DK148828B - Fremgangsmaade til fremstilling af polysaccharider med antigen og immunostimulerende virkning - Google Patents

Fremgangsmaade til fremstilling af polysaccharider med antigen og immunostimulerende virkning Download PDF

Info

Publication number
DK148828B
DK148828B DK475978AA DK475978A DK148828B DK 148828 B DK148828 B DK 148828B DK 475978A A DK475978A A DK 475978AA DK 475978 A DK475978 A DK 475978A DK 148828 B DK148828 B DK 148828B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
polysaccharides
product
days
haemophilus influenzae
antigen
Prior art date
Application number
DK475978AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK148828C (da
DK475978A (da
Inventor
Claudine Brossard
Martine Henry
Denis Raichvarg
Original Assignee
Roussel Uclaf
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roussel Uclaf filed Critical Roussel Uclaf
Publication of DK475978A publication Critical patent/DK475978A/da
Publication of DK148828B publication Critical patent/DK148828B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK148828C publication Critical patent/DK148828C/da

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/21—Haemophilus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Description

148828
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte polysaccharider som angivet i krav l’s indledning.
Polysaccharider extraheret fra visse stammer af Haemophilus influenzae er beskrevet i litteraturen.
Således beskriver en artikel fra 1971 i Journal of Immunology (bd. 107, nr. 4, oktober 1971, side 1071-1080) fremstillingen af sådanne polysaccharider ud fra bakterielle kapsler af en stamme af Haemophilus influenzae af serotype b.
Ifølge denne offentliggørelse skal størstedelen af de virkninger, som forårsages af Haemophilus influenzae, såvel hos voksne som hos børn, og navnlig i tilfælde af meningitis skyldes tilstedeværelsen af et toxin af polysaccharidkarakter, som er til stede i kapslerne af Haemophilus influenzae af serotype b.
Genstanden for denne offentliggørelse er således at fremstille en kapsulær ekstrakt og derefter fra denne ekstrakt at eliminere endotoxinet og de pyrogene stoffer ved deproteine-ring med henblik på at finde et middel til de førnævnte reaktioner.
Til udførelse af en sådan fremstilling søger forfatterne overvejende at fremstille den kapsulære form af Haemophilus influenzae for deraf at isolere det søgte produkt. Skematisk går de frem ved formaldehydbehandling efterfulgt af en fældning med ethanol og derefter en søjleeluering.
Ifølge angivelserne i den nævnte artikel udgøres det opnåede polysaccharid af et polyribosephosphat med glycosid-bindinger mellem C^- og C^-atomerne i furanosidformen af D-ribose.
Ifølge denne artikel har det opnåede polysaccharid mistet sine toksiske egenskaber, medens det har bevaret sine specifikke antigene og immuniserende egenskaber over for Haemophilus influenzae.
Det har nu vist sig, at man ikke mere ud fra kapsler af Haemophilus influenzae, men ud fra cellerne selv kan isolere et detoxificeret toxin af polysaccharidkarakter, som frembyder antigene og immunostimulerende egenskaber samt en god tolerance, og som kan benyttes i behandlingen eller forebyggelsen af lidelser fremkaldt af Haemophilus influenzae samt i behandlingen af 148828 2 forskellige åndedrætslidelser eller bronchitis. Disse hidtil ukendte polysaccharider har en tilsyneladende molekylvægt over 200.000 og er i hovedsagen opbygget af gallactose, glucose og mannose.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del anførte.
Den tilsyneladende molekylvægt er molekylvægten bestemt ved hjælp af en porøs gel, som er standardiseret ved hjælp af kendte makromolekylære opløsninger.
Blandt standardiserede porøse geler, som tillader molekylær sortering, kan nævntes Sephadex (indregistreret varemærke) (Sephadex G 200) og agarosegeler (Sepharose 4B, indregistreret varemærke).
Betegnelsen polysaccharider bestående i hovedsagen af gallactose, glucose og mannose angiver, at disse polysaccharider indeholder mindst 40-50% af disse hexoser, især omkring 44,5% (bestemt efter den korrigerede orcinolmetode).
Polysacchariderne, som fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indeholder desuden en lille mængde hexosaminer, især glucosamin.
Det efter Elson Morgan bestemte indhold af hexosaminer er for de omhandlede polysaccharider i nærheden af 2%.
Disse forbindelser indeholder desuden spor af pentoser, men indeholder ikke hverken heptoser eller uronsyrer.
Disse produkter indeholder heller ikke diaminopimelin-syre. Fraværet af diaminopimelinsyre i polysacchariderne defineret som ovenfor angiver, at der ikke forekommer nogen forurening med peptidoglycaner fra membranvæggen.
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis stammer af Haemophilus influenzae deponeret i Pasteur-in-stituttet i Paris under numrene 52.151 og 5481, især den stamme, som er deponeret i Pasteur-instituttet i Paris under nr. 52.151.
Disse stammer tilhører serotype a.
Stammerne af Haemophilus influenzae kan navnlig dyrkes i omrørt væskeformet miljø under aerobe betingelser. De benyttede dyrkningsmiljøer er de sædvanlig for disse stammer.
148828 3
Disse miljøer kan f.eks. omfatte kødekstrakter, caseinpepton, gærautolysater, sojapapainpepton, sukkerarter, uorganiske elementer, hemin, coenzym I og destilleret vand.
Man høster cellerne efter fuldstændig udvikling, dvs. efter ca. 6 timer, ved en temperatur på 37°C.
De mikrobielle celler vaskes derefter.
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres ekstraktionen fortrinsvis ved en temperatur i nærheden af 65°C.
Rensningen af det urene råprodukt består fortrinsvis i at fælde nucleinsyrerne med streptomycinsulfat.
Det i den overliggende væske tilstedeværende streptomycinsulfat kan med fordel elimineres ved dialyse på en porøs membran. Den porøse membran kan foreligge i form af en hul fiberpatron såsom fibrene "Hollow fiber" H^DP^q, som har en tærskel for tilbageholdelse af stoffer, hvis molekylvægt er over 10.000.
Det således rensede produkt kan med fordel lyofiliseres.
Den forsigtige hydrolyse af det rensede produkt udføres fortrinsvis i varmen i et vandigt-organisk opløsningsmiddel i nærværelse af en ionbytterharpiks.
Den forsigtige hydrolyse af det rensede produkt kontrolleres ved Schwartzman's reaktion (påvisning hos kaniner af en lokal ikke-specifik hypersensibilitet, som ytrer sig ved en ændring af endothelium af de kutane kar og en leucocytær infiltration af væggen af de små kar).
Den forsigtige hydrolyse af det rensede produkt udføres med fordel ved tilbagesvalingstemperatur i en blanding af vand og chloroform i nærværelse af en ionbytterharpiks som f.eks. Dowex (indregistreret varemærke) 50 W x 8, 200-400 mesh H+ nr. 41631.
Den forsigtige hydrolyse standses, når Schwartzman's reaktion bliver negativ. Under forsøgets betingelser bliver denne reaktion negativ efter ca. 15 timers forløb. Det opnåede produkt kan derpå med fordel lyofiliseres.
De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede produkter har meget interessante farmakologiske egenskaber.
De har navnlig bemærkelsesværdige antigene og immunostimulerende egenskaber. De har desuden en meget god tolerance.
148828 4
Disse egenskaber er illustreret nedenfor i den eksperimentelle del.
Disse egenskaber retfærdiggør anvendelsen af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede polysaccharider som medikamenter.
Disse medikamenter finder f.eks. anvendelse i behandlingen eller forebyggelsen af sygdomme fremkaldt af Haemophilus influenzae og i behandlingen og forebyggelsen af åndedrætslidelser, bronchitis og kronisk bronchitis.
Den normale dosis, som varierer efter det benyttede produkt, den behandlede patient og den pågældende lidelse,* kan f.eks. være fra 1 til 100 mikrogram pr. dag ad perlingual vej hos mennesker.
Som medikamenter kan de omhandlede polysaccharider inkorporeres i farmaceutiske præparater beregnet til indgift ad fordøjelsesvejen eller parenteralt eller lokalt.
De farmaceutiske præparater fremstilles efter gængse metoder og kan f.eks. være faste eller flydende og foreligge i de i den humane medicin gængs benyttede farmaceutiske former såsom f.eks. uoversukrede eller oversukrede tabletter, gela-' tinekapsler, granulater, stikpiller og injektionspræparater.
De fremstilles efter gængse metoder. Den eller de aktive bestanddele kan inkorporeres deri sammen med i disse farmaceutiske præparater normalt benyttede tilsætningsstoffer såsom taikum, gummi arabicum, lactose, stivelse, magnesiumstearat, kakaosmør, vandige eller ikke-vandige bærestoffer, fedstdffer af animalsk eller vegetabilsk oprindelse, paraffinderivater, glycoler og diverse fugte-, dispergerings- eller emulgerings-midler samt konserveringsmidler.
Nedenstående eksempel illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Eksempel
Trin A: Dyrkning
Ved simpel blanding af de forskellige bestanddele fremstiller man et næringsmiljø efter recepten: 5 148828 - kødekstrakt 5 g - natriumchlorid 5 g - caseinpepton 5 g - gærautolysat 5 g - dikaliumphosphat 3,5 g - monokaliumphosphat 1,5 g - sojapapainpepton 20 g - destilleret vand ad 1000 ml
Man Indstiller pH-rørdien på 7,4-7,6 og steriliserer miljøet. Man poder miljøet ved hjælp af en stamme af Haemophilus influenzae (Pasteur-instituttet serotype a nr. 52.151) og tilsætter 10 g glucose, 1 mg hemin og 1,5 mg coenzym I. Man holder ved 37°C i varmeskab i 24 timer.
Man indfører det ovenfor opnåede podemateriale i 10 liter næringsmiljø med samme sammensætning som angivet ovenfor og indeholdende de samme tilsætningsstoffer.
Efter 16 timer ved 57°C får man en forkultur, som man benytter til podning af 80 liter af et næringsmiljø med samme sammensætning som angivet ovenfor, hvorpå man tilsætter 800 g glucose, 120 mg hemin og 160 mg coenzym I samt 2,8 liter moderopløsning med følgende sammensætning for 10 liter: 1 liter gærekstrakt, 400 g glucose i 1 liter vand, vand ad 10 liter, pH-værdi indstillet på 8.
Man lader fermentere i 6 timer, hvorpå man centrifugerer kontinuerligt ved 30.000 omdrejninger pr. minut. Man får 130 g fugtige celler.
Trin B: Ekstraktion af cellerne
Til 100 g fugtige celler opnået ovenfor sætter man 870 ml afmineraliseret vand opvarmet til 68°C og 870 ml 90%'s phenol ligeledes opvarmet til 68°C. Man omrører ved 2000 omdrejninger pr. minut og lader blandingen henstå ved 68°C i 30 minutter.
Man opbevarer blandingen 12 timer ved 4°C, skiller phenol-og vandfasen fra hinanden ved kontinuerlig centrifugering (på Westfalia-centrifuge) og klarer derpå den vandige fase.
Man foretager en anden ekstraktion af phenolfasen, idet man tilsætter det ved ovenstående centrifugering opnåede slam og afmineraliseret vand til opnåelse af samme rumfang som ved 148828 6 den første ekstraktion. Man omrører som ovenfor 30 minutter ved 68°C, lader henstå 12 timer ved 4°C og centrifugerer.
Man får de to vandige faser 'hidrørende fra ekstraktionerne og dialyserer dem i 4 dage til eliminering af phenolet.
Efter elimineringen af phenolet forener man de vandige faser, inddamper dem på Amicon-membran (membran H-^DP-^q med en tærskel for tilbageholdelse af stoffer, hvis molekylvægt er over 10.000), idet man reducerer rumfanget til 3,5 liter.
Man centrifugerer ved 4°C ved 12.000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter, samler den vandige fase og lyofiliserer.
Der fås 6 g af et råprodukt, som foreligger i form af et fnugagtigt hvidt pulver.
Trin C: Rensning af råproduktet
Til 1200 ml af en opløsning indeholdende 5 mg/ml råprodukt fremstillet ovenfor sætter man langsomt i løbet af ca. 45 minutter og under kraftig omrøring 240 ml af en 2,5%’s opløsning af streptomycinsulfat. Man fælder således nuclein-syrerne.
Man lader henstå 15 minutter og centrifugerer ved 12.000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter ved 4°C. Man samler den vandige fase, eliminerer streptomycinsulfatet fra den overliggende væske ved dialyse på porøs membran (Hollow fiberpatron H-jDP10) med en tærskel for tilbageholdelse af stoffer, hvis molekylvægt er over 10.000.
Man lyofiliserer derpå det således opnåede rensede produkt og får 1,3 g af det rensede produkt.
Analyse: C% 40,26 H% 6,84 N% 6,53 Indhold af: - proteiner (Lowryrs metode) 9,5% - neutrale hexoser (orcinolmetode) 41 % - neutrale hexoser (korrigeret orcinolmetode) 35 % t uronsyrer (korrigeret carbazol) 6,8% - hexosaminer (Elson Morgan’s metode) 5»6% - pentoser (Bial’s metode) 1 %
Trin D: Hydrolyse I 650 ml vand opløser man de 1,3 g ovenfor opnåede renset produkt, omrører ved 4°C i 12 timer og centrifugerer derpå i 20 minutter.
148828 7
Man samler den overliggende væske, tilsætter 650 ml chlorofom og 510 g Dowex-harpiks (50 ¥ x 8 200-400 mesh H+) frasuget på Biichner-tragt.
Man opvarmer blandingen til tilbagesvaling i 15 timer, hvilket er den fornødne tid til opnåelse af, at Schwartzman's reaktion bliver negativ, eliminerer chloroformet ved inddamp-ning under vakuum ved 40°C og lyofiliserer derpå.
Der fås 0,65 g polysaccharider ekstraheret fra mikrobielle enheder af Haemophilus influenzae.
Analyse: C% 40,02 H% 6,53 N% 0,90 Indhold af: - proteiner . (Lowry's metode) 1 % (ca. 1,9%) - neutrale oser (korrigeret orcinolmetode) 44,5?·% (ca.83,4%) - uronsyrer (korrigeret carbazol) 0 % - osaminer (Elson Morgan's metode) 2 % (ca. 3,7%) - pentoser (Bial's metode) 0,8 % (ca. 1,5%) - heptoser (Dische's metode) 0 % - undersøgelse for diaminopimelinsyre: negativ - identifikation af neutrale hexoser (ved chromatografi på celluloseacetat, silicagel, papir): tilstedeværelse af gallactose, glucose, mannose - identifikation af hexosamin ved elektroforese: tilstedeværelse af gluc.osamin.
De i parentes angivne procentværdier er omregnet i forhold til en sum på 100% med et fugtighedsindhold på ca. 9,3%.
Farmakologisk, undersøgelse I. Bestemmelse af antigen aktivitet • Den·· antigene · aktivitet -af dét opnåede produkt påvis'es over for ét .anti-(Haemophilus influenzae type a)-serum.
Denne påvisning udføres gennem i immunologien gængs benyttede undersøgelser, nemlig gennem en "ringtest", gennem passiv hemagglutination, ved agglutination af kim, ved Ouchter-lony's teknik og ved tilvejebringelse af fældningskurve.
Ved disse forskellige undersøgelser har det fremstillede produkt givet værdier for passiv hemagglutination indtil 1/128 og 1/256.
148828 8 II, Påvisning af immunogen styrke
Kaniner af racen Fauve de Bourgogne deles i 6 hold. Hvert hold modtager ad interkostal og intravenøs vej en dosis af produktet fra trin D lig med 1, 10 og 100 mpg/kg. En serie på 3 kaniner modtager produktet fra trin D uden hjælpestof. Den anden serie immuniseres ved hjælp af produktet fra trin D plus komplet Freund's hjælpestof. En injektion af produktet foretages hver 30. dag. Der foretages hlodudtagning på tidspunkterne : t0 - %-38 dage ~^+b7 dage -"t+74 dage ~^+7& dage ”^+101 dage %-105 dage _t+130 dage.
Tilstedeværelsen af specifikke antistoffer detekteres fra og med den 38. dag og forøges efter gentagelserne, idet de efter denne immunisering fundne værdier far hemmaggluti-nation er 1/128 og 1/256. Serum undersøges ved “ringtesf*-teknikken, ved aggluminationsteknikken og ved. dem kvantitative fældnings teknik.
Man noterer ingen forskel mellem dyrene·, som er vaccineret med produktet fra trin D alene·, og dem, der er vaccineret med produktet fra trin D plus Freund's hjælpestof.
III, Opsoniner
Denne teknik har til formål ved tø lorimetermetoden at påvise leucocytterm.es evne til at phagocytere bakterier.
Man antager ved denne bestemmelse, at 0§£- opsonisering er lig med en optisk tæthed på 0,050, og at XG0S& opsonisering er lig med en maksimal optisk tæthed på 0,25©«
Efter at have foretaget beregningen, konstaterer man, at opsoniseringsprocenten hos dyr, der er immuniseret med produktet fra trin D, varierer mellem 50 og 70$, idet opsoniseringsprocenten hos kontroldyrene er 0.
IV, Påvisning af baktericid evne af serum
Kaninserum immuniseret med produktet fra trin D bringes i kontakt med en kultur af Haemophilus influenzae i forskellige fortyndinger. Efter podning på et gelosemiljø og dyrkning konstaterer man antallet af levende kolonier med følgende kontrol: 148828 9
- kanin før immunisering t = O
(positiv kontrol = 0% dødelighed for bakterierne) - serum af kanin vaccineret med kimene af Haemophilus influenzae (negativ kontrol = 100% dødelighed).
Man kan notere en meget regulær forøgelse af den bakteriel de evne som en funktion af tiden.
tQ = 0% dødelighed af bakterierne t38 dage = 0% t47 dage = 0% ^52 dage = 80% dødelighed af bakterierne 74 dage ) t ) 76 dage ^ mellem 75 og 80% ^.01 dage = 83% ^30 dage = 100%
Kontrol: anti-H.i.-serum = 100%.
Denne undersøgelse viser den specifikke aktivitet af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede produkt.
V. Neutralisation af den endotoxiniske aktivitet lokalt
Produktet fra trin D indgivet på kaniner antagoniserer den lokale aktivitet af Haemophilus influenzae ved at neutralisere aktiviteten af et produkt, som udløser en lokal reaktion (Schwartzman’s reaktion).
VI. Undersøgelse af akut toksicitet
Den akutte toksicitet bestemmes på et hold på 10 mus.
Efter indgift ad intraperitoneal vej er den letale dosis 50, DL^q, af produktet fra trin D mellem 65 og 110 mg/kg.
DK475978A 1977-10-27 1978-10-26 Fremgangsmaade til fremstilling af polysaccharider med antigen og immunostimulerende virkning DK148828C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR7732416 1977-10-27
FR7732416A FR2407262A1 (fr) 1977-10-27 1977-10-27 Nouveaux polysaccharides extraits de corps microbiens d'haemophilus influenzae, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces nouveaux produits

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK475978A DK475978A (da) 1979-04-28
DK148828B true DK148828B (da) 1985-10-14
DK148828C DK148828C (da) 1986-03-17

Family

ID=9197013

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK475978A DK148828C (da) 1977-10-27 1978-10-26 Fremgangsmaade til fremstilling af polysaccharider med antigen og immunostimulerende virkning

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4210641A (da)
EP (1) EP0001945B1 (da)
JP (1) JPS5558097A (da)
CA (1) CA1093963A (da)
DE (1) DE2860565D1 (da)
DK (1) DK148828C (da)
FR (1) FR2407262A1 (da)
IE (1) IE47885B1 (da)
IT (1) IT1106073B (da)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5626198A (en) * 1979-08-08 1981-03-13 Takara Shuzo Co Ltd Preparation of antitumor substance
FR2510606A1 (fr) * 1981-07-30 1983-02-04 Berri Balzac Procede d'obtention de polyosides capsulaires, polyosides capsulaires ainsi obtenus et leur application a la preparation de vaccins
US5097020A (en) * 1983-07-05 1992-03-17 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4673574A (en) * 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US5360897A (en) * 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4496538A (en) * 1982-07-06 1985-01-29 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4762713A (en) * 1983-07-05 1988-08-09 The University Of Rochester Boosting of immunogenic conjugate vaccinations by unconjugated bacterial capsular polymers
US4808700A (en) * 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
JPS61257930A (ja) * 1985-05-09 1986-11-15 Morinaga Milk Ind Co Ltd 感染防御剤
GB8520101D0 (en) * 1985-08-09 1985-09-18 Unilever Plc Phase separation
US20060039899A1 (en) * 2004-08-23 2006-02-23 Winn Robert T Animal nutritional product that increases weight gain and reduces diarrhea morbidity, mortality and severity by stimulation of natural immune response, nutritional support of immune function and supplemental nutricines and probiotics
AR055311A1 (es) 2006-02-17 2007-08-15 H P B S A Composicion farmaceutica solida para el tratamiento de la hiperplasia benigna de prostata, procedimiento para su elaboracion y metodo de tratamiento
US10702596B2 (en) * 2017-07-05 2020-07-07 Inventprise, Llc Polysaccharide purification for vaccine production using lytic enzymes, tangential flow filtration, and multimode chromatography

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB725938A (en) * 1952-01-24 1955-03-16 Wander A G A Method of preparing substantially protein-free polysaccharides from micro-organisms
GB1053144A (da) * 1963-05-14
US3314801A (en) * 1963-10-24 1967-04-18 Martin C Cadmus Microbial polysaccharide and process
DE1568320C3 (de) * 1966-08-19 1975-09-18 Byk-Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh, 7750 Konstanz Kosmetischer Wirkstoff und kosmetisches Mittel mit wasserretinierenden Eigenschafte n
US4003792A (en) * 1967-07-01 1977-01-18 Miles Laboratories, Inc. Conjugates of acid polysaccharides and complex organic substances
NL174267B (nl) * 1969-05-20 Roussel Uclaf Verbetering van de werkwijze voor de bereiding van een somatisch antigeen volgens het nederlandse octrooischrift 169754 en werkwijze ter bereiding van een farmaceutisch preparaat.
US3711462A (en) * 1970-04-01 1973-01-16 Mobil Oil Method of clarifying polysaccharide solutions
US3923782A (en) * 1973-05-29 1975-12-02 Cornell Res Foundation Inc Production of heteropolysaccharide by fermentation of methanol

Also Published As

Publication number Publication date
IT7851659A0 (it) 1978-10-26
IE782127L (en) 1979-04-27
FR2407262B1 (da) 1980-05-16
DK148828C (da) 1986-03-17
CA1093963A (fr) 1981-01-20
DE2860565D1 (en) 1981-04-16
IE47885B1 (en) 1984-07-11
JPS5558097A (en) 1980-04-30
DK475978A (da) 1979-04-28
FR2407262A1 (fr) 1979-05-25
IT1106073B (it) 1985-11-11
EP0001945A1 (fr) 1979-05-16
EP0001945B1 (fr) 1981-03-25
US4210641A (en) 1980-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3992730B2 (ja) グルカンの酵素処理
DK148828B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af polysaccharider med antigen og immunostimulerende virkning
US4948785A (en) Plant polysaccharide fractions inducing prolactin in mammals
Górska et al. Structural and immunochemical studies of neutral exopolysaccharide produced by Lactobacillus johnsonii 142
FI110164B (fi) Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi
EP0220387B1 (de) Konjugatimpfstoffe gegen Infektionen durch gramnegative Bakterien, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendung derselben
EP0135820B1 (en) Antitumor agent
FI74474B (fi) Foerfarande foer framstaellning av nya, ur klebsiella pneumoniae extraherade glykoproteiner.
EP0041897B1 (en) Polysaccharide antigen from streptococcus and vaccines
CZ70896A3 (en) Pharmaceutical preparation and the use of galacturonides for preparing thereof
US20070031447A1 (en) Method of isolating biologically active fraction containing clinically acceptable native S-lipopolysaccharides obtained from bacteria producing endotoxic lipopolysaccharides
EP0015175A1 (fr) Médicament constitué de Pichia ou d'extraits de Pichia
CN101014698A (zh) 作为多种疫苗候选物的保守性内核脂多糖表位
SU1732815A3 (ru) Способ получени гипотриглицеридально-активных полисахаридов
Sengupta et al. Antibody against the capsule of Vibrio cholerae O139 protects against experimental challenge
DE3543267C2 (de) Acylglykan-Extrakte von Klebsiella, deren Gewinnungsverfahren und deren Verwendung als Arzneimittel
Nigam Effect of core lipopolysaccharides from Salmonella minnesota R mutants on the survival times of mice bearing Ehrlich tumor
GB2077101A (en) Antiallergic composition containing streptococci
US20240148778A1 (en) Glycoside inhibitors of yeast
Rebers et al. The effect of formalin-killing of Pasteurella multocida on the antigenicity and extractability of its lipopolysaccharide
RU2076734C1 (ru) Способ получения пероральной химической вакцины
JPH07330806A (ja) 中性多糖体及びその用途
Lugowski Immunotherapy in gram-negative bacterial infections.
JP4165690B2 (ja) インターロイキン１２産生促進組成物の製造方法
Bandekar et al. Biological Activities of Lipid A from Vibrio parahaemolyticus Stimulation of Murine Peritoneal Macrophages

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed