DE3028583C2

DE3028583C2 -

Info

Publication number: DE3028583C2
Application number: DE3028583A
Authority: DE
Inventors: Yoshio Tokio/Tokyo Jp Koide; Kiyoto Miyagi Jp Edo; Nakao Sendai Miyagi Jp Ishida
Original assignee: KAYAKU ANTIBIOTIC RESEARCH Co Ltd TOKIO/TOKYO JP
Current assignee: KAYAKU ANTIBIOTIC RESEARCH Co Ltd TOKIO/TOKYO JP
Priority date: 1979-10-09
Filing date: 1980-07-28
Publication date: 1990-05-10
Also published as: GB2059946A; DE3028583A1; FR2467240B1; JPS5653697A; US4328212A; GB2059946B; JPS6030679B2; FR2467240A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Gegenstand der Patentansprüche.

Es ist bereits bekannt, daß bei der Kultivierung von Streptomyces carzinostaticus variant F41 Kuroya die hochmolekularen Antitumor-Antibiotika Neocarzinostatin (vgl. JA-AS 21 752/1967), N-1-Fraktion, N-2-Fraktion (vgl. JA-AS 680/1972) und Ma-Fraktion (vgl. JA-AS 13 516/1979) erhalten werden können. Bei weiteren Untersuchungen der kultivierten Substanz haben die Erfinder festgestellt, daß sie auch ein neues Antitumor-Antibiotikum NCS-C enthält, das sich hinsichtlich seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften von Neocarzinostatin, der N-1-Fraktion, der N-2-Fraktion und der Ma-Fraktion unterscheidet.

Es ist folglich Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Antitumor-Antibiotikum NCS-C (im folgenden als "NCS-C-Substanz" bezeichnet) sowie Salze dessen freier Säure zu schaffen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikums NCS-C und der Salze dessen freier Säure zu schaffen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man das neue Antitumor-Antibiotikum NCS-C schafft. Sein Salzsäuresalz weist folgende physikalischen und chemischen Eigenschaften auf:

(a) Aussehen: hellgelblich-bräunliches Pulver,
(b) Zersetzungspunkt: 125°C,
(c) spezifische Drehung: = -171° (c= 1,4×10^-3, in Methanol),
(d) Elementaranalyse: C 51,72, H 4,94, N 2,03, O 31,00, Cl 10,31,
(e) molekulare Summenformel: C₃₀H₃₃_-₃₅Cl₂NO₁₃,
(f) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Schultern bei 240, 265, 274, 290, 305 und 330 nm,
(g) Infrarot-Absorptionsspektrum: Absorptionen bei 3400, 1780, 1610, 1400, 1190, 1080 und 1010 cm^-1,
(h) Farbreaktionen: Permanganatreaktion, Diazokupplungsreaktion - positiv; Xanthoproteinreaktion, Ehrlich- Reaktion, Ninhydrinreaktion, Orcinreaktion, Molisch- Reaktion - negativ,
(i) Löslichkeit: leicht löslich in Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol; löslich in Aceton; etwas löslich in Äthylacetat; kaum löslich in Wasser, Äther und Benzol.

Erfindungsgemäß werden auch die Salze der freien Säure des Antitumor-Antibiotikums NCS-C geschaffen.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung der NCS-C- Substanz oder von Salzen deren freier Säure ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Neocarzinostatin liefernden Mikroorganismus in einem Kulturmedium kultiviert, das Kulturmedium in Bakterienkörper und Kulturfiltrat auftrennt, das Kulturfiltrat vor dem Extrahieren auf pH 1 bis pH 4 einstellt, das Kulturfiltrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren, polaren, organischen Lösungsmittel unter sauren Bedingungen extrahiert, die organische Schicht konzentriert und einer Reinigungsstufe unterwirft.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert; es zeigt

Fig. 1 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum des erfindungsgemäßen Antitumor-Antibiotikums NCS-C und

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der gleichen Substanz.

Die erfindungsgemäße NCS-C-Substanz kann beispielsweise folgendermaßen hergestellt werden:

Ein Neocarzinostatin liefernder Mikroorganismus, der zur Familie der Streptomyces gehört, wird zur Herstellung der erfindungsgemäßen NCS-C-Substanz eingesetzt. Derartige Neocarzinostatin liefernde Mikroorganismen umfassen Streptomyces carzinostaticus variant F41 Kuroya sowie alle Bakterien, die die NCS-C-Substanz liefern und zur Streptomyces-Familie gehören. Streptomyces carzinostaticus variant F41 Kuroya ist unter der Annahmenummer 2257 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, sowie unter ATCC Nr. 15 945 bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden. Zur Kultivierung von Streptomyces carzinostaticus variant F41 Kuroya für die Herstellung der erfindungsgemäßen NCS-C-Substanz können die in den obengenannten JA-AS 21 752/1967 und 13 516/1979 beschriebenen Kultivierungsverfahren angewendet werden.

Die NCS-C-Substanz kann aus der Kulturlösung gemäß einem weiter unten beschriebenen Verfahren isoliert werden. Nach der Trennung der Kulturlösung in die Bakterienkörper und die Kulturlösung, die nach einem bekannten Verfahren, z. B. durch Filtration oder durch Zentrifugieren, erreicht werden kann, ist die NCS-C-Substanz zunächst hautsächlich in dem Filtrat der Kulturlösung enthalten. Der pH-Wert des auf diese Weise erhaltenen Filtrats wird anschließend auf 1 bis 4 eingestellt, und zwar mit einer Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, oder mit einer organischen Säure, wie Essigsäure oder Ameisensäure. Beim Extrahieren des auf diese Weise auf einen bestimmten pH eingestellten Filtrats mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Butanol oder Chloroform, wandert der größte Teil der NCS-C-Substanz in die organische Schicht. Die organische Schicht wird anschließend konzentriert und einer Reinigungsstufe unterworfen, welche in Kombination eine Adsorptionschromatographie, z. B. an Silikagel, Aluminiumoxid oder Amberlite XAD, eine Phasenumkehrchromatographie, z. B. mit µ-Bondapack C₁₈ oder Lichrosorb RP-8, und eine Gelpermeationschromatographie, z. B. mit Sephadex LH-20 oder TSK-Gel, umfaßt. Dabei wird die NCS-C-Substanz in reiner Form erhalten.

Das Salzsäuresalz der NCS-C-Substanz weist folgende Eigenschaften auf:

(1) Physikalische und chemische Eigenschaften:
- (a) Aussehen. hellgelblich-bräunliches Pulver,
- (b) Zersetzungspunkt: 125°C,
- (c) spezifische Drehung: = -171° (c= 1,4×10^-3, in Methanol),
- (d) Elementaranalyse: C 51,72, H 4,94, N 2,03, O 31,00, Cl 10,31,
- (e) molekulare Summenformel: C₃₀H₃₃_-₃₅Cl₂NO₁₃,
- (f) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Schultern bei 240, 265, 274, 290, 305 und 330 nm,
- (g) Infrarot-Absorptionsspektrum: Absorptionen bei 3400, 1780, 1610, 1400, 1190, 1080 und 1010 cm^-1,
- (h) Farbreaktionen; Permanganatreaktion, Diazokupplungsreaktion - positiv; Xanthoproteinreaktion, Ehrlich- Reaktion, Ninhydrinreaktion, Orcinreaktion, Molisch- Reaktion - negativ,
- (i) Löslichkeit: leicht löslich in Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol; löslich in Aceton; etwas löslich in Äthylacetat; kaum löslich in Wasser, Äther und Benzol.
- (j) Stabilität: thermische Stabilität bei 60°C Ultraviolette Bestrahlung: bestrahlt mit einer Toshiba Sterilisationslampe aus einem Abstand von 20 cm pH: nach dem Zeitraum von 4 Stunden
(2) Akute Toxizität:
Maus, intravenöse Injektion LD₅₀ = 1,8 mg/kg
Maus, intraperitoneale Injektion LD₅₀ = 10 mg/kg und höher
(3) Biologische Eigenschaften:
- (i) Antitumorwirkungen: Yoshida Sarkom (ip-ip) Hela-S3-Zellen: die NCS-C-Substanz zeigt ihre Antitumorwirksamkeit bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml nicht, eine Mischung von Preneocarzinostatin und der NCS- C-Substanz (10 : 1) zeigte jedoch eine Antitumorwirkung bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml.
- (ii) Antimikrobielle Wirksamkeit: Wie aus der obigen Tabelle hervorgeht, ist, obwohl die erfindungsgemäße NCS-C-Substanz selbst eine Antitumor- und antimikrobielle Wirksamkeit aufweist, ihre Wirksamkeit beträchtlich erhöht, wenn man sie in Verbindung mit Preneocarzinostatin verwendet.

Gemäß der obigen Beschreibung sind die physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen NCS-C-Substanz vollständig verschieden von denen des durch Streptomyces carzinostaticus varinat F41 Kuroya produzierten Neocarzinostatins, der N-1-Fraktion, der N-2- Fraktion, der Ma-Fraktion und des Carzinostatin-Komplexes, der von einer analogen Bakterienspecies, nämlich Streptomyces carzinostaticus, produziert wird (vgl. JA-AS 5 400/1960). Die erfindungsgemäße NCS-C-Substanz unterscheidet sich hinsichtlich ihrer Eigenschaften auch von jeglichen anderen Antitumor-Antibiotika. Daher handelt es sich bei der erfindungsgemäßen NCS-C-Substanz um einen neuen Stoff.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

In einem 400-l-Kultivierungstank werden 200 l eines wäßrigen Kulturmediums (eingestellt auf pH 6,6) hergestellt, das eine Zusammensetzung (Gew.-%) von 2,0% Stärke, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,5% Trockenhefe, 0,25% Natriumchlorid, 0,35% Calciumcarbonat, 0,005% Manganchlorid, 0,005% Kupfersulfat und 0,005% Zinksulfat umfaßt. Das Kulturmedium wird 30 min thermisch bei 120°C sterilisiert. Anschließend werden 3 l einer Impflösung von Streptomyces carzinostaticus variant F41 Kuroya zugegeben, die zuvor 24 h auf einem Kulturmedium der identischen Zusammensetzung des obigen Kulturmediums kultiviert wurde. Das Kulturmedium wird dann 50 h bei 27°C unter Belüftung und Rühren kultiviert (Lufteinspeisung: 300 l/min; Rühren: 180 U/min). Man erhält 180 l einer Kulturlösung. Diese Kulturlösung wird anschließend mittels einer Filterpresse filtriert. Nach Einstellen des pH-Wertes des Filtrats mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 werden 100 l n-Butanol zugesetzt, und das resultierende Lösungsgemisch wird 2 h mit einer Rührgeschwindigkeit von 180 U/min gerührt. Anschließend läßt man das Gemisch 24 h stehen. Daraufhin wird die Butanolschicht, die sich in ausreichendem Maße von der Wasserschicht getrennt hat, entfernt und in einem Schnellverdampfer bei 50°C eingeengt. Man erhält eine konzentrierte Lösung der NCS-C-Substanz (Ausbeute: 1200 ml).

Beispiel 2

Die in Beispiel 1 erhaltene, konzentrierte Lösung wird auf einer Säule adsorbiert, die mit 5 l Silikagel gefüllt ist. Das Silikagel wurde zuvor mit Chloroform äquilibriert. Anschließend wird mit einem Methanol-Chloroform-Gemisch (1 : 1) eluiert, und man erhält 400 ml einer aktiven Fraktion. Diese Fraktion wird dann einer Konzentrations- und Trocknungsstufe unter vermindertem Druck unterworfen. Man erhält die NCS-C-Substanz in Form eines rohen Pulvers (Ausbeute: 2,1 g).

Beispiel 3

2,1 g des in Beispiel 2 erhaltenen, rohen Pulvers werden in 50 ml Methanol aufgelöst. Die resultierende Lösung wird dann durch eine Säule laufengelassen, die mit 1 l Sephadex LH-20 gefüllt ist. Die Säule war zuvor mit 1,0 N Chlorwasserstoffsäure- Methanol (1 : 9) äquilibriert worden. Unter Verwendung von 1,0 N Chlorwasserstoffsäure-Methanol (1 : 9) als Eluierungsmittel wird eine Chromatographie durchgeführt. Es werden 90 ml einer aktiven Fraktion aufgefangen. Diese Fraktion wird anschließend konzentriert und getrocknet, wobei man 126 mg der NCS-C-Substanz als Pulver erhält.

Claims

1. Antitumor-Antibiotikum NCS-C und Salze der freien Säure desselben, wobei das Chlorwasserstoffsäuresalz folgende physikalische und chemische Eigenschaften aufweist:

2. Verfahren zur Herstellung von Antitumor-Antibiotikum NCS-C des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Neocarzinostatin liefernden Mikroorganismus in einem Kulturmedium kultiviert, das Kulturmedium in Bakterienkörper und Kulturfiltrat auftrennt, das Kulturfiltrat vor dem Extrahieren auf pH 1 bis pH 4 einstellt, das Kulturfiltrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren, polaren, organischen Lösungsmittel unter sauren Bedingungen extrahiert, die organische Schicht konzentriert und einer Reinigungsstufe unterwirft.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser nicht mischbares, polares, organisches Lösungsmittel Butanol oder Chloroform einsetzt.