DE3940551C2

DE3940551C2 - Mittel zur Behandlung von durch Aids-Viren verursachter infektiöser Dementia

Info

Publication number: DE3940551C2
Application number: DE3940551A
Authority: DE
Inventors: Eiji Kojima; Hidetoshi Yoshioka; Kunichika Murakami; Hiroaki Mitsuya; Takuma Shirasaka; Samuel Broder
Original assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd; Jujo Paper Co Ltd; National Institutes of Health NIH
Current assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1989-12-07
Publication date: 1999-05-06
Anticipated expiration: 2009-12-08
Also published as: US5580860A; JPH03118324A; CA2004784C; GB8927850D0; GB2236251B; FR2652502A1; DE3940551A1; CA2004784A1; JPH0637391B2; GB2236251A; FR2652502B1

Description

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von 2-Amino-6-chlor-pu rin-9-β-2',3'-didesoxyribofuranosid zur vorbeugenden und therapeuti schen Behandlung von durch AIDS-Viren verursachter infektiöser De mentia.

Als Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Viren (Anti-HIV-Mittel) sind Dideso xynucleoside, wie Azidothymidin (AZT), Didesoxyadenosin (DDA), Dideso xyinosin (DDI) etc. sowie Dextransulfat, lösliches CD4, Phosphonoformi at, Ribavirin, Suramin etc. bekannt.

Von dem Zeitpunkt an, da die Anti-HIV-Wirkung von beispielsweise AZT, DDA und DDI, welche zu einer Gruppe von Verbindungen gehören, die als Didesoxynucleoside bezeichnet werden, erkannt worden ist, sind neue Di desoxynucleoside, die mit verschiedenartigen Substituenten modifiziert worden sind, hergestellt und als neue Anti-HIV-Mittel vorgeschlagen wor den.

Unter diesen Verbindungen finden sich beispielsweise solche, mit einem Halogenatom im Molekül, wie 6-Chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofur anosid und 6-Jod-purin-9-β-2',3'-didesoxyribofuranosid (siehe beispiels weise die JP-OS Sho. 63.267796). Weiterhin sind 2-Fluor-2'-3'-didesoxya denosin und 2-Brom-2',3'-didesoxyadenosin bekannt (J. Biol. Chem., 263 (1988) 5870). Bekannt sind weiterhin 2-Chlor-2'-3'-didesoxyadenosin (J. Biol. Chem.. 263 (1988), 5870; J. Med. Chem., 32 (1989) 1135) und 2- Chlor-2',3'-didehydro-2',3'-didesoxyadenosin (J. Med. Chem., 32 (1989) 1135).

Darüber hinaus sind auch Verbindungen, wie 9-(2-Fluor-2,3-didesoxy-β- D-threo-pentofuransyl)-adenin bekannt geworden (J. Med. Chem., 30 (1987), 2131).

Die EP-A-0 286 425 beschreibt 6-substituierte 2',3'-Didesoxynucleoside einer allgemeinen Formel, unter welche auch die Verbindung 2-Amino-6- chlor-purin-9-β-2',3'-didesoxyribofuranosid fällt, ohne jedoch konkret er wähnt zu werden. Ferner ist angegeben, daß diese 6-substituierten 2',3'- Didesoxynucleoside zur Behandlung oder Prophylaxe von AIDS geeignet sind.

Von den oben angesprochenen Verbindungen ist als therapeutischer Wirkstoff zur Behandlung von AIDS lediglich AZT zugelassen worden.

Die meisten der oben aufgeführten bekannten Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Viren (Anti-HIV-Mittel) zeigen Probleme im Hinblick auf die Aktivität gegen das AIDS-Virus (HIV), im Hinblick auf ihre Toxizität gegenüber Zel len oder bezüglich ihres Absorptionsverhaltens durch den lebenden Kör per. Auch für das einzig zugelassene Arzneimittel AZT sind Nebeneffekte, wie Myelotoxizität, bekannt.

Ein wesentliches Symptom von Personen, die Träger des AIDS-Virus sind, sind Gehirnstörungen. Dieses Phänomen wird dadurch verursacht, daß das AIDS-Virus das Gehirn des mit HIV infizierten Patienten erreicht und als Folge einer Infektion die Gehirnzellen zerstört, so daß eine gewisse De mentia verursacht wird. Somit besteht ein starkes Bedürfnis für ein Mittel zur vorbeugenden und therapeutischen Behandlung von durch AIDS-Vi ren verursachter infektiöser Dementia.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Mittel zur vorbeugenden und therapeutischen Behandlung von durch AIDS-Viren verursachter infektiöser Dementia anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung des Wirkstoffs 2-Amino-6- chlor-purin-9-β-2',3'-didesoxyribofuranosid gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung von 2-Amino-6-chlor purin-9-β-2',3'-didesoxyribofuranosid zur vorbeugenden und therapeuti schen Behandlung von durch AIDS-Viren verursachter infektiöser De mentia.

Das erfindungsgemäß als Wirkstoff verwendete 2-Amino-6-chlor-purin-9- β-2',3'-didesoxyribofuranosid besitzt die folgende Formel (I)

Die Erfindung sei im folgenden näher unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse eines Anti-HIV-Tests wiedergibt, bei dem die erfindungsgemäß verwendete Verbindung 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyri bofuranosid (nachfolgend abgekürzt als 6-Cl-DDG bezeichnet) eingesetzt worden ist;

Fig. 2 eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse des Anti- HIV-Tests der Vergleichsverbindung (DDG) wiedergibt;

Fig. 3 eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse des Anti- HIV-Tests der Vergleichsverbindung 2-chlor-2',3'-didesoxyadenosin (nachfolgend abgekürzt als 2-Cl-DDA bezeichnet) wiedergibt;

Fig. 4 eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse des Anti- HIV-Test von 6-Cl-DDG verdeutlicht; und

Fig. 5 eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse des Anti- HIV-Tests von DDG darstellt.

In dem Diagramm der Fig. 1 stehen die ausgefüllten Balken für jene Zellen, die von HIV-infiziert sind, während die weißen Balken die nicht mit HIV infizierten Zellen repräsentieren (Kontrolle). Auf der Ordinate sind die Anzahl der unter suchten Zellen (x 10⁵) und auf der Abszisse die Konzentration des Anti-HIV-Mit tels (6-Cl-DDG) (in µM) aufgetragen.

Wenn die Konzentration von 6-Cl-DDG mehr als 50 µM beträgt, wird Dimethyl sulfoxid (DMSO) zur Verbesserung der Löslichkeit zugesetzt. Beispielsweise wird bei 200 µM 6-Cl-DDG Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 1% zugege ben.

Das Balkendiagramm der Fig. 2 zeigt in den schwarzen Balken die mit HIV-infi zierten Zellen und in den weißen Balken die nicht mit HIV-infizierten Zellen (Kontrolle). Auf der Ordinate sind die Anzahl der untersuchten Zellen (x 10⁵) und auf der Abszisse die Konzentration des Anti-HIV-Mittels (DDG) (in µM) aufgetra gen.

In der Fig. 3 stehen die schwarzen Balken für die mit HIV infizierten Zellen und die weißen Balken für die nicht mit HIV infizierten Zellen (Kontrolle). Auf der Ordinate sind die Anzahl der untersuchten Zellen (x 10⁵) und auf der Abszisse die Konzentration der Vergleichsverbindung (2-Cl-DGA) (in µM) aufgetragen.

In dem Diagramm der Fig. 4 zeigt das linke Diagramm die Ergebnisse am 8. Tag und das rechte Diagramm jene am 9. Tag. Dabei sind auf der Ordinate der Prozent satz der H9-Zellen aufgetragen, die das P24-Antigen von HIV exprimieren, wäh rend die Abszisse die Konzentration von 6-Cl-DDG (in µM) wiedergibt.

In der Fig. 5 zeigt das linke Diagramm die Ergebnisse am 8. Tag und das rechte Diagramm jene am 9. Tag. Dabei sind auf der Ordinate der Prozentsatz der H9- Zellen angegeben, die das P24-Antigen von HIV exprimieren und auf der Abszisse die Konzentration von DDG (in µM).

Das erfindungsgemäß als Wirkstoff eingesetzte 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D- 2',3'-didesoxyribofuranosid kann wie folgt hergestellt werden:

Man kann 2',3-Didesoxyuridin und 2-Amino-6-chlor-purin als Ausgangsmate nalien einer Basenaustauschreaktion (das heißt einer Trans-Glykosilierung) unter Einwirkung eines Mikroorganismus unterwerfen, so daß man das entspre chende 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid ohne weite res und mit guter Ausbeute erhält (JP-OS Hei 1-46183).

Man kann 2',3'-Didesoxyuridin und 2-Amino-6-chlor-purin als Ausgangsmate rialien kontinuierlich in einfacher Weise und mit guter Ausbeute zu dem entspre chenden 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid umsetzen, indem man die Basenaustauschreaktion unter Anwendung eines Immobilisier ten Mikroorganismus durchführt (JP-OS Hei 1-181885).

Weiterhin sind 2',3'-Didesoxypurinnucleoside mit einem Halogenatom im Ba senteil bekannt. Beispielsweise beschreibt die JP-OS Sho. 63-267796 syntheti sche Verfahren zur Herstellung von a) 6-Chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribo furanosid und b) 6-Jod-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid. In dieser Ver öffentlichung sind jedoch keine Daten bezüglich eines Anti-HIV-Tests dieser Verbindungen a) und b) beschrieben, so daß nicht ersichtlich ist, ob diese Verbin dungen a) und b) als Anti-HIV-Mittel geeignet sein könnten. Darüber hinaus ver mittelt diese Druckschrift keine Anhaltspunkte dafür, daß von diesen Verbin dungen a) und b) verschiedene 2',3-Didesoxypurinnucleoside, die in der 6-Stel lung halogeniert sind, eine Anti-HIV-Wirkung besitzen.

Weiterhin finden sich in J. Biol. Chem. 263 (1988) 5870 Hinweise auf die Anti- HIV-Wirkung von drei Verbindungen, nämlich von c) 2-Fluor-2',3'-didesoxyade nosin, d) 2-Chlor-2',3'-didesoxyadenosin und e) 2-Brom-2,3'-didesoxyadenosin. Nach den Angaben dieser Veröffentlichung ergibt sich allerdings für die Verbin dungen c), d) und e) die HIV-Inhibierende Wirkung bei einer Konzentration von 1 bis 10 µM, während die Cytotoxizität ebenfalls bei einer Konzentration von im Bereich von 1 bis 10 µM auftritt. Somit können im Hinblick auf den therapeuti schen Index (Konzentration für das Auftreten der Cytotoxizität/Konzentration zur Inhibierung von HIV) diese Verbindungen c), d) und e) in der Praxis kaum als Anti-HIV-Mittel eingesetzt werden.

Darüberhinaus ist in J. Med. Chem., 32 (1989) 1135 die Anti-HIV-Wirkung von zwei Verbindungen, nämlich von d) 2-Chlor-2',3'-didesoxyadenosin und f) 2- Chlor-2',3'-didehydro-2',3'-didesoxyadenosin beschrieben. Nach den Angaben diese Druckschrift zeigt die Verbindung d) keinerlei Wirkung bei einer Konzen tration von 2 µM und kann bei einer Konzentration von 100 µM die Bildung von reverser Transkriptase kaum um 97% beeinflussen. Bei einer Konzentration von 100 µM zeigt die Verbindung d) jedoch eine hohe Cytotoxizität von 23%. Die Ver bindung f) kann die Bildung von reverser Transkriptase bei einer Konzentration von 20 µM um 75% inhibieren; bei mehr als 20 µM ist die Toxizität jedoch so groß, daß der Test nicht durchgeführt werden kann. Damit kommt die Verwendung der Verbindungen d) und f) als Anti-HIV-Mittel in der Praxis nicht in Frage.

Somit sind unter den 2',3'-Didesoxypurinnukleosiden mit einem Halogenatom im Basenteil Verbindungen nicht bekannt, welche sowohl bezüglich ihrer Wir kung gegenüber HIV als auch bezüglich ihrer Toxizität gegenüber Zellen sich als zufriedenstellend erwiesen haben. Es hat sich gezeigt, daß 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid ein extrem wirksames Mittel zur Bekämpfung von AsS-Viren darstellt und da mit als Anti-HIV-Mittel eingesetzt werden kann. Es hat sich insbesondere ge zeigt, daß 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid sowohl eine starke Wirkung gegenüber den AIDS-Viren ausübt (eine starke Anti-HIV- Wirkung) und eine geringe Cytotoxlzltät aufweist, was eine Folge der charakteri stischen Struktur dieser Verbindung ist. Es hat sich weiterhin erwiesen, daß 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid neben seiner Wir kung gegen AIDS-Viren eine hohe Lipophilität aufweist, offenbar als Folge der Einführung des Chloratoms in die 6-Stellung der Purinbase, so daß diese Verbin dung in vivo eine sehr gute Permeabilität für das Eindringen in die Zellen zeigt.

Im folgenden sei die Anti-HIV-Wirkung des 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosids erläutert.

Oben sind bereits Verbindungen angegeben worden, die bislang als Mittel zur Be kämpfung von AIDS-Viren entwickelt worden sind. Diese Verbindungen besit zen jeweils ihre Vorteile und Nachteile im Hinblick auf die Wirkung und die Toxi zität, so daß sie bei der praktischen Anwendung Probleme aufwerfen. Daher ist lediglich Azidothymidin (AZT) als einziges Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Vi ren und als Wirkstoff zur Behandlung von AIDS zugelassen worden.

AZT gehört zu einer Gruppe von Verbindungen, die aufgrund ihrer Struktur als 2',3'-Didesoxynucleoside bezeichnet werden; da sie keine Hydroxylgruppe in der 3'-Stellung aufweist, wirkt diese Verbindung als Terminator der DNA-Kette und unterbricht in dieser Weise direkt die DNA-Synthese des AIDS-Virus. Da AZT ein sehr gutes Substrat für die reverse Transkriptase des AIDS-Virus darstellt, wirkt sie antagonistisch, wenn die reverse Transkriptase aus der RNA des AIDS-Virus DNA synthetisiert, so daß die reverse Transkriptase gehemmt wird.

Da, wie beschrieben, AZT eine Verbindung darstellt, die direkt gegen die reverse Transkriptase wirkt, von der angenommen wird, daß sie der wesentliche Schlüs sel für die Vermehrung des AIDS-Virus darstellt, übt sie eine starke Anti-HIV- Wirkung aus und stellt ein nützliches Mittel dar. Andererseits sind in vivo Nebe neffekte, wie das Auftreten von Myelotoxizität festgestellt worden.

Nachdem klargeworden ist, daß AZT derartige Nebenwirkungen besitzt, hat sich die Forschung auf Verbindungen mit geringeren Nebenwirkungen und stärkerer Anti-HIV-Wirkung gerichtet.

Arzneimittelwirkstoffe, die als Wirkstoffe der nächsten Generation zur thera peutischen Behandlung von AIDS anstelle von AZT entwickelt werden, sind bei spielsweise 2',3'-Didesoxycytidin (DDC), 2',3'-Didesoxyadenosin (DDA), 2',3'-di desoxyinosin (DDI). Diese Verbindungen besitzen sämtlich eine sehr ähnliche Struktur wie AZT und gehören zu der Gruppe von Verbindungen, die als 2',3'-Didesoxyuridin bezeichnet werden.

In vitro besitzen DDC, DDA, DDI eine stärkere Anti-HIV-Wirkung als AZT, so daß derzeit positive klinische Tests mit diesen Verbindungen durchgeführt wer den. Somit ist davon auszugehen, daß diese Verbindungen neben AZT ebenfalls als Arzneimittelwirkstoffe zugelassen werden.

Es hat sich jedoch in jüngster Zeit erwiesen, daß auch diese Verbindungen Neben wirkungen besitzen, wie eine Störung der peripheren Nerven und Myelotoxizität. Somit besteht ein Bedürfnis für die Entwicklung von noch besseren Anti-HIV- Mitteln.

Ein wesentliches Symptom von Personen, die Träger des AIDS-Virus sind, sind Gehirnstörungen. Dies ist ein Phänomen, das dadurch verursacht wird, daß das AIDS-Virus das Gehirn des mit HIV infizierten Patienten erreicht und als Folge einer Infektion die Gehirnzellen zerstört, so daß eine gewisse Dementia verur sacht wird. Um dieses als Folge von HIV-Infektionen auftretende Symptom zu lindern und zu behandeln ist es erforderlich, daß das Anti-HIV-Mittel in wirksa merer Weise die Blut/Gehirn-Grenzschicht durchdringt. Das Hindurchtreten dieses Arzneimittelwirkstoffes durch die Blut/Gehirn-Grenzschicht hängt stark von dem lipophilen Verhalten des Arzneimittelwirkstoffes ab. DDC, DDA und DDI besitzen eine geringere Lipophilität als AZT, das heißt, sie besitzen ein schwaches lipophiles Verhalten.

Bei der Entwicklung eines wirksameren Anti-HIV-Mittels ist es daher erforder lich, die durch die Lipophilität repräsentierte Affinität gegenüber Zellen ebenso zu berücksichtigen, wie die starke Anti-HIV-Wirkung und die geringe Cytotoxizi tät.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxy ribofuranosid bei starker Anti-HIV-Wirkung und geringer Cytotoxizität eine erhöhte Lipophilität aufweist. Diese erfindungsgemäß eingesetzte Verbindung besitzt keine Hydroxylgruppe in der 3'-Stellung und wirkt damit als Terminator der DNA-Kette und hemmt daher die reverse Transkriptase des AIDS-Virus (HIV). Dadurch, daß ein Halogenatom in dem Molekül vorhanden ist, ergibt sich eine Steigerung der Lipophilltät im Vergleich zu 2',3-Didesoxypurinnucleosiden, welche kein Chloratom als Halogenatom in dem Molekül aufweisen. Hierdurch wird eine Verbesserung des Hindurchdringens dieses Wirkstoffes durch die Blut/Gehirn-Grerizachicht erreicht. Dadurch, daß das Chloratom in der 6-Stel lung der Purinbase vorliegt, ergibt sich also dieser vorteilhafte Effekt zusammen mit einer starken Anti-Virus-Wirkung und einer geringen Cytotoxizität.

Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel Herstellungsbeispiel 1

Man beschickt ein Fermentiergefäß mit 10 Litern eines flüssigen Mediums, wel ches 5 g/l Hefeextrakt. 10 g/l Pepton und 5 g/l NaCl enthält, stellt das Medium auf einen pH-Wert von 7,0 ein und pasteurisiert es.

Dieses Medium impft man dann mit 100 mg E. Coli JA-300 (Gene, 10, (1980) 157) an und züchtet das Material unter Schütteln während 16 Stunden bei 37°C.

Dann trennt man die Pilzkörper durch Zentrifugieren von dem Medium ab, wäscht sie mit physiologischer Salzlösung, suspendiert sie in einem 0,05 M Phosphatpuffer (mit einem pH-Wert von 7,5), der mit KH₂PO₄ und Na₂HPO₄ ein gestellt worden ist mit einer Menge von 100 mg des feuchten Materials pro ml.

Nach dem Erwärmen auf 50°C gibt man 70 ml der Suspension der Pilzkörper zu 70 ml einer Reaktionsflüssigkeit, die aus einem 0,05 M Phosphatpuffer besteht, der 7,0 mMol, 2',3'-Didesoxyuridin und 7,0 mMol 2-Amino-6-chlor-purin enthält, und die mit KH₂PO₄ und Na₂HPO₄ auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt worden und zuvor auf 50°C erwärmt worden ist.

Man setzt das Material während 4 Stunden bei 50°C unter Schütteln um und er hitzt dann während 3 Minuten auf 100°C.

Nach Beendigung der Reaktion trennt man die Pilzkörper durch Zentrifugieren ab und überführt die überstehende Flüssigkeit in ein Becherglas (überstehende Flüssigkeit 1).

Zu den abzentrifugierten Pilzkörpern gibt man 70 ml eines Phosphatpuffers (0,05 M) mit einem pH-Wert von 7,5. Nachdem man das Material eine gewisse Zeitdauer gerührt hat, zentrifugiert man erneut ab und überführt die überstehen de Flüssigkeit durch Dekantieren in ein Becherglas. Diese Maßnahme wird zwei mal wiederholt (überstehende Flüssigkeiten 2 und 3).

Diese überstehenden Flüssigkeiten 1, 2 und 3 werden nacheinander durch eine mit einem adsorptiven Harz (HP-20 der Firma Mitsubishi Kasei) gefüllte Säule (4 × 20 cm) geführt. Nach dem Auftrag der Proben wird diese Säule mit einem Liter destillierten Wassers gewaschen, wonach das Produkt mit Methanol eluiert wird.

Nach dem Entfernen des Lösungsmittels löst man das Produkt erneut in 10% Methanol enthaltendem Chloroform und chromatographiert die Lösung auf ei ner mit Kieselgel gepackten Säule (4 × 20 cm). Als mobile Schicht verwendet man 10% Methanol enthaltendes Chloroform.

Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und aufkonzen triert, wonach die erhaltenen Feststoffe aus Methanol umkristallisiert werden. Die Kristalle werden getrocknet und man erhält 1,057 g (3,92 mMol, Ausbeute = 56%) 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3-didesoxyribofuranosid, Schmelz punkt 138°C.

Untersuchungsmethoden A-1 Antivirustest (1)

Die Anti-HIV-Wirkung des in der obigen Weise synthetisierten 2-Amino-6- chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosids wird nach der Methode von Mitsuya et al. (Biochemical Pharmacology 36 (1987) 2179) unter Verwendung von ATH8-Zellen (OKT4 + T cell clone: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 83 (1986) 1911) be stimmt. Insbesondere setzt man 2 × 10⁵ ATHS-Zellen nach der Vorbehandlung mit Polybrene (hergestellt von der Firma Sigma Company) während 45 Minuten dem AIDS-Virus (HIV) aus, um eine Infektion zu bewirken. (Die Anzahl der HIV- Viren wird derart eingestellt, daß sich 2.000 pro ATH8-Zelle ergeben). Anschlies send suspendiert man die mit HIV infizierten Zellen erneut in jeweils einem ml des entsprechenden Mediums, welches Interleukin 2 (IL-2) enthält und mit dem Anti-HIV-Mittel in variierenden Konzentrationen versetzt worden ist, und in einem ml eines Mediums, welches lediglich IL-2 enthält und kein Anti-HIV-Mit tel enthält.

Man fermentiert das Material bei 37°C in einem gemischten Gas, welches 5% Kohlendioxid und 95% Luft enthält. Die Vergleichszellen werden in ähnlicher Weise hergestellt, mit dem Unterschied, daß man sie nicht mit dem AIDS-Virus (HIV) infiziert.

Nach fünf Tagen bestimmt man die Gesamtzahl der Zellen mit Hilfe der Hämocy tometer-Methode nach dem Anfärben mit Trypanblau.

A-2 Antivirustest (2)

Man bewertet die Anti-HIV-Wirkung von 6-Cl-DDG nach der Methode von Mitsu ya et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (1986) 1911) unter Anwendung des H9- Zellsystems. Insbesondere züchtet man HIV-infizierte H9-Zellen, die mit dem Anti-HIV-Mittel in variierenden Konzentrationen versetzt worden sind, wäh rend 8 Tagen bzw. 9 Tagen zur Bewertung des Prozentsatzes der H9-Target-Zellen, die das p24 gag Protein des HIV-Virus exprimieren. Die Messung erfolgt nach der monoclonalen Murin-Antikörpermethode (M26).

B. Lipophilitäts-Test

HIV infiziert nicht nur die T4-Zellen, sondern auch die Zellen des zentralen Ner vensystems, so daß sich die Dementia ergibt. Es ist bekannt, daß die meisten Arz neimittelwirkstoffe die Blut/Gehirn-Grenzschicht nicht durchdringen können; AZT durchdringt diese Grenzschicht jedoch relativ leicht und ergibt dadurch eine gewisse Wirkung im Hinblick auf eine Verbesserung der durch AIDS verursach ten Dementia.

Es ist im allgemeinen anerkannt, daß Substanzen mit einer höheren Lipophill tät relativ leicht von dem Gehirn aufgenommen und anschließend über die Hirn- Rückenmarks-Flüssigkeit wieder ausgeschieden werden (J. Pharm. Pharmacol., 9 (1957) 345). Daher ist es durch Bestimmen des Lipophilitäts-Grades möglich, Hinweise darauf zu erhalten, wie leicht die Verbindung die Blut/Gehirn-Grenz schicht zu durchdringen vermag (V. International Conference on AIDS Abstracts 559 (1989)).

Im allgemeinen bestimmt man den Lipophilitätsgrad über den Verteilungskoef fizienten (P) in einer Wasser/n-Octanol-Mischung. Der Test zur Bestimmung der Lipophilität von 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid wird über die Bestimmung des Verteilungskoeffizienten P mit Hilfe der Schüttel flaschenmethode bestimmt (J. Pharm. Pharmacol., 39 (1987) 253).

Man beschickt einen Scheidetrichter mit n-Octanol und einem Phosphatpuffer (mit einem pH-Wert von 7,4), schüttelt während 3 Stunden und läßt dann wäh rend 12 Stunden stehen, um eine vollständige Trennung zu bewirken. Dann löst man 1 mg der zu untersuchenden Probe (die während 12 Stunden bei 50°C in ei nem Vakuumtrockner getrocknet worden ist) in 50 ml des in dieser Weise erhalte nen, mit n-Octanol gesättigten Puffers und verwendet 0,5 ml dieser Lösung für die quantitative Bestimmung. Die restlichen 49,5 ml des mit n-Octanol gesättigten Puffers und die 49,5 ml des mit dem Puffer gesättigten n-Octanols werden in einen Scheidetrichter überführt. Nach dem Schütteln während 3 Stunden in dem Scheidetrichter läßt man während 2 Stunden stehen und zentrifugiert dann während 15 Minuten bei 1.500 min^-1. Nach dem vorsichtigen Abtrennen der n-Octanol-Schicht entnimmt man die Probe für die quantitative Bestimmung. Die quantitative Bestimmung erfolgt durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatog raphie (HPLC) unter Anwendung der in der nachfolgenden Tabelle 1 angegebenen Bedingungen.

Tabelle 1

Säule	TSK-Gel ODS-80TM
Elutionsmittel	Phosphatpuffer (pH 6,9)/Acetonitril = 92/8
Wellenlänge des für den Nachweis eingesetzten Lichtes	UV 254 nm
Säulentemperatur	34,5°C
Injektionsmenge	10 µl
Standard-Probenkonzentration	10, 20, 30 ppm

Beispiel 1 A-1 Antivirustest (1)

Die Ergebnisse des Anti-HIV-Tests von 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-D-2',3'-di desoxyribofuranosids sind in der Fig. 1 dargestellt.

Die Verbindung (6-Cl-DDG) zeigt eine HIV-inhibierende Wirkung bei einer Kon zentration von 2 µM und inhibiert HIV bei einer Konzentration von 5 µM vollständig.

Zum Vergleich sind die Ergebnisse des Anti-HIV-Tests unter Verwendung von 2',3'-didesoxyguanosin (DDG) in der Fig. 2 dargestellt. Die Konzentration für die vollständige Inhibierung von HIV mit DDG beträgt 10 µM.

Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, daß das 6-Cl-DDG eine gleiche oder stärkere Anti-HIV-Wirkung als DDG aufweist, dessen Wirkung bereits bekannt ist.

Bei dem Anti-HIV-Test bezüglich der Verbindung 6-Cl-DDG wird bei Konzentrationen oberhalb von 50 µM Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben, um 6-Cl-DDG zu lösen. Wenn die Konzentration von 6-Cl-DDG 50 µM, 200 µM, 500 µM bzw. 1.000 µM beträgt, wird Dimethylsulfoxid in Mengen von 0,25%, 1%, 2,5% bzw. 5% zugegeben.

Somit ist der Grund dafür, daß bei dem Anti-HIV-Test von 6-Cl-DDG bei einer Konzentration von oberhalb 200 µM eine Cytotoxizität auftritt, die Folge der An wesenheit von Dimethylsulfoxid (Biochemical Pharmacology, 36 (1987) 2719).

A-2 Anttivirustest (2)

Die Ergebnisse des Anti-HIV Tests von 6-Cl-DDG sind in der Fig. 4 dargestellt. Bei einer Konzentration von 3 µM zeigt 6-Cl-DDG eine inhibierende Wirkung auf die Exprimierung des p24-Antigens und inhibiert die Exprimierung von p24 bei ei ner Konzentration von 10 µM praktisch vollständig.

Zu Vergleichszwecken sind die unter gleichen Bedingungen erzielten Ergebnisse mit DDG in der Fig. 5 dargestellt.

Aus diesen Ergebnissen ist weiterhin ersichtlich, daß im Vergleich zu DDG 6-Cl- DDG eine gleiche oder stärkere Anti-HIV-Wirkung entfaltet.

B. Lipophilitäts-Test

Wie oben bereits erwähnt, erfolgt die Bestimmung der Lipophilität über die Mes sung des Verteilungskoeffizienten P.

Der Verteilungskoeffizient P ist wie folgt definiert:

P = (Co - Cw)/Cw,

worin Co für die Konzentration der Probe in dem Puffer vor dem Schütteln und Cw für die Konzentration der Probe im Puffer nach dem Schütteln stehen.

Das in diesem Test erzielte Ergebnis, das heißt, log P von 2-Amino-6-chlor-pu rin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid ist in der Tabelle 2 angegeben. Zu Ver gleichszwecken sind auch die log P von Azidothymidin (AZT), Didesoxyinosin (DDI) und Didesoxyguanosin (DDG) angegeben.

Tabelle 2

Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Lipophilltät von AZT größer ist als jene von DDI und DDG, während die Lipophilität der erfindungsgemäß ein gesetzten Verbindung 6-Cl-DDG noch höher ist als die von AZT.

Es ist davon auszugehen, daß dann, wenn log P zwischen -1,5 und +0,7 liegt, die Geschwindigkeit des Hindurchdringens des Wirkstoffes durch die Blut/Gehirn- Grenzschicht (Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit/Plasma) mit ansteigendem Wert von log P ansteigt (siehe V. International Conference on AIDS Abstracts (1989) 559).

Somit ist festzustellen, daß aufgrund der Tatsache, daß die erfindungsgemäß ein gesetzte Verbindung 6-Cl-DDG besser durch die Blut/Gehirn-Grenzschicht hin durchzudringen vermag als AZT. DDI und DDG, die bislang als Anti AIDS-Mittel bekanntgeworden sind, die Verbindung wirksamer gegen HIV zu wirken vermag, welche in die Gehirnzellen eingedrungen sind und diese beeinträchtigen. Aus die sem Grund wird 6-Cl-DDG eine besonders starke Wirkung bei der Behandlung von durch AIDS verursachte Dementia zugeordnet.

Bei einer experimentellen Studie hinsichtlich der Verteilung von 6-Cl- DDG im Gehirn der Ratte nach oraler Verabreichung zeigte sich, daß im Vergleich zu 6-Cl-G und DDG die Konzentration an 6-Cl-DDG im Gehirn signifikant höher war.

6-Cl-DDG kann daher erfindungsgemäß zur vorbeugenden und therapeu tischen Behandlung von durch AIDS-Viren verursachter infektiöser De mentia eingesetzt werden.

Claims

Verwendung von 2-Amino-6-chlor-purin-9-β-2',3-didesoxyribofur anosid zur vorbeugenden und therapeutischen Behandlung von durch AIDS-Viren verursachter infektiöser Dementia.