chromatographie en phase vapeur.
Des acylglycannes plus particulièrement préférés comportent un enchaînement de galactoses liés en ß 1 ->3 d'un poids moléculaire d'environ 9000.
Les acylglycannes de l'invention peuvent être extraits de différentes espèces de Klebsiella. On retient cependant plus particulièrement ceux qui proviennent de Klebsiella pneumoniae, et tout particulièrement ceux qui proviennent de la souche portant, à l'Institut Pasteur, ou Collection nationale de Cultures de Micro-organismes, les numéros 52 145 et 1-163 et, à la National Culture Type Collection, le numéro 5055. Cette souche est depuis longtemps commercialisée et librement disponible auprès du public, notamment auprès de l'Institut Pasteur à Paris sous la référence 52145 ; cette souche a de plus été déposée par la titulaire le 25 juin 1981 sous le N° 1-163 à l'Institut Pasteur, Collection nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), 25, rue du Docteur-Roux, 75724 Paris-Cedex 15 (France).
En plus des oses et des lipides, les acylglycannes selon la présente invention sont caractérisés par la présence d'acide 2-céto 3-dés-oxyoctolosonique, de glucosamines, de phosphates d'acides a- et ß-hydroxymyristiques et d'acide palmitique.
Les acylglycannes selon la présente invention se présentent sous la forme d'une poudre blanche inodore hydrosoluble.
Comme toutes les molécules d'origine biologique, ils sont hydratés ou s'hydratent facilement; leur spectre infrarouge n'est donc pas caractéristique, les nombreux pics étant fondus entre eux. Leur point de fusion n'est pas non plus caractéristique, puisqu'il s'agit d'une carbonisation qui se fait sur une large plage de températures.
Le présent brevet a également pour objet un procédé d'obtention des acylglycannes tels que définis ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on traite un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella renfermant 30 à 45% de protéines, 30 à 40% d'osés neutres, une faible proportion d'acides uroniques, 2 à 5% d'osamines et ayant un poids moléculaire d'environ 350 000, à l'aide d'un détergent, chauffe à environ 80° C, Chromatographie sur silice branchée hydrosoluble et récupère la fraction correspondant au pic d'élution repéré par spectrométrie à 200 nm, disparaissant à 280 nm, et apparaissant à 492 nm après coloration au phénol sulfurique.
Par faible proportion d'acides uroniques, on entend moins de 6% d'acides uroniques, et de préférence moins de 4%.
Les extraits bactériens hydrosolubles de Klebsiella de départ du procédé peuvent être notamment obtenus par mise en culture de germes appartenant au genre Klebsiella, lyse des germes, séchage, délipidation par extraction à l'aide de solvants des lipides, ultrafil-tration, traitement de la solution aqueuse ainsi obtenue à l'aide d'un sel d'ammonium quaternaire, élimination du précipité, puis soit traitement à froid du surnageant à l'aide d'un alcanol de faible poids moléculaire, isolation, puis dissolution dans l'eau, dialyse et séchage du produit obtenu, remise en solution, filtration sur gel puis isolation de la première fraction éluée et séchage, soit concentration du surnageant par utilisation d'au moins un dispositif de sélection de molécules, traitement à froid du concentré à l'aide d'un alcanol et isolation du précipité obtenu.
De telles préparations ont déjà été décrites, notamment dans le brevet français N° 2.490.496 et dans la demande de brevet européen N° 0.049.182 publiée sous le N° 29.070E par Derwent Publications Farmdoc Book N° 1500 du 2 juin 1980, ainsi que dans la demande de brevet français N° 2.540.136.
C'est ainsi que le présent brevet a aussi pour objet un procédé d'obtention des acylglycannes tels que définis ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on traite à l'aide d'un détergent un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella, tel que préparé ci-dessus, chauffe à environ 80° C, Chromatographie sur silice branchée hydrophobe et récupère la fraction correspondant au troisième pic
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d'élution repéré par spectrométrie à 200 nm, disparaissant à 280 nm, et apparaissant à 492 nm après coloration au phénol sulfurique.
D'autres extraits bactériens hydrosolubles de Klebsiella de départ, convenant pour la mise en œuvre du procédé, sont par exemple obtenus par mise en culture des germes, lyse des germes par broyage, centrifugation fractionnée pour sédimenter les débris cellulaires sous une accélération d'environ 8000 g, puis les membranes sous une accélération de 20 000 à 40 000 g, séparation de l'extrait brut par centrifugation fractionnée en solution saline et dans l'eau, traitement par une base ou un hypobromite, élimination de l'excès de réactif et du résidu insoluble, traitement à l'aide d'une solution aqueuse d'acide acétique à une température de 70 à 100° C, élimination de la fraction insoluble, délipidation par extraction à l'aide de solvants des lipides, traitement à l'aide de lysozyme, séparation de la fraction de poids moléculaire d'environ 350 000 et séchage. Un exemple d'une telle préparation figure dans la demande de brevet européen N° 0089266.
Les produits doués de propriétés détergentes sont bien connus. Il s'agit, par exemple, de sels d'ammonium quaternaires, notamment des halogénures d'ammonium quaternaires tels que l'iodure de té-traéthylammonium, le chlorure de N-hexadécyl-N,N-diméthylben-zène méthanaminium, le bromure de N-hexadêcyl-2-hydroxy-N,N,N-triméthyl-l-hexadécanaminium, les halogénures de N,N,N-triméthyl-l-hexadécanaminium ou de cêtylpyridinium.
Il s'agit aussi de sulfates ou sulfonates alcalins de type ester alkyl ou alkylarylique tels que le sodium dioctyî sulfosuccinate, le sodium dodécylbenzène sulfonate, le sodium dodécyl sulfate, le sodium tétradécyl sulfate, le lithium dodécylsulfate, des polyéthylèneglycols mono (nonylphényl) éthers comme les Triton N», des polyéthylèneglycols p-isooctyl phényléthers comme les Triton X® ou des polymères de 4-(l,l,3,3-tétraméthylbutyl)phénol avec le formaldéhyde et l'oxiranne comme le Triton® A20.
Il s'agit de préférence d'un sulfate alcalin de type ester alkyl, tel que le sodium dodécyl sulfate.
Le détergent est utilisé en solution dans un solvant pharmaceuti-quement acceptable conservant au détergent ses propriétés détersi-ves, de préférence en solution dans l'eau. Selon le pouvoir détergent, il est utilisé à la concentration d'environ 1 % dans le cas de produits très détergents tels que le sodium dodécyl sulfate, ou plus concentré, par exemple 2 à 10%, dans le cas des sels d'ammonium quaternaires.
La température d'environ 80° C est conservée quelques minutes, de préférence environ 5 minutes.
Le gel de silice utilisé pour la Chromatographie est constitué de silice sur laquelle sont branchés des groupements hydrophobes, de préférence des acides gras. Les acides gras peuvent, par exemple, être des acides gras en C3 à C30, notamment en C3 à C20- On utilise de préférence le gel C8 commercialisé sous le nom Aquapore® RP300.
Le repérage de la fraction intéressante de nature glucidique et substantiellement dépourvue de protéines est réalisé, par exemple, par spectrophotométrie à 200 nm (détection des glucides et des protéines), 280 nm (détection des protéines seules), 492 nm après coloration par le phénol sulfurique (détection des sucres seuls).
L'élution est de préférence réalisée à l'aide d'un mélange acétoni-trile-solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,1% pH 1,8 utilisé en gradient. Le gradient est avantageusement constitué successivement d'un mélange acétonitrile-solution d'acide trifluoroacétique 20-80, puis 50-50. Dans ces conditions, les acylglycannes recherchés correspondent au troisième pic repéré à 200 nm lorsqu'on utilise un gel en C8. Ce pic disparaît à 280 nm et apparaît à 492 nm après coloration au phénol sulfurique.
L'isolation des acylglycannes est faite de manière classique pour des macromolécules mélangées à des petites molécules, c'est-à-dire par exemple par ultrafiltration à l'aide de membranes de seuil de rétention 5000 par exemple, par dialyse ou par Chromatographie sur gel.
Les acylglycannes peuvent ensuite être séchés, par exemple par lyophilisation, évaporation ou atomisation.
La présente invention a également pour objet les acylglycannes tels qu'obtenus par les procédés ci-dessus décrits, c'est-à-dire lorsqu'ils sont obtenus par la mise en œuvre de ces procédés ou lorsqu'ils présentent des caractéristiques physico-chimiques analogues à celles des acylglycannes obtenus par la mise en œuvre de ces procédés.
Les acylglycannes objet de la présente invention possèdent de très intéressantes propriétés pharmacologiques; ils sont doués notamment de remarquables propriétés antiallergiques et immunomo-dulatrices. Ils stimulent, en particulier, l'immunité à médiation cellulaire.
Parmi les propriétés immunomodulatrices des acylglycannes selon l'invention, on peut citer en particulier des propriétés stimulantes de la sécrétion d'Interleukine I et de Colony Stimulating Factor, ainsi que des propriétés mitogènes.
Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale.
Ces propriétés justifient l'utilisation des acylglycannes selon l'invention à titre de médicaments.
Parmi les acylglycannes objet de l'invention, on retient tout particulièrement les acylglycannes caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les acylglycannes tels qu'obtenus par les procédés de l'invention pour leur utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique curatif ou préventif du corps humain ou animal.
Les médicaments selon l'invention trouvent leur emploi, par exemple, dans le traitement ou la prévention, chez l'homme et l'animal, des maladies infectieuses causées par les bactéries ou les virus, dans le traitement des maladies à parasites, des toxi-infections, dans le traitement des infections posthospitalières et postchirurgicales, et des allergies de toutes origines.
A titre préventif, les acylglycannes selon la présente invention peuvent être utilisés seuls; ils peuvent également être utilisés à titre d'adjuvant dans des vaccins.
La dose usuelle, variable selon le dérivé utilisé, le sujet et l'affection en cause, peut être, par exemple, de 1 à 15 mg par jour. Par voie orale, chez l'homme, le dérivé de l'exemple 1 peut être administré à la dose quotidienne de 2 à 10 mg, par exemple pour le traitement de la bronchite chronique, soit environ de 0,03 à 0,15 mg par kilogramme de poids corporel.
L'invention a enfin pour objet les compositions pharmaceutiques qui renferment les acylglycannes selon la présente invention à titre de principe actif.
A titre de médicaments, les acylglycannes selon la présente invention peuvent être administrés par les voies digestive, parentérale ou locale.
Les compositions pharmaceutiques correspondantes peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, par exemple les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables lyophilisées ou non, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions, les gouttes, les collyres, les aérosols; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés parafiiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Il va être donné maintenant, à titre non limitatif, des exemples de mise en œuvre de l'invention.
Exemple N° 1
On ajoute 7,83 ml d'une solution aqueuse à 1% de sodium dodécyl sulfate à 235 mg d'extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella préparé comme indiqué ci-après selon l'option b, et chauffe pendant 5 minutes à 80° C. Après refroidissement, on Chromatographie par fractions de 0,5 ml, sur une colonne pour Chromatographie
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liquide haute performance (HPLC) de silice greffée par des acides gras en C8 (Aquapore® RP300 de 4,6 x 25 cm), en éluant à l'aide d'un gradient acétonitrile-solution aqueuse à 0,1% pH 1,8 d'acide trifluoracétique sous un débit de 2 ml/min, dans les conditions suivantes (cf. tableau ci-après):
Temps
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On isole les fractions correspondant au troisième pic repéré par spectrométrie à 200 nm, élimine les petites molécules par dialyse et amène à sec. On obtient 67,85 mg des acylglycannes attendus.
Analyse:
C: 42 H: 7,8 N: 0,3%
Protéines 0,8%, sucres 80%, lipides 24,5%.
Préparation de l'extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella de départ:
Stade A: Culture
On prépare un milieu de culture répondant à la formule suivante:
Extrait de viande 690 g
Chlorure de sodium 690 g
Peptone de caséine 690 g
Autolysat de levure 690 g
Photphate bipotassique 483 g
Phosphate monopotassique 207 g
Glucose 4104 g
Peptone papaïnique de soja 2760 g
Eau distillée q.s.p. 138 1
On prépare le milieu de culture en mélangeant successivement l'extrait de viande, le chlorure de sodium, la peptone de caésine, l'autolysat de levure, le phosphate bipotassique et le phosphate monopotassique dans environ 20 1 d'eau distillée. On ajuste le pH aux environs de 7.
On stérilise le milieu à 120° C pendant 40 min. Les solutions de glucose et de peptone papaïnique de soja sont introduites dans le milieu de culture au moment de l'ensemencement, après avoir été stérilisées au préalable.
La souche de Klebsiella (Institut Pasteur N° 1-163) est ensemencée dans 50 cm3 de milieu de culture. Cette solution, servant d'ino-culum, est introduite dans le reste du bouillon de culture. On ajuste le volume total du milieu de culture à 138 1 par addition d'eau distillée stérile.
Le milieu de culture est maintenu à 37° C et le pH est ajusté automatiquement à 7 environ (par addition d'une solution d'ammoniaque ou par addition d'une solution d'acide chlorhydrique).
La croissance des germes est appréciée au photomètre.
Stade S: Lyse
A 1381 de bouillon de culture à complet développement obtenu au stade A ci-dessus, on ajoute une solution aqueuse de chlorhydrate de lysozyme (stérilisée par filtration sur membrane), afin d'avoir une concentration finale de 160 y de chlorhydrate de lysozyme par cm3 de milieu de culture.
On laisse en contact 1 h à 56° C en présence de 0,25 g d'EDTA par litre de bouillon, de 862,5 mg de mercurothiolate sodique et de 80 g de polysorbate (commercialisé sous le nom de Tween 80), par litre de bouillon de culture.
On poursuit la lyse pendant environ 10 jours à 37° C dans des conditions stériles.
On recueille le lysat, homogénéise par agitation puis lyophilise.
Stade C: Traitement a) Par l'acétone:
On met en suspension dans 1381 d'acétone la poudre obtenue au stade B ci-dessus, puis agite vigoureusement pendant environ 3 h.
La suspension est alors centrifugée et on recueille une poudre que l'on essore.
b) Par le méthanol:
La poudre obtenue précédemment est mise en suspension dans 138 1 de méthanol et agitée vigoureusement pendant environ 3 h.
La suspension obtenue est alors centrifugée.
La poudre essorée est séchée à température ambiante sous pression réduite.
Stade D: Ultrafiltration
On met en solution dans 6x101 d'eau distillée contenant 1 g/1 de merthiolate six parties égales de poudre obtenue au stade C ci-dessus.
On maintient la solution sous agitation à +4° C pendant 24 h, centrifuge pendant environ 2 h à 20 000 g, puis à 60 000 g.
On récupère la solution, que l'on complète à 10 1 avec l'eau distillée filtrée (sur membrane stérilisante). On introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses pour ultrafiltration dont le seuil de rétention est de 300 000 et de diamètre apparent des pores d'approximativement 2 Â (membranes commercialisées par la société Amicon ou par la société Romicon sous la désignation XM 300).
On fait circuler dans l'appareil 50 volumes d'eau distillée, soit un volume de 500 1.
La solution diafiltrée est récupérée puis centrifugée à 60 000 g et la solution obtenue lyophilisée.
Stade E:
Option a:
20 g de produit tel qu'obtenu au stade D ci-dessus sont dissous dans 21 d'eau permutée.
On ajoute, lentement, environ 1,61 de bromure de cétyltriméthyl-ammonium à 3% dans l'eau, agite l'ensemble pendant 1 h, puis centrifuge à 10 000 tr/min pendant 15 min. On élimine le précipité, ajoute ensuite au surnageant isolé 3 1 d'éthanol à 95° en 15 min. Après 1 h d'agitation, on centrifuge à 10000 tr/min pendant 15 min; le surnageant ainsi obtenu est éliminé et le précipité est redissous dans 11 d'eau, puis dialysé pendant 48 h dans des tubes Visking® contre de l'eau permutée à +4° C. Au terme de cette dialyse, la solution est lyophilisée. On obtient 6,2 g de glycoprotéines dont on dissout 1 g dans 19 ml d'une solution aqueuse de carbonate d'ammonium 0,1 M. La solution est passée sur une colonne de 2,5 cm de diamètre renfermant 11 d'Ultragel® ACA34 (éluant: solution aqueuse de carbonate d'ammonium 0,1M); les fractions correspondant au premier pic d'élution (détection aux UV à 280 nm) sont rassemblées et lyophilisées, et on obtient 0,51 g d'extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella.
Option b:
On met en solution aqueuse à 10 g/11 kg de produit tel qu'obtenu au stade D ci-dessus.
On ajoute 0,8 volume de solution aqueuse à 3% de bromure de cétyltriméthylammonium à raison de 11/min environ et agite modérément pendant 1 h. On élimine le précipité formé par centrifugation en continu à débit de 5 1/h environ, à 62 000 g.
Le surnageant est concentré par ultrafiltration sur fibres creuses à seuil de rétention fixé à 5000 (Hollow Fibers H10P5 commercialisées par Amicon et Romicon) en deux cycles de traitement dans les proportions 5/1. On ajoute, à la vitesse de 21/min 6 volumes d'étha-
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noi à 96% et agite modérément pendant 15 min. On laisse décanter, essore et rince le précipité, sèche à moins de 40° C en présence de déshydratant, homogénéise par broyage mécanique et obtient 200 g d'extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella.
Exemple 2:
On a préparé des comprimés répondant à la formule:
Produit de l'exemple 1 1 mg
Excipient q.s. pour un comprimé terminé à 100 mg
(Détail de l'excipient: lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium.)
Exemple 3:
On a préparé des aérosols délivrant des doses contenant chacune:
Produit de l'exemple 1 0,5 mg
Emulsifiant 0,15 mg
Propulseur 50 mg
Exemple 4:
On a préparé une crème répondant à la formule:
Produit de l'exemple 1 1 mg
Excipient: alcool 2-octyl-dodécanol, alcool cétostéarylique, cétostéaryl sulfate de sodium,
parahydroxybenzoate de méthyle et de propyle,
eau purifiée 10 mg
ANNEXE PHARMACOLOGIQUE
1. Test de réponse d'hypersensibilité retardée (HSR) au globule rouge de mouton ( G RM)
Méthode
L'expérience est réalisée sur des lots de 10 souris femelles âgées de 9 à 10 semaines pesant environ 20 g.
Le traitement est réalisé 3 h avant l'immunisation par les GRM par une injection intrapéritonéale de 0,5 ml de NaCI 9% contenant le produit testé. Les doses testées sont de 10, 100 et 1000 x 10 6 g par kg.
L'immunisation est réalisée 3 h après le traitement par l'injection intraveineuse de GRM (108 GRM/souris).
La révélation de l'HSR est réalisée 4 jours plus tard par injection intraplantaire dans la patte arrière gauche de 40 x IO-61 d'une suspension de GRM.
La lecture est réalisée 24 h après la révélation, par la mesure de l'épaisseur des pattes arrière gauche et droite.
Les résultats sont exprimés par la différence entre les épaisseurs des pattes arrière gauche et droite de chaque souris.
Résultats
Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant:
Traitement (IO"6 g/kg)
Différence (nm)
Lot témoin
0
3,23+0,76
Lots traités
10
4,74+0,95
100
6,33+0,93
1000
9,00+1,80
Toute augmentation des différences patte gauche - patte droite par rapport au lot témoin traduit une augmentation des réponses d'hypersensibilité retardée. On s'aperçoit que, pour toutes les doses étudiées (10; 100; 1000 x 10~6 g/kg), les acylglycannes de la présente invention augmentent de manière importante les réponses d'HSR.
2. Toxicité aiguë
La dose létale 50 (DL 50) par voie intrapéritonéale, chez la souris, a été déterminée par la méthode Behrens et Karber.
Elle est d'environ 20 mg/kg pour les acylglycannes de l'exemple 1.
R
Claims (9)
1 mannose et environ 1 heptose.
1. Les acylglycannes extraits de Klebsiella, caractérisés en ce qu'ils sont essentiellement constitués d'environ 80% d'osés neutres et 20% de lipides, renferment moins de 2% de protéines et ont un poids moléculaire d'environ 12 500.
2. Les acylglycannes selon la revendication 1, caractérisés en ce que les oses sont présents dans les proportions relatives approximatives suivantes, pour 1 glucose: environ 4 galactoses, environ
2
REVENDICATIONS
3. Les acylglycannes selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils comprennent un enchaînement de galactoses liés en
ß 1 ->3, d'un poids moléculaire d'environ 9000.
4. Les acylglycannes selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisés en ce que la Klebsiella est Klebsiella pneumoniae.
5. Les acylglycannes selon la revendication 4, caractérisés en ce que la Klebsiella est la souche portant, à l'Institut Pasteur, ou Collection nationale de Cultures de Micro-organismes, les numéros 52145 et 1-163 et, à la National Culture Type Collection, le numéro 5055.
6. Procédé d'obtention des acylglycannes selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on traite un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella renfermant 30 à 45% de protéines, 30 à 40% d'osés neutres, une faible proportion d'acides uroniques, 2 à 5% d'osamines et ayant un poids moléculaire d'environ 350 000, à l'aide d'un détergent, chauffe à environ 80° C, Chromatographie sur silice branchée hydrophobe, et récupère la fraction correspondant au troisième pic d'élution repéré par spectrométrie à 200 nm et disparaissant à 280 nm.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que:
— le détergent est un sulfate alcalin de type ester alkyl,
— l'élution est effectuée à l'aide d'un gradient acétonitrile-solu-tion aqueuse à 0,1% pH 1,8 d'acide trifluoroacétique.
8. Les acylglycannes obtenus par le procédé selon l'une des revendications 6 et 7.
9. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, commr principe actif, les acylglycannes selon la revendication 1.
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