NL8503367A - Uit klebsiella geextraheerde acylglycanen, werkwijze voor hun verkrijging, hun toepassing als geneesmiddelen en de preparaten die ze bevatten. - Google Patents
Uit klebsiella geextraheerde acylglycanen, werkwijze voor hun verkrijging, hun toepassing als geneesmiddelen en de preparaten die ze bevatten. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8503367A NL8503367A NL8503367A NL8503367A NL8503367A NL 8503367 A NL8503367 A NL 8503367A NL 8503367 A NL8503367 A NL 8503367A NL 8503367 A NL8503367 A NL 8503367A NL 8503367 A NL8503367 A NL 8503367A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- klebsiella
- water
- glyeans
- acyl
- molecular weight
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
Description
* —" * -1-
85.3130/vdV/vL
Korte aanduiding: Uit Klebsiella geëxtraheerde acylglycanen, werkwijze voor hun verkrijging, hun toepassing als geneesmiddelen en de preparaten die ze bevatten
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op uit Klebsiella geëxtraheerde acylglycanen, een werkwijze voor hun verkrijging, hun toepassing als geneesmiddelen en de preparaten die ze bevatten.
In een bepaald aantal Franse octrooischriften zijn uit gelyseerde mi-5 croben van Klebsiella geëxtraheerde glycolproteïnen en/of een werkwijze voor hun bereiding beschreven. Dit geldt bijvoorbeeld voor de Franse octrooischriften 2.0U3.UT5, 2.088.112, 2.1T1.90T, 2 M2 ATI, 2Λ90Λ95, 2Λ90Λ96 en 2.5^0.136.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe extracten uit 10 bacteriën en heeft derhalve betrekking op uit Klebsiella geëxtraheerde acylglycanen die gekenmerkt zijn doordat zij in hoofdzaak bestaan uit ongeveer 8>Q% neutrale monosacchariden en 20% lipiden, minder dan 2% eiwitten bevatten en een molecuulgewicht bezitten van ongeveer 12500.
Onder neutrale monosacchariden verstaat men sacchariden die geen 15 basische of zuurrest bevatten, in het bijzonder neutrale hexosen zoals glu-cosen, galactose of mannose.
Zij worden bepaald volgens de methode van Tillmans en Philippi (Biochem. Z., 1929, 215.5 36) gemodificeerd door Rimington (Biochem. J., 1931, 25, 1062).
20 De eiwitten worden bepaald volgens de methode van Lowry (J. Biol. Chem.
1951, 193, 265-273).
De lipiden worden bepaald door chromatografie in dampfase na methano- lyse.
Het molecuulgewicht van de acylglycanen volgens de onderhavige aanvra-25 ge is geschat door filtratie op een hydrofiele en onoplosbare gel op basis van dextran, zoals Sephadex ^ , met een chromatografiedrempel van 50.000.
Yoorkeursacylglycanen zijn die waarbij de monosacchariden aanwezig zijn in ongeveer de volgende relatieve verhoudingen, per 1 glucose: ongeveer 4 galactosen, ongeveer 1 mannose en ongeveer 1 heptose. Deze bepaling kan 30 bijvoorbeeld uitgevoerd worden door chromatografie in dampfase.
lieer in het bijzonder de voorkeur verdienende acylglycanen bevatten een keten van 3 1 —? 3 gebonden galactosen met een molecuulgewicht van ongeveer 9000.
i'- tr Λ ‘y .n v ·.* v 0 0 / - * -2-
De acylglycanen volgens de uitvinding kunnen geëxtraheerd worden uit verschillende soorten van Klebsiella. Men geeft echter meer in het hij zonder de voorkeur aan die afkomstig uit Klebsiella pneumoniae, en zeer in het bijzonder die afkomstig uit de stam die in het instituut Pasteur of de na-5 tionale microörganismen cultuur collectie de nrs. 521^-5 en 1-163 en bij de nationale cultuurtype collectie no. 5055 draagt. Deze stam is reeds lang in de handel verkrijgbaar en vrij voor het publiek beschikbaar, in het bijzonder bij het instituut Pasteur te Parijs onder de referentie 52.1^5; deze stam is bovendien door aanvraagster 25 juni 1981 gedeponeerd onder het 10 no. 1-163 bij het instituut Pasteur (ook wel genaamd nationale collectie van Cultures van microörganismen).
Naast monosacchariden en lipiden zijn de acylglycanen volgens de onderhavige uitvinding gekenmerkt door de aanwezigheid van 2-keto-3-desoxy-octolos^n^guur, glucosaminen, fosfaten van α en β-hydroxymyristinezuur en 15 palmitinezuur.
De acylglycanen volgens de onderhavige uitvinding worden aangeboden in de vorm van een wateroplosbaar kleurloos wit poeder.
Als alle moleculen van biologische oorsprong, worden zij gemakkelijk gehydrateerd of hydrateren zij zich gemakkelijk; hun infraroodspectrum is 20 derhalve niet karakteristiek, de talrijke pieken zijn onderling versmolten. Hun smeltpunt is evenmin karakteristiek, omdat het daarbij gaat om een carbo-nisatie die plaatsvindt over een breed temperatuursgebied.
De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van de acylglycanen zoals hierboven omschreven, welke 25 werkwijze gekenmerkt is doordat men een wateroplosbaar bacterieel extract van Klebsiella dat 30% tot b$% eiwitten, 30% tot b0% neutrale monosacchari-den, een geringe hoeveelheid uronzuren, 2% tot 5% osaminen bevat en een molecuulgewicht bezit van ongeveer 35.000 behandelt met een oppervlakte-actieve stof, verwarm! tot ongeveer 80°C, chromatografeert op hydrofoob ver-30 takt siliciumoxyde, en de fractie wint overeenkomende met de derde elutie-piek gelokaliseerd door spectrometrie bij 200 nrn en verdwijnend bij 280 nm, en verschijnend bij b92 nm na kleuren met fenol-zwavelzuur.
Onder geringe hoeveelheid uronzuren verstaat men minder dan 6% uronzuren en bij voorkeur minder dan b%.
35 De wateroplosbare uitgangsbacteriën-extracten van Klebsiella voor de werkwijze kunnen in het bijzonder verkregen worden door kweken van micro-
*§ *1 f 5 M § 1 V ^ v V ü -) J
-3- organismen behorende tot het geslacht Klebsiella, lysis van de microörga-nismen, drogen, ontvetten door extraheren met behulp van oplosmiddelen voor lipiden, ultrafiltratie, behandeling van de aldus verkregen waterige oplossing met een quaternair ammoniumzout, verwijdering van het neerslag, 5 en vervolgens ofwel behandeling in de koude van de bovenstaande vloeistof met behulp van een alkanol met laag molecuulgewicht, isolatie en vervolgens heroplossen in water, dialyse en drogen van het verkregen produkt, het opnieuw in oplossing brengen, filtreren over een gel gevolgd door isolatie van de eerste geëlueerde fractie en drogen^ofwel concentreren van de boven-10 staande vloeistof door toepassen van tenminste een molecuulselectie-inrichting, behandeling in de koude van het concentraat met behulp van een alkanol en een isolatie van het verkregen neerslag.
Dergelijk|éereidingen zijn in het bijzonder beschreven in het Franse octrooischrift 2Λ90Λ96 en in de Europese aanvrage 0.0^9.182 gepubli-15 ceerd onder no. 29.070 E door Derwent publicaties Farmdoc boek 1500 van 2 juni ^ÖO^alsmede in de Franse octrooiaanvrage 2.5^-0.136.
De onderhavige aanvrage heeft derhalve ook betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van de acylglycanen zoals hierboven omschreven, welke werkwijze gekenmerkt is doordat men een wateroplosbaar bacteriën^extract 20 van Klebsiella, zoals hierboven bereid, behandeit met een oppervlakteactie-ve stof, verwarmt: tot ongeveer 80°C, chromatografeert op hydrofoob vertakt siliciumoxyde en de fractie wint overeenkomende met de derde elutie-piek gelokaliseerd door spectrometrie bij 200 nm verdwijnend bij 280 nm, en verschijnend bij b-92 nm na kleuren met fenol-zwavelzuur.
25 Andere, voor het uitvoeren van de werkwijze geschikte, wateroplosbare uitgangsbacteriën^extracten van Klebsiella worden bijvoorbeeld verkregen door kweken van microörganismen, lysis van de microorganismen door fijn maken, gefractioneerde centrifugering om de celresten te sedimenteren onder een versnelling van ongeveer 8000 g, vervolgens de membranen onder een 30 versnelling van 20.000 tot UO.OOQ g, scheiding van het ruwe extract door gefractioneerde centrifugering in zoutoplossing en in water, behandeling met een base of een hypobromiet, verwijdering van de overmaat reactiemid-del en van het onoplosbare residu, behandeling met een waterige azijnzuur-oplossing bij een temperatuur van 70°C tot 100°C, verwijdering van de on-35 oplosbare fractie, ontvetten door extraheren met behulp van oplosmiddelen voor lipiden, behandeling met lysozym, scheiding van de fractie met een Λ r? * *“T ,»? in -· ƒ ' J kif ^ "J \J J * -k- molecuulgewicht van ongeveer 350.000 en drogen. Een voorbeeld van een dergelijke bereiding komt bijvoorbeeld voor in de Europese octrooiaanvrage ΟΟ89266.
De produkten die oppervlakteactieve eigenschappen bezitten zijn alge-5 meen bekend. Het betreft bijvoorbeeld quaternaire ammoniumzouten, in het bijzonder quaternaire ammoniumhalogeniden zoals tetraëthylammoniumjodide, N-hexadecyl-N,N-dimethylbenzeenmethanaminiumchloride, N-hexadecyl-2-hydro-xy-N ,N ,N-trimethyl-1 -hexadecanaminiumbromide, het N,11 ,H-trimethyl-1 -hexade-canaminiumhalogenide of cetylpyridiniumhalogenide.
10 Het betreft eveneens alkalisulfaten of sulfonaten van het alkylester of alkylarylestertype zoals natriumdioctylsulfosuccinaat, natriumdodecyl-benzeensulfonaat, natriumdodecylsulfaat, natriumtetradecylsulfaat, lithium-dodecylsulfaat, mono (nonylfenyl) ethers van polyethyleenglycolen zoals Triton if^ , p-iso-octylfenylethers van polyethyleenglycolen zoals Triton 15 ^of polymeren van k-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)fenol met formaldehyde en oxiran zoals Triton ® A20.
Het gaat bij voorkeur om een alkalisulfaat van het alkylestertype zoals natriumdodecylsulfaat.
De oppervlakteactieve stof "wordt gebruikt in oplossing in een farma-20 ceutisch aanvaardbaar oplosmiddel dat aan de oppervlakteactieve stof haar oppervlakteactieve eigenschappen doet behouden, bij voorkeur in oplossing in water. Afhankelijk van het oppervlakteaetief vermogen, wordt zij gebruikt in een concentratie van ongeveer 1$ in het geval van zeer sterk oppervlaktomwerking bezittende produkten zoals natriumdodecylsulfaat of 25 meer geconcentreerd, bijvoorbeeld 2% tot 10$ in het geval van quaternaire ammoniumzouten.
De temperatuur van ongeveer 80°C wordt enkele minuten aangehouden, bij voorkeur ongeveer 5 minuten.
Het voor de chromatografie gebruikte siliciumoxydegel bestaat uit 30 siliciumoxyde waarop vertakkingen voorkomen van hydrofobe groepen, bij voorkeur van vetzuren. De vetzuren kunnen bijvoorbeeld vetzuren zijn met 3 tot 30 koolstof atomen, in het bijzonder 3 tot 20 koolstof at omen. Men gebruikt bij voorkeur het gel CQ dat in de handel gebracht wordt onder de naam /gN ö
Aquapore ^ RP300.
35 Het lokaliseren van de belangwekkende fractie van koolhydraten-aard en in hoofdzaak vrij van eiwitten wordt bijvoorbeeld uitgevoerd met spec-trometrie bij 200 nm (aantonen van de koolhydraten en van de eiwitten), ύ v J 3 Ó Ö / -5- 28θ ma (aantonen van alleen eiwitten), b-92 nm na kleuren met fenol-zwavelzuur (aantonen van alleen suikers).
De elutie wordt bij voorkeur uitgevoerd met een mengsel van acetoni-tril-waterige 0,1¾ trifluorazijnzuuroplossing met een pH van 1,8 gebruikt 5 in gradiëntvorm. De gradiënt bestaat met voordeel opeenvolgend uit een mengsel van acetonitril-trifluorazijnzuuroplossing 20-80, en vervolgens 50-50. Onder deze omstandigheden komen de gezochte acylglycanen overeen met de derde piek gelokaliseerd bij 200 nm als men een Cg gel gebruikt.
Deze piek verdwijnt bij 280 nm en verschijnt bij b92 nm na kleuren 10 met fenol-zwavelzuur.
De isolatie van de acylglycanen is uitgevoerd op de bekende wijze voor macromoleculen gemengd met kleine moleculen d.w.z. bijvoorbeeld door ultrafiltratie met behulp van membranen met een retentiedrempel van bijvoorbeeld 5000, door dialyse of door chromatografie op een gel.
15 De acylglycanen kunnen vervolgens^bijvoorbeeld, gedroogd worden door lyofiliseren, indampen of verstuiven.
De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op de acylglycanen zoals verkregen volgens de hierboven beschreven werkwijzen, d.w.z. als zij verkregen worden onder toepassing van deze werkwijzen of als zij fysio-20 chemische eigenschappen bezitten analoog aan die van de onder toepassing van deze werkwijzen verkregen acylglycanen.
De acylglycanen, die het onderwerp van de onderhavige uitvinding vormen, bezitten zeer belangwekkende farmacologische eigenschappen; zij bezitten in het bijzonder opmerkelijke anti-allergische en immunomoduleren-25 de eigenschappen. Zij stimuleren in het bijzonder de immuniteit tegen cellulaire bemiddeling.
Van de immunomodulerende eigenschappen van de acylglycanen volgens de uitvinding kunnen in het bijzonder genoemd worden de stimulerende eigenschappen op de afscheiding van interleukine I en de Colony stimulerende 30 factor ("Colony Stimulating Factor") alsmede mitogene eigenschappen.
Deze eigenschappen zijn verder op in het experimentele gedeelte toegelicht.
Deze eigenschappen rechtvaardigen het gebruik van de acylglycanen volgens de uitvinding als geneesmiddelen.
35 Be onderhavige aanvrage heeft derhalve eveneens betrekking op de toe passing, als geneesmiddelen, van de acylglycanen zoals hierboven omschreven, o o o 7 -6- voor hun gebruik bij een methode voor de - curatieve of preventieve -therapeutische behandeling van het menselijk of dierlijk lichaam.
Van de acylglycanen, die het onderwerp der uitvinding vormen, geeft men zeer in het bijzonder de voorkeur aan de acylglycanen die gekenmerkt 5 zijn doordat zij bestaan uit de acylglycanen zoals verkregen volgens de werkwijzen der uitvinding, voor hun gebruik bij een methode voor de curatieve of preventieve therapeutische behandeling van het menselijk of dierlijk lichaam.
De geneesmiddelen volgens de uitvinding vinden bijvoorbeeld hun ge- O f* 10 bruik bij de behandeling /het voorkomen, bij de mens en het dier, van in-fectieuze ziekten veroorzaakt door bacteriën of virussen, bij de behandeling van ziekten met parasieten, toxicologische infecties, bij de behandeling van infecties na behandeling in een ziekenhuis en na chirurgische behandeling, en allergieën van allerlei typen.
15 Als preventief voorbeeld kunnen de acylglycanen volgens de onderhavi ge uitvinding alleen gebruikt worden; zij kunnen eveneens gebruikt worden als adjuvants in vaccins.
De gebruikelijke doses, die varieert afhankelijk van de gebruikte verbinding, de proefpersoon en de desbetreffende aandoening kan bijvoorbeeld 20 .....
1 mg tot 15 mg per dag bedragen. Bij orale toediening bij de mens kan de verbinding van voorbeeld I toegediend worden in een dagelijkse dosis van 2 mg tot 10 mg bijvoorbeeld voor de behandeling van chronische bronchitis ofwel ongeveer 0,03 mg tot 0,15 mg per kilogram lichaamsgewicht.
De uitvinding heeft tenslotte ook betrekking op farmaceutische prepa-25 raten die als werkzaam bestanddeel de acylglycanen volgens de onderhavige uitvinding bevatten.
Als geneesmiddelen kunnen de acylglycanen volgens de onderhavige aanvrage toegediend worden op orale, parenterale of locale wijze.
De overeenkomstige farmaceutische preparaten kunnen bijvoorbeeld vas-30 te stoffen of vloeistoffen zijn en aangeboden worden in de gewoonlijk in de menselijke geneeskunde gebruikte farmaceutische vormen zoals bijvoorbeeld eenvoudige of beklede tabletten, pillen, korreltjes, oplossingen, siropen, suppositoria, al dan niet gelyofiliseerde injecteerbare preparaten, eitjes, zalven, pommades, lotions, druppels, oogwaters, aerosolen; 35 zij worden bereid volgens de gebruikelijke methoden. · Het werkzame bestanddeel of de werkzame bestanddelen kunnen hierin opgenomen worden met gewoon- ·- , -·, '-* tj >j o o y -τ- lijk in deze farmaceutische preparaten gebruikte excipienten zoals talk, arabisehe gom, lactose, zetmeel, magnesiumstearaat, cacaoboter, al dan niet waterige dragers, vette stoffen van dierlijke of plantaardige oorsprong, paraffinederivaten, glycolen, verschillende bevochtigingsmiddelen, disper-5 geermiddelen of emulgeermiddelen, en conserveermiddelen.
Er zullen nu als niet beperkend, voorbeelden gegeven worden van de uitvoering van de uitvinding.
Voorbeeld no. I
Men voegt 7,83 ml van een waterige oplossing met 1# natriumdodecylsul-10 faat toe en 235 mg wateroplosbaar bacteriënextract van Klebsiella bereid als hier na aangegeven volgens keuze b en verwarmt 5 minuten op 80°C.
Ha afkoelen chromatografeert men met fracties van 0,5 ml, op een kolom voor vloeistofchromatografie met hoog scheidingsvermogen (HPLC) met sili-ciumoxyde geënt met Cg vetzuren (Aquapore ^ RP300 van kf6 x 25 cm), onder 15 elueren met een gradiënt van acetonitril-waterige 0,1# trifluorazijnzuur-oplossing met een pH van 1,8 met een debiet van 2 ml/mn, onder de volgende omstandigheden (zie onderstaande tabel):
Tijd Acetonitril Water 0 0 100 20 10 0 100 20 20 80 35 20 80 1^5 50 50 60 50 50 25 80 100 0
Men isoleert de fracties overeenkomende met de derde piek gelokaliseerd door spectrcmetrie bij 200 mn, verwijdert de kleine moleculen door dialyse en dampt in tot droog. Men verkrijgt 67,85 mg van de verwachte acylglycanen.
30 Analyse: C%: h2 E%: 7,8 ΪΓ#: 0,3
Eiwitten 0,8#, suiker 80#, lipiden 2k,5%.
w £ 0 Ό / * * -8-
Berei&ing van het wateroplosbare uitgangsbacteriënextract van Klebsiella:
Trap A: kweek
Men bereidt een kweekmedium dat beantwoordt aan de volgende formule: 5 - vleesectract 690 g - natriumchloride 690 g - caseinepepton 690 g - gist-autolysaat 690 g - bikaliumfosfaat 483 g 10 - monokaliumfosfaat 207 g - glucose 4104 g - papaxnepepton van soja 27βθ g - gedestilleerd water q,.s.p. 138 liter
Men bereidt het kweekmedium door achtereenvolgens mengen van het vlees-15 extract, natriumchloride, caseinepepton, gistautolysaat, bikaliumfosfaat, en mono-kaliumfosfaat in ongeveer 20 liter gedestilleerd water. Men stelt de pH in op Ongeveer 7·
Men steriliseert het medium kO minuten op 120°C. De glucose-oplossingen en papaïnepeptonoplossingen van soja worden in het kweekmedium gebracht 20 op het tijdstip van de enting na vooraf te zijn gesteriliseerd.
3
De Klebsiella stam (institut Pasteur no. 1-163) wordt geënt in 50 cm kweekmedium. Deze oplossing, die dient als entmedium wordt gebracht in de rest van de kweekbouillon. Men stelt het totaal volume van het kweekmedium in op 138 liter door toevoegen van steriel gedestilleerd water.
25 Het kweekmedium wordt op 37°C gehouden en de pH wordt automatisch in gesteld op ongeveer 7 (door toevoegen van een ammoniakoplossing of door toevoegen van een zoutzuuroplossing).
De groei van de microorganismen wordt beoordeeld met de fotometer.
Trap B: lysis 30 Aan 138 liter van de in de bovenstaande trap A verkregen kweekbouillon met volledige ontwikkeling, voegt men een waterige oplossing toe van lysozym-chloorhydraat (gesteriliseerd door filtreren over een membraan) om een eindconcentratie te verkrijgen van 160 ï lysozymchloorhydraat per 3 cm kweekmedium.
35 Men laat een uur staan bij 56°C in aanwezigheid van 0,25 g Edta per liter bouillon, 862,5 mg natriummercurothiolaat en 80 g polysorbaat (in de #Ö V3 0 Q 7 * m m -9- handel gebracht onder de naam Tween 8θ) per liter kweekbouillon.
Men zet de lysis gedurende ongeveer 10 dagen voort bij 3T°C onder steriele omstandigheden.
Men wint het lysaat, homogeniseert door roeren en lyofiliseert ver-5 volgens.
Tran C: behandeling a) Met aceton:
Men suspendeert in 138 liter aceton het in de bovenstaande trap B verkregen poeder waarna men ongeveer 3 uren krachtig roert.
10 De suspensie wordt dan gecentrifugeerd en men wint een poeder dat men afzuigt.
b) Met methanol:
Het hiervoor verkregen poeder wordt gesuspendeerd in 138 liter methanol en ongeveer 3 uren krachtig geroerd.
15 De verkregen suspensie wordt dan gecentrifugeerd.
Het afgezogen poeder wordt gedroogd bij kamertemperatuur onder vermin- . derde druk.
Trap D: Ultrafiltratie
Men lost in 6 maal 10 liter gedestilleerd water dat 1 g/1 merthiolaat 20 bevat, zes gelijke delen van het in de bovenstaande trap C verkregen poeder op.
o
Men roert de oplossing 2k uren bij +b C, centrifugeert ongeveer 2 uren bij 20.000 g, en vervolgens bij 60.000 g.
Men wint de oplossing die men aanvult tot 10 liter met (over een ste-25 riliserend membraan) gedestilleerd gefiltreerd water. Men brengt de verkregen oplossing in een diafiltratie-inrichting voorzien van poreuze membranen voor ultrafiltratie waarvan de retentiedrempel 300.000 bedraagt en de schijnbare diameter van de poriën ongeveer 2 A (membranen in de handel gebracht door MICOH of door R0MIC0N onder de aanduiding XM 300).
30 Men laat in de inrichting 50 volumen gedestilleerd water circuleren ofwel een volume van 500 liter.
De diagefiltreerde oplossing wordt gewonnen en vervolgens gecentrifugeerd bij oO.QQQ g en de verkregen oplossing gelyofiliseerd.
Trap Ξ: 35 geuze a: 20 g produkt zoals verkregen in de bovenstaande trap D worden opgelost k· 'J ·/ j i s
w' V
-10- in twee liter gedeïoniseerd water.
Men voegt langzaam, ongeveer 1,6 liter 3%'s cetyltrimethylammonium-bromide in water toe, roert het geheel een uur, en centrifugeert vervolgens 15 minuten hij 10.000 t/mn. Men verwijdert het neerslag, voegt vervolgens 5 aan de geïsoleerde bovenstaande vloeistof 3 liter 95° ethanol toe in 15 minuten. Na een uur roeren, centrifugeert men 15 minuten bij 10.000 t/mn; de aldus verkregen bovenstaande vloeistof wordt verwijderd en het neerslag opnieuw opgelost in 1 liter water, en vervolgens ^8 uren gedialyseerd in Viskingv ' buizen tegen gedeïoniseerd water bij +U C. Na beëindiging van 10 deze dialyse wordt de oplossing gelyofiliseerd. Men verkrijgt 6,2 g glyco-proteïnen waarvan men 1 g oplost in 19 ml van een waterige 0,1M ammonium-carbonaatoplossing. De oplossing wordt geleid over een kolom van 2,5 cm (h) diameter die 1 liter Ultragelv ACA3b bevat (elutiemiddel: 0,1M waterige ammoniumcarbonaatoplossing); de fracties overeenkomende met de eerste elu-15 tiepiek (aangetoond met U.V. bij 280 nm) worden samengevoegd en gelyofiliseerd en men verkrijgt 0,51 g wateroplosbaar bacteriënextract van Klebsiella.
Keuze b:
Men lost 1 kg van het produkt zoals verkregen in de bovenstaande trap D op in water tot een oplossing van 10 g/liter.
20 Men voegt /O^^rb^nïme v an een waterige oplossing met 3% cetyltrimethyl- ammoniumbromide toe in een hoeveelheid van ongeveer 1 liter /minuut en roert 1 uur matig. Men verwijdert het gevormde neerslag door continu centrifugeren met een debiet van ongeveer 5 liter/uur, bij 62.000 g.
De bovenstaande vloeistof wordt geconcentreerd door ultrafiltreren op 25 holle vezels met een retentiedrempel van 5000 (Hollow Fibers H10P5 in de handel gebracht door AMIC0N en R0MIC0N) in 2 behandelingskringlopen in de verhoudingen 5/1. Men voegt, met een snelheid van 3 liter per minuut,
6 volumen 96%'s ethanol toe en roert 15 minuten matig. Men laat decanteren, zuigt af en wast het gevormde neerslag, droogt bij minder dan i+0°C in tegen-30 woordigheid van een dehydratatiemiddel, homogeniseert door mechanisch fijn maken en verkrijgt 200 g wateroplosbaar b act eri ën^extract van Klebsiella. Voorbeeld II
Men bereidt tabletten die beantwoorden aan de formule: - Produkt van voorbeeld I 1 mg 35 - Excipient q,.s. voor een tablet tot 100 mg (Bijzonderheden van de excipient: lactose, zetmeel, talk, magnesiumstearaat).
B o u ύ ό Ό 7 -11-
Voorbeeld III
Men bereidt aerosolen die doses afgeven elk bevattende: - Produkt van voorbeeld I 0,5 mg - Smulgeermiddel 0,15 mg 5 - Drijfmiddel 50 mg
Voorbeeld IV
Men bereidt een zalf die beantwoordt aan de volgende formule: - Produkt van voorbeeld I 1 mg - Excipient: 2-octyldodecanol, cetostearylaleohol, 10 natriumcetostearylsulfaat, methyl-en propylparahydroxy- benzoaat, gezuiverd water 10 mg
FARMACOLOGISCHE BIJLAGE
1/. Vertraagde hypersensibiliteitsresponsproef (HSR) met het rode s chapenbloedli ehaamp j e (GRM)
15 METHODE
De proef wordt uitgevoerd met groepen van 10 vrouwelijke muizen van 9 tot 10 weken oud die ongeveer 20 g wegen.
De behandeling wordt 3 uren voor de immunisatie met de GRM uitgevoerd door een intraperitoneale injectie van 0,5 ml 9%'s NaCl dat het te onder-20 zoeken produkt bevat. De onderzochte doses bedragen 10, 100 en 1000 x 10”^g per kg.
De immunisatie wordt 3 uren na de behandeling uitgevoerd door intra- 8 veneuze injectie van GRM (10 GRM/muis).
Het het HSR wordt U dagen later uitgevoerd door intra- 25 plantaire injectie in de linker achterpoot van bO x 10-^ per 3/van een GRM suspensie.
.ontwikkelen
De interpretatie geschiedt 2k uren na het ' , door bepalen van de dikte van de linker en rechter achterpoot.
De resultaten zijn uitgedrukt als het verschil tussen de dikten van 30 de linker en rechter achterpoten van elke muis.
RESULTATEN
De resultatejéij^4amengevat in de volgende tabel: <7 ' -12-
Behandeling Verschil _10 g/kg_
Blanco groep 0 3,23 + 0,76
Behandelde groepen 10 1)-,7^ + 0,95 5 100 6,33 + 0,93 1000 9,00 + 1,80
Elke vergroting van de linkerpoot-rechterpootverschillen ten opzichte van de vergelijkingsgroep "betekent een verhoging van de vertraagde hyper-sensihiliteitrespons. Men ziet dat voor alle onderzochte dosis (10; 100;
10 1000 10~^ g/kg) de acylglycanen volgens de onderhavige uitvinding de HSR
respons op belangrijke wijze vergroten.
2/ Acute giftigheid
De lethale dosis 50 (LD 50) bij -intraperitoneale toediening, bij de muis is bepaald volgens de methode van BEKREUS en KARBER.
15 Zij bedraagt ongeveer 20 mg/kg voor de acylglycanen van voorbeeld I.
j v 0 o o 7
Claims (10)
1. Uit Klebsiella geëxtraheerde aeylglyeanen, met het kenmerk dat zij in hoofdzaak bestaan uit ongeveer 80# neutrale monosaccha-riden en 20# lipiden, minder dan 2# eiwitten bevatten en een molecuulge-wieht bezitten van ongeveer 12500.
2. Aeylglyeanen volgens conclusie 1 met het kenmerk dat de monosacchariden aanwezig zijn in ongeveer de volgende relatieve verhoudingen per 1 glucose: ongeveer k galactosen, ongeveer 1 mannose en ongeveer 1 heptose.
3. Aeylglyeanen volgens conclusie 1 of 2 met het kenmerk 10 dat zij een keten van 3 1 —> 3 gebonden galactosen bevatten met een mole-euulgewicht van ongeveer 9000. U. Aeylglyeanen volgens conclusie 1,2 of 3 met het kenmerk dat zij afkomstig zijn van Klebsiella pneumoniae.
5. Aeylglyeanen volgens conclusie U met het kenmerk dat zij 15 afkomstig zijn uit de stam die in het Institut Pasteur of de Nationale microörganismen cultuur collectie nrs. 521^5 en 1-163 en bij de nationale cultuurtype collectie no. 5055 draagt.
6. Werkwijze voor het verkrijgen van aeylglyeanen zoals omschreven in êén der conclusies 1-5 met het kenmerk dat men een wateroplos-20 baar bacterieel extract van Klebsiella dat 30# tot ^5# eiwitten, 30# tot b0% neutrale monosacchariden, een geringe hoeveelheid uronzuren, 2# tot 5# osar· minen bevat en een molecuulgewicht bezit van ongeveer 350000 behandelt met een oppervlakteactieve stof, verwamt tot ongeveer 80°C, chromatografeert op hydrofoob vertakt siliciumoxyde, en de fractie wint overeenkomende met 25 de derde elutiepiek gelokaliseerd door spectrometrie bij 200 nm en verdwijnend bij 280 nm.
7. Werkwijze voor het verkrijgen van aeylglyeanen zoals omschreven in êén der conclusies 1-5 waarbij men een wateroplosbaar bacterieel extract van Klebsiella bereid zoals dat verkregen door kweken van microörganismen 30 behorende tot het geslacht Klebsiella, lysis van de microörganismen, drogen, ontvetten door extraheren met behulp van oplosmiddelen voor lipiden, ultrafiltratie, behandeling van de aldus verkregen waterige oplossing met een quaternair ammoniumzout, verwijdering van het neerslag, en vervolgens ofwel behandeling in de koude van de bovenstaande vloeistof met behulp van een & u *j -j u o 7 '» V * -1U- -ft a alkanol met laag molecuulgewicht, isolatie en vervolgens heroplossen in water, dialyse en drogen van het verkregen produkt, het opnieuw in oplossing brengen, filtreren over een gel gevolgd door isolatie van de eerste ge-elueerde fractie en drogen ofwel concentreren van de bovenstaande vloeistof 5 door toepassen van tenminste een molecuulselectie-inrichting, behandeling in de koude van het concentraat met behulp van een alkanol en een isolatie van het verkregen neerslag met het kenmerk dat men het genoemde wateroplosbare bacteriën extract van Klebsiella behandelt met een oppervlakteactieve stof, verwarmt tot ongeveer 80°C, chromatografeert op 10 hydrofoob vertakt siliciumoxyde en de fractie wint overeenkomende met de elutiepiek gelokaliseerd door spectrometrie bij 200 nm verdwijnende bij 280 nm en verschijnend bij k92 nm na kleuren met fenolzwavelzuur.
8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7 met het kenmerk dat: - de oppervlakteactieve stof een alkalisulfaat van het alkylestertype 15 is, - de èlutie uitgevoerd wordt met behulp van een gradiënt van acetoni-tril-waterige 0,1% trifluorazijnzuuroplossing met pH 1,8.
9. Acylglycanen zoals verkregen met een werkwijze volgens een der conclusies 6, 7 of 8.
10. Acylglycanen zoals omschreven in één of meer der conclusies 1-5 of 9, voor hun gebruik bij een werkwijze voor de preventieve of curatieve therapeutische behandeling van het menselijk of dierlijk lichaam.
11. Farmaceutische preparaten met het kenmerk dat zij als werkzaam bestanddeel, de acylglycanen zoals omschreven in conclusie 10 be-25 vatten. 3503367
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8418627A FR2574429B1 (fr) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | Acylglycannes extraits de klebsiella, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant |
| FR8418627 | 1984-12-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8503367A true NL8503367A (nl) | 1986-07-01 |
Family
ID=9310306
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8503367A NL8503367A (nl) | 1984-12-06 | 1985-12-06 | Uit klebsiella geextraheerde acylglycanen, werkwijze voor hun verkrijging, hun toepassing als geneesmiddelen en de preparaten die ze bevatten. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4751218A (nl) |
| JP (1) | JPH0742322B2 (nl) |
| BE (1) | BE903800A (nl) |
| CH (1) | CH669386A5 (nl) |
| DE (1) | DE3543267C2 (nl) |
| FR (1) | FR2574429B1 (nl) |
| GB (1) | GB2168365B (nl) |
| IT (1) | IT1181742B (nl) |
| LU (1) | LU86195A1 (nl) |
| NL (1) | NL8503367A (nl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0213099A3 (de) * | 1985-08-23 | 1989-07-19 | Cederroth Nordic Aktiebolag | Mittel mit antiphlogistischer, immunstimulierender und zytoprotektiver Wirkung, ihre Herstellung und pharmazeutische Verwendungen |
| JPS62282592A (ja) * | 1986-05-30 | 1987-12-08 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 高粘性ｂｓ−１物質及びその製造法 |
| FR2620130B1 (fr) * | 1987-09-08 | 1990-01-12 | Lipha | Nouveaux polysaccharides hydrosolubles, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et preparation les renfermant |
| FR2648351A1 (fr) * | 1989-06-20 | 1990-12-21 | Roussel Uclaf | Utilisation de complexes glycoproteiques extraits de bacteries gram(-) pour la fabrication d'un medicament facilitant la cicatrisation de la peau et procede de preparation |
| FR2650506B1 (fr) * | 1989-07-11 | 1991-11-08 | Roussel Uclaf | Galactanne extrait de klebsiella, procede d'obtention et application a titre de medicament |
| FR2655267B1 (fr) * | 1989-12-04 | 1992-04-03 | Roussel Uclaf | Nouveau derive sulfate du galactanne extrait de klebsiella, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions pharmaceutiques le renfermant. |
| GB9224956D0 (en) * | 1992-11-28 | 1993-01-20 | Euro Dpc Ltd | Improvements relating to allergen testing & apparatus |
| FR2809014A1 (fr) * | 2000-05-16 | 2001-11-23 | Pf Medicament | Utilisation d'une proteine ompa d'enterobacterie comme agent antimicrobien |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR7207M (nl) * | 1966-12-14 | 1969-08-25 | ||
| US3929994A (en) * | 1969-05-20 | 1975-12-30 | Roussel Uclaf | Anti-inflammatory glycoprotein compositions and method of use |
| NL174267B (nl) * | 1969-05-20 | Roussel Uclaf | Verbetering van de werkwijze voor de bereiding van een somatisch antigeen volgens het nederlandse octrooischrift 169754 en werkwijze ter bereiding van een farmaceutisch preparaat. | |
| FR2088112B2 (nl) * | 1970-05-20 | 1975-01-10 | Cassenne Lab Sa | |
| BE795417A (fr) * | 1972-02-15 | 1973-08-14 | Roussel Uclaf | Nouveaux composes d'origine-bacterienne et procede d'obtention |
| FR2462477A1 (fr) * | 1979-07-31 | 1981-02-13 | Cassenne Lab Sa | Nouvelles glycoproteines de klebsiella pneumoniae, procede d'obtention, application a titre de medicaments et compositions les renfermant |
| FR2490495A1 (fr) * | 1980-09-19 | 1982-03-26 | Roussel Uclaf | Nouvelles glycoproteines hydrosolubles immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant |
| FR2540136A1 (fr) * | 1983-01-28 | 1984-08-03 | Roussel Uclaf | Nouveau procede de preparation d'acylglycoproteines immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, compositions pharmaceutiques et procede de lutte contre les maladies allergiques |
| FR2490496A1 (fr) * | 1980-09-19 | 1982-03-26 | Roussel Uclaf | Nouvelles glycoproteines immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant |
| FR2523154A1 (fr) * | 1982-03-09 | 1983-09-16 | Fabre Sa Pierre | Procede de preparation de proteoglycanes immunostimulants inducteurs d'interferon, proteoglycanes obtenus et medicaments les contenant |
| DE3300633A1 (de) * | 1982-08-10 | 1984-03-01 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von rhamnose oder fucose |
-
1984
- 1984-12-06 FR FR8418627A patent/FR2574429B1/fr not_active Expired
-
1985
- 1985-12-04 US US06/804,687 patent/US4751218A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-04 IT IT48874/85A patent/IT1181742B/it active
- 1985-12-05 LU LU86195A patent/LU86195A1/fr unknown
- 1985-12-05 JP JP60272645A patent/JPH0742322B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 BE BE0/215973A patent/BE903800A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-12-05 CH CH5176/85A patent/CH669386A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-12-06 DE DE3543267A patent/DE3543267C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-06 GB GB08530117A patent/GB2168365B/en not_active Expired
- 1985-12-06 NL NL8503367A patent/NL8503367A/nl active Search and Examination
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61140524A (ja) | 1986-06-27 |
| JPH0742322B2 (ja) | 1995-05-10 |
| BE903800A (fr) | 1986-06-05 |
| FR2574429A1 (fr) | 1986-06-13 |
| IT8548874A0 (it) | 1985-12-04 |
| DE3543267A1 (de) | 1986-08-28 |
| IT1181742B (it) | 1987-09-30 |
| DE3543267C2 (de) | 1995-05-11 |
| LU86195A1 (fr) | 1986-06-25 |
| FR2574429B1 (fr) | 1987-12-11 |
| GB2168365B (en) | 1988-08-10 |
| CH669386A5 (nl) | 1989-03-15 |
| GB8530117D0 (en) | 1986-01-15 |
| GB2168365A (en) | 1986-06-18 |
| US4751218A (en) | 1988-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gautam et al. | Immunoadjuvant potential of Asparagus racemosus aqueous extract in experimental system | |
| KR100780521B1 (ko) | 미국산 인삼 분획물을 만드는 방법과 이를 함유하는생산물, 및 면역 조절제로서 미국산 인삼 분획물의 이용 | |
| Leung et al. | The isolation and characterization of an immunomodulatory and anti-tumor polysaccharide preparation from Flammulina velutipes | |
| AU616670B2 (en) | Saponin adjuvant | |
| Xu et al. | Antitumor and immunomodulatory activity of polysaccharides from the roots of Actinidia eriantha | |
| Xu et al. | Chemical composition and antitumor activity of different polysaccharides from the roots of Actinidia eriantha | |
| JP2004505925A (ja) | 免疫調節特性を示すクロレラ調製物 | |
| AU2007227383A1 (en) | Extracts and methods comprising ganoderma species | |
| DE2331144A1 (de) | Wasserloesliche extrakte von mycobacterien | |
| KR20100067305A (ko) | 낙엽진흙버섯으로부터 추출한 항바이러스 활성을 갖는 약학조성물 | |
| DE4330773A1 (de) | Blockierung der Anlagerung von Keimen an menschliche Zellen | |
| NL8503367A (nl) | Uit klebsiella geextraheerde acylglycanen, werkwijze voor hun verkrijging, hun toepassing als geneesmiddelen en de preparaten die ze bevatten. | |
| CN111410698A (zh) | 骆驼刺糖聚合物及其制备方法和应用 | |
| DK148828B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af polysaccharider med antigen og immunostimulerende virkning | |
| JPH0539305A (ja) | アストラガルス・メンブラナセウスから抽出した免疫 変調性多糖類及びこれらを含有する薬剤組成物 | |
| JP2001504144A (ja) | Ｇｂｓトキシン／ｃｍ１０１の精製方法 | |
| US5336666A (en) | Immunostimulant drug based on polar glyopeptidolipids of mycobacterium chelonae | |
| CH639395A5 (fr) | Glycoproteines constitutives d'hafnia, procede de preparation et compositions pharmaceutiques. | |
| JP2602295B2 (ja) | 多糖類，その単離法および該多糖類を含む薬剤組成物 | |
| HU185315B (en) | Siliconpolymer compositions for treating textile materials | |
| Mizushiri et al. | Chemical characterization of lipopolysaccharides from Proteus strains used in Weil-Felix test | |
| RU2028381C1 (ru) | Способ получения сульфатированного производного галактана | |
| JPH1149801A (ja) | 微生物由来の新規多糖類 | |
| IE56612B1 (en) | New process for the preparation of immuno-stimulating acylglycoproteins extracted from klebsiella pneumoniae and anti-allergic pharmaceutical compositions | |
| JPH0345601A (ja) | クレブシエラ属から抽出されたガラクタン、その製造方法及び薬剤としての使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: THE BOOTS COMPANY PLC |
|
| BN | A decision not to publish the application has become irrevocable |