DE3543267C2

DE3543267C2 - Acylglykan-Extrakte von Klebsiella, deren Gewinnungsverfahren und deren Verwendung als Arzneimittel

Info

Publication number: DE3543267C2
Application number: DE3543267A
Authority: DE
Inventors: Pierre Smets; Rene Zalisz
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Boots Co PLC
Priority date: 1984-12-06
Filing date: 1985-12-06
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2005-12-07
Also published as: DE3543267A1; BE903800A; JPS61140524A; GB2168365B; FR2574429B1; GB8530117D0; FR2574429A1; JPH0742322B2; LU86195A1; US4751218A; IT8548874A0; IT1181742B; NL8503367A; CH669386A5; GB2168365A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Acylglykan-Extrakte von Klebsiella, deren Gewinnungsverfahren, deren Ver wendung als Arzneimittel und diese enthaltenden Zusam mensetzungen.

In einer bestimmten Anzahl französischer Patentschriften wurden Glykoprotein-Extrakte lysierter Mikroorganismen körper von Klebsiella und/oder deren Herstellungsverfah ren beschrieben. Dies trifft beispielsweise für die FR-PSen 2 043 475, 2 088 112, 2 171 907, 2 462 477, 2 490 495, 2 490 496 und 2 540 136 zu.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue bakterielle Ex trate und hat somit Acylglykan-Extrakte von Klebsiella zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie im wesentlichen aus etwa 80% neutralen Osen und 20% Lipiden, die weniger als 2% Proteine enthalten, bestehen und ein Molekulargewicht von etwa 12 500 besitzen.

Mit neutralen Osen bezeichnet man Osen, die keinen basi schen oder sauren Rest besitzen, insbesondere neutrale Hexosen, wie Glucose, Galactose oder Mannose.

Sie werden nach der Methode von Tillmans und Philippi (Biochem. Z., 1929, 215, 36), die von Rimington (Biochem. J., 1931, 25, 1062) modifiziert wurde, bestimmt.

Die Proteine werden nach der Methode von Lowry (J. Biol. Chem. 1951, 193, 265-273) bestimmt.

Die Lipide werden durch Chromatographie in der Gasphase nach Methanolyse bestimmt.

Das Molekulargewicht der Acylglykane der vorliegenden Erfindung wurde durch Filtration an hydrophilem und unlöslichem Gel auf Dextran-Basis, wie Sephadex®, mit einer chromatographischen Schwelle bzw. Retentionsschwelle entsprechend 50 000 bestimmt.

Die bevorzugten Acylglykane sind diejenigen, bei denen die Osen in den folgenden, annähernden, relativen Anteilen je 1 Glucose vorliegen: etwa 4 Galactose, etwa 1 Man nose und etwa 1 Heptose. Diese Bestimmung kann beispiels weise durch Chromatographie in der Gasphase erfolgen.

Bevorzugtere Acylglykane enthalten eine Galactosenkette mit β 1→ 3-Verknüpfungen mit einem Molekulargewicht von etwa 9000.

Die erfindungsgemäßen Acylglykane können Extrakte von verschiedenen Klebsiella-Gattungen sein. Man greift in dessen insbesondere auf diejenigen zurück, die Klebsiella pneumoniae entstammen, und vor allem auf diejenigen, die dem Stamm entstammen, der in der Collection Nationale de Culture de Microorganis mes die Nummer I-163 besitzt. Dieser Stamm befindet sich seit langem im Handel und ist der Öffentlichkeit frei verfügbar, insbesondere über das Pasteur-Institut in Paris unter der Referenz 52145. Dieser Stamm wurde überdies von der Anmelderin am 25. Juni 1981 unter der Nr. I-163 im Institut Pasteur (noch bezeichnet als Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) hinterlegt.

Außer durch die Osen und Lipide sind die erfindungsge mäßen Acylglykane durch die Anwesenheit von 2-Keto-3- desoxy-octolonsäure, von Glucosaminen, von Phosphaten, von α- und β-Hydroxy-myristinsäure und von Palmitinsäure gekennzeichnet.

Die erfindungsgemäßen Acylglykane liegen in Form eines wasserlöslichen, geruchlosen, weißen Pulvers vor.

Wie alle Moleküle biologischen Ursprungs, sind sie hydra tisiert oder sind leicht hydratisierbar. Ihr Infrarot- Spektrum ist somit nicht charakteristisch, wobei die zahlreichen Peaks untereinander verschmelzen. Ihr Schmelzpunkt ist nicht charakteristischer, da es sich um eine Carbonisierung handelt, die innerhalb eines breiten Temperaturbereichs erfolgt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung von Acylglykanen, wie vorstehend definiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen wasser löslichen Bakterienextrakt von Klebsiella, der 30 bis 45% Proteine, 30 bis 40% neutrale Osen, einen geringen Anteil an Uronsäuren, 2 bis 5% Osamine umfaßt und ein Molekulargewicht von etwa 350 000 aufweist, mit einem Detergens behandelt, auf etwa 80°C erhitzt, an hydro phobem, verzweigtem Siliciumdioxid chromatographiert und die dem Elutionspeak entsprechende Fraktion, die durch Spektrometrie bei 200 nm festgestellt wird, bei 280 nm verschwindet und bei 492 nm nach Färbung mit Phe nolschwefelsäure erscheint, zurückgewinnt.

Unter einem geringen Anteil an Uronsäuren versteht man weniger als 6% Uronsäuren und vorzugsweise weniger als 4%.

Die wasserlöslichen Bakterienextrakte von Klebsiella, von denen das Verfahren ausgeht, können insbesondere er halten werden durch Kultivierung von der Gattung Klebsiella angehörenden Stämmen, Lyse der Stämme, Trock nung, Delipidation durch Extraktion mit Lösungsmitteln für Lipide, Ultrafiltration, Behandlung der so erhalte nen, wäßrigen Lösung mit einem quaternären Ammoniumsalz, Eliminierung des Niederschlags, danach entweder Behand lung des Überstands in der Kälte mit einem Alkanol mit niedrigem Molekulargewicht, Isolierung, danach Auflösung in Wasser, Dialyse und Trocknung des erhaltenen Produkts, Wiederauflösung, Filtration an einem Gel, anschließende Isolierung der ersten eluierten Fraktion und Trocknung oder Einengung des Überstands unter Verwendung von wenig stens einer Vorrichtung bzw. Maßnahme zur Selektionie rung von Molekülen, Behandlung des Konzentrats in der Kälte mit einem Alkanol und Isolierung des erhaltenen Niederschlags.

Derartige Herstellungen wurden bereits insbesondere in der FR-PS 2 490 496 und in der europäischen Patentanmel dung Nr. 0.049.182, die unter der Nr. 29.070 E von Derwent Publications Farmdoc book Nr. 1500 vom 2. Juni 1980 veröffentlicht wurde, sowie in der FR-PS 2 540 136 beschrieben.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Ver fahren zur Gewinnung von Acylglykanen, wie vorstehend definiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsiella, der wie vorstehend hergestellt wurde, mit einem Deter gens behandelt, auf etwa 80°C erhitzt, an verzweigtem, hydrophobem Siliciumdioxid chromatographiert, die dem dritten Elutionspeak entsprechende Fraktion, der durch Spektrometrie bei 200 nm festgestellt wird, bei 280 nm verschwindet und bei 492 nm nach Färbung mit Phenol schwefelsäure erscheint, zurückgewinnt.

Andere wasserlösliche Bakterien-Ausgangsextrakte von Klebsiella, die für die Durchführung des Verfahrens ge eignet sind, werden beispielsweise durch Kultivierung von Stämmen, Lyse der Stämme durch Zerkleinerung, frak tioniertes Zentrifugieren, um die Zellenbruchstücke unter einer Beschleunigung etwa 8000 g, danach die Membranen unter einer Beschleunigung von 20 000 bis 40 000 g zu sedimentieren, Abtrennung des rohen Extrakts durch fraktioniertes Zentrifugieren in Salzlösung und in Wasser, Behandlung mit einer Base oder einem Hypo bromit, Eliminierung von Reagensüberschuß und unlösli chem Rückstand, Behandlung mit einer wäßrigen Essig säurelösung bei einer Temperatur von 70 bis 100°C, Eli minierung der unlöslichen Fraktion, Delipidation durch Extraktion mit Lösungsmitteln für Lipide, Behandlung mit Lysozym, Abtrennung der Fraktion mit einem Moleku largewicht von etwa 350 000 und Trocknen. Ein Beispiel für eine derartige Herstellung findet sich z. B. in der europäischen Anmeldung Nr. 0 089 266.

Die Produkte, die Detergenseigenschaften besitzen, sind gut bekannt. Es handelt sich z. B. um quaternäre Ammo niumsalze, insbesondere um quaternäre Ammoniumhalogenide, wie Tetraethylammoniumjodid, N-Hexadecyl-N,N-dimethyl benzol-methanaminiumchlorid, N-Hexadecyl-2-hydroxy-N,N, N-trimethyl-1-hexadecanaminiumbromid, die N,N,N-Trime thyl-1-hexadecanaminiumhalogenide oder die Cetylpyridi niumhalogenide.

Es handelt sich auch um Alkalisulfate oder -sulfonate vom Alkylester- oder Alkarylester-Typ, wie das Natrium dioctylsulfosuccinat, das Natriumdodecylbenzolsulfonat, das Natriumdodecylsulfat, das Natriumtetradecylsulfat, das Lithiumdodecylsulfat, die Polyethylenglykol-mono- (nonylphenyl)-ether, wie Triton N®, die Polyethylen glykol-p-isooctylphenylether, wie Triton X®, oder die Polymeren von 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-phenol mit Formaldehyd und Oxiran, wie Triton® A20.

Vorzugsweise handelt es sich um ein Alkalisulfat vom Alkylester-Typ, wie Natriumdodecylsulfat.

Das Detergens wird in Lösung in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel verwendet, das dem Deter gens dessen detersive Eigenschaften beläßt, vorzugs weise in Lösung in Wasser. Entsprechend der Detergens stärke wird es in einer Konzentration von etwa 1% im Falle von sehr starken Detergensprodukten, wie Natrium dodecylsulfat, verwendet oder konzentrierter, z. B. 2 bis 10% im Falle von quaternären Ammoniumsalzen.

Die Temperatur von etwa 80°C wird einige Minuten, vor zugsweise etwa 5 Minuten, beibehalten.

Das für die Chromatographie verwendete Siliciumdioxid gel besteht aus Siliciumdioxid, dem hydrophobe Gruppen, vorzugsweise von Fettsäuren, aufgepfropft sind. Die Fettsäuren können z. B. C_3-30- und insbesondere C_3-20- Fettsäure sein. Vorzugsweise verwendet man das unter der Bezeichnung Aquapore® RP300 in den Handel gebrach te Gel C₈.

Die Bestimmung der interessanten Fraktion von Kohlenhydrat- Natur, die im wesentlichen von Proteinen frei ist, er folgt beispielsweise durch Spektrophotometrie bei 200 nm (Nachweis der Kohlenhydrate und von Proteinen), 280 nm (allei niger Nachweis der Proteine), 492 nm nach Färbung mit Phenolschwefelsäure (alleiniger Nachweis von Zuckern).

Die Elution erfolgt vorzugsweise mit einem Acetonitril- 0,1%ige pH 1,8 wäßrige Trifluoressigsäurelösung-Gemisch, das als Gradient verwendet wird. Vorteilhafterweise besteht der Gradient sukzessive aus einem Acetonitril- Trifluoressigsäurelösung-Gemisch 20/80, dann 50/50. Unter diesen Bedingungen entsprechen die gewünschten Acyl glykane dem dritten, bei 200 nm festgestellten Peak, wenn man ein C₈-Gel verwendet. Dieser Peak verschwindet bei 280 nm und erscheint nach Färbung mit Phenolschwe felsäure bei 492 nm.

Die Isolierung der Acylglykane erfolgt nach einer klassi schen Arbeitsweise für die mit kleinen Molekülen gemischten Makromoleküle, d. h. beispielsweise durch Ultrafiltration mit Membranen mit einer Retentionsschwelle von 5000 beispielsweise, durch Dialyse oder durch Gelchroma tographie.

Die Acylglykane können dann z. B. durch Lyophilisierung, Verdampfen oder Zerstäuben getrocknet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Acylglykane, die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren erhal ten werden, d. h. wenn sie aufgrund der Durchführung die ser Verfahren erhalten werden oder wenn sie physio chemische Merkmale besitzen, die denjenigen der Acyl glykane analog sind, die aufgrund der Durchführung dieser Verfahren erhalten werden.

Die erfindungsgemäßen Acylglykane besitzen sehr inter essante pharmakologische Eigenschaften; sie sind insbe sondere mit bemerkenswerten anti-allergischen und immuno- modulatorischen Eigenschaften versehen. Sie stimulieren insbesondere die Immunität über die zelluläre Einwir kung.

Unter den immuno-modulatorischen Eigenschaften der er findungsgemäßen Acylglykane kann man insbesondere die Eigenschaften einer Stimulierung der Interleukine I- Sekretion und des Colony Stimulating Factor sowie von mitogenen Eigenschaften nennen.

Diese Eigenschaften werden nachstehend im experimentel len Teil veranschaulicht.

Diese Eigenschaften rechtfertigen die Verwendung der erfindungsgemäßen Acylglykane als Arzneimittel.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung der Acylglykane, wie vorstehend definiert, als Arznei mittel, bei deren Verwendung bei einer heilenden oder präventiven therapeutischen Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers.

Unter den erfindungsgemäßen Acylglykanen greift man vor allem auf die Acylglykane zurück, die dadurch gekenn zeichnet sind, daß sie aus Acylglykanen bestehen, wie sie nach erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, zu deren Verwendung bei einer heilenden oder präven tiven therapeutischen Behandlungsmethode des menschli chen oder tierischen Körpers.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel finden beispielsweise bei der Behandlung oder Vorbeugung bei Mensch und Tier von infektiösen Erkrankungen Verwendung, die von Bakte rien oder Viren verursacht werden, bei der Behandlung von Erkrankungen aufgrund von Parasiten, von Toxi-Infek tionen, bei der Behandlung von post-hospitalen und post- chirurgischen Infektionen und von Allergien jeglichen Ursprungs.

Zu Präventivzwecken können die erfindungsgemäßen Acylglykane allein eingesetzt werden. Sie können auch als Adjuvans in Vakzinen verwendet werden.

Die übliche Dosis, die entsprechend dem verwendeten Deri vat, dem Patienten und der jeweiligen Erkrankung variie ren kann, kann beispielsweise 1 mg bis 15 mg/Tag betra gen. Bei der oralen Verabreichung an den Menschen kann das Derivat des Beispiels 1 in einer Tagesdosis von 2 mg bis 10 mg, z. B. bei der Behandlung der chronischen Bronchitis, entsprechend etwa 0,03 mg bis 0,15 mg/kg Körpergewicht, verwendet werden.

Als Arzneimittel werden die erfindungsgemäßen Acylglykane über den Verdauungsweg, den parenteralen Weg oder den lokalen Weg verabreicht.

Die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können z. B. Feststoffe oder Flüssigkeiten sein und in pharmazeutischen Formen vorliegen, wie sie üblicherwei se in der Humanmedizin verwendet werden, wie z. B. ein fache oder dragierte Tabletten, Gelkapseln, Granulate, Lösungen, Sirupe, Suppositorien, lyophilisierte oder nicht-lyophilisierte, injizierbare Präparate, Ovula, Cremes, Pomaden, Lotionen, Tropfen, Augentropfen, Areo sole. Sie werden nach üblichen Methoden hergestellt. Der oder die Wirkstoffe können hierbei Exzipienten ein verleibt werden, die üblicherweise in derartigen phar mazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie Talk, Gummiarabikum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nicht-wäßrige Träger, Fett körper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffin derivate, Glykole, verschiedene Netz-, Dispergier- oder Emulgiermittel und Konservierungsmittel.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Man gibt 7,83 ml einer 1%igen wäßrigen Natriumdodecyl sulfat-Lösung zu 235 mg wasserlöslichem Bakterienex trakt von Klebsiella, der, wie nachstehend, gemäß Variante b hergestellt wurde, und erhitzt 5 min auf 80°C. Nach dem Abkühlen chromatographiert man in Frak tionen von 0,5 ml an einer Kolonne für Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) von mit C₈-Fettsäuren gepfropftem Siliciumdioxid (Aquapore® RP300 von 4,6×25 cm), wobei man mit einem Acetonitril-0,1%ige pH 1,8 wäßrige Trifluoressigsäurelösung-Gradienten bei einem Durchsatz von 2 ml/min unter den folgenden Be dingungen eluiert (siehe nachstehende Tabelle):

Man isoliert die dem dritten Peak, der durch Spektro metrie bei 200 nm bestimmt wird, entsprechenden Frak tionen, eliminiert die kleinen Moleküle durch Dialyse und bringt zur Trockene. Man erhält 67,85 mg erwartete Acylglykane.

Analyse:
C = 42%, H = 7,8%, N = 0,3%
Proteine 0,8%, Zucker 80%, Lipide 24,5%

Herstellung des wasserlöslichen Bakterienextrakts von Klebsiella, von dem ausgegangen wird.

Stufe A: Kultur

Man stellt ein Kulturmilieu der folgenden Formulierung her:

Fleischextrakt\|690 g
Natriumchlorid	690 g
Caseinpepton	690 g
Hefeautolysat	690 g
Bikaliumphosphat	483 g
Monokaliumphosphat	207 g
Glucose	4104 g
Soja-Papainpepton	2760 g
destilliertes Wasser q.s. für	138 l

Man stellt das Kulturmilieu her, indem man nacheinander den Fleischextrakt, das Natriumchlorid, das Caseinpepton, das Hefeautolysat, das Bikaliumphosphat und das Mono kaliumphosphat in etwa 20 l destilliertem Wasser mischt. Man stellt den pH auf etwa 7 ein.

Man sterilisiert das Milieu 40 min bei 120°C. Die Lö sungen der Glucose und des Soja-Papainpeptons werden in das Kulturmilieu zum Zeitpunkt der Impfung bzw. des An setzens der Kultur nach vorangegangener Sterilisierung eingebracht.

Der Klebsiella-Stamm (Institut Pasteur Nr. I-163) wird in 50 ccm Kulturmilieu angesetzt. Diese Lösung, die als Inokulum dient, wird in den Rest der Kulturbrühe einge bracht. Man stellt das Gesamtvolumen des Kulturmilieus durch Zugabe von sterilem, destilliertem Wasser auf 138 l ein.

Das Kulturmilieu wird bei 37°C gehalten und der pH auto matisch auf etwa 7 eingestellt (durch Zugabe einer Ammo niaklösung oder durch Zugabe einer Chlorwasserstoff säurelösung).

Das Wachstum der Stämme wird photometrisch bewertet.

Stufe B: Lyse

Zu 138 l Kulturbrühe mit vollständiger Entwicklung, die in der vorstehenden Stufe A erhalten wurde, gibt man eine wäßrige Lysozymhydrochlorid-Lösung (sterilisiert durch Filtrieren an einer Membran) zu, um eine Endkon zentration von 160 γ Lysozymhydrochlorid/cm³ Kultur milieu zu erhalten.

Man hält 1 h bei 56°C in Gegenwart von 0,25 g EDTA/l Brühe, 862,5 mg Natriummercurothiolat und 80 g Poly sorbat (unter der Bezeichnung Tween 80 in den Handel ge bracht) je Liter Kulturbrühe in Kontakt.

Man setzt die Lyse etwa 10 Tage bei 37°C unter steri len Bedingungen fort.

Man gewinnt das Lysat, homogenisiert durch Rühren bzw. Bewegen und lyophilisiert dann.

Stufe C: Behandlung

a) mit Aceton:

Man suspendiert in 138 l Aceton das in der vorangegange nen Stufe B erhaltene Pulver und rührt dann kräftig etwa 3 h.

Die Suspension wird dann zentrifugiert und man gewinnt ein Pulver, das man absaugt.

b) mit Methanol:

Das vorstehend erhaltene Pulver wird in 138 l Methanol suspendiert und kräftig etwa 3 h gerührt.

Die erhaltene Suspension wird dann zentrifugiert.

Das abgesaugte Pulver wird bei Raumtemperatur unter ver mindertem Druck getrocknet.

Stufe D: Ultrafiltration

Man löst in 6×10 l destilliertem Wasser, das 1 g/l Merthiolat enthält, sechs gleiche Teile des in der vor angegangenen Stufe C erhaltenen Pulvers.

Man hält die Lösung 24 h bei +4°C unter Rühren, zentri fugiert etwa 2 h bei 20 000 g, dann bei 60 000 g.

Man gewinnt die Lösung, die man mit filtriertem, destil liertem Wasser (an einer Sterilisationsmembran) auf 10 l auffüllt. Man bringt die so erhaltene Lösung in eine Dia filtrationsvorrichtung ein, die mit porösen Membranen für die Ultrafiltration ausgestattet ist, deren Reten tionsschwelle 300 000 beträgt und die einen scheinbaren Porendurchmesser von etwa 2 Å besitzen (unter der Be zeichnung XM 300 von der Firma Amicon und der Firma Romicon in den Handel gebrachte Membranen).

Man läßt in der Vorrichtung 50 Volumina destilliertes Wasser entsprechend einem Volumen von 500 l zirkulieren.

Die diafiltrierte Lösung wird gewonnen und dann bei 60 000 g zentrifugiert und die erhaltene Lösung lyophi lisiert.

Stufe E: Variante a

Man löst 20 g des in der vorhergehenden Stufe D erhal tenen Produkts in 2 l permutiertem Wasser.

Man gibt langsam etwa 1,6 l Cetyltrimethylammoniumbromid zu 3% in Wasser zu, rührt das Ganze 1 h und zentri fugiert dann bei 10 000 U/min während 15 min. Man entfernt den Niederschlag, gibt hierauf zu dem isolier ten Überstand 3 l Ethanol von 95° innerhalb 15 min. Nach einstündigem Rühren zentrifugiert man bei 10 000 U/min 15 min lang. Der so erhaltene Überstand wird ent fernt und der Niederschlag in 1 l Wasser wieder aufge löst und dann 48 h in Visking®-Rohren gegen permutier tes Wasser bei +4°C dialysiert. Am Ende dieser Dialyse wird die Lösung lyophilisiert. Man gewinnt 6,2 g Glyco proteine, von denen man 1 g in 19 ml einer 0,1 M wäßri gen Ammoniumcarbonatlösung löst. Die Lösung leitet man über eine Kolonne mit einem Durchmesser von 2,5 cm, die 1 l Ultragel®ACA34 enthält (Elutionsmittel: 0,1 M wäßrige Ammoniumcarbonatlösung); die dem ersten Elu tionspeak entsprechenden Fraktionen (Nachweis mit UV bei 280 nm) werden gesammelt und lyophilisiert, und man gewinnt 0,51 g wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsiella.

Variante b)

Man bringt in eine wäßrige Lösung von 10 g/l 1 kg des in der vorstehenden Stufe D erhaltenen Produkts ein.

Man gibt 0,8 Volumina 3%ige wäßrige Cetyltrimethylammo niumbromid-Lösung in einer Menge von etwa 1 l/min zu und rührt mäßig während 1 h. Man entfernt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren kontinuierlich mit einem Durchsatz von etwa 5 l/h bei 62 000 g.

Der Überstand wird durch Ultrafiltration an Hohlfasern mit einer bei 5000 fixierten Retentionsschwelle (Hollow Fibers H10P5 von Amicon und Romicon in den Handel ge bracht) in zwei Behandlungszyklen in den Verhältnissen 5/1 konzentriert. Man gibt in einer Geschwindigkeit von 3 l/min 6 Volumina 96%iges Ethanol zu und rührt 15 min mäßig. Man läßt dekantieren, saugt ab und spült den Niederschlag, trocknet bei weniger als 40°C in Gegen wart eines Dehydrationsmittels, homogenisiert durch mechanisches Zerkleinern und gewinnt 200 g wasserlös lichen Bakterienextrakt von Klebsiella.

Beispiel 2

Man stellt Tabletten der folgenden Formulierung her:

Produkt von Beispiel 1\|1 mg
Exzipient q.s. für eine Tablette mit einem Endgewicht von	100 mg

(Bestandteile des Exzipienten: Lactose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat).

Beispiel 3

Man stellte Aerosole her, die Dosen mit dem folgenden Inhalt freisetzten:

Produkt von Beispiel 1\|0,5 mg
Emulgiermittel	0,15 mg
Treibmittel	50 mg

Beispiel 4

Man stellte eine Creme mit der folgenden Formulierung her:

Produkt von Beispiel 1\|1 mg
Exzipient: 2-Octyldodecanolalkohol, Cetostearylalkohol, Natriumketostearylsulfat, Methyl- und Propyl-p-hydroxybenzoat, gereinigtes Wasser	10 mg

Pharmakologische Untersuchungen 1. Test der verzögerten Hypersensibilitätsreaktion (HSR) gegenüber roten Blutkörperchen des Schafes (GRM) Methode

Die Untersuchung wurde an Gruppen von 10 weiblichen Mäusen mit einem Alter von 9 bis 10 Wochen und einem Gewicht von etwa 20 g durchgeführt.

Die Behandlung erfolgte 3 h vor der Immunisierung mit der GRM durch intraperitoneale Injektion von 0,5 ml NaCl von 9‰, enthaltend das zu untersuchende Produkt. Die un tersuchten Dosen betragen 10, 100 und 1000×10^-6 g/kg.

Die Immunisierung erfolgte 3 h nach der Behandlung durch intravenöse Injektion von GRM (10⁸ GRM/Maus).

Die Sichtbarmachung der HSR erfolgte 4 Tage später durch intraplantare Injektion in die linke Hinterpfote von 40×10^-6 l einer GRM-Suspension.

Die Bewertung wurde 24 h nach der Sichtbarmachung durch Messung der Dicke der linken und rechten Hinterpfote durchgeführt.

Die Ergebnisse werden durch den Unterschied zwischen den Dicken der linken und rechten Hinterpfote einer jeden Maus ausgedrückt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle angegeben.

Jede Erhöhung der Unterschiede zwischen linker und rechter Pfote in bezug auf die Vergleichsgruppe drückt eine Erhöhung der verzögerten Hypersensibilitätsreaktionen aus. Man beobachtet, daß bei allen untersuchten Dosen (10, 100, 1000 × 10^-6 g/kg) die erfindungsgemäßen Acylglykane erheblich die HSR-Reaktionen erhöhen.

2. Akute Toxizität

Die letale Dosierung 50 (LD₅₀) bei intraperitonealer Verab reichung bei der Maus wurde nach der Methode von Behrens und Karber bestimmt.

Sie beträgt etwa 20 mg/kg für die Acylglykane von Bei spiel 1.

Claims

1. Acylglykan-Extrakte von Klebsiella, dadurch ge kennzeichnet, daß sie aus etwa 80% neu tralen Osen und 20% Lipiden, die weniger als 2% Proteine enthalten, bestehen und ein Molekulargewicht von etwa 12 500 besitzen.

2. Acylglykane gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Osen in den folgenden ungefähren relativen Anteilen je 1 Glucose vorliegen: etwa 4 Galactosen, etwa 1 Mannose und etwa 1 Heptose.

3. Acylglykane gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß sie eine Kette von Galactosen, die β 1→ 3 verknüpft sind, mit einem Molekulargewicht von etwa 9000 umfassen.

4. Acylglykane gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie Klebsiella pneumoniae entstammen.

5. Acylglykane gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeich net, daß sie dem Stamm entstammen, der in der Colleciton Nationale de Culture de Microorganismes die Nummer I-163 be sitzt.

6. Verfahren zur Gewinnung von Acylglykanen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsiella, der 30 bis 45% Proteine, 30 bis 40% neutrale Osen, einen geringen Anteil an Uronsäuren, 2 bis 5% Osamine besitzt und ein Molekulargewicht von etwa 350 000 auf weist, mit Hilfe eines Detergens auf etwa 80°C erhitzt, an hydrophoben, verzweigten bzw. gepfropften Siliciumdi oxid chromatographiert und die dem dritten Elutionspeak entsprechende Fraktion, die durch Spektrometrie bei 200 nm festgestellt wird und bei 280 nm verschwindet, zurückgewinnt.

7. Verfahren zur Gewinnung von Acylglykanen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem man einen wasser löslichen Bakterienextrakt von Klebsiella herstellt, wie eines solchen, der erhalten wird durch Kultivierung von der Gattung Klebsiella angehörenden Stämmen, Lyse der Stämme, Trocknung, Delipidation durch Extraktion mit Hilfe von Lösungsmitteln für Lipide, Ultrafiltra tion, Behandlung der so erhaltenen, wäßrigen Lösung mit einem quaternären Ammoniumsalz, Eliminierung des Nieder schlags, anschließend entweder Behandlung des Überstands in der Kälte mit einem Alkanol mit niedrigem Molekular gewicht, Isolierung, anschließende Auflösung in Wasser, Dialyse und Trocknung des erhaltenen Produkts, erneute Auflösung, Filtration an einem Gel, anschließende Iso lierung der ersten eluierten Fraktion und Trocknung oder Einengung des Überstands unter Verwendung von zumindest einer Vorrichtung bzw. Maßnahme zur Selektionierung von Molekülen, Behandlung des Konzentrats in der Kälte mit einem Alkanol und Isolierung des erhaltenen Niederschlags, dadurch gekennzeichnet, daß man den wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsiella mit einem Detergens behandelt, auf etwa 80°C erhitzt, an verzweigtem hydrophoben Siliciumdioxid chromatographiert und die dem Elutionspeak entsprechende Fraktion, die durch Spektrometrie bei 200 nm festgestellt wird, bei 280 nm verschwindet und bei 492 nm nach Färbung mit Phenolschwefelsäure erscheint, zurückgewinnt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens ein Alkalisulfat vom Alkylester-Typ ist und die Elution mit einem Acetonitril-0,1%ige pH 1,8 wäßrige Trifluoressigsäurelösung-Gradienten durchgeführt wird.

9. Acylglykane gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei einer präventiven oder heilenden therapeutischen Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers.