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Neue chemische Substanz, gennant Bedinin Die Erfindung betrifft eine
neue chemische Substanz, die'als Bredinin bezeichnet wird und die sich zur Verwendung
als Therapeutikum zur Unterdrückung von Immunreaktionen bei Organ transplantationen
verwenden lässt, sowie ein Verfahren zur Gewinnung dieser neuen Substanz.
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Es sind bereits Verbindungen bekannt, die antivirale Wirkung haben,
als Antimetabolit-Chemotherapeutika Verwendung finden können und/oder als Therapeutika
zur Unterdrückung von Immunreaktionen bei Organtransplantationen zu dienen vermögen.
Dazu gehören beispielsweise Virazol ( 1-ß-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxamid),
Pyrazomycin ( 3(5)-Ribofuranosyl-4-hydroxypyrazol-5(3)-carboxamid), Cytosin-arabinosid
( I-ß-D-Arabinofuranosylcytosin) und Azathioprin ( Imuran, 6-[(1-Methyl-4-nitroimidazol-5-yl)-thio]-purin
). Insbesondere in jüngster Zeit besteht ein wachsender Bedarf an wirksamen Immunoreaktionen
bei Organtransplantationen unterdrückenden Yiitteln. Es wurde insbesondere Imuran
häufig bei solchen Operationen gegeben. Die relativ hohe Toxizität der bekannten
Mittel macht es jedoch unmöglich, sie fortlaufend zu verabreichen.
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Der erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Substanz zu schaffen,
die vergleichsweise geringe Toxizität hat und unbedenklich auch längerfristig als
Therapeutikum zur Unterdrückung von Immunoreaktionen bei Organtransplantationen
eingesetzt werden kann.
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Diese Aufgabe wird gelöst mit einem chemaschen-Stoff, der erfindungsgemäss
gekennzeichnet ist durch die Formel
bei dem es sich um ein Anhydro-4-carbamoyl-5-hydroxy-1-ribofuranosylimidazoliumhydroxid
handelt, das als Bredinin bezeichnet wird.
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Ein Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemässen Substanz Bredinin
ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus des Genus Eupenicillium, und
zwar Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734, in einem Kulturmedium gezüchtet und daraus
das Bredinin isoliert wird.
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Es wurde überraschend gefunden, dass es sich bei der neuen als Bredinin
bezeichneten Substanz der oben angegebenen Formel I um ein Mittel handelt, das antivirale
Wirksamkeit besitzt und als Mittel zur Unterdrückung von Immunoreaktionen eingesetzt
werden kann, und zwar auch über längere zeiten, ohne dass toxische Nebenwirkungen
auftreten.
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Bredinin lässt sich vorteilhaft durch ein mikrobiologisches Verfahren
gewinnen. Es wird dazu der Mikroorganismus Eupenicillium brefeldianum (vergl. z.B.
A.C. Stolk, "Persoonia" 4, 391 (1967); A.B. Raper "A Manual of the Penicillia" Seite
141 (1949) ) verwendet. Dieser Mikroorganismus ist hinterlegt in Japan beim Institute
for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science & Technology,
unter FERM-P No. 1104, und in den V.St.A. beim United States Department of Agriculture,
Nothern Marketing and Nutrition Research Division unter NP 5734.
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Man kann zur Gewinnung des erfindungsgemässen Bredinins den Microorganismus
Eupenicillium brefeldianum NPRL 5734 (FERM-P No. 1104) in üblicher Weise züchten.
Dabei kann man feste oder flüssige Nährböden verwenden; für Produktionen im technischen
Maßstab wird bevorzugt das Submers-Verfahren benutzt, bei dem die Mikroorganismen
in der gesamten-Nährlösung verteilt unter Belüftung Kultiviert werden.
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Als Züchtungsmedium kann ein für die Kultivierung von Microorganismen
übliches Nährsubstrat eingesetzt werden. Dabei können als Quelle fur assimilierbaren
Kohlenstoff beispielsweise Glukose, Saccharose, Laktose, Maltose, Starlce, Dextrin,
Melassen, Glycerin und dergleichen eingesetzt werden. Als Quelle für assimilierbaren
Stickstoff
können zweckmässig Kronweichwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsaatpulver, Weizenkleie,
Pepton, Fleischextralzt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Ammoniumsalz, Nitrat und
dergleichen benutzt werden. Es können weiterhin, sofern erforderlich, Salze, wie
beispielsweise Magnesiurn-, Calciurn-, Kalium-, Natrium-, Zink-Eisen (II)- oder
(111)-Salze, Phosphate, Manganate, zugesetzt werden.
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Die Temperatur, bei der gezüchtet wird, kann angepasst dem Wachstum
der Mikroorganismen und der Produktion an Bredinin, vorteilhaft zwischen 26 bis
30°C variiert werden. Die Züchtungsdauer hängt von den speziell gewählten Bedingungen
ab und liegt vorzugsweise bei 40 bis 70 Stunden, und wenn die höchste Produktionsgeschwindigkeit
an Bredinin erreicht ist, sollte der Züchtungsvorgang zweckmässig abgebrochen werden.
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Das Bredinin befindet sich in dem flüssigen Filtrat; der Hiyceliakuchen
enthält diese Substanz nicht. Da Eredinin eine in Nasser lösliche Substanz ist,
die sich in den meisten organischen Lösungsmitteln nur schwer und speziell in mit
Wasser nicht miscabaren organischen Lösungsmitteln praktisch gar nicht lösen lässt,
ist es nicht möglich, dass Bredinin aus dem Filtrat durch Extraktion mit einem organischen
Lösungsmittel isoliert wird. Daher macht man für die Isolierung zweckmässig Gebrauch
von der schwach sauren Natur des Bredinins oder dessen Unlöslichkeit in organischen
Lösungsmitteln. Da Bredinin eine schwache antimikrobielle Aktivität nat, lässt es
sich mittels des üblichen Plattentestes unter Verwendung von Candida albicans als
Testorganisraus nachweisen.
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Ein Beispiel für einen Isolier- und Reinigungsvorgang bei der Gewinnung
des erfindungsgemässen Bredinins ist die folgende Arbeitsweise: Das aus der Züchtung
von Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 (FERM-P No. 1104) gewonnene Filtrat wird
auf pH 9,0 eingestellt und dann durch ein stark basisches Anionenaustauscherharz
vom Hydroxy-Typ, beispielsweise Amberlite IRA-411 (Handelsbezeichnung
der
Firma Röhm # Hass Co., V.St.A.) hindurchgeleitet; das Bredinin wird daran absorbiert.
Anschliessend wird mit 2%iger wässeriger Essigsäure eluiert und vorteilhaft wird
das Eluat nochmals mit stark basischem Anionenaustauscherharz behadenlt und eluiert.
Das Eluat wird im Vakuum eingedampft, bis ein öliger Rückstand verbleibt. Diesem
wird Methanol und Azeton zugesetzt und der dabei anfallende feste Kuchen wird pulverisiert,
wobei ein grau-weisses Pulver gewonnen wird. Man löst dieses Pulver in einer geringen
Menge an Wasser und unterwirft es der Säulenchromatographie, wobei als stationäre
Phase Silicagel benutzt wird. Die dabei erhaltenen violetten aktiven Fraktionen
werden im Vakuum getrocknet.
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Das Pulver wird in Wasser gelöst, danach mit Schwefelwasserstoff-Gas
gesättigt und so die Chelatkomplexe bildenden Metalle abgetrennt. Danach kann gewünschtenfalls
noch weiter gereinigt und dazu das pulverförmige rohe Bradinin in O,1 Mol Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung
gelöst und die Lösung durch eine Säule aus DEAE-Sephadex A-25 (Handelsbezeishnung
für vernetztes Diäthylaminoäthyldextran-Gel, Produkt der Firma Farmacia Co., Schweden)
geleitet werden Aus dem die aktive Fraktion enthaltenden Eluat wird durch Zugabe
von Tiethanol Bredinin in Form von weissen Kristallen auskristallisiert.
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Die physico-chemischen Eigenschaften von Bredinin sind folgende: 1.
Elementaranalyse: Gefunden: C: 41,70%, H: 5,06%, N: 16,21%, O: 37,03% 2. Molekulargewicht
und Molekularformel: Gefunden: 265 (durch Titration) Theoretisch: 259,22 als C9H13N3O6
3. Schmelzpunkt: >200°C ( Zersetzung, unter Braunwerden) 4. Optische Drehung:
[α]D27 = -35° (C=0,8, H2O) 5. Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in H2O): #max
: 245 mµ, E1cm 1% = 250 #max: 279 mµ, E1cm1% = 580
6.- Infrarot-Absorbtionsspektrum
(in Kflr tablettiert): Absorptionsbanden bei 3420, 3130, 2925, 2770, 1625, 1540,
1445, 1300, 1260, 1195, 1030, 1100, 1080, 1055, 930, 873, 829, 770, 740, 725, 560
cm-¹.
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7. Farbreaktionen: Positiv: Ferichlorid, Molisch, Kaliumpermanganat,
Pauli und Ehrlich.
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Negativ: Tolens, Fehling, Dragendorf, Leidon-Smith, Isatin, Sakaguchi
und Ninhydrin.
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8. Löslichkeit: Leicht löslich: Wasser etwas löslich : Methanol Schwer
löslich: Athanol unlöslich : übliche organische Lösungsmittel.
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9. pKa: schwach sauer (pt' 6,75).
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10. Färbung: weisse Kristalle 11. Stabilität: Wird bei pH 2-9 bei
60°C während 30 Minuten nicht inaktiviert Die chemische Struktur des 3redinins wird
in Übereinstimmung mit der Röntgen-Analyse in Form der oben angegebenen Formel (I)
wiedergegeben. Dabei sind selbstverständlich auch sonstige theoretisch glaubwürdige
Strukturen für diese Verbindung mit eingeschlossen.
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Die biologischen Eigenschaften des Bredinins sind die folgenden: 1.
Toxizität: 1) Akute Toxizität: >1 g/kg (i.p. Mäuse) Es wurden die länger als
eine Woche überlebenden Tiere festgestellt, nachdem die Substanz intraperitoneal
4 Tage lang in einer Menge von 500 mg/kg je Tag gegeben worden war.
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2) Blutuntersuchung bei kontinuierlicher Verabreichung: Die Ergebnisse
der Blutuntersuchung sind in Tabelle 1 veranschaulicht. Es wurden Bredinin und zu
Vergleichs zwecken Imuran Mäusen 8 Tage lang verabreicht.
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Tabelle 1 Leucocyten-Zahl Erythrocyten-Zahl Hämmoglobin mm 3 inr3
q/dl Kontroll- 5200 924 x 10 8,7 Test 7400 917 x 10 9,2 4700 821 x 10 9,4 Bredinin
5900 981 x10 11,0 100 mg/kg 4900 377 x 10 10,1 je Tag 6600 793 x 10 8,8 Imuran 1900
620 x 10 7,0 100mg/kg 1800 758 x 10 6,8 je Tag 2600 340 x 10 7,2 Aus Tabelle 1 ist
zu ersehen, dass bei Imuran-Gaben die beucocyten-Zahl ganz ergeblich abnimmt; auch
die Erytrocyten-Zahl ist vermindert. Bei Bredinin-Gaben sind diese Werte gegenüber
der Kontrollprobe praktisch nicht verändert.
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2. Antimikrobielle Aktivität: Bredinin hat keine antibakterielle Aktivität,
es weist jedoch eine schwache Inhibitoraktivität gegen Candida Arbicans auf.
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3. Wirksamkeit zur Unterdrückung von Immunreaktionen: 1) bei kontinuierlicher
Gabe von Bredinin über 4 Tage: 4 x 108 Zellen roter Blutkörperchen ( nachstehend
als SRBC (seep red blood cells) bezeichnet) wurden drei aus je männlichen Mäusen
des Stammes ddy bestehenden Gruppen intravenös injiziert. Danach wurde an die Mäuse
aus 2 der Gruppen Bedinin, ar einen Gruppe 50 mg/kg je Tag und der anderen Gruppe
100 mg/kg je Tag 4 Tage lang intraperitoneal verabreicht.
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Der Hämolysin-Titer und die auf Lilz Platten Dildenden Zellen wurden
an den 4 Tagen nach SRBC-Imunität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 veranschaulicht.
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Tabelle 2 Hämolysin-Titer Platzen bildende Zellen/Milz 4 Kontroll-Test
40 31,4 x 104 3redinin (50 mg/kg/Tag) 10 7,6 x Bredinin (100 mg/kg/Tag) > 5 1,8
x 104 wie in Tabelle 2 ersichtlich, lässt sich die Wirkung zur Unterdrückuny von
Immunreaktionen bei den mit Bredinin behandelten Tieren deutlich beobachten. Bei
einer 4 Tage währenden Verabreichung von 50 mg/kg je Tag wurde bereits eine hervorragende
Wirkung erzielt, und bei Gaben von 103 mg/kg je Tag wurde die Ailzahl der Platten
bildenden Zellen auf Milz auf eine Grössenordnung von 1/20 heruntergedrückt.
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2) Wirkung einer einmaligen Gabe von Bredinin: Es wurde SRBC Mäusen
intravenös inkiziert. Gleichzeitig bwz. am 1, 2. und 3. Tag nach der SRBC-Injektion
wurden 200 mg/kg an Bredinin intrperitoneal verabreicht. Am 4. Tag wurden der Hämolysin-Titer
und die Platten bildenden Zellen geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 veranschaulicht.
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T a b e l l e 3 Kontroll- Bredinin-Gabe (200 mg/kg) am test 0.Tag
1.Tag 2.Tag 3.Tag Hämolysin- 40 40 40 10 20 Titer Platten bildende Zellen 31,4 31,8
33,1 11,2 10,2 auf Milz (x 104) Man erkennt aus Tabelle 3, dass, wenn Bredinin am
gleichen Tag mit oder am ersten Tag nach der SRBC-Injektion verabreicht worden war,
die Immunreaktionen unterdrückende Wirkung gering ist..
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Die besten Ergebnisse für die Immunreaktionen unterdrückende wirkung
beobachtet man dann, wenn Bredinin am zweiten Tag nach der SRBC-Injection verabreicht
wird; und auch bei Verabreichung des Bredinins am dritten Tag nach der SP3C-Injektion
erkennt man noch die, allerdings etwas schwächer gewordene unterdrückende Wirkung.
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3) Wirkung auf Thymus-unabhängige Antigen-bildung: Als Ergebnis von
unter Verwendung von E. coli Endotoxin durchgeführten Experimenten wurde festgestellt,
dass Bredinin die Thymusunabhängige Antigebildung nicht inhibiert.
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4) Wirkungen auf sekundäre Resistenz: SRBC (4 x 108) wurden 4 Gruppen
von je 10 Mäusen intraperitoneal injiziert. 21 Tage später wurden den Mäusen aus
drei dieser Gruppen erneut 4 x 108 SRBC intravenös injiziert, und gleichzeitig wurden
intraperitoneal 3 Tage lang einmal täglich einer Gruppe 100 mg/kg je Tag an Bredinin
und einer Gruppe 100 mg/kg je Tag an Imuran verabreicht. 3 Tage nach der zweiten
SRBC-Injection wurden Hämolysin-Titer und Anzahl der Platten bildenden Zellen in
Milz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 veranschaulicht.
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Tabelle 4 Hämolysin- Platten bildende Titer Zellen / Milz Sekundäre
Kontroll- Immunität 40 15,3x104 Test Keine sekundäre In-unität (nur 5 0,19 primäre
Immunität) 0,19x104 Bradinin-Test (100 mg/kg) 5 3,1x104 Imuran-Test (100 mg/kg)
20 8,3x104 Die Ergebnisse zeigen, dass Bredinin auch gegen sekundäre Resistenz wirksam
ist, während Imuran nur eine sehr schwache Wirkung dafür zeigt.
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wie zuvor veranschaulicht, besitz; tredinin ein2 wesentlich stärkere
Wirkung zur Unterdrückung von Immunreaktionen, verglichen mit Imuran, und zwar nicht
nur gegen primäre Resistenz sondern auch gegen sekundäre Resistenz. Diese Tatsache
zeigt den sesonderen technischen Fortschritt, der mit dem erfindungsgemässen chemischen
Stoff erreicht wird, insbesondere im Hinblick auf die klinische Anwendung, denn
die Antigen-Stimulation geht nach erfolgter Organtranspiantation ständig weiter.
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4. Wirkung gegen Viren-Vermehrung 1) Es wurde die Wirkung von Bredinin
auf die Vermehrung von Herpes simplex Virus, Polio Virus, einen Hämagglutination
bewirkenden Virus aus Japan und Vaccinia Virus untersucht, und es wurden, ausgenommen
gegenüber Vaccinia Virus, keine inhibierenden Wirkungen beobachtet.
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Es wurden primäre Mäuseembryo-Zellen in einem Bredinin entllaltenden
Medium gezüchtet und nach 24 Stunden wurde mit 100 TCID50 (Tissue Culture Infectious
Dose 50%) an Virus beimpft. Die Prüfung wurde 72 Stunden später durchgeführt, die
Ergebnisse sind in Tabelle 5 veranschaulicht.
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Tabelle 5 Bredinin 100 20 4 0,8 0,16 Kontroll-(/ml) test Cytopathy
- - - - 1 111 scher Effekt 2) Wirkung auf Influenza-Virus-Infektion: Es wurden für
dicse Untersuchung EVC ( Hämagglutination bewirkender Virus aus Japan) - freie Mäuse
des ddY-Stammes mit einem Gewicht von 14 - 16 y eingesetzt. Der infizierende Virus,
Influenza A2 Kuramoto Starmm (H2N2), wird zunächst in der Allantoishöhle eines Bruteis
vermehrt. Anschliessend wird 1/250 ml an Virus-Flüssigkeit je Maus unter Verwendung
eines Dampf-Inhalators (vaponephrine Type nebulizer) nasal appliziert. Der Komperssor
des Inhalators wird so eingestellt, dass 10 ml Virusflüssigkeit in 30 Minuten gesprüht
wird.
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Bredinin und Imuran werden zweimal, jeweils 3 bzw. 1 Stunde vor der
Virusinfektion und zweimal, jeweils 1 bzw. 3 Stunden nach der Infektion gegeben
und dann anschliessena noch 5 Tage lang zweimal täglich intraperitoneal verabreicht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 wiedergegeben.
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Tabelle 6 Bredinin Imuran Kontrolltest Dosis (mq/kg) 25 5 25 5 ~
Salzlösung Anzahl der behandelten Mäuse 10 10 10 10 40 Überlebende/Behandelte 8/10
7/10 10/10 6/10 4/40
Wie zuvor veranschaulicht ist Bredinin gegen
experimentelle Influenza-Virus-Infektionbei Mäusen wirksam und hat im wesentlichen
den gleichen Heileffekt wie Imuran. 90% der mäuse starben am 15. Tag nach der Infektion,
jedoch nur 20% in den Fällen, in denen 25 mg/kg und 39% in den Fällen, in denen
5 mg/kg verabreicht worden waren. Die antivirale Aktivität von Bredinin baruht daraufm
dass es nicht wirksam ist für die Virusvermehrung sondern die durch Influenza-Virus
verursachte cellulare Immunität unterdrükt.
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5.Antitumor-Aktivität: Bredinin hat eine schwache Anrirumoraktivität
für Ehrlich-Aszites-Tumor und Leukemia l-1210 bei Mäusen.
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In den folgenden Beispielen werden die erfindungsgemässe Substanz
und deren Wirkung noch weiter veranschaulicht.
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Beispiel 1 100 ml eines aus 20% Glukose, 10%Kartoffelextrakt (gewönnen
aus 300 g Kartoffelschnitzel und 1 Liter Wasser, die 1 Stunde lang gekocht worden
waren), 0, 5 Baumwollsatpulver, 0,5% KH2PO4 und 0,25% SO. 7H20 bestehenden Mediums
(pH 6,5) wurden in einen 500 ml Kolben gegeben und 15 Minuten lang bei 1200C sterilisiert.
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Dieses Medium wurde mit Sporen von Eupenicillium brefeldianum NRRL
5734 (FERM-P No.1104) beimpft und bei 26°C und Rotation mit 300 UpM unter Schütteln
gezüchtet. Nach 48 Stunden wurde das gezüchtete Medium auf 20 Liter des wie oen
beschriebenen Mediums in einem 30 1 fassenden Ferm.entiertrog übertragen und unter
R-hren mit 300 UpM und Belüften mit 20 i/isin. bei 26°C 49 Stunden lang kultiviert.
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Das so gewonnene gezüchtete Medium wurde zu 200 1 eines zuvor sterilisierten
Mediums (pH 6,5), bestehend aus 2% Glukose, 1% Pepton, 1%kornweichflüssigkeit, 0,2%
KH2PO4, 0,1%MgSO4 7H2O und 0,1% Antischaumittel in einem 3ß00 liter fassenden Fermentationstank
aus Edelstahl gegeben und unter Rühren mit 350 UpM und Belüften mit 200 1/Min. 55
Stunden lang bei 260C gezüchtet.
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Die Brühe wurde durch Zugabe von 50 %iger wässeriger Natriumhydroxidlösung
auf pH 9,0 eingestellt und filtriert, und es wurden 170 l an klarem Filtrat gewonnen.
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Dieses filtrat wurde durch eine Säule ( 15 cn Durchmesser) aus 20
l Amberlite IRA-411 (ON-Typ) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/Min
geleitet, und dabei wurde das Material absorbiert; anschliessend wurde mit 50 1
Wasser gewaschen. Dann wurde mit 2%iger wässeriger Essigsäure eluiert und dabei
in Fraktionen von je 5 l Eluat aufgeteilt. Durch Prüfung mit Candida albicans als
Testorganismus wurden die Fraktionen Nr. 7 bis 9 als active Fraktionen ermittelt.
Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, der pH-Wert wurde mit 50%iger wässeriger
Natriumhydroxid lösung auf 9,6 eingestellt, dann wurde durch eine Säule (Durchmesser
7,5 cm) aus 4 l Amberlite IRA-411 (ON-Typ) geleitet, mit Wasser gewaschen, danach
mit 2%iger wässeriger Essigsäure eluiert und Fraktionen aus je 500 ml aufgefangen.
Es wurde festgestellt, dass aie Fraktionen Nr. 13 bis 13 die aktiven Fraktionen
waren.
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Diese wurden zusammengegeben und im Vakuum bis auf 200 ml eines öligen
Rückstandes konzentriert. Der Rückstand wurde mit 400 ml Methanol und 200 ml Azeton
gut vermischt; dabei entstand eine Ausfällung, die durch 10 Minuten langes Zentrifugieren
mit 3000 UpM abgeschieden wurde. Die abgeschiedene Substanz wurde mit Azeton gewaschen
und im Vakuum getrocknet, und es wurden 50 y an rohem Bredinin (Reinheit 10%) als
grau-weisses Pulver gewonnen.
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Beispiel 2 Pulver von rohem Bredinin, wie es gemass Beispiel 1 gewonnen
worden war, wurde in einer geringen Menge Wasser gelöst und in einem Lösungsmittelgemisch
aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser (10:1:2) suspendiert und auf eine aus 50 ml Silicagel
(60 - SO mesh) bestehende Säule (Durchmesser 4,0 cm), die mit dem genannten Lösungsmittelgemisch
beladen war, aufgegeben, und dann wurde mit den gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt.
Das Eluat wurde in Fraktionen von je 100 ml aufgeteilt, und es wurde festgestellt,
dass die Fraktionen 5 bis 7, die violette Färbung zeigten, die aktiven Fraktionen
waren. Diese aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben
und im
Vakuum getrocknet, und es wurden 14,3 g eines dunkel blau-violetten Pulvers (Reinheit
26%) gewonnen.
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Das Pulver wurde in 100 ml Wasser gelöst und mit Schwefelwasserstoffgas
gesättigt, und dabei wurden die Chelatkomplexe bildender Metalle als Sulfide abgetrennt.
Das getrocknete Material wurde in 10 ml eines 0,1 Mol Pyridin-Essigsäure-Puffers
(pH 6,0) gelöst und auf eine Säule aus 400 ml DEAD-Sephadex A-25 (Durchmesser der
Säule 2 cm), beladen mit dem gleichen Puffer, aufgegeben. Das Eluat wurde in Fraktionen
von je 10 ml unterteilt, und es wurde gefunden, dass die Fraktionen 70 - 135 Aktivität
aufwiesen. Diese Fraktionen wurden zusammengegeben und im Vakuum zur Trockene eingedampft,
und es wurden 1,0 g eines weissen Pulvers (Reinheit 90%) gewonnen. Nach Umkristallisation
aus heissem Methanol konnten 1,1 g an Dredinin-Kristallen (Reinheit 100%) gewonnen
werden.