DE2639410A1

DE2639410A1 - Biologisch aktive substanz und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2639410A1
Application number: DE19762639410
Authority: DE
Inventors: Ibaraki Hitachi; Daisuke Irie; Hiroshi Sumiyama; Hajime Tsukuni; Mitsuo Wada
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co ltd
Priority date: 1975-09-03
Filing date: 1976-09-01
Publication date: 1977-03-10
Also published as: GB1513344A; FR2322609A1; JPS5231891A; DE2639410C2; JPS54999B2; FR2322609B1

Description

DR. ING. E. HOFFMANN · DIPL.. ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN

PATENTANWÄLTE D-8000 MÖNCHEN 81 · ARABEUASTRASSE 4 · TELEFON (0811) 911087

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HITACHI CHEMICAL COMPANY, LTD., Tokyo / Japan

Biologisch aktive Substanz und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft eine neue Substanz, erhalten aus den Fermentationsprodukten eines Stammes der Art Streptomyces und der Art Actinomyces, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz.

Aus den Fermentationsprodukten von Stämmen der Art Streptomyces und der Art Actinomyces sind schon wertvolle Substanzen erhalten worden. So können z.B. Trichomycin und Soedomycin aus den Fermentationsprodukten von Streptomyces hachijoensis erhalten werden.

Trichomycin, das in der JA-AS 29-4200/1954 beschrieben wird, ist eine Verbindung, die weder Stickstoff, Schwefel noch Halogen enthält und die in Äther, Äthylacetat und Amylalkohol unlöslich, in Wasser fast unlöslich und bis zu einem gewissen Ausmaß in Butanol, Methanol, Äthanol und Aceton ■ löslich ist. Gegenüber Ninhydrin zeigt sie eine negative Reaktion.

Das in der JA-AS 49-42560/1974 beschriebene Soedomycin kann durch folgendes Verfahren hergestellt werden. Eine Kulturlösung von Streptomyces hachijoensis wird von unlöslichen Produkten, z.B. von Zellkörpern und dergl., befreit. Der

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erhaltene Überstand wird mit einer Zinkchloridlösung behandelt, wodurch ein Niederschlag gebildet wird. Zu dem so erhaltenen Niederschlag wird eine Dinatriumhydrogenphosphatlösung gegeben, um den pH-Wert der Lösung aus 7,0 bis 9,4 einzustellen und die gewünschte Substanz in die Wasserschicht zu extrahieren. Der Extrakt wird mit Methanol, Äthanol oder Aceton versetzt, um einen Niederschlag zu bilden. Dieser Niederschlag wird in destilliertem Wasser aufgelöst, sterilisiert und gefriergetrocknet, wodurch Soedomycin erhalten wird. Soedomycin hat die folgenden physikochemischen Eigenschaften:

Elementaranalyse: C 33,81% H 6,33% 0 59,86%

Molekulargewicht: 1200 IR-Spektrum : 1030, 1655, 2920 und 3450 cm"¹.

Soedomycin wird beim Erhitzen auf 220⁰C braun und wandelt seine Farbe bei dieser Temperatur unter Schrumpfen nach Schwarz. Selbst bei 300⁰C schmilzt es nicht. Soedomycin zeigt gegenüber Ninhydrin eine negative Reaktion.

Durch die Erfindung wird nun eine neue Substanz zur Verfügung gestellt, die sich von den obengenannten Substanzen unterscheidet. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz durch eine einfache Verfahrensweise und mit hoher Ausbeute zur Verfügung.

Gegenstand der Erfindung ist die biologisch aktive Substanz VI-7501, die durch ein Verfahren hergestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Kultur der Art Streptomyces oder der Art Actinomyces in einem Nährmedium von 28 bis 29°C 24 bis 60 Stunden lang züchtet und sodann die Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 durch Gelfiltration von der Züchtungsflüssigkeit, den Zellwänden und den Zellkörpern abtrennt. Die Substanz ist in Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol und Chloroform unlöslich. Sie zeigt eine posi-

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tive Reaktion gegenüber Ninhydrin oder Fluorescamin und eine negative Reaktion gegenüber Anthron. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz.

Für die erfindungsgemäße Kultivierung können die allgemeinen, für die Kultivierung von Actinomycetes üblichen Techniken angewendet werden. Als Stickstoffquellen können Peptone, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat und dergl. verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen können Glucose, Stärke, Lactose, Maltose, Melassen und dergl. verwendet werden. Als andere Nährstoffe können anorganische Salze wie Natriumchlorid, Calciumphosphat, Magnesiumchlorid etc. und Hilfsmittel wie Vitamin B^, Aminosäuren etc. erforderlichenfalls dem Medium zugegesetzt werden. Die Fermentationstemperatur kann geeigneterweise auf 28 bis 29⁰C eingestellt werden. Der Anfangs-pH-Wert des Mediums kann geeigneterweise auf 5 bis 7, vorzugsweise auf neutral, eingestellt werden. Die Fermentation wird in einem flüssigen Medium, das die obengenannten Nährstoffe enthält, als Schüttelfermentation oder als Belüftungsund Durchbewegungsfermentation durchgeführt. Es ist vorteilhaft, die Fermentation durch Belüftung-Durchbewegung vorzunehmen.

Der Verlauf der Fermentation eines Stammes der Art Streptomyces oder der Art Actinomyces, die das erfindungsgemäße VI-7501 liefern, wurde verfolgt. Beim Fortschritt des Verbrauchs an Sacchariden tritt 24 Stunden nach dem Beginn eine Antitumoraktivität auf, die ungefähr nach 48 Stunden ihr Maximum erreicht und sodann wieder abnimmt. Wenn die Aktivität das Maximum erreicht, dann wird die Fermentation abgebrochen und das erfindungsgemäße VI-7501, das in dem flüssigen Medium und auch in den Zellkörpern (mit Einschluß der Zellwände) enthalten ist, wird aus den Fermentationsprodukten erhalten.

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men gefunden wurde. Es hat ein Molekulargewicht von 1,5 x 10 bis 3»5 x 10 und kann aufgrund seiner physikochemischen Eigenschaften als Polypeptid angesehen werden.

Das VX-7501 kann aus den Fermentationsprodukten isoliert werden. Nach der Entfernung der Zellkörper und der anderen unlöslichen Substanzen aus den Produkten wird die gewünschte Substanz nach den folgenden Methoden gereinigt:

(1) fraktionierte Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel wie Alkohol, Aceton etc.;

(2) fraktionierte Ausfällung mit einem Ausfällungsmittel wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Natriumchlorid, Zinkchlorid, Zinksulfat etc.;

(3) Adsorption mit einem Adsorptionsmittel wie Kaolin, Zeolith, Bentonit, Aluminiumoxid, saurem Ton etc.;

(4) Dialyse oder Ultrafiltration mit einer semipermeablen Membran;

(5) Ausfällung mit Zinkchlorid und Extraktion mit einer wäßrigen Dinatriumhydrogenphosphatlösung;

(6) Gelfiltration durch ein Polyacrylamid-, Dextran-, Agarosegel etc ;

(7) Chromatographie mit einem Ionenaustauscher wie DEAE-Cellulose etc.;

(8) kontinuierliche Papierelektrophorese;

(9) Scheibenelektrophorese;

(10) isoelektrischer Punkt-Elektrophorese.

Diese Methoden können selbst dann, wenn sie einzeln angewendet werden_s wirksam für den oben angegebenen Zweck eingesetzt werden. Um den Reinigungsgrad zu erhöhen, können vorzugsweise zwei oder mehrere dieser Methoden kombiniert werden.

Um das VI-7501 aus den Zellwänden oder den Zellkörpern herauszunehmen, werden die Zellkörper von dem Fermentationsgemisch abgetrennt und mit destilliertem Wasser gewaschen.

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Es wurde eine Fermentation unter Belüften und Durchbewegen bzw. Rühren durchgeführt, wobei z.B. die folgenden Medien verwendet wurden: Medium A, bei dem 10 g Glucose, 5g Fleischextrakt, 5 g Pepton und 5 g Kaliumchlorid in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden warn; Medium B, bei dem 20 g Glucose, 5 g Ammoniumsulfat, 2,5 g Hefeextrakt, 0,2 g Dikaliumhydrogenphosphat, 4 g Kaliumchlorid und 8 g Calciumcarbonat in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden waren; und Medium C, bei dem 10g Glucose, 5 g PoIypepton, 3 g Hefeextrakt und 3 g Malzextrakt in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden waren. In jedem Falle erschien 24 Stunden nach Induzierung der Fermentation eine Antitumoraktivität, die nach 48 Stunden ihren Maximalwert erreichte..

Als Stämme der Art Streptomyces oder der Art Actinomyces, die für die erfindungsgemäße Fermentation verwendet werden können, können als Beispiele folgende Stämme genannt werden: Streptomyces griseus (ATCC-3326, IAM-0124, IFM-1123), Streptomyces hachijoensis (ATCC-19769, ISP-5114, IFO-12782), Streptomyces collinus (ATCC-19743, ISP-5129), Streptomyces griseoruber (ATCC-23919, ISP-5281), Streptomyces lincolenensis (ATCC-25466, ISP-5355), Streptomyces cinereoruber (ATCC-19740, ISP-5012), Streptomyces michiganensis (ATCC-14970, ISP-5015), Streptomyces lavendulae (ATCC-8664, ISP-5069), Streptomyces xanthochromogenus (ATCC-19818, ISP-5111), Streptomyces vridifaciens (ATCC-11989, ISP-5239), Streptomyces netropsis (ATCC-23940, ISP-5259)» Streptomyces flavogriseus (ATCC-25452, ISP-5323), Streptomyces vendargensis (ATCC-25507, ISP-5379) und Streptomyces albolongus (ATCC-27414, ISP-5570). Als Species, die zu der Art Actinomyces gehören, können z.B. erwähnt werden: Actinomyces coerukscens (ATCC-19896, ISP-5146) und Actinomyces cremeus (ATCC-19897, ISP-5147). Das erfindungsgemäße VI-7501 ist eine Substanz, die in den Fermentationsprodukten der obengenannten Mikroorganis-

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Nach dem Waschen werden die Zellkörper zerkleinert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Alle Waschwässer werden kombiniert und durch eine der obengenannten Methoden (1) bis (10) oder eine Kombination davon behandelt. Auf diese Weise kann das auf bzw. in der Zellwand und in dem Zellkörper enthaltene VI-7501 erhalten werden.

Die Mengen von YI-7501, die auf bzw. in den Zellwänden und in den Zellkörpern enthalten sind, sind etwa 1/8 bis 1/4 derjenigen Mengen- die in der Fermentationsflüssigkeit vorhanden sind.

Unter den obengenannten Methoden werden zum Erhalt von VI-7501 die folgenden Methoden besonders bevorzugt;

(a) Die Fermentationsflüssigkeit oder die Waschwässer werden einer Gelfiltration unterworfen, um eine Fraktion

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mit einem Molekulargewicht von 1,5 x 10 bis 3»5 x 10 zu erhalten.

(b) Das obengenannte Ausfällungsmittel wird zu der Fermentationsflüssigkeit oder zu den Waschwässern gegeben. Das so ausgefällte VI-7501 wird in Wasser aufgenommen und die wäßrige Lösung wird sodarni einer Gs!filtration unterworfen, um eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 zu erhalten.

(c) Nach der Desorption von auf dem obengenannten Adsorptionsmittel adsorbiertem VI-7501 wird die ¥1=7501 enthaltende Lösung einer Gelfiltration unterworfen _s um eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 1,5 x 10 bis 5₉5 χ 10 zu erhalten.

Die Gelfiltrationsmethode ist einfach einsetzbar, und sie liefert VI-7501 mit konstanten Eigenschaftsn und in hohen Ausbeuten aus den Fermentationsprodukteno

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Das VI-7501 inhibiert die Aktivität der Bernsteinsäure-Dehydrogenase in der Tumorzelle, wobei diese Inhibierung saktivität mit seiner Antitumoraktivität in Beziehung steht. So wird die Bernsteinsäure-Dehydrogenase-Inhibierung (nachstehend als BDI abgekürzt) als Anzeichen für die Antitumoraktivität der erfindungsgemäßen Substanz verwendet.

BDI ist eine Wirkung, die die Aktivität der Bernsteinsäure-Dehydrogenase in der lebenden Zelle inhibiert. Die Bernsteinsäure-Dehydrogenase wandelt in einer lebenden Zelle Triphenyltetrazoliumchlorid in Formazan um. BDI kann quantitativ nach einer Methode bestimmt werden, bei der man die obige Umwandlung in Gegenwart von VI-7501 unter Verwendung von Tumorzellen und Messung der gebildeten Formazan-Mengen vornimmt. Diese Methode wird zur Erfassung des Einflusses eines Arzneimittels auf den Stoffwechsel einer Zelle und als Bewertungsmethode für die Antitumoraktivität verwendet.

VI-7501 kann unter Verwendung der BDI-Wirkung wie folgt spezifiziert werden. Zu der Fermentationsflüssigkeit eines . Stammes der Art Streptomyces oder der Art Actinomyces wird Ammoniumsulfat gegeben, um einen Niederschlag auszusalzen. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einer Dinatriumhydrogenphosphatlösung aufgelöst. Diese Lösung wird entsalzt und gefriergetrocknet, wodurch ein leicht braunes Pulver (das nachstehend als VI-75OO bezeichnet wird) erhalten wird. Das so erhaltene VI-7500 wird unter Verwendung von Dextrangel (Sephadex G-1OO, Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals AB) einer Gelchromatographie unterworfen. In' Fig. 1 ist die Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der BDI-Aktivität von VI-7500 angegeben. Die Einheit der BDI auf der Ordinate der Fig. 1 wird nachstehend erläutert. In der Fig. 1 sind auch die Adsorptionen bei 280 und 440 m/u jeder Fraktion dargestellt.

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- 8 Nachfolgend werden die Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen der Molekulargewichtsverteilung, der BDI-Aktivität und der Absorption von UV-Licht. Fig. 2 zeigt eine Eichkurve, welche das Molekulargewicht durch Gelchromatographie mit Dextrangel anzeigt. Fig. zeigt ein UV-Absorptionsspektrum von VI-7501. Fig. 4 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum von VI-7501. Fig. 5 und 6 zeigen die Tumorzellen schädigende Aktivität von VI-7501. Fig. 7 zeigt die Beziehung zwischen der Tumorzellen schädigenden Aktivität und der Antitumoraktivitat (in vitro) von VI-7501. Fig. 8 zeigt die Aktivität von deaktiviertem Friend Leukämie Virus.

Aus Fig. 1 wird ersichtlich, daß sich Fraktionen mit einer BDI-Aktivität nur im Bereich des Molekulargewichts von 1,5 x 10 bis 3»5 x 10 verteilen. Das Molekulargewicht einer Fraktion mit einer maximalen BDI befindet sich bei etwa 2,3 x 10⁴.

Das erfindungsgemäße VI-7501 hat daher ein Molekulargewicht von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 und zeigt eine BDI-Aktität. Diese Substanz besitzt auch eine Antitumoraktivitat, wie aus den später angegebenen Ergebnissen von Tierversuchen und von in vitro-Tests hervorgeht.

Die Eichkurve des Molekulargewichts für das obige Chromatogramm ist in Fig. 2 dargestellt. Die Markierungen 4, 5 und 6 zeigen die graphischen Darstellungen für Albumin (Molekulargewicht 67 000), oc-Chymotripsin (Molekulargewicht 22 500) und Lysozym (Molekulargewicht 14 000).

Die oben beschriebene Chromatographie wurde mit einer Säule mit Abmessungen von 26 mm0 χ 1000 mm und mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h durchgeführt. Als Lösungsmittel

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wurde eine wäßrige 0,5 M NaCl-Lösung verwendet.

Das erfindungsgemäße VI-7501 hat weiterhin die folgenden charakteristischen Eigenschaften bzw. Parameter:

(1) Aussehen und Farbe: weißes oder leicht gelbes Pulver;

(2) UV-Absorptionsspektrum: Fig. 3; die Kurven 7 und 8 zeigen die Absorptionen von VI-7501, wobei dessen Konzentrationen 400 /ug/ml bzw. 133/ug/ml betragen;

(3) IR-Absorptionsspektrum: Fig. 4 (KBr-Tablette);

(4) Schmelz- oder Zersetzungspunkt: zersetzt sich bei 220 bis 235⁰C;

(5) Molekulargewicht: 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 ;

(6) Reaktion der wäßrigen Lösung: neutral;

(7) Permeabilität durch Membranen: durch Cellophanfilm oder Collodiummembranen nicht permeabel;

(8) Löslichkeit: leicht löslich in Wasser und fast unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol und Chloroform;

(9) Aussalzung: durch Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Natriumchlorid etc. ausgesalzt;

(10) Adsorption und Desorption: adsorbiert auf Aktivkohle, Bentonit, saurem Ton, Kaolin und Zeolith und teilweise desorbiert von dem Adsorbat auf saurem Ton oder Kaolin mit einer 4%igen Dinatriuinhydrogenphosphatlösung;

(11) Stabilität: die gefriergetrocknete Substanz ist bei gewöhnlicher Temperatur relativ stabil; in der wäßrigen Lösung wird sie durch Erhitzen deaktiviert. In wäßriger Lösung ist sie gegenüber UV-Strahlen, Wasserstoffionen und Sauerstoff relativ stabil. Sie ist auch relativ stabil gegen einen Einfrier-Aufschmelz-Vorgang. Die BDI-Wirkung wird durch Phenol, Formalin, Kupferionen und Quecksilberionen inhibiert;

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(12) Färbungsreaktionen:

Reaktion mit Ninhydrin: positiv Folin-Lowry-Reaktion: positiv Reaktion mit Fluorescamin: positiv Reaktion mit Anthron: negativ

(13) Einfärbbarkeit: sie wird mit Amidoschwarz 1OB eingefärbt.

VI-7501 hat zwar eine BDI-Aktivität, zeigt aber nur eine sehr schwache oder fast überhaupt keine antimikrobielle Aktivität. Biologische Methoden mit Bakterien können daher zur Bestimmung der erfindungsgemäßen Substanz nicht angewendet werden. Ergebnisse von Untersuchungen zur Bestimmung von VI-7501 haben gezeigt, daß die Methode unter Verwendung der BDI-Aktivität von VI-7501 zur quantitativen Bestimmung von VI-7501 geeignet ist, da die BDI-Aktivität von VI-7501 in guter Beziehung zu ihrer Antitumor-Aktivitat steht.

Nachstehend wird die quantitative Bestimmung von VI-7501 beschrieben.

Tumorzellen werden von Ascites einer Maus gesammelt, die von Sarcoma-180 (nachstehend als S-180 abgekürzt) infiziert ist. Die Zellen werden in einer 1/15 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 suspendiert und die Dichte der Zellen in der Suspension wird auf 3 x 10 bis 7 x 10/0,3 ml eingestellt. Portionen der Zellsuspension mit jeweils 0,3 ml werden in ein kleines Reagenzglas eingebracht und mit 0,2 ml einer Lösung der erfindungsgemäßen Substanz versetzt. Das Gemisch wird gut durchgemischt.

Nach 1 stündigem Stehenlassen des Gemisches in einem Thermostat bei 37⁰C werden 0,3 ml einer O,O3$6igen Lösung von Triphenyltetrazoliumchlorid (abgekürzt als TTC) zugegeben und das Gemisch wird 15 h bei 37⁰C gehalten. Sodann werden

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3 ml einer 0,5%igen Trichloracetatlösung (0,5 g Trichloracetat werden in 100 ml Äthylacetat aufgelöst) zugesetzt und das Gemisch wird stark geschüttelt und durch Zentrifugieren getrennt. Die Absorption der auf diese Weise abgetrennten Äthylacetatschicht wird "bei einer Wellenlänge von 480 myu bestimmt. Der Inhibierungsindex (abgekürzt als I.I.) wird unter Verwendung der gemessenen Werte (Absorption) nach folgender Gleichung bestimmt:

Darin bedeuten

ρ ι Absorption

a: Absorption einer Lösung, erhalten ohne Zusatz der Lösung der erfindungsgemäßen Substanz

m: Absorption einer Lösung, erhalten ohne Zusatz der Lösung der erfindungsgemäßen Substanz und ohne Zusatz von TTC.

Die Aktivität der Standardsubstanz wird auf 1600 Einheiten eingestellt. Dieser Wert wird erhalten, indem man den reziproken Wert des Gewichtes (0,625 mg gemäß der Erfindung), was einem I.I.-Wert von 50% entspricht, mit 10^ multipliziert.

Die Aktivität einer Probe wird anhand der Aktivität der Standardsubstanz bestimmt. Dieser Wert wird errechnet, indem das Gewicht (mg) der Probe, das einem I.I.Wert von 50% entspricht, mit 1600/0,625 multipliziert wird.

Die Konzentration der Probe, die dem obigen Verfahren unterworfen wird, wird so eingestellt, daß der I.I.-Wert zwischen 20 und 80% fällt. Sämtliche oben angegebenen Verfahrensmaßnahmen müssen unter sterilen Bedingungen vorgenommen werden.

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Die 1/15 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4, die beim obigen Test verwendet wird, wird wie folgt hergestellt. 11,94 g Dinatriumhydrogenphosphat-dodecahydrat (Na₂HPO^.12H₂O) und 4,25 g Natriumchlorid werden in destilliertem Wasser zur Injektion aufgelöst und das Gesamtvolumen der Lösung wird auf 500 ml eingestellt (Lösung 1). 4,54 g Monokaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO^) und 4,25 g Natriumchlorid werden in destilliertem Wasser aufgelöst und das Gesamtvolumen wird auf 500 ml eingestellt (Lösung 2). Sodann werden 76 ml der Lösung 1 und 24 ml der Lösung 2 vermischt. 1/15 M Phosphatpufferlösung, wie oben beschrieben, werden hergestellt, indem 100 γ Penicillin und 100 γ Streptomycin zu 1 ml der gemischten Lösung gegeben werden.

Die obengenannte TTC-Lösung wird hergestellt, indem 2,7 g Natriumsuccinat und 30 mg 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid zu 100 ml der obengenannten Phosphatpufferlösung gegeben werden.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz wird in "Einheiten" gemessen und nach der obigen Methode errechnet. Die Einheiten werden als BDI-Einheiten bezeichnet. Hierin sollen Einheiten immer BDI-Einheiten bezeichnen, wenn nichts anderes angegeben ist.

Die spezifische Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz ist die Aktivität pro 1 mg Proteingehalt einer auf Albumin verminderten Probe, bestimmt nach der Polin-Lowry-Methode.

Nachfolgend wird die Antitumoraktivität von VI-7501 erläutert. In Tabelle I sind die Testergebnisse bei der Behandlung von tierischen Tumoren (in vivo) zusammengestellt. 1x10 Tumorzellen von Ehrlich Ascites Carcinom (nachstehend als EAC abgekürzt) oder S-180 wurden in eine peritoneale

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Höhlung einer Maus (dd-Y-System) hineintransplantiert. Von dem Tag an wurde VI-7501 in die Peritonealhöhlung zur Behandlung bei den folgenden Bedingungen injiziert: Anzahl der Behandlungen: 1 bis 20, Dosis: 283 bis 2834 Einheiten.

Wie aus Tabelle I hervorgeht, sind mehr als 2076 Einheiten zur wirksamen Behandlung von EAC nötig, wenn der Tumor nur einmal behandelt wird. Mehr als 531 Einheiten sind notwendig, wenn dieser 5mal behandelt wird. Im Falle von 283 Einheiten kann der Tumor selbst dann nicht behandelt werden, wenn 10mal (S-180) behandelt wird.

(1) Zur wirksamen Behandlung mit der erfindungsgemäßen Substanz (VI-7501) sollte die zur einmaligen Behandlung verabreichte Menge größer sein als ein vorgewählter Wert. Je größer die Dosiseinheit ist, desto höher ist ihr Effekt.

(2) Bei konstanter Dosis ist der Effekt umso höher, je größer die Anzahl der Behandlungen (Gesamteinheiten) ist.

(3) Wenn die zu verabreichenden Gesamteinheiten die gleichen sind, dann ist eine Behandlung, bei der die erfindungsgemäße Substanz in einer kleinen Menge getrennt über einen langen Zeitraum verabreicht wird, weniger wirksam als eine Behandlung, bei der die Substanz in einer großen Menge innerhalb einer kurzen Zeitspanne verabreicht wird.

Aus der oben beschriebenen Antitumor-Aktivität von VI-7501 kann gefolgert werden, daß die Aktivität die Beschädigungswirkung der Tumorzellen stark betrifft. Die Zellbeschädigungs-Aktivität wird in den Fig. 5 und 6 dargestellt.

Die Suspension mit 1 χ 10^ Zellen (S-180)/ml (zur Verdünnung wird Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,15 verwendet) wird mit einer Lösung von VI-7501 (die Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,15 wird zur Auflösung des VI-7501 verwendet) vermischt. Das Gemisch wird 5 bis

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60 min lang in einem Reagenzglas "bei 37⁰C geschüttelt. Ein Tropfen des Gemisches wird sofort mit 5 Tropfen 0,5%iger Trypanblau-Lösung in physiologischer Kochsalzlösung vermischt. Die blaugefärbten Zellen (beschädigte Zellen) werden unter dem Mikroskop gezählt und das Verhältnis der lebenden Zellen wird errechnet. Das Verhältnis der lebenden Zellen (Überlebensrate) wird nach folgender Gleichung errechnets

Anzahl der nichtgefärbten Zellen (lebende Zellen) _1Q0 Anzahl der blaugefärbten Zellen +Anzahl der nicht-

gefärbten Zellen

Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. In Fig. beziehen sich die Kurven 9, 10, 11, 12, 13 und 14 auf 0 Einheiten/ml, 692 Einheiten/ml, 3460 Einheiten/ml, 13 840 Einheiten/ml, 32 524 Einheiten/ml bzw. 55 360 Einheiten/ml der Konzentration von VI-7501·

Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß bei einer Konzentration des VI-7501 von 692 Einheiten/ml die Anzahl der blaugefärbten Zellen sehr gering war und daß somit nur wenige Zellen beschädigt wurden. Bei einer Konzentration von mehr als 3460 Einheiten/ml nahm der Anteil der lebenden Zellen entsprechend der Konzentration von VI-7501 ab.

Das Verhältnis bzw. der Anteil der lebenden Zellen (Schüttelzeit: 60 min) ist in Fig. 6 gegen die Konzentration von VI-7501 aufgetragen.

Das Gemisch aus Tumorzellen und einer Lösung von VI-7501 in einem Reagenzglas wurde in die Peritonealhöhlung einer Maus eintransplantiert. Es wurde beobachtet, ob die auf diese Weise implantierte Maus durch die transplant!erten Tumorzellen getötet wird. 1 ml einer Suspension (1 χ 10 Zellen/ml) von S-180 wurde mit 1 ml einer Lösung (13 840 Einheiten/ml) von VI-7501 in einem Reagensglas vermischt» Zur Verdünnung wurde Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,15

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verwendet. Das Gemisch wurde bei 37°C geschüttelt. Nach 5, 20 und 60 min wurden jeweils 0,2 ml des Gemisches in die Peritonealhöhlung einer Maus (10 Mäuse/Gruppe) hineintransplantiert.

Die Todesrate durch den Tumor wurde im Verlauf von 60 Tagen beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig.7 zus ammengeste111.

Aus Fig. 7 wird ersichtlich, daß alle Mäuse dem Tod durch Tumor entkamen, wenn eine Tumorzellsuspension mit einer VI-7501-Lösung 60 min geschüttelt wurde. Die Kontrollgruppe, der ein Gemisch aus der Tumorzellensuspension und einer Kochsalzlösung eintransplantiert worden war, wurde vollständig getötet.

Die Tumorzellen beschädigende Aktivität konnte auch hinsichtlich der Zellen von EAC, der Ascites-Tumorzellen der Ratte (AH-66) und der Zellen von Yoshida Sarkom beobachtet werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Weiterhin kann VI-7501 den Friend Leukämie Virus (als FLV abgekürzt) in vitro deaktivieren. Die hypertrophierte Milz einer Maus, die mit FLV infiziert war, wurde in der 4fachen Gewichtsmenge physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert und 15 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Der abgetrennte Überstand wurde als "20% FLV-Milz-Homogenat" bezeichnet. Dieses Produkt wurde auf das 4fache mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und die so erhaltene Lösung wurde als "5% FLV-Milz-Homogenat" bezeichnet. Eine dieser zwei Arten von Homogenat und die gleiche Menge einer Lösung mit 2076 Einheiten/ml VI-7501 oder einer Lösung mit 20 760 Einheiten/ml wie das Homogenat wurden in ein Reagenzglas eingebracht. Nach 60minütigem Schütteln des Gemisches wurden jeweils 0,2 ml dieser Gemische in die Peritonealhöhlung einer Maus injiziert. Im Verlauf von 60 Tagen wurden die Todesfälle

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durch Infektion mit FLV beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.

Die Linien 15 und 16 entsprechen den Fällen, bei denen 20%iges und 5%iges FLV-Milz-Homogenat verwendet wurden. Es wird ersichtlich, daß FLV durch VI-7501 deaktiviert werden kann. 60% der Mäuse, denen ein Gemisch aus 20% FLV-Milz-Homogenat und VI-7501 (2076 Einheiten/ml) injiziert worden waren, und 100% der Mäuse, denen ein Gemisch aus 5% FLV-Milz-Homogenat und VI-7501 (2076 Einheiten/ml oder 20 760 Einheiten/ml) injiziert worden waren, entkamen dem Tod durch Infektion.

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Tabelle I
Effekt von VI-7501 auf Tumoren bei Mäusen (in vivo)

Tumor Dosis (Einheit/ Verfahren Gesamtdosis Überlebensrate (%)

Zeit/Körper) (Einheit/Körper) 30 Tage 60 Tage

EAC
(10⁴
Zellen/
Körper)

443 1328 2125 2834

einmal/Tag χ 1 Tag

531

844 1134

physiologische Kochsalzlösung

einmal/Tag χ 5 Tage 443
1328
2125
2834

2655
4220
5670

40 30 90 90

60

70

100

20

S-180
(10⁴
Zellen/
Körper)

283

einmal/Tag χ 1 Tag einmal/Tag x 5 Tage einmal/Tag χ 10 Tage

567

einmal Tag/x 1 Tag einmal/Tag χ 5 Tage einmal/Tag χ 10 Tage

1384

einmal/Tag χ 20 Tage einmal/Tag χ 10 Tage

physiologische Kochsalzlösung

einmal/Tag x 20 Tage 1415
2830

567
3335
5670

27680
13840

20 20 20

30 70 80

100 80

30

TPO CB CO

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Tabelle II Tumorzellen schädigende Aktivität von VI-75O1

Tumor

Anzahl der

Zellen

(Zellen/ml)

Schüttelbedingungen

Konzentration Verhältnis d. von VI-7501 beschädigten (Einheiten/ml) Zellen (%)

S-180

AH-66

Yoshida Sarkom

10'

37 C, 30/min dito dito

dito

13 840
13 840
13 840

13 840

59,2 51,1 36,0

55,8

Die akute Toxizität von VI-7501 durch intraperitoneale Verabreichung bei der Mais ist wie folgt: LD = 1,5 x 10⁵ Einheiten/kg (einmal)

VI-7501, gelöst in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung kann subkutan oder intravenös verabreicht werden.

Untenstehend wird die antimikrobielle Aktivität von VI-7501 gezeigt. Die Mikroorganismen wurden dem Test unterworfen, nachdem sie alle von einer konservierten Schrägkultur zu einem neuen Schrägkulturmedium subkultiviert worden waren. In einer Petrischale wurde ein Agar-Medium hergestellt, in dem ein Mikroorganismus suspendiert war. Nach der Papier-Scheiben-Methode wurde die antimikrobielle Aktivität von VI-7501 bestimmt. Die Scheiben wurden in eine Lösung von VI-7501 mit 19 200, 9600, 4800 bzw. 2400 Einheiten/ml eingetaucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

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Tabelle III

Antimikrobielle Aktivität

Nr. Mikroorganismus Durchmesser d.Inhibierungs-

rings(mm)

(Konzentration von VI-7501: 2400-19 200 Einheiten/ml)

1 Staphylococcus aureus(ATCC-6538p) 0

2 Staphylococcus aureus(ATCC-6538DR) 0

3 Bacillus subtilis (ATCC-6633) 0

4 Bacillus cereus (IAM-1190) 0

5 Sarcina lutea (ATCC-9341) 0

6 Micrococcus flavus (ATCC-10240) 0

7 Escherichia coli (NIHJ) 0

8 Klebsiella pneumoniae(ATCC-10031) 0

9 Pseudomonas aeruginosa (IAM-1001) 0

10 Mycobacterium smegmatis(ATCC-607) 0

11 Candida albicans (YU-1200) 0

12 Saccharomyces cerevisiae(ATCC-9763) 0

13 Penicillium chrysogenum (ATCC-10002) 0

14 Microsporum gypseum (ATCC-14683) 0

Aus den obigen Ergebnissen ergibt sich, daß VI-7501 keine antimikrobielle Aktivität besitzt. Das VI-7501 unterscheidet sich von den in Tabelle IV gezeigten Antitumorsubstanzen.

	Bekannte	Tabelle IV	Literaturstelle
	Polvpeptid	Antitumor-Polypeptide	Tanaka & Nakamura, "Koseibusshitsu taiyo",Tokyo Univ. S. 132
Nr.	Phenomycin	Charakteristikum	dito
1	Enomycin	basisches Polypeptid	dito
2	Peptimycin	basisches Polypeptid	dito Ota,"Nichii",Nr.2601
3	Neocarzinostatin	basisches Polypeptid
4	antimikrobiell, MG: 10 700

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Tabelle III (Fortsetzung)

Nr. Polypeptid Char akt er i s tikum

Literaturstelle

5 Carzinomycin

dunkelgrüne Substanz

Sumiki,"Koseibusshitsu"(II),Tokyo Univ.,S.252

6	Carzinoeidin	antimikrobiell	dito
7	Melanomycin	melaninartiges schwarzes Pulver	dito
8	Marinamycin	antimikrobiell	dito
9	Actinogan	Glicopeptid gleich	wie bei Nr.1
10	A-216	basisches Peptid gleich	wie bei Nr.5
11 .	A-280	saures Chromopeptid antimikrobiell	dito
12	Iyomycin	schwach antimikrobiell	dito
13	Plurallin	Chromopeptid	dito
14	Cairacin	basisches Mucoprotein	dito
15	Flammvlin	basisches Mucoprotein	dito

Für den Fachmann wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Substanz VI-7501 wirksam zur Remission und zur Behandlung von Tumoren oder Leukämien des Menschen verwendet werden kann.

Die erfindungsgemäße Substanz kann gewöhnlich auf parenteralem Wege, vorzugsweise durch subkutane oder intravenöse Injektion, verabreicht werden. Der erfindungsgemäße Wirkstoff VI-7501 kann für klinische Anwendungszwecke in verschiedenen Arten von Dosiseinheitsformen verwendet werden. Es ist jedoch praktisch und vorzuziehen, eine einzige Dosis der gefriergetrockneten Form zu verwenden, die vorzugsweise auf einem geeigneten Träger getragen wird und in einem geeigneten sterilen Gefäß, z.B. einer Ampulle, eingeschlossen ist. Der Inhalt des Gefäßes wird unter aseptischen Bedingungen in einem geeigneten, physiologisch annehmbaren Lösungsmittel, z.B. physiologischer Kochsalzlösung, unmittelbar vor der Verabreichung aufgelöst, wodurch eine flüssige Zubereitung erhalten wird, die für die parenterale Verabreichung fertig ist. Eine

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einzige Dosis (als "Einheit" bezeichnet) der erfindungsgemäßen Substanz kann gewöhnlich im Bereich von etwa 5000 bis 100 000 Einheiten/Erwachsener/1 Verabreichung betragen. Eine einzelne Dosis der erfindungsgemäßen Substanz kann gewöhnlich denjenigen Patienten verabreicht werden, die einmal am Tag behandelt werden. Eine Behandlungsperiode umfaßt gewöhnlich eine 30malige Verabreichung. Die Verabreichung sollte sorgfältig je nach Art und Schwere des Tumors oder der Leukämie, der möglichen Nebenwirkungen, der Toxizität und der anderen Faktoren ausgewählt werden.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Eine Samenkultur von Streptomyces griseus IMF-1123 (ATCC-3326) wurde zu einem Medium gegeben, das in der Weise hergestellt worden war, daß 5 g Glucose, 5 g Fleischextrakt, 5 g Pepton und 5 g Natriumchlorid in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden waren. Die zugegebene Menge betrug 590 des Gemisches. Das Gemisch wurde unter Belüften bie 28 bis 29⁰C gerührt. Nach 48 h wurde die Fermentation abgebrochen und unlösliche Materialien wie Zellen und dergl. wurden abfiltriert. 500 g Ammoniumsulfat wurden zu 1 1 Filtrat gegeben. Nach 5stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden die ausgefällten Produkte durch Zentrifugieren gesammelt. Die ausgefällten Produkte wurden in 100 ml einer 4%igen Dinatriumhydrogenphosphatlösung aufgelöst. Die Lösung wurde in einer Säule mit Sephadey G-100 (Pharmacia Fine Chemicals AB) chroma to graphiert. Eine Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 wurde gesammelt. Sie zeigte eine BDI-Aktivität und sie enthielt die Antitumorsubstanz. Diese Fraktion wurde dialysiert, entsalzt und gefriergetrocknet, wodurch 200 mg VI-7501 mit einer spezifischen Aktivität von 5,3 x 10 Einheiten/mg Protein (auf Albumin vermindert) erhalten wurden.

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Elementaranalyse:

C 35,0% H 5,95% N 6,80% S 1,02% 0 51,19% (durch Differenz) Spezifische optische Drehung:
[a]°₂o_c = +43,14°.

Beispiel 2

Zu dem Medium des Beispiels 1 wurde eine Samenkultur von Streptomyces hachijoensis H-2609 (IFO-12782, ATCC-19769) in einer Menge von 5%, bezogen auf das Gemisch, gegeben. Das Gemisch wurde unter Belüften bei 28 bis 29°C gerührt. Nach 48 h wurde die Fermentation abgebrochen und unlösliches Material wie Zellen und dergl. wurde abfiltriert. 500 g Ammoniumsulfat wurde zu 1 1 des Filtrats gegeben. Nach 5stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden .die ausgefällten Produkte durch Zentrifugieren gesammelt. Die ausgefällten Produkte wurden in 100 ml einer 4%igen Dinatriumhydrogenphosphatlösung aufgelöst. Die Lösung wurde auf einer Säule mit Sephadex G-100 (Pharmacia Fine Chemicals AB) chromatographiert. Eine Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 , die eine BDI und Antitumoraktivität zeigte, wurde erhalten. Diese Fraktion wurde dialysiert, entsalzt und gefriergetrocknet, wodurch 250 mg VI-7501 mit einer spezifischen Aktivität von 5,5 x 10 Einheiten/mg Protein (auf Albumin vermindert) erhalten wurden. Diese Substanz zeigte die gleichen Eigenschaften oder ähnliche Eigenschaften wie oben beschrieben.

Beispiel 3

Zu einer Brühe (Filtrat), erhalten bei den gleichen Fermentationsbedingungen wie in Beispiel 2 wurden 20 g Zeolith gegeben und das Gemisch wurde ausreichend gerührt. Der Zeolith wurde im Vakuum abfiltriert. Zu dem abgetrennten Zeolith wurden 100 ml einer 5%igen Dinatriumhydrogenphosphatlösung gegeben. Nach einstündigem Rühren wurde der Zeolith

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durch Filtration im Vakuum entfernt. Das Filtrat wurde durch eine Säule mit Sephadex G-100 chromatographiert, wodurch eine Fraktion erhalten wurde, die eine BDI-Aktivität hatte und einen Molekulargewichtsbereich von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 aufwies. Die Fraktion wurde dialysiert, um Dinatriumhydrogenphosphat zu entfernen,und gefriergetrocknet, wodurch 210 mg VI-7501 mit einer spezifischen Aktivität von 4,4 χ 10 Einheiten/mg Protein (berechnet als Albumin) erhalten wurden. Diese Substanz zeigte ähnliche oder gleiche Eigenschaften wie oben beschrieben.

Mit der Erfindung wird somit eine neue und wertvolle Substanz zur Verfügung gestellt, die als VI-7501 bezeichnet wird. Erfindungsgemäß kann eine Substanz mit einer konstanten Qualität durch ein einfaches Reinigungsverfahren erhalten werden.

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Claims

- 24 Patentansprüche

Biologisch aktive Substanz VI-7501, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch ein Verfahren erhalten worden ist, bei dem man eine Kultur der Art Streptomyces oder der Art Actinomyces in einem Nährmedium 24 bis 60 Stunden bei 28 bis 29⁰C züchtet und die Fraktion mit einem Molekulargewichts-

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bereich von 1,5 χ 10 bis 3,5 x 10 durch Gelfiltration aus der Fermentationsflüssigkeit, den Zellwänden und den Zellkörpern gewinnt, daß sie in Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol und Chloroform unlöslich ist, und daß sie mit Ninhydrin oder Fluorescamin eine positive Reaktion und mit Anthron eine negative Reaktion ergibt.
2. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kultur der Art Streptomyces oder der Art Actinomyces in einem Nährmedium 24 bis 60 Stunden bei 28 bis 29⁰C züchtet und daß man sodann die Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 durch Gelfiltration aus der Fermentationsflüssigkeit, den Zellwänden und den Zellkörpern gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gewinnung der Substanz in der Weise durchführt, daß man ein Ausfällungsmittel zu der Fermentationsflüssigkeit, den Waschwässern der Zellwände oder den Waschwässern der zerkleinerten Zellkörper gibt, um einen Niederschlag zu bilden, daß man den Niederschlag in einer Lösung aufnimmt und daß man die Lösung einer Gelfiltration unterwirft, um eine Fraktion

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mit einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10

abzutrennen.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gewinnung der Substanz in der Weise durchführt,

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daß man ein Adsorptionsmittel zu der Fermentationsflüssigkeit, den Waschwässern der Zellwände oder den Waschwässern der zerkleinerten Zellkörper gibt, das adsorbierte Produkt auf dem Adsorptionsmittel einer Desorption mit einer Lösung von Dinatriumhydrogenphosphat unterwirft, und daß man das aufgelöste Gemisch einer Gelfiltration unterwirft, um eine Fraktion mit

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einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 x 10 bis 3,5 x 10 abzutrennen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelfiltration unter Verwendung eines Dextrangels, Polyacrylamidgels oder Agarosegels durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausfällungsmittel Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Natriumchlorid, Zinksulfat und/oder Zinkchlorid verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Aluminiumoxid, sauren Ton, Kaolin, Bentonit, Zeolith und/oder Celit verwendet.

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