DE69834128T2

DE69834128T2 - Neuer serratia marcescens stamm, prodigiosin sowie dessen verwendung als immunsuppressivum

Info

Publication number: DE69834128T2
Application number: DE69834128T
Authority: DE
Inventors: Mook Hwan KIM; Kook Young KIM; Bae Sang HAN; Rak Sung Kangnam-ku YOO
Original assignee: Hankook Sin Yak Pharm Co Ltd Nonsan; Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST; Hankook Sin Yak Pharm Co Ltd
Current assignee: Hankook Sin Yak Pharm Co Ltd Nonsan Chungcheo; Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 1997-09-20
Filing date: 1998-09-19
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-09-20
Also published as: US6645962B1; KR100252197B1; US7083969B2; US20050069560A1; EP1017840B1; KR19990025976A; EP1017840A1; DE69834128D1; WO1999015690A1; AU9188998A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Serratia-marcescens-Stamm, ein Prodigiosin, und die Verwendung des Prodigiosins auf Gebieten der Immunsuppression. Genauer gesagt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen neuen Stamm Serratia marcescens, welcher das Prodigiosin herstellen kann, und die Verwendung des Prodigiosins als Immunsuppressivum.
Stand der Technik
Seit einigen Jahren werden aktiv Studien durchgeführt und Forschung dahingehend betrieben, Immunsuppressiva zu entwickeln, die zum Studium von Immunozyten und von Immunantworten sowie zur Behandlung von Krankheiten nützlich sind, die eine Immunsuppression erfordern. Beispielsweise werden Immunsuppressiva bei der Erforschung nahezu sämtlicher Immunantworten eingesetzt, einschließlich der Zytokinbildung, der T-Zellen-Aktivierung, der Antikörperbildung, des Zelltods, der DNA-Synthese, der Immunozyten-Differenzierung, der intrazellulären Signalweiterleitung und dergleichen. Die Immunsuppressiva werden auch zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt, die übertriebenen Immunantworten zuzuschreiben sind, wie beispielsweise hypersensible Immunantwort und Allergien. Außerdem werden sie benötigt, um übermäßige Immunantworten nach der Transplantation von Organen wie beispielsweise der Niere, der Leber, der Bauchspeicheldrüse, des Rückenmarks, des Herzens, der Haut, der Lunge und so weiter zu unterdrücken.
Die am meisten verwendeten Immunsuppressiva umfassen beispielsweise Zyklosporin A, Zyklophosphamid, Rapamyzin, FK-506 und so weiter. Viele Immunsuppressiva mit ähnlichem oder differentem Unterdrückungsverhalten werden nun erforscht.
Die zur Gattung Streptomyces oder Serratia gehörenden Mikroorganismen produzieren rote Substanzen mit Pyrrolylpyromethen-Strukturen; als Beispiele hierfür können unter anderem Prodigiosin, Metacycloprodigiocin, Prodigiosen, Methoxyprodigiosin und Prodigiosin 25-C angeführt werden. Von ihnen ist nun bekannt, dass sie eine antibakterielle Wirkung sowie Anti-Malaria-Wirkung haben, und insbesondere Prodigiosin 25-C weist eine immunsuppressive Wirkung auf.
WO-A 95/17381 offenbart 2,2'-bi-1H-Pyrrol-Derivate gemäß der folgenden allgemeinen Formel
Diese Verbindungen weisen eine immunsuppressive Wirkung auf.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Prodigiosin als Immunsuppressivum mit T-zellen-selektiver immunsuppressiver Wirkung herzustellen. Dieses Ziel wird durch die Verwendung gemäß Anspruch 1 erreicht. Anspruch 2 ist ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel.
Die besten Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Die detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung folgt dem Muster Isolation eines gewünschten Mikroorganismus-Stamms; mykologische Charakterisierung des Stamms; Extraktion des Prodigiosins mit einem organischen Lösungsmittel; Purifikation des Prodigiosins durch Kieselgel-Säulenchromatographie und Dünnschichtchromatographie; Strukturanalyse durch magnetische Kernresonanz (NMR); Gebrauch des Prodigiosins als T-zellenselektives Immunsuppresivum.
Keimfreie Versuchstiere, Mäuse BDF1 und B6C3F1, die vom Genetic Resources Center, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology des Korean Institute of Science and Technology stammen, wurden zur Bestimmung der immunsuppressiven Wirkung des Prodigiosins eingesetzt. Die Daten aus den ex-vivo-Versuchen bezüglich der immunsuppressiven Wirkung von Prodigiosin zeigen, dass eine Menge von 300 nM Prodigiosin eine zytotoxische Wirkung aufweist, eine Menge von unter 100 nM jedoch keine Wirkung erzielt. In den Konzentrationen, in denen sie keine zytotoxische Wirkung haben, kann Prodigiosin die Immunantwort von β-Lymphozyten nicht unterdrücken. Prodigiosin hatte keinen Einfluss auf die Antikörperbildung und die Proliferation von β-Lymphozyten, hat jedoch eine potentiell unterdrückende Wirkung auf die Proliferation und die Aktivität von T-Lymphozyten. Diese selektive Immunsuppression bei T-Lymphozyten wird nicht auf die selektive Zytotoxizität gegenüber T-Lymphozyten zurückgeführt. Bei in-vivo-Versuchen wurden dieselben Ergebnisse bezüglich Immunsuppression erzielt wie bei den ex-vivo-Versuchen. Bei der Messung der T-Lymphozyten-Aktivität mit Hilfe einer Abstoßungsreaktion zwischen Transplantat und Empfänger und einer T-zellen abhängigen Antikörperbildungsreaktion unterdrückte das Prodigiosin die Immunantwort, übte jedoch keine toxische Wirkung auf Tiere aus. Daher wird angenommen, dass die immunsuppressive Wirkung des Prodigiosins auf die selektive Suppression der T-Lymphozyten-Aktivität zurückzuführen ist.
Prodigiosin 25-C, ein zu Prodigiosin analoges, hinsichtlich Struktur und Molekulargewicht jedoch hiervon unterschiedliches Immunsuppressivum, unterdrückt bekanntlich die Proliferation von T-Lymphozyten, nicht jedoch die Proliferation von B-Lymphozyten. Von den T-Lymphozyten werden die CD8-T-Lymphozyten unterdrückt, nicht jedoch die CD4-T-Lmphozyten. Im Gegensatz dazu hat das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung eine immunsuppressive Wirkung sowohl auf die CD8-T-Lymphozyten als auch auf die CD4-T-Lymphozyten. Diese immunsuppressive Wirkung ähnelt derjenigen von anderen bereits vorhandenen Immunsuppressiva. Wie die im Handel erhältlichen Immunsuppressiva, beispielsweise Zyklosporin A, Zyklophosphamid, FK-506 und Rapamyzin unterdrückt das Prodigiosin der Erfindung selektiv die Immunantwort von T-Lymphozyten.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Reaktionssysteme veranschaulichen die Anwendung von Prodigiosin zur Grundlagenforschung in der Immunologie, sind jedoch nicht auf eine solche bestimmte Verwendung von Prodigiosin beschränkt. Die derzeit eingesetzten Immunsuppressiva werden auf verschiedenen Gebieten benötigt. Als Erstes werden sie bei der Behandlung von Krankheiten, die eine Immunsuppression erforderlich machen, sowie bei der Grundlagenforschung hierfür benötigt. Immunsuppressive Medikamente sind zur Beseitigung der Immunantwort nötig, die auf die Transplantation von Organen oder Geweben folgt. Ein weiteres Anwendungsgebiet von Immunsuppressiva ist die Grundlagenforschung in Bezug auf Immunzellen. Dieses Gebiet umfasst Studien über Cytokine, die Aktivierung und Differenzierung von Immunzellen und die intrazelluläre Signalweiterleitung. Auf diesem Gebiet sind Zyklosporin A, Zyklophosphamid, FK-506 und Ripamycin erhältlich. Da das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung eine Wirkung hat, die vergleichbar mit den oben genannten Immunsuppressiva ist, kann es auf diesen verschiedenen Gebieten als Heilmittel und als Standard eingesetzt werden.
Das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung hat die folgende chemische Formel, bei einem Molekulargewicht von 323, gemessen durch NMR.
Anhand der folgenden Beispiele, die zur Verdeutlichung dienen, jedoch nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung aufzufassen sind, kann die vorliegende Erfindung besser verständlich gemacht werden.
Beispiel I: Kultur eines Serratia-marcescens-Stammes und Gewinnung von Prodigiosin
Aus einem Schwemmsandgebiet in Mokpo, Korea, wurden Bodenproben entnommen. Aus den Proben wurde eine zur Gattung Serratia spp. gehörende Bakteriengruppe isoliert und erhielt den Namen Serratia marcenscens B-1231. Sie wurde am 19.
September 1997 bei der Koreanischen Sammlung von Arten-Kulturen am Korean Resarch Institute of Bioscience and Biotechnology (Koreanisches Forschungsinstitut für Biowissenschaften und Biotechnologie) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer KCTC-0386BP. Um ein Immunsuppressivum zu erhalten, wurden Serratia marcescens B-1231 62 Stunden lang bei 28°C in einem 1L-Erlenmeyer-Kolben kultiviert, das ein Grundnährmedium enthielt, welches aus 1 % löslicher Stärke; 0,5 % Pharmamedia; 0,2 % Glukose; 0,1 % Ammoniumsulfat; 0,1 % Kaliumphosphat; 0,05 % MgSO₄•7H₂O; 0,1% Kalziumchlorid und 0,3 NaCl enthielt, bei pH 7,0. Eine gleiche Menge Ethylacetat wurde der Kultur zugefügt, und diese wurden 30 min lang ausreichend vermischt, um eine organische Schicht zu erhalten. Als die organische Schicht unter verringertem Druck konzentriert wurde, erhielt man eine rote Substanz. Diese wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie getrennt, bei der eine Mischung aus Chloroform und Methanol als mobile Phase eingesetzt wurde. Danach wurde eine Kieselgel-Dünnschichtchromatographie durchgeführt, um das Zielmaterial zu reinigen.
Beispiel II: in vitro-Versuch über die zytotoxische Wirkung von Prodigiosin auf Lymphozyten
Immunzellen wurden aus der Milz der keimfreien Tiere entnommen und in vitro kultiviert. Die Kulturen wurden mit unterschiedlichen Mengen Prodigiosin von 3 nM bis 30,000 nM behandelt, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde vom ersten bis zum dritten Tag nach der Behandlung gemessen. Ausgehend von der ursprünglichen Lebensfähigkeit der Immunzellen wurde die Lebensfähigkeit der Versuchsgruppen berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten dargestellt. Wie aus diesen Daten hervorgeht, ist die Lebensfähigkeit der behandelten Immunzellen bei einer Konzentration von mindestens 300 nM im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe deutlich verringert. Daher wurden Folgeversuche zur Immunwirkung bei höchstens 100 nM durchgeführt, um die Zytotoxizität auszuschließen, und nur die immunsuppressive Wirkung des Prodigiosins zu messen.
Tabelle 1 Wirkung von Prodigiosin auf die Lebensfähigkeit von Immunzellen
Beispiel III: in vitro-Versuch zur Wirkung von Prodigiosin auf die Immunzellen-Proliferation
Drei Standard-Substanzen, die Lymphozyten zur Proliferation veranlassen, wurden eingesetzt, um die Wirkung des Prodigiosins auf die Proliferation von Lymphozyten zu messen. 5 μg/ml Lipopolysaccharid wurden verwendet, um B-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, 5 μg/ml Concanavalin A für T-Lymphozyten, und 5 μg/ml Kermesbeer-Mitogen für sowohl B- als auch T-Lymphozyten. Prodigiosin wurde zusammen mit der die Proliferation anregenden Substanz zugegeben. Drei Tage nach Zugabe wurde die Proliferationswirkung durch Messung der synthetisierten DNA-Menge bestimmt. Um die Zytotoxizität von Prodigiosin auszuschließen, wurde es in einer Konzentration von höchstens 100 nM verwendet. Die Wirkung des Prodigiosins auf die Proliferation der Lymphozyten ist in Tabelle 2 unten dargestellt. In Tabelle 2 bedeuten die Prozentangaben für die Proliferation die Proliferations-Menge der mit Prodigiosin behandelten Lymphozyten in Bezug zu derjenigen der nicht behandelten Gruppe. Wie dargestellt, erreicht die durch Prodigiosin in einer Menge von 30-100 nM bewirkte Suppression bei durch Concanavalin A angeregte T-Lymphozyten 96–98 %; die Proliferation der durch Lipopolysaccharid angeregten B-Lymphozyten und der durch Kermesbeer-Mitogen angeregten B-/T-Lymphozyten wird jedoch jeweils zu 13–19 % bzw. 45–83 % unterdrückt. Folglich zeigen diese Daten, dass das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung eine potentiell immunsuppressive Wirkung hat, die selektiv auf T-Lymphozyten ausgeübt wird.
Wirkung von Prodigiosin auf die Proliferation von Immunzellen Tabelle 2
Beispiel VI: in-vitro-Versuch zur Wirkung von Prodigiosin auf die Immunantwort
Der Einfluss von Prodigiosin auf die Funktionen der Lymphozyten wurde unter Verwendung von drei Reaktionssystemen gemessen. Als Erstes wurde die Proliferationsfähigkeit von B-Lymphozyten als Reaktion auf einen Lipopolysaccharid-Stimulus ermittelt. Dazu wurde am dritten Tag nach der Stimulation mit Lipopolysaccharid die Antikörperbildung der B-Lymphozyten gemessen. Wenn B-Lymphozyten mit Lipopolysaccharid stimuliert werden, können sie ohne Hilfe der T-Lymphozyten Antikörper bilden. Als Zweites wurde eine gemischte Lymphozyten-Reaktion ausgelöst, um die Wirkung auf die T-Zellen-Antwort festzustellen. Diese Reaktion benötigt keine Hilfe von den B-Lymphozyten. Am dritten Tag nachdem zwei Arten von Heteroimmunzellen, die sich in ihrem Histokompatibilitätsantigen unterscheiden, vermischt wurden, um die Aktivität der T-Lymphozyten anzuregen, wurde die T-Zellen-Antwort beurteilt. Als Drittes wurde die T-zellenabhängige Antikörperbildungsreaktion verwendet, um die Wirkung von Prodigiosin auf die gleichzeitige Immunantwort von B- und T-Lymphozyten zu beurteilen. Diese Reaktion erfordert die gleichzeitige Funktion der B- und T-Lymphozyten. Am fünften Tag nach Immunisierung der Lymphozyten mit den roten Blutzellen von Schafen wurde ihre Fähigkeit zur Antikörperbildung bewertet.
Die Wirkung von Prodigiosin auf die Immunantwort von Lymphozyten wird in Tabelle 3 unten gezeigt. Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, wird die Immunantwort, bei der T-Lymphozyten involviert sind, bedeutend unterdrückt, die B-Zellen-Antwort jedoch durch alle Konzentrationen hindurch überhaupt nicht. In Tabelle 3 beziehen sich die Werte relativ zur Immunantwort der nicht mit Prodigiosin behandelten Lymphozyten.
Zusammen genommen zeigen die Daten aus den Beispielen III und IV, dass das Prodigiosin die Proliferation und die Immunantwort von T-Lymphozyten potentiell selektiv unterdrückt.
Tabelle 3 Wirkung von Prodigiosin auf die Immunantwort von Immunzellen
Beispiel V: Selektive Zytotoxizität von Prodigiosin gegenüber B-, CD4-T- und CD8-T-Lymphozyten
Durch Messung des Mengenanteils der jeweiligen Zellen wurde untersucht, ob die selektive Immunsuppression von Prodigiosin gegenüber T-Zellen auf die selektive Zytotoxizität gegenüber T-Zellen zurückzuführen ist oder nicht. Am dritten Tag nach Behandlung der Immunzellen mit Prodigiosin wurde die Zahl der Zellen gezählt. Da T-Lymphozyten aus DC4-T-Zellen (Helfer-T-Zellen) und CD8-T-Zellen (zytotoxische T-Zellen) bestehen, wurde in diesem Beispiel der Anteil an T- und B-Lymphozyten berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt. Die Daten aus Tabelle 4 zeigen, dass das Prodigiosin keine selektive Zytotoxizität aufweist. Daher ist erwiesen, dass die selektive Immunsuppression für T-Lymphozyten auf die Unterdrückung der Immunantwort, nicht aber auf Zytotoxizität, zurückzuführen ist. Zusammen mit dem Ergebnis aus Beispiel II zeigt dieses Ergebnis auch, dass das Prodigiosin innerhalb eines wirksamen experimentellen Konzentrationsbereichs nicht toxisch ist.
Tabelle 4 Zytotoxizität von Prodigiosin gegenüber Lymphozyten
Beispiel VI: in-vivo-Versuch zur Wirkung von Prodigiosin auf T-Lymphozyten
Für die in-vivo-Beurteilung der durch Prodigiosin hervorgerufenen Immunsuppression wurde eine Reaktion zwischen Transplantat und Empfänger herangezogen. Die Reaktion zwischen Transplantat und Empfänger ermöglicht eine Bewertung der Immunantwort der T-Lymphozyten. Am sechsten Tag nach der Transplantation der T-Lymphozyten von BDF1-Mäusen, die sich ihn ihrem Antigen für Histokompatibilität unterscheiden, wurde das Gewicht der Lymphknoten gemessen und dadurch die Immunantwort der T-Lymphozyten auf die transplantierten Heteroantigene festgestellt. Das Prodigiosin wurde fünf Tage lang peritonal in einer Dosis von 30-100 mg pro kg Körpergewicht injiziert. Als Positivkontrolle wurde Zyklophosphamid fünf Tage lang in einer Dosis von 100 mg/kg peritonal injiziert. Das Körpergewicht der gespritzten Mäuse wurde gemessen, um die Toxizität des Prodigiosins mit der des Zyklophosphamids zu vergleichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 dargestellt, welche einen Beleg dafür darstellt, dass das Prodigiosin potentiell die Immunantwort der T-Lymphozyten ebenso wie die Positivkontrolle, das Zyklophosphamid, unterdrückt. Was das Körpergewicht anbelangt, so hatte es sich bei den Mäusen, denen Prodigiosin in einer wirksamen Konzentration injiziert wurde, nicht verändert. Dies zeigt, dass das Prodigiosin die Immunantwort von T-Lymphozyten unterdrückt, ohne in vivo eine toxische Wirkung zu haben. Im Gegensatz dazu trat bei den mit Zyklophosphamid in wirksamer Konzentration injizierten Mäusen ein Gewichtsverlust auf, was die Toxizität der Chemikalie zeigt.
Tabelle 5 Wirkung von Prodigiosin auf T-Lymphozyten
Beispiel VII: Wirkung von Prodigiosin auf T-Lymphozyten in vivo (T-zellen-abhängige Immunantwort)
Eine T-zellen-abhängige Immunantwort-Reaktion wurde verwendet, um den Einfluss von Prodigiosin auf T-Lymphozyten in vivo zu beurteilen. Versuchstiere wurden durch peritonale Injektion mit roten Blutzellen von Schafen immunisiert. 4 Tage nach der Immunisierung wurde die Zahl der Antikörper bildenden Zellen gezählt. Prodigiosin wurde täglich peritonal injiziert. Ausgehend von der Anzahl der Antigen bildenden Zellen bei nicht behandelten Tieren wurde der Einfluss von Prodigiosin auf T-Lymphozyten in vivo in Prozent ermittelt. Ebenso wurde das Gewichtsverhältnis zwischen Milz und Körper gemessen, um die Toxizität von Prodigiosin auf die Tiere zu bestimmen. Als Positivkontrolle wurde Zyklophosphamid verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 unten dargestellt. Wie aus den in Tabelle 6 enthaltenen Daten hervorgeht, wurde die Zahl der Antikörper bildenden Zellen durch Behandlung mit Prodigiosin deutlich verringert, was in Bezug auf die Immunsuppression vergleichbar ist mit der Positivkontrolle, dem Zyklophosphamid. Berücksichtigt man nun das Gewichtsverhältnis zwischen Milz und Körper, zeigte das Prodigiosin bei wirkungsvollen Konzentrationen keine Toxizität, wohingegen das Zyklophosphamid bei wirkungsvoller Konzentration sehr toxisch war.
Tabelle 6 Wirkung von Prodigiosin auf T-zellen-abhängige Immunantwort
Industrielle Anwendung
Wie aus den Daten in den Beispielen hervorgeht, hat das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung eine potentiell unterdrückende Wirkung auf die Immunantwort der T-Lymphozyten, sowohl in vivo, als auch in vitro. Was noch besser ist, ist dass Prodigiosin in wirksamer Konzentration keine Toxizität aufweist. Daher kann das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung als Immunsuppresivum oder als Standardmittel auf verschiedenen Gebieten eingesetzt werden, einschließlich der Behandlung von Krankheiten, die eine Immunsuppression erforderlich machen, und Grundlagenforschung über die Krankheiten, die Transplantation von Organen oder Gewebe, und die Immunzellen.

Claims

Verwendung des Prodigiosins nach der Formel:
zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit, bei der T-zellen-selektive immunosuppressive Wirkung sowohl auf CD8- als auch auf CD4-T-Lymphozyten erforderlich ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die T-zellen-selektive immunosuppressive Wirkung mit der Transplantation von Organen oder Geweben verbunden ist.