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Die
vorliegende Erfindung betrifft die chemische Struktur einer Reihe
bislang noch nicht identifizierter Verbindungen, die Eisen mit hoher
Affinität binden,
die in der vorliegenden Fachliteratur als Exocheline bezeichnet
werden und von Mykobakterien freigesetzt werden. Die Erfindung betrifft
ebenfalls Modifizierungen, die an diesen erstmals identifizierten
Verbindungen vorgenommen werden, um die physiologischen Eigenschaften
und die Anwendungsmöglichkeiten
dieser erstmals identifizierten und modifizierten Verbindungen zu
variieren.
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Beim
akuten Herzinfarkt wird das Herzgewebe durch zwei aufeinanderfolgende
Ereignisse geschädigt,
nämlich
in der ischämischen
Phase durch Hypoxie und in der Reperfusionsphase durch oxidative
Schäden.
Herzmuskelgewebe, das in der ischämischen Phase geschädigt wurde,
kann gerettet werden, indem den ischämischen Bereichen erneut Blut zugeführt wird.
Die Reperfusion kann indes durch eine entzündliche Reaktion des erneut
durchbluteten Gewebes zu Schädigungen
führen,
wobei die entzündliche
Reaktion auf das Eindringen von Leukozyten in das Gewebe und auf
die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies zurückzuführen ist. Eine der reaktivsten
Spezies ist die Hydroxylspezies (•OH), welche in Gegenwart von
Eisen gebildet wird und zum Zelltod führt. Durch Verhinderung der
Bildung von (•OH) wird
verhindert, dass es aufgrund dieser Ursache zu tödlichen Zellschäden kommt.
Es ist bekannt, dass die Bildung von (•OH) von der Gegenwart freien
Eisens abhängt
und dass Eisen-Komplexbildner Schädigungen bei der Reperfusion
verhindern. Wenn vor der Reperfusion beispielsweise der Eisen-Komplexbildner
Deferoxamin verabreicht wird, werden Schädigungen verhindert und die
Ausdehnung, welche der Herzinfarkt während der Verstopfung der arteriellen
Herzkranzgefäße und während der
Reperfusion erreicht, wird verringert. Die Reperfusionsschäden stellen
sich nach der Wiederherstellung der Blutversorgung des ischämischen
Herzmuskels indes sehr schnell ein.
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Die
Bildung des (•OH)-Radikals
hängt von der
Gegenwart freien Eisens ab; Eisen-Komplexbildner können das freie Eisen abfangen
und auf diese Weise dafür
sorgen, dass für
die katalytische Bildung von Hydroxylradikalen kein Eisen zur Verfügung steht.
Die bekannten Eisen-Komplexbildner sind indes entweder nicht im
Stande, die Bildung von (•OH) durch
die Fenton-Reaktion zu verhindern (dies ist bei EDTA der Fall),
oder sie dringen zu langsam in die Zellen ein (dies ist bei Desferoxamin
der Fall), sodass keine ausreichenden Mengen zur Verfügung stehen, um
schnell genug eine Menge an Eisen zu komplexieren, die ausreichend
wäre, um
die Bildung von (•OH)
und infolgedessen die Zerstörung
von Zellen zu verhindern. Wie beispielsweise Krischer et al. berichten,
wurde gezeigt, dass Desferoxamin zwar wirksam ist, wenn es vor dem
Auftreten des Herzinfarktes verabreicht wird, nicht aber, wenn es
zum Zeitpunkt des Einleitens der Reperfusion oder danach verabreicht
wird.
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Ähnliche
Schädigungen
des Herzgewebes können
in Folge von Bypass-Operationen wie etwa während des Operationsvorganges
am offenen Herzen auftreten, oder an anderen Organen der Körpers, denen
es in Folge eines chirurgischen Eingriffs oder einer Verletzung
an sauerstoffreichem Blut fehlt.
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Die
Autoren Macham, Ratlegde und Barclay von der University of Hull
in England haben Exocheline kurz beschrieben und deren allgemeine
Aufgaben im Wachstumsprozess von Mykobakterien diskutiert (Lionel
P. Macham, Colin Ratledge und Jennifer C. Nocton, "Extracellular Iron
Acquisition by Mycobacteria: Role of the Exochelins and Evidence Against
the Participation of Mycobactin",
Infection and Immunity, Vol. 12, Nr. 6, S. 1242–1251, Dez. 1975; Raymond Barclay
und Colin Ratlege, "Mycobactins
and Exochelins of Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum
and Other Related Species",
Journal of General Microbiology, 134, 771–776, (1988); L.P. Macham und
C. Ratledge, "A
New Group of Water-soluble iron-binding Compounds from Mycobacteria:
The Exochelins",
Journal of General Microbiology, 89, 379–282, (1975)). Macham hat in
der extrazellulären
Flüssigkeit
eine Substanz entdeckt, die er als Exochelin bezeichnet hat. Er
hat Exochelin als eine wasser- und chloroformlösliche Verbindung beschrieben,
welche dazu befähigt
ist, freies Eisen zu komplexieren. Den Ausführungen Machams zufolge weist
dieser Stoff Ähnlichkeiten
mit Mycobactin auf, welches sich in der Zellwand befindet und die Aufgabe
hat, Eisen in das Innere der Zelle zu überführen. Mycobactin ist allerdings
ein lipophiles, wasserunlösliches
Molekül,
das nicht in die extrazelluläre Umgebung
diffundieren und dort freies Eisen assimilieren kann. Macham et
al. haben erkannt, dass Exochelin bei physiologischen pH-Werten
die Aufgabe erfüllt,
anderen eisenhaltigen Verbindungen wie etwa Transferrin und Ferritin,
die im Serum vorkommen, das Eisen zu entreißen und in einer Form bereitzustellen,
in welcher es auf Mycobactin übertragen
werden kann. Macham et al. haben die Exocheline zwar nicht isoliert
oder aufgereinigt, konnten aber feststellen, dass es sich um Penta-
oder Hexapeptide handelt, deren Molekulargewicht 750 bis 800 beträgt und die
3 Mol an ε-N-Hydroxylysin, ε-N-Acetyl-ε-N-hydroxylysin
oder ε-N-Hydroxyornithin
sowie 1 Mol an Threonin enthalten. Darüber hinaus hat der Autor veröffentlicht,
dass die Moleküle,
in Abhängigkeit
von der bakteriellen Herkunft des Exochelins, auch β-Alanin oder
Salicylsäure
umfassen.
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Barclay
(ibid) hat die Produktion von Exochelinen von zweiundzwanzig verschiedenen
Stämmen von
M. tuberculosis und verwandten Arten beschrieben. In der vorliegenden
Fachliteratur findet sich indes weder eine Aufklärung der spezifischen Strukturen
der Exocheline noch Erkenntnisse über Anwendungsmöglichkeiten
für die
Exocheline, abgesehen von deren Aufgabe als Transportmedium, welches dem
Mycobactin, das sich in der Zellwand befindet, Eisen zuführt.
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Sharman
et al. haben die Isolierung, Aufreinigung und Struktur von Exochelin
MS, dem extrazellulären
Siderophor von Mycobacterium Smegmatis, veröffentlicht.
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Es
besteht somit ein Bedarf für
eine Substanz, die ohne Schwierigkeiten zum Zeitpunkt der Reperfusion
verabreicht werden kann und das freie Eisen, sobald es gebildet
oder verfügbar
gemacht wird, mit hoher Geschwindigkeit komplexiert, um die Bildung
des (•OH)-Radikals
zu verhindern. Weiterhin besteht ein Bedarf dafür, die spezifische Struktur
von Exochelin aufzuklären,
sodass seine Funktionsweise vollständig verstanden werden kann
und sein Nutzen in der Diagnostik, in der Behandlung und in der
Vorbeugung erkannt werden kann.
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KURZDARSTELLUNG
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Die
vorliegende Erfindung, welche in der Verwendung einer wirksamen
Menge an Desferriexochelinen zur Herstellung eines Medikaments zur
Verhinderung der Schädigung lebenden
Gewebes durch die Bildung oder die Gegenwart des (•OH)-Radikals besteht,
deckt diesen Bedarf. Insbesondere zielt die Erfindung darauf ab,
dem Herzmuskel nach einer Verletzung durch eine eisenvermittelte
Bildung freier Radikale ein Medikament zu verabreichen, welches Exocheline
umfasst. Ferner wird die chemische Struktur von Exochelinen und
modifizierten Exochelinen aufgezeigt sowie weitere Möglichkeiten,
diese Stoffe zur Behandlung und Diagnose von Krankheiten bei Säugetieren
anzuwenden.
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ZEICHNUNGEN
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Diese
und andere Eigenschaftsmerkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden zum besseren Verständnis anhand der folgenden
Beschreibung, der angehängten
Ansprüche und
der beigefügten
Zeichnungen erläutert.
Es zeigen:
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1 die chemische Struktur eines Eisen-Chelatkomplexes
des Exochelins (Ferriexochelin) sowie das (eisenfreie) Desferriexochelinmolekül;
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2 ein Elutionsprofil des Filtrates einer Kultur
von M. tuberculosis, aufgenommen bei 220 nm und 450 nm;
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3 ein
Elutionsprofil desselben Filtrates, aufgenommen bei 450 nm, wobei
für jedes
Signal das Molekulargewicht angegeben ist;
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4 das Massenspektrum eines in größeren Anteilen
vorkommenden serinhaltigen Exochelins bei m/z = 720,3, wobei die
daraus abgeleitete Struktur ebenfalls abgebildet ist;
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5 ein
Diagramm, in welchem die Hemmung von Zellschäden durch die Behandlung von Herzmuskelzellen
mit einer Exochelinmischung dargestellt ist;
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6 ein
Diagramm, in welchem die Hemmung von Zellschäden durch die Behandlung von Herzmuskelzellen
mit Exochelin 758C dargestellt ist;
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die 7, 8, 9 Diagramme,
in welchen die Hemmung von Zellschäden durch die Behandlung von
Herzmuskelzellen mit den Exochelinen 758C, 772A und 772C dargestellt
ist;
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10 die chemische Struktur eines Eisen-Chelatkomplexes
des Exochelins (Ferriexochelin) sowie das (eisenfreie) Desferriexochelinmolekül mit Kennzeichnung
derjenigen Stellen, an denen eine Modifizierung vorgenommen werden
kann.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Es
ist entdeckt worden, dass Exocheline oxidative Zellschäden, die
durch die eisenvermittelte Katalyse von Reaktionen zwischen Gewebe
und freien Radikalen wie etwa dem Hydroxylradikal (•OH) verursacht
werden, verhindern oder deutlich verringern können, insbesondere hinsichtlich
der Hydroxylradikale, die bei der Fenton-Reaktion entstehen, wobei
diese Schäden
gemeinhin mit dem Begriff Reperfusionsschäden bezeichnet werden. Es ist
weiterhin entdeckt worden, dass das Exochelin Reperfusionsschäden wirksam
verzögern
oder diesen vorbeugen kann, wenn es zu Beginn oder im Laufe des
Reperfusionsvorganges verabreicht wird. Darüber hinaus ist entdeckt worden,
dass Exocheline entgegen den ursprünglichen Theorien von Macham
et al. und Barclay et al. eine viel breiter gefächerte Stoffklasse umfassen
und auch eine andere chemische Struktur aufweisen.
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Es
ist ebenfalls entdeckt worden, dass diese Stoffe eine weite Bandbreite
von Metallen komplexieren können,
wobei bislang noch unbekannte Stoffe gebildet werden. Neben der
vorbeugenden Wirkung gegen Reperfusionsschäden können Exocheline, die in geeigneter
Weise modifiziert wurden, dazu verwendet werden, bestimmte Krankheiten
zu behandeln, bestimmte Zellen wie etwa Krebszellen anzugreifen,
die Wirksamkeit medikamentöser
Behandlungen zu überwachen
und das Vorhandensein bestimmter Krankheitszustände nachzuweisen. Insbesondere
ist bekannt, dass das Wachstum von Neuroblastomzellen durch das
Entfernen von Eisen unter Verwendung der eisenkomplexbildenden Verbindung Desferrioxamin
negativ beeinflusst werden kann, ohne dass dabei das Wachstum normaler Zellen
beeinträchtigt
würde.
Zu den weiteren Anwendungsmöglichkeiten
für Exocheline
gehören
die Behandlung eines Eisenüberschusses
in Folge von Transfusionen oder die Chemotherapie zur Bekämpfung von Krebs,
insbesondere von Leukämie.
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Bei
der Isolierung und Aufreinigung von Exochelinen ist festgestellt
worden, dass die Exocheline eine Molekülfamilie bilden, die eine Spannbreite
von Molekulargewichten aufweist und über mehrere verschiedenartige
Seitenketten verfügt.
Des Weiteren sind die Exocheline in aufgereinigter Form hergestellt worden,
und zum ersten Mal wurde ihr Nutzwert zum Abfangen von freiem Eisen
dergestalt aufgezeigt, dass sie der Bildung gewebeschädigender
Hydroxylradikale (•OH)
wirksam vorbeugen. Insbesondere sind aufgereinigte Exocheline von
M. tuberculosis isoliert worden, und es wurde gezeigt, dass sie
Eisen aus Transferrin, Lactoferrin und Ferritin bei physiologischen
pH-Werten wirksam entfernen können,
und zwar ohne dass die infektiösen
Eigenschaften der Bakterien, aus denen sie gewonnen wurden, dabei übertragen
würden.
Es ist weiterhin zum ersten Mal gezeigt worden, dass diese Exocheline
die Bildung von Hydroxylradikalen durch die Fenton-Reaktion verhindern
und dass sie, wie anhand der Reaktion von Herzmuskelzellen gezeigt
wurde, nach einem Herzinfarkt oder nach Gefäßschädigungen in anderen Geweben
Reperfusionsschäden
wirksam vorbeugen können,
wenn die Verabreichung entweder nach dem Anfall oder über mehrere
Stunden hinweg nach dem Ereignis erfolgt.
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Während die
Mycobactine ausführlich
untersucht worden sind, wurden Exocheline bislang noch nicht isoliert
oder aufgereinigt, und weder ihre Struktur noch ihre Zusammensetzung
sind aufgeklärt
worden. Darüber
hinaus haben wir festgestellt, dass die Exocheline in der vorliegenden
Literatur falsch beschrieben wurden, weshalb eine Strukturaufklärung für diese
Verbindungen nicht gelang. Genauer gesagt hat Macham (ibid.) sie
als Penta- oder Hexapeptide beschrieben, deren Molekulargewicht
750 bis 800 beträgt
und die 3 Mol an ε-N-Hydroxylysin, ε-N-Acetyl-ε-N-hydroxylysin
oder ε-N-Hydroxyornithin
sowie 1 Mol an Threonin enthalten. Wir haben entdeckt, dass die
Exocheline eine viel größere Spannbreite
an Molekulargewichten aufweisen und mehrere Reihen von Verbindungen
bilden, deren Unterschiede hinsichtlich der Molekulargewichte erkennbar
sind, die lediglich 2 Mol an ε-N-Hydroxylysin umfassen
und die auch keine Peptide sind. Ein Peptid ist ein Polymer einer Aminosäure (NH2-CHR-COOH), welches durch eine Kondensationsreaktion
zwischen der Carboxylgruppe eines ersten Moleküls und der Aminogruppe eines
weiteren Moleküls
unter Bildung einer Amidbindung (-CO-NH-) entsteht. Exocheline können nicht
als Peptide angesehen werden. Stattdessen enthalten sie drei Aminosäuren und
weitere strukturelle Bestandteile (Salicylsäure, Dicarbonsäuren oder
Analoga der Monoester sowie Hydroxycarbonsäuren), mit denen sie unter
Kondensation Amidbindungen (-NH-CO-), Hydroxamatbindungen (-NH(OH)-CO-)
und Esterbindungen (-CO-O-) eingehen. Die Ferri- und Desferriformen sind in 1 dargestellt.
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Herstellung – die Exocheline
wurden aus einem virulenten (Erdman) und einem avirulenten (H37Ra)
Stamm von M. tuberculosis gewonnen und aufgereinigt. Um ihre Produktionsleistung
an Exochelinen zu steigern, wurden die M. tuberculosis-Bakterien
in einem Eisenmangelmedium kultiviert. Genauer gesagt wurden der
Erdman-Stamm von M. tuberculosis (American type culture collection 35801)
sowie H37Ra (ATCC 25177) auf Agarplatten des Typs Middlebrook 7H11
bei 37°C
unter 5% CO2 kultiviert. Nach 14 Tagen wurden
die Bakterien entnommen, in 150 ml modifiziertem Sauton-Medium in Suspension
gebracht und in Kulturflaschen 3 bis 8 Wochen lang inkubiert. Das
modifizierte Sauton-Medium
enthielt 0,12 mg/l Ammoniumeisen(III)-citrat ohne Tensidzusatz.
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Anschließend wurden
eisenreiche Exocheline (Ferriexocheline) gewonnen, indem filtriert,
mit Eisen gesättigt,
mit Chloroform extrahiert und mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) aufgereinigt wurde. Im spezifischen Fall wurde der flüssige Überstand
der obigen Suspension über
nacheinander geschaltete 0,8-μm- und 0,2-μm-Filter
mit geringer Proteinbindung filtriert. Die Exocheline wurden anschließend mit
Eisen beladen, indem die filtrierte Überstandsflüssigkeit Eisen(III)-chlorid
(150 mg pro Liter Kulturfiltrat) ausgesetzt wurde. Die eisen(III)-haltigen
Exocheline wurden mit Chloroform gemischt (1 Volumen an Kulturfiltrat
auf 1,5 Volumina an Chloroform), und nach der Phasentrennung wurde
die exochelinreiche Chloroformschicht entfernt und unter Zusatz
von wasserfreiem Magnesiumsulfat (2 g/l) gelagert. Der Chloroformextrakt
wurde dann über
eine Glasfritte filtriert und am Rotationsverdampfer eingedampft,
woraufhin ein brauner Rückstand
erhalten wurde.
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Der
braune Rückstand
wurde weiter aufgereinigt, indem er in 5 ml einer ersten gepufferten
Lösung
(0,1% Trifluoressigsäure)
in Suspension gebracht wurde, woraufhin die Suspension auf eine Flüssigchromatographiesäule (C-18
Sep-Pak Kartusche) gegeben wurde. Die braune Bande, die sich unweit
des oberen Endes der Säule
bildete, wurde mit einem zweiten Puffer (0,1% TFA, 50% Acetonitril) eluiert.
Der teilweise aufgereinigte Stoff wurde anschließend dreifach mit 0,1%iger
Trifluoressigsäure verdünnt und
mit einer Rate von 1 ml/min. einem Trenngang mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie
unterzogen, woraufhin er auf eine C-18-Säule gegeben wurde. Das Vorhandensein
der eisenreichen Exocheline im HPLC-Eluat wurde nachgewiesen, indem
gleichzeitig die UV-Absorption des 450-nm-Peaks (Eisenverbindungen)
und des 220-nm-Peaks aufgezeichnet wurden, wobei letztere Amidgruppen
und aromatische Gruppen anzeigt. Näherungsweise 5 große und 10
kleinere Peaks, welche in 2 dargestellt
sind und von der letzten C-18-Säule
eluiert wurden, zeigten ein hohes Absorptionsverhältnis von
450 nm zu 220 nm. Durch Massenspektrometrie wurde bestätigt, dass
es sich dabei um Exocheline handelt. Die großen Peaks wurden mittels eines
zweiten Umkehrphasen-HPLC-Trenngangs auf einer Alkyl-Phenyl-Säule weiter
aufgereinigt. Die Exocheline, die aus dem Erdman-Stamm von M. tuberculosis
gewonnen wurden, waren identisch mit den Exochelinen, die aus dem H37Ra-Stamm gewonnen wurden.
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Charakterisierung – Nach den
Ergebnissen der LSIMS- und ESI-MS-Untersuchung der zahlreichen,
von der Säule
eluierten Peaks, welche in ihrer Fe(III)-Form vorlagen, (siehe 3)
beschränken sich
die Eisen-Exocheline nicht auf die zwei spezifischen Moleküle, die
oben aufgeführt
sind, sondern umfassen eine Familie, deren Vertreter Massen zwischen
716 und 828 Dalton aufweisen. Jedes Mitglied der Familie scheint
sich von seinem nächsten
Verwandten um 14 Dalton zu unterscheiden, was die Anzahl der CH2-Gruppen in der R1-Alkylseitenkette
widerspiegelt, und/oder um 2 Dalton, was das Vorhandensein einer
Doppelbindung in der R1-Alkylseitenkette
widerspiegelt. Demnach scheinen die Exocheline zwei Reihen zu bilden,
wobei die aufeinander folgenden Mitglieder der jeweiligen Reihe
sich hinsichtlich ihrer Masse um 14 Dalton unterscheiden, was bei der
gesättigten
Reihe Massen von näherungsweise 716,
730, 744, 758, 772, 786, 800, 814 und 828 Dalton entspricht und
bei der ungesättigten
Reihe Massen von 742, 756, 770, 784 798, 812 und 826. Zusätzlich dazu
definiert das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Methylgruppe
bei R3 (d. h. H oder CH3)
zwei weitere Reihen von Molekülen,
welche als die Serinreihe (R3 = H) und als
die Threoninreihe (R3 = CH3)
bezeichnet werden, wobei dieser Umstand durch Aminosäurenanalyse
bestätigt
wurde. Die Verbindungen, die den stärksten polaren Charakter aufweisen,
befinden sich in der Figur auf der linken Seite (sie werden zuerst
eluiert) und die unpolarsten (sie sind am besten in Fettstoffen
löslich)
auf der rechten Seite. Sämtliche
dieser Peaks sind indes wasserlöslich.
Wenn mehr als ein Peak mit demselben Molekulargewicht detektiert
wurde, erhielten die jeweiligen Peaks die Zusatzbezeichnungen A,
C oder C (d. h. 785A, B und C), um den Polaritätsgrad auszudrücken, wobei
A für die
polarste Verbindung und C für die
am wenigsten polare Form stehen. Es wird angenommen, dass die polareren
Formen dadurch entstehen, dass an unterschiedlichen Stellen im Molekül eine Methylgruppe
vorhanden ist.
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Struktur
des Exochelins – 4 zeigt das Ergebnis der Untersuchung
mittels Tandem-Massenspektrometrie,
wobei der Zerfall des am stärksten verbreiteten
serinhaltigen Desferriexochelins (unter He-Fluss bei 2 keV für eine Kollisionsenergie
von 6 KeV) bewirkt wurde, und zwar mit (M + H)+ bei
m/z 720,3. Für
jedes der neutralen Moleküle,
die jeweils einem Peak des in 4 gezeigten
Spektrums entsprechen, wurden die Fragment-Ionen einem der 6 Molekülbestandteile
A–F zugeordnet,
die beim Spalten der Amid- oder Esterbindungen unter Wasserstoffübertragung
entstehen. Die Säurehydrolyse
und Methylierung der Exochelin führte
zur Bildung von Salicylsäure
und Pimelinsäure.
Die massenspektrographische Untersuchung weist darauf hin, dass
die Pimelinsäure
in dem Exochelin in Form ihres Methylesters vorliegt.
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Auf
der Grundlage dieser Untersuchung ist in der 1 die
allgemeine Struktur der Ferriexocheline und der Desferriexocheline
dargestellt. Die Methylgruppe, die an der R4-Position dargestellt
ist (gemäß der Anordnung
in 10) kann sich auch an der R6-Position befinden. Das Eisen-Exochelin-Kernmolekül ist ringartig,
wobei sich das Eisen in der Mitte befindet. Das Molekül enthält 3 Aminosäureeinheiten (zwei
N-Hydroxylysine und 1 Serin oder Threonin, in Abhängigkeit
von davon, ob R3 ein Wasserstoff oder eine
Methylgruppe ist). Der Hauptunterschied zwischen Exochelinen und
Mycobactinen von M. tuberculosis besteht darin, dass R1 in
den Exochelinen entweder für
einen gesättigten
Alkylmethylester ((CH2)nCOOCH3) oder für
einen einfach ungesättigten
Alkylmethylester (CH2)xCH=CH(CH2)yCOOCH3 stehen
kann und dass Exocheline eine erheblich kürzere Alkylseitenkette als
Mycobactine aufweisen, wobei sich an den Enden dieser kürzeren Seitenketten Methylestereinheiten
befinden. Diese Unterschiede sorgen für die Wasserlöslichkeit
der Exocheline sowie für
ihre Fähigkeit,
Aufgaben in einer extrazellulären
Umgebung zu erfüllen.
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Klinischer
Nutzen – der
klinische Nutzen der Verabreichung von Exocheline zur Vorbeugung
gegen Reperfusionsschäden
wurde durch die Anwendung auf Muskelzellen erwachsener Ratten aufgezeigt.
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In
den untenstehenden Beispielen werden die verschiedenen Exocheline,
sowohl in ihrer Desferri- als auch in ihrer Ferri-Form, mit ihrem
Molekulargewicht gemäß den Angaben
zur Elutionskurve in 3 gekennzeichnet.
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Beispiel 1
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Das
Herz einer männlichen
Ratte wurde herausgetrennt, nachdem die Ratte anästhesiert, eine Thorakotomie
vorgenommen und das Herz in situ gekühlt wurde. Das herausgetrennte
Herz wurde anschließend
in der Anordnung nach Langendorff mit Collagenase und Hyaluronidase
in einer modifizierten Krebs-Ringer-Pufferlösung, die 50 μM Calcium enthielt,
perfundiert. Anschließend
wurde das Gewebe fein zerteilt und dann in einer Collagenase/Trypsin-Lösung dispergiert,
in eine kalte Trypsinhemmerlösung
filtriert und zunehmenden Konzentrationen an Calcium ausgesetzt.
Nach dem Entfernen der geschädigten
Zellen wurde die restliche Zellsuspension gemeinsam mit einem Kulturmedium,
das 5% fötales Rinderserum
enthielt, in mehrere lamininbeschichtete Kunststoffschalen gegeben.
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Nach
einer Ruhezeit von 48 Stunden wurde jeder der Kulturschalen Wasserstoffperoxid
zugesetzt, und die Lactat-Dehydrogenase-Aktivität (LDH), welche Zellschädigungen anzeigt,
wurde nach mehreren Zeitintervallen gemessen. Zu Vergleichszwecken
wurde ein Zellschädigungsindex
(CII) erstellt, indem die LDH bei unbehandelten Zellkulturen zum einen
in unverändertem
Zustand (Index 0) und zum anderen nach dem Einwirken eines Detergens,
welches eine 100%ige Lyse der Muskelzellen bewirkt (1% Triton X-100),
gemessen wurde, wobei die letztere Messung einem CII von 100 entspricht.
Daraufhin wurde der LDH-Wert unter spezifischen Behandlungsbedingungen
nach mehreren Zeitabschnitten bestimmt, was die Bestimmung des entsprechenden CII-Wertes
ermöglichte,
sodass die Einzelergebnisse gegen die Zeit aufgetragen werden konnten.
(5).
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Unter
Anwendung der oben beschriebenen Vorgehensweise wurde eine Mischung
der Desferri-Form der Exocheline 772C und 784 (eine 50:50-Mischung
des Peaks 772C und des Peaks 784) isoliert, wobei es sich um eine
verhältnismäßig unpolare
Substanz handelt, und zur Behandlung der Zellkulturen eingesetzt.
Das Exochelin wurde in seine Desferriexochelin-Form überführt, indem
es mehrere Tage lang mit 50 Millimol an EDTA bei einem pH-Wert von
6 inkubiert wurde. Die Desferri-Form wurde anschließend durch
Chloroformextraktion erneut aufgereinigt.
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Drei
Zellproben wurden entweder a) H2O2, b) H2O2 und 50 μM
an gleichzeitig zugesetztem Desferriexochelin (eisenfreiem Exochelin)
oder c) H2O2, welches
2 Stunden nach dem Zusatz von 100 μM an Desferriexochelin zur Zellkultur
zugegegeben wurde (Vorinkubation), ausgesetzt. Bei den unbehandelten Zellkulturen
zeigte sich nach Ablauf eines Zeitraumes von 4 Stunden eine Zellschädigung von
fast 62%. Im Gegensatz dazu hat der Zusatz von Exochelin, der gleichzeitig
oder 2 Stunden vor dem Peroxidzusatz erfolgte, die Zellschäden im Wesentlichen
verhindert oder deutlich verringert, wobei die Zellschädigung näherungsweise
2 bis 9% betrug.
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Beispiel 2
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Es
wurde wie in Beispiel 1 vorgegangen, wobei jedoch das Desferriexochelin
758C eingesetzt wurde, welches im Vergleich mit den Exochelinen 772C
und 784 polarer ist. Es zeigte sich hinsichtlich der Wirkung nur
ein geringer oder gar kein Unterschied zwischen einer gleichzeitigen
Gabe des Desferriexochelins 758C oder einer Gabe innerhalb von 15
Minuten nach der H2O2-Gabe.
In beiden Fällen wurde
nach 2 Stunden im Wesentlichen dasselbe Ausmaß an Zellzerstörung festgestellt
wie im Kontrollansatz. Wenn die Gabe des Desferriexochelins 758C
hingegen 2 Stunden vor dem H2O2-Zusatz
erfolgte, verringerte sich die Zellzerstörung auf einen CII-Wert von
ungefähr
20. Die Ergebnisse sind in der 6 dargestellt.
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Beispiel 3
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Die
oben dargelegte Vorgehensweise wurde unter Verwendung der Desferriexochelin
772A, 772C und 758C wiederholt. In den 7 bis 9 sind
die Ergebnisse für
eine Gabe, die 2 Stunden im Voraus erfolgt, für eine gleichzeitige Gabe und
für eine
Gabe der Exocheline mit 20 Minuten Verzögerung aufgetragen. Lediglich
beim Exochelin 772C konnte unter allen Bedingungen eine Verzögerung der
Schädigung
festgestellt werden, während
das Exochelin 772A unter keiner der Bedingungen wirksam ist. Das Exochelin
758C wiederum zeigt nur dann eine Schutzwirkung, wenn es 2 Stunden
vor dem Peroxid-Zusatz
gegeben wird. Daher wird die Schlussfolgerung gezogen, dass verhältnismäßig unpolare, besser
in Fettstoffen lösliche
Exocheline wirksam sind, wenn sie zum Zeitpunkt der Bildung des (•OH)-Radikals,
d. h. zum Zeitpunkt des Auftretens der Schädigungen, oder danach verabreicht
werden; Exocheline mit einem stärker
ausgeprägten
polaren Charakter müssen
1 bis 2 Stunden vor dem Ereignis, welches zur Bildung freier Radikale
führt,
verabreicht werden, um die Zellzerstörung zu verhindern oder zu verringern.
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Beispiel 4
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Die
Fähigkeit
von Exochelinen, mit eisenaufnehmenden Proteinen in Konkurrenz um
das Eisen zu treten, wurde bestimmt, indem Desferriexochelin mit
Lösungen
von Transferrin, Lactoferrin oder Ferritin bei Eisen/Exochelin-Molverhältnissen
von 4:1 und 1:1 inkubiert wurde. Der Umwandlungsgrad von Exochelin
aus seiner Desferri- in seine Ferni-Form wurde anschließend mittels
Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Innerhalb einer Minute nachdem das Desferriexochelin
einer zu 95% an Eisen gesättigten
Transferrinvorlage ausgesetzt wurde, begann das Exochelin, Eisen
aus dem Transferrin aufzunehmen, und innerhalb einer Stunde war
das Exochelin vollständig mit
Eisen gesättigt.
Bei einer Transferrinvorlage, die zu 40% an Eisen gesättigt war,
wurde das Eisen ebenfalls ohne Schwierigkeiten entfernt, wobei dieser
Wert annähernd
dem Eisensättigungsgrad
des Transferrins, so wie es im Serum vorliegt, entspricht. Ähnliche
Ergebnisse wurden erzielt, wenn das Desferriexochelin eisengesättigtem
Lactoferrin ausgesetzt wurde. Ferritin gab Eisen gleichermaßen an das Exochelin
ab, wobei die Umsetzung aber langsamer erfolgte als bei den anderen
eisenbindenden Proteinen.
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Es
ist festgestellt worden, dass Exochelin auf sehr wirksame Weise
freies Eisen in physiologischen Systemen abfangen und eisentragenden
Proteinen das Eisen entziehen. Es wurde insbesondere entdeckt, dass
Exochelin wirkungsvoll die Bildung des freien Hydroxylradikals (•OH) verhindert
und auf diese Weise die Schäden,
welche in ischämischem
Gewebe auftreten, wenn diesem Gewebe erneut Blut zugeführt wird,
deutlich verringert oder verhindert, wobei die Exochelin mit höherem Molekulargewicht und
weniger polarem Charakter zur Verhinderung der Zellzerstörung wirksamer
sind. Obgleich die positive Wirkung anhand von Herzgewebe aufgezeigt
wurde, ist es nach dem jetzigen Stand offensichtlich, dass die Anwendung
von Exochelinen nach einer Unterbrechung der Blutversorgung anderer
Körperorgane einschließlich des
Gehirns, der Nieren, der Leber, des Darms und der Skelettmuskulatur
positive Wirkungen hat, wobei das Anwendungsgebiet aber nicht auf
die genannten Organe beschränkt
ist.
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Die
Versuche haben gezeigt, dass die Affinität der Exochelin nicht auf Eisen
beschränkt
ist, sondern dass weitere Metalle wie etwa Na, K, Mn, Mg, Al und
Zn komplexiert werden können.
Daher können Exochelin
verwendet werden, um dem Körper
verschiedene erwünschte
Metalle oder zuzuführen
oder um im Körper
verschiedene unerwünschte
Metalle zu komplexieren. Hinzu kommt, dass bestimmte Zellen, einschließlich bestimmter
Krebszellen, bekanntermaßen
einen Bedarf an oder eine Affinität gegenüber bestimmten Metallen haben.
Dies kann dahingehend von Nutzen sein, dass dieser Zelle reaktive
Verbindungen, die den Exochelinen anhaften, zugeführt werden
können,
um die Zelle zu zerstören
(Chemotherapie) oder dass einem erkrankten Organ ein heilender pharmazeutischer
Wirkstoff, der an das Exochelin gebunden ist, gezielt zugeführte werden
kann. In umgekehrtem Sinne können
Desferriexocheline auch verwendet werden, um freies Eisen zu binden, da
bestimmte Krebszellen einen hohen Eisenbedarf haben, wodurch eine
Eisenversorgung der Krebszelle verhindert wird, was wiederum zum
Absterben der Krebszelle führt.
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Während in 1 die Struktur der Exocheline, die aus
M. tuberculosis gewonnen wurden, dargestellt ist, können bekanntermaßen auch
andere Mykobakterien Exocheline erzeugen, und diese Exocheline können bekanntermaßen abweichende Strukturen
aufweisen, einschließlich
unterschiedlicher Aminosäuren
in Abhängigkeit
von den Mykobakterien, aus denen sie gewonnen wurden. Sämtliche
dieser Exocheline werden indes ähnliche
Eigenschaften aufweisen und in ähnlichen
Reihen vorliegen, in denen die jeweiligen Vertreter ähnliche
Molekulargewichtsabstände
zu ihren Nachbarn aufweisen. Die Wirksamkeit der verschiedenen Mitglieder der
Reihe wird auch hier von der relativen Polarität der Moleküle abhängen. Daher sind im Rahmen
der Erfindung auch Exocheline denkbar, die von anderen Mykobakterien
erzeugt einschließlich
M. tuberculosis, M. microti, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M.
marinum, M. gastri, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. trivale,
M. malmoense, M. shimoidei, M. gordonae, M. asiaticum, M. szulgai,
M. simiae, M. scrofulaceum, M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M.
ulcerans, M. haemophilum, M. farcinogenes, M. lepraemuriurn, M.
paratuberculosis, M. chelonae subsp. chelonae, M. chelonae subsp.
abscesses, M. fortuitum, M. chitae, M. senegalense, M. agri, M. smegmatis,
M. phlei, M. thermoresistibile, M. aichiense, M. aurum, M. chubuense,
M. duvalii, M. flavescens, M. gadium, M. givum, M. komossense, M.
neoaurum, M. obuense, M. parafortuitum, M. rhodesiae, M. sphagni,
M. tokalense oder M. vaccae erzeugt werden, wobei sich die Auswahl
jedoch nicht auf die genannten Mykobakterien beschränkt.
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Es
ist ferner denkbar, dass Exocheline modifiziert werden können, um
ihre Löslichkeitseigenschaften,
ihre Fähigkeit,
Metalle zu komplexieren, oder die Geschwindigkeit, mit der sie von
Zellen aufgenommen werden, zu beeinflussen. Hinzu kommt der Nachweis
von modifizierten Exochelinen oder Exochelinen, wenn diese ein Metall
komplexieren, und zwar unter Anwendung von monoklonalen Antikörpern oder chemischer
Analytik als Diagnosewerkzeuge, um mittels Blutuntersuchung, Urinuntersuchung
oder nichtinvasiver instrumentellen Techniken die Entwicklung eines
Krankheitszustandes oder die Wirksamkeit einer Behandlung zu überwachen.
Mit Bezug auf die Strukturen der metallhaltigen und metallfreien
Verbindungen, die in 10 dargestellt sind,
wird insbesondere an die folgenden Substitutionen gedacht:
R1=(CH2)nCH3 als lineare oder verzweigte Kette; (CH2)nCOOH, eine Fettsäure; (CH2)nCOOR, ein Fettsäureester,
wobei R eine Alkylgruppe ist; (CH2)nCONH2;
R2 = eine Substitution an einer beliebigen
der 4 freien Stellen am Ring, und zwar mit Alkylgruppen, Sulfonamiden,
Hydroxyl, Halogen, Acetyl, Carbamyl, Aminen, NO2 oder
einer Kombination dieser Substituenten;
R3 – das H
(Serin) oder das CH3 (Threonin) können durch
Seitenketten ersetzt werden wie sie an β-Hydroxyaminosäuren vorkommen,
die dazu befähigt sind,
zyklische Oxazolin-Strukturen
zu bilden.
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R4a und R4b = H, CH3 oder andere Alkylgruppen oder substituierte
Alkylgruppen;
R5a und R5b =
H, CH3 oder andere Alkylgruppen oder substituierte
Alkylgruppen;
X = O, NH, S, CH2;
M
= ein-, zwei-, oder dreiwertige Metalle wie Pb, Al, Cd, Ni, Ag,
Au, As, Mg, Mn, Zn, Cu, Ru, Nb, Zr, Ta, V, Ga, Pt, Cr, Sc, Y, Co,
Ti, Na, K;
* steht für
Chiralitätszentren,
welche in R- oder S-Konfiguration vorliegen können;
Die verschiedenen
Hydroxylgruppen (OH), die an der Komplexierung des Metalls beteiligt
sind, können durch
unterschiedliche funktionelle Gruppen wie etwa H oder ein Halogen
ersetzt werden, um die Affinität
der Verbindung gegenüber
dem komplexierten Metall zu variieren oder um das Molekül in einen
Metall-Antagonisten umzuwandeln.
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Obgleich
die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte
Versionen und deren Anwendungsmöglichkeiten
recht ausführlich beschrieben
worden ist, sind andere Versionen und Anwendungen möglich. Beispielsweise
können
Exocheline verwendet werden, um infektiöse Bakterien wie etwa M. tuberculosis
zu bekämpfen,
indem die Eisenversorgung der Mykobakterien unterbunden wird, oder
um toxische Mengen an Metallen aus dem Körper zu entfernen oder um erwünschte Metalle dem
Körper
zuzuführen.
Weiterhin können
modifizierte, metallhaltige Exocheline, denen pharmazeutische Wirkstoffe
oder Chemikalien angefügt
wurden, diese solchen Stellen im Körper zuführen, die vorzugsweise komplexierte
Metalle absorbieren, und die vorzugsweise absorbierten Exocheline
mit komplexierten Metallen können
als Ziele bei der Behandlung mit anderen Mitteln wie etwa mit Mikrowellenenergie zur
hypothermischen Behandlung von Krebszellen verwendet werden. Daher
ist der Geltungsbereich der beigefügten Ansprüche keinesfalls derart so aufzufassen,
als beschränke
er sich auf die vorliegende Beschreibung der bevorzugten Versionen.
