DE2905066C2 - Antibiotikum SF-2050B, Verfahren zur Herstellung desselben und antibakterielle Mittel, welche dasselbe enthalten - Google Patents

Antibiotikum SF-2050B, Verfahren zur Herstellung desselben und antibakterielle Mittel, welche dasselbe enthalten

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DE2905066C2
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Description

Bodenmycel wird auf verschiedenen Kulturmedien reichlich gebildet; die Bildung von Luftmycel ist dagegen verhältnismäßig gering. Auf Nährmedien aus anorganischen Salzen-Stärke-Agar, Tyrosin-Agar oder Saccharose-Nitrat-Agar, auf denen sich Luftmycel verhältnismäßig gut entwickelt, wies dieses Luftmycel monopodiale Verzweigungen auf; quirlständige Verzweigungen wurden nicht beobachtet. Die Spitzen des Luftmycels erschienen gerade. Besondere Strukturen wie Sclerotium wurden nicht beobachtet.
Bei der elektronen-mikroskopischen Beobachtung konnte festgestellt werden, daß die Oberflächenstruktur der Sporen glatt ist. Die Sporen haben eine elliptische bis kurz-zylindrische Form und eine Größe von 0,5 bis 0,8 X 0,8 bis 1,4 Mikron.
11. Eigenschaften der Kulturen auf verschiedenen Kulturmedien
Die Eigenschaften der Kulturen des Stammes SF-2050 sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt. Die in der Zusammenstsllung in Klammer angegebenen Farben wurden nach dem Standardwerk »Color Harmony Mannual of Container Corporation of America« festgestellt. Die Bebrütungstemperatur betrug 28°C und die Beobachtungen wurden 14 bis 21 Tage nach der Bebrütung durchgeführt.
Tabelle 1 Kulturmedium Wachstum Farbe der Rückseite Luftmycel
lösliches Pigment
Saccharose-Nitrat-Agar
Glucose-Asparagin-Agar
Glycerin-Asparagin-Agar
anorganische
Salze-Stärke-Agar Hafermehl-Agar
Hefeextrakt-Malzextrakt-Aigar
normales Wachstum,
farblos bis schwach perlfarbig
dünnes Wachstum, gelb bis gelblich-braun
normales Wachstum, schwach perlfarbig
gutes Wachstum, schwachgelb bis gelblich-braun
normales Wachstum, gelb bis zitronengelb
gutes Wachstum, hellbraun
schwach muschelrosa keins
(3 ca)
schwach, weiß bis keins
schwachgelb
schwach, weiß bis keins
schwach perlfarbig (2 ba)
muschelrosa bis hell- keins
melonengelb (3 ca-3 ea)
sehr schwach, keins
weiß bis hellgelb
schwach, muschelrosa keins
(3 ca)
Fortsetzung Kulturmedium Wachstum Farbe der Rückseite Luflmycel lösliches Pigment Tyrosin-Agar gutes Wachstum, hellbraun schwach muschelrosa keins
bis hellgelb (3 ca bis
I Ά db)
Nähragar normales Wachstum, schwach, weiß keins
hellgcib
III. Physiologische Eigenschaften
ι: (1) Wachsturn-Tcrnperaiurbereich:
der Stamm SF-2050 wächst in einem Temperaturbereich von 20-330C auf Stärke-Agar-Medium. Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 25 und 3O0C.
(2) Verflüssigung von Gelatine:
positiv (bei 2O0C , Htägige Bebrütung).
(3) Hydrolyse von Stärke:
positiv (bei 28°C).
(4) Koagulation von Magermilch:
negativ (bei 28°C).
(5) Peptonisierung von Magermilch:
positiv (bei 28°C).
(6) Farbstoffbildungsvermögen:
negativ.
IV. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen
(festgestellt in Pridham-Gottlieb's-Agarmedium bei einer Bebrütungstemperatur von 28°C)
(1) ausgenutzt werden: D-Glucose, Rhamnosc.
(2) zweifelhaft: D-Xylose, L-Arabinosc.
(3) nicht verwendet werden: D-Fructose, D-Mannit, l-lnosit. Saccharose, Raftlnose.
V. Diaminopimelinsäure (DAP) im Hydrolysat der Gesamtzclle: LL-Form
Die vorstehend aufgeführten Charaktcristika des Stammes SF-2050 können wie folgt zusammengefaßt werden: der Stamm SF-2050 gehört zur Gattung Streptomyces, das Luftmyccl ist durch gerade Spitzen gekennzcichnet und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt. Die Farbe des Luftmycel ist anfänglich weiß bis hellgelb und wird gelegentlich muschel-rosa bis gelbstichig, wenn der Stamm altert. Der Stamm SF-2050 gehört zu den Rot- oder Gelb-Reihen nach Tresner und Backus (H. D. Tresner und F. J. Backus: Appl. Microbiol. 11, 335 [1963]). Die Rückseite des Wachstums ist gelb bis hellbraun gefärbt; in keinem der Kulturmedien wurde ein lösliches Pigment erzeugt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der vorstehend beschriebene Stamm in an sich bekannter Weise in einem Kulturmedium gezüchtet, welches NährstofTquellen enthält, die für gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbar sind. Zu diesem Zweck können beliebige Nährstoffe verwendet werden, die auch üblicherweise bei der Züchtung bekannter Stämme der Gattung Streptomyces eingesetzt werden. Beispiele fur solche Nährstoflquellen sind Glucose, Glycerin, Stärke, Stärkesirup, Melasse und Sojabohnenöl als Kohlenstoffquellen; Sojabohnenmehl, Weizenkeime, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwas-Scf, ArnrnöniümSüifai Und Nairiumniirai als Siicksioffquciien. Gegebenenfalls können auch anorganische Salze wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kobaltchlorid, die entsprechenden Phosphate u. ä. Verbindungen zugesetzt werden. Darüberhinaus können solche organischen und anorganischen Materialien zugesetzt werden, die das Wachstum des benutzten Stammes unterstützen und die Bildung der Substanz SF-2050 B begünstigen. Insbesondere die Zugabe von Kobaltionen begünstigt die Bildung der gewünschten Antibiotika.
Als Züchtungsmethode bietet sich für die vorliegende Erfindung insbesondere die Züchtung in flüssigem Medium an, insbesondere die submerse Kultur unter aeroben Bedingungen, die auch üblicherweise zur Herstel-
lung bekannter Antibiotika angewandt wird. In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Züchtung unter aeroben Bedingungen, geeigneterweise bei einer Temperatur von 22 bis 30° C, am häufigsten bei einer Temperatür um 280C. Unter diesen Bedingungen erreicht die Bildung der Substanz SF-2050 B in der Kulturbrühe ein Maximum nach einer Züchtungsdauer von 1 bis 4 Tagen, wobei sowohl nach der Schüttelkultur-Methode als auch nach der Tankkultur-Methode (Züchtung in Ruhe) gearbeitet werden kann.
Zur Untersuchung der Substanz SF-2050 B die erfindungsgemäß wie beschrieben erzeugt worden ist, kann folgende Methode angewandt werden: Das Prüf-Kulturmedium enthielt 0,1 % Glucose, 0,5 % Trypton, 0,25 % Hefeextrakt und 1,5 % Agar (pH 7,0). Als Prüf-Mikroorganismus wurde Bazillus stearothermophilus verwendet. Die Prüfung wurde nach der üblichen Papierscheiben-Methode in der Weise durchgeführt, daß der Durchmesser der Hemmzone nach 16- bis 18stündiger Züchtung bei 55° C bestimmt wurde. Die Substanz SF-2050 B gemäß vorliegender Erfindung weist saure Natur auf und enthält eine Carboxylgruppe (— COOH) und eine SuI-
fonsäuregruppe (—SO1H) im Molekül. Die physiko-chemischen Eigenschaften werden im folgenden noch näher erläutert werden. Infolge dieser physiko-chemischen Eigenschaften kann sie kaus der Kulturbrühe, die bei der Züchtung des Stammes SF-20S0 anfällt, isoliert und dann gereinigt werden. Beispielsweise läßt sich die Substanz SF-2O5OB aus der Gärbrühe des Stammes SF-2050 wie folgt isolieren:
Die Gärbrühe, die die Substanz SF 2050 B enthält, wird nitriert, um Farbstoffe abzutrennen. Das so gewon- s nene Filtrat wird mit Aktivkohle behandelt, an der das gewünnschte Antibiotikum adsorbiert wird. Die Aktivkohle wird anschließend mit 50%igen Aceton (einer Mischung aus Wasser und Aceton im Volumenverhältnis 1:1 eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen, die die aktive Substanz enthalten, werden vereinigt und durch Verdampfen des Wassers und des Acetons unter vermindertem Druck eingeengt. Die verbleibende konzentrierte Lösung wird unter vermindertem Druck destilliert zur Entfernung des restlichen Acetons. Der Rückstand wird mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. einem Halogenalkan wie Dichlormethan, welches eine gewisse Menge eines quatcrnaren Ammoniumsalzes wie Benzyldimethylcetylammoniumchlorid oder Tetra-n-Butylammoniumhydrogensulfat enthält, extrahiert. Der so gewonnene Extrakt wird wiederum mit Wasser extrahiert, welches Natriumiodid enthält. Die gewonnene wäßrige Lösung, die die Substanz SF-2QS0 B enthält, wird der Gefriertrocknung unterworfen, durch welche man ein pulverförmiges Rohprodukt erhält, welches aus der Substanz SF-20S0 B besteht. Zur Reinigung wird dieses Rohprodukt einer chromatographischen Behandlung unterworfen, wobei man beispielsweise mit einem Anionen-Austauscher, deraus Diäthylaminoäthyldectran besteht, arbeitet. Man erhält auf diese Weise aktive Fraktionen, die die Substanz SF-2050 B enthalten. Die Reinigung und Trennung kann auch mit Hilfe eines Gelfiltrationsmittels auf der Basis von Polyacrylamiden oder mit einem synthetischen Adsorberharz, welches aus einem mikroporösen Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol besteht, durchgeführt werden. Die aktiven Fraktionen, die die Substanz SF-2050 B enthalten, werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Auf diese Weise erhält man die Substanz pulverförmig und in reiner Form, so daß sie bei der Prüfung mit Hilfe der DUnnschichtchromatographie an SiIikagel oder Cellulose einen Einzelfleck ergibt, wenn mit verschiedenen Lösungsmitteln als Laufmittel entwikkelt wird.
Die erfingungsgemäße Substanz SF-2050 B ist bei Temperaturen, die höher liegen als Umgebungstemperatur, und auch unter sauren Bedingungen sehr instabil. Bei der Abtrennung der Substanz SF-2050 B aus der Gärbrühe ist es daher sehr wichtig, zu verhindern, daß die Lösung im Verlauf der Aufarbeitungs- und Reinigungsstufe sauer werden; die Behandlung der Lösung muß schnell bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden.
Weil die Substanz SF-2050 B unter sauren Bedingungen sehr instabil ist, ist es äußerst schwierig, sie in Form der freien Säuren zu isolieren. Aus diesem Grund ist es in der Praxis vorzuziehen, die Substanz in Form ihrer Alkalimetallsalze, z. B. als Natrium- oder Kaliumsalz, oder auch als Bariumsalz zu gewinnen. Neutralisierte wäßrige Lösungen der Substanz SF-2050 B werden der Gefriertrocknung unterworfen; die Substanz fällt dabei in Form eines amorphen Pulvers an. Die Reinheit der so gewonnnenen Salze ist Schwankungen unterworfen, die von der Potenz oder dem Gehalt des Antibiotikums in der aufgearbeiteten Gärbrühe abhängen. Die Natur des Salzes von SF-2050 B wird von dem Kation bestimmt, welches in den Lösungen bei der Behandlung der Substanzen bei der Aufarbeitung der Reinigung vorhanden ist. Beispielsweise erhält man die Substanz SF-2050 B in Form ihres Dinatriumsalzes, wenn man eine wäßrige Lösung von Natriumchlorid zum Eluieren bei der chromatographischen Behandlung verwendet und das Chromatographieren an einem Diäthylaminoithyldextran vorgenommen wird. Außer in Form des Dinatriumsalzes kann die Substanz SF-2050 B auch in Form anderer pharmazeutisch akzeptabler Salze gewonnen werden, beispielsweise in Form des Dikaliums&lzes, der Erdalkalimetallsalze wie Calium- oder Bariumsalze, der Ammoniumsalze oder anorganischen Aluminiumsalze sowie in Form von Salzen mit substituierten Ammoniumverbindungen, d. h. als quaternäre Ammoniumsalze (organische Salze). Diese pharmazeutisch akzeptablen Salze können in derselben Weise hergestellt werden, wie vorstehend für das Dinatriumsalz beschrieben. Das Dinatriumsulz der Substanz SF-2050 B kann in ein anderes Salz mit unterschiedlichem Kation umgewandelt werden, indem man die wäßrige Lösung des Dinatriumsalzes durch eine Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz leitet, in welchem die Wasserstoflionen durch das gewünschte Kation ersetzt worden sind.
Die Substanz SF-2050 B ist eine dibasiche Säure. Das Natriumsalz ist ein farbloses Pulver ohne definierten Schmelzpunkt. Die Reaktion mit Ninhydrin ist negativ, die mit Natriumjodid positiv. Das Dinatriumsalz ist ein so farbloses in Wasser lösliches Pulver; die Löslichkeit in Methanol ist geringer und die Löslichkeit in Äthylacetat, Chloroform und Bezol sehr schwach.
Die Substanz SF-2050 B weist folgende Kenndaten auf:
(a) die Substanz stellt eine zweibasige Säure dar, die bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese bei pH 6,4 zur Anode wandert, wobei die Mobilität bei dieser Elektrophorese 1,58 beträgt, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 ansetzt.
Das Dinatriumsalz der SF-2050 B weist folgende Kenndaten auf:
(a) die Substanz besitzt charakteristische Adsorptions-Peaks bei 228 nm und 305 nm im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in wäßriger Lösung;
(b) im Infrarot-Absorptionsspektrum (tablettiert in Kaliumbromid) zeigt die Substanz die in F i g. 2 der beigefügten Zeichnung dargestellte Kurve (Peaks bei 3450,1760,1630,1520,1410,1260,1080,940,940,910 und 870 cm"1);
(c) das kernmagnetische Wasserstoff-Resonanzspektrum im Deuterowasser entspricht der in Fi g. 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellten Kurve;
(d) das kreisförmige Kriitallspektrum der Substanz ist in Fig. 4 der beigefügten Zeichnungen zu erkennen;
(e) bei der Elementaranalyse ergaben sich folgende Werte:
:ji C 33,5%, H 3,9%, N 5,7% und S 13,8%;
:j$ (f) bei der Hochleistungs-Flüssigkeilschromatographie an einer Kolonne mit einer Größe von 4 mm x 30 pm, die mit mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen behandeltem Silikagel gefüllt war, ergab sich eine Verweil-
s dauer von 22 Minuten und 20 Sekunden bei der Entwicklung mit 0,3 ml pro Minute einer auf 0,01 mgepuf-
I ferten Phosphatlösung bei pH 6,5; I (g) die Substanz ergibt einen Einzelfleck bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose hei Rf - 0,42,
|i wenn n-Butanol-Propanolo-Wasscr (7:7:6) als Laufmittel verwendet wird, bzw. bei Rr - 0,32 bei Verwen-
,'';' dung von 80%igem wäßrigem Propanol (d. h. einer Mischung aus Wasser und Propanol im Volumenver-
fi ίο hältnis von 8:2) und bei Rf = 0,65 bei Verwendung von Acetonitril-Wasscr (7:3) als Laufmittel.
j| (h) die Substanz verliert ihre antibakterielle Wirkung bei der Behandlung mit Hydroxylamin;
|t (i) die Substanz weist eine Hemmwirkung gegenüber jff-Lactamase auf.
U Weitere physiko-chemische Eigenschaften des Natriumsalzes der Substanz SF-2050 B sind im folgenden auf-
tl 15 geführt; eine Analysenprobe dieser Substanz konnte in Form eines amorphen Pulvers durch Gefriertrocknung
1| ihrer neutralen wäßrigen Lösung gewonnen werden; die Probe enthält möglicherweise einige wenige Prozent
K Wasser und nicht feststellbare Spuren von Verunreinigungen.
};i 1. Das Natriumsalz der Substanz SF-2050 B liegt im wesentlichen als Dinatriumsalz vor, da die freie Säure auf-
Vf. grand der Ergebnisse der Elementaranalyse und der Elektrophorese als zweibasige Säure anzusehen ist.
;i 20 2. Das Natriumsalz der Substanz SF-2050 B wandert bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese in
|'< Pyridin-gepufferter Acetatlösung bei pH 6,4 zur Anode und zeigt bei dieser Elektrophorese eine Mobilität von
;| 1,58, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 annimmt.
p 3. Das Natriumsalz ist bei der Lagerung als festes Pulver in der Kälte und in Gegenwart eines wasserbindenden
Ι» Mitteis etwas beständig. In wässriger Lösung ist das Natriumsalz unter sauren Bedingungen sehr unbeständig
!> 25 und unter neutralen Bedingungen ebenfalls unbeständig; es zeigt seine größte Stabilität bei einem pH-Wert von
K| 6,5 bis 8. Selbst unter neutralen Bedingungen läßt es sich leicht bei erhöhter Temperatur zersetzen. Wird eine
ύ neutralisierte wäßrige Lösung des Natriumsalzes mit der gleichen Volumenmenge einer wäßrigen Lösung von
p 0,02 m Hydroxylamin vermischt und läßt man anschließend die Mischung bei Umgebungstemperatur 30 Minu-
;i ten oder länger stehen, so verschwindet die antibakterielle Wirkung vollständig, ebenso wie der charakteri-
30 stische Absorptions-Peak bei 305 nm.
4. Das Natriumsalz ist verhältnismäßig leicht löslich im Wasser, weniger löslich in Methanol und im wesentlichen unlöslich in Chloroform und Äthylacetat.
5. Die Substanz SF-2050 B (das Natriumsalz) besitzt keinen definierten Schmelzpunkt und zersetzt sich langsam bei Temperaturen von 150°C und darüber.
35 6. Bei der Gewichtsanalyse des Natriumsalzcs wurden folgende Werte festgestellt:
C 33,5%, H 3,9%, N 5,7% und S 13,8%.
7. Das Natriumsalz weist in einer Konzentration von 25|jg/ml in einer m/100-gepufferten Phosphatlösung (pH
6,5) ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum auf, wie in Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt; man
erkennt charakteristische Absorptions-Peaks bei 228 nm und 305 nm. 40 8. Das Natriumsalz, tablettiert in Kaliumbromid, besitzt ein Infrarot-Absorptionsspektrum wie in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.
9. Das Natriumsalz weist im Deuterowasscr ein kernmagnetisches Wasserstoff-Resonanzspektrum auf, wie in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.
10. Das Natriumsalz zeigt in 1/100 m-gcpufferter Phosphatlösung (pH 6,5) eine Drehkristall-Spektralkurve, 45 wie in Fig. 4 der beigerügten Zeichnungen dargestellt.
11. Die Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose sind wie folgt:
(a) Rf = 0,42 bei Verwendung von n-Butanol-Propanol-Wasser (7:7:6) als Laufmittel.
(b) Rf » 0,65 bei Verwendung von Acetonitril-Wasser (7:3) als Laufmittel und 50 (c) Rf - 0,32 bei Verwendung von Propanol-Wasser (8:2) als Laufmittel.
12. Bei der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an einer Kolonne mit einer Größe von 4 mm x 30 cm, die mit Silikagel gefüllt war, wies das Natriumsalz eine Verweildauer von 22 Minuten und 20 Sekunden auf, wenn als Laufmittel eine 1/100-gepufferte Phosphatlösung (pH 6,5) verwendet und die Fließgeschwindigkeit auf
JS 3,0 ml pro Minute eingestellt wurde.
13. Farbreaktionen: Gegenüber Kaliumpermanganat und Natriumiodid sind die Farbreaktionen positiv, gegenüber Ninhydrin sind die Farbreaktionen negativ.
In den Zeichnungen bedeuten:
Fig. 1 die Kurve des Ultraviolettabsorptionsspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-60 2050B gemäß vorliegender Erfindung (25 μ/ml, in 1/100 m-gepuflerter Phosphatlösung bei pH 6,5);
Fig. 2 die Kurve des Infrarotabsorptionsspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050B, tablettiert in Kaliumbromid;
Fi g. 3 die Kurve des kernmagnetischen Wasserstoff-Resonanzspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050 B, bestimmt in Deuterowasser bei 100 MHz;
65 F i g. 4 die Kurve des DrehkristaUspektrums einer Probe des Natriumsaizes der Substanz SF-2050 B, bestimmt in 1/100 m-gepufferten Phosphatlösung bei pH 6,5.
Die antibakterielle Wirkung der Substanz SF-2050 B gemäß vorliegender Erfindung, d. h. die Wirkung, mit der die Substanz das Wachstum verschiedener Bakterien hemmt, wurde nach der übliche Petrischalen-Methode
bestimmt. Dazu wurde die Substanz SF-2050 B in Form ihres Natruimsalzes jeweils in destilliertem Wasser in
den in der folgenden Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen gelöst. Mit den so hergestellten Testlösungen
wurden Filterpapierseheiben mit einem Durchmesser von 8 mm imprägniert und anschließend an der Luft
getrocknet. Alle so behandelten Papierscheiben wurden auf eine Platte mit einem Versuchs-Bebrütungsmedium (1), (2) oder (3) mit der in der folgenden Tabelle 2 angegebenen Zusammensetzung gelegt. In dem Bebrütungsmedium war auch der Test-Mikroorganismus enthalten. Die Platte wurde auf eine Agar-Schicht in der
Petrischale gelegt. Die Bebrütung erfolgte bei 370C in 16 Stunden. Anschließend wurde der Durchmesser der
Hemmzone, die sich um die Papierscheibe ausgebildet hatte, gemessen. Die Ergebnisse der Versuche sind in der
folpenden Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2
Testorganismus Κυη/.enlration der Durchmesser der Hemmzone (mm) geprüften Antibiotika Substanz SF-2O5G 8 Bsbrüiungsiüedium Zusammensetzung auf: 0,5% Bebrütungsmedium (3) 1,0%
(Kg/ml) 38,5 (D (2) 0,3% Polypepton 0,5%
10 36,3 1,5% Fleischextrakt 0,25%
Bacillus stearothermophilus 5 32,2 Natriumchlorid 1,5%
2,5 - Agar (pH 7,0)
1,25 23,5 (2)
80 20,5
Bacillus subtilis ATCC 6633 40 17,6
20 -
10 25,6 (3)
80 21,5
Staphylococcus aureus 209 P 40 16,7
20 -
10 25,0 (2)
80 21,5
Escherichia coli K-12 40 19,9
20 -
10 22,5 (2)
10 19,0
Vibrio percolans 5 16,4
2,5 -
1,25 30,0 (2)
80 28,2
Proteus mirabiles 40 23,6
20 -
10 17,6 (2)
80 16,6
Klebsieila pneumoniae 40 13,4
20 -
10
und (3) wiesen folgende
Die Bebrütungsmedien (1), (2) Bebrütungsmedium
Bebrütungsmedium (1) Polypepton
Glucose 0,1% Fleischextrakt
Trypton 0,5% Agar (pH 7,0)
Hefeextrakt 0,25%
Agar (pH 7,0) 1,5%
Durch weitere Versuche konnte festgestellt werden, daß die Substanz SF-2050 B die Fähigkeit hat, die Wirkung von jS-Lactamase zu inhibieren; die Bestimmung erfolgte nach der Methode von Sargent (M. G. Sargent,
»Journal of Bacteriology« 95,1493 [1968]). Nach der Methode von Sergent wird die Hemm wirkung gegenüber>
Lactamase wie folgt bestimmt:
es werden zunächst wie folgt vier Reagentien hergestellt:
Reagenz A:
Eine Penicillines«: wurde in 0,1 m-gepufferter Phosphatlösung (pH 7,0) gelöst kund die entstandene Lösung wurde mit der gleichen gepufferten Phosphat lösung auf eine Potenz verdünnt, daß sich eine LichUbiorption (optische Dichte) von etwa 0,5 bei einer Lichtwellenlänge von 490 nm, gemessen unter den nachstes hend aufgeführten Bedingungen, ergibt.
Reagenz B:
l,3%ige Lösung des Kaliumsalzes von Penicillin G in Wasser.
Reagenz C:
0,1 η-gepufferte Phosphatlösung, pH 7,0.
ίο Reagenz D:
Jod-gepuffcrte Acetatlösung, die nach der Methode von Sargent hergestellt wurde.
Für den Kontrollversuch wurden 0,5 ml Reagenz B und 2 ml Reagenz C zusammen in ein Reagenzglas gegeben und die Mischung in dem Reagenzglas wurde 5 Minuten auf 300C erhitzt. Danach wurden 0,5 ml Reagenz A
is in das Reagenzglas gegeben und die entstandene Mischung wurde 30 Minuten bei 300C gehalten und dann mit weiteren 5 ml Reagenz D vermischt. Nach lOminütigem Stehen wurde die Lichtabsorption (bzw. die optische Dichte) der Reaktionslösung bei einer Lichtwellenlänge von 490 nm bestimmt und als Wert α ausgedrückt. Als Blindversuch fur diesen Kontrollvcrsuch wurden 0,5 ml Reagenz B und 2 ml Reagenz C zusammen in ein Reagenzglas gegeben und die Mischung 5 Minuten auf 300C erhitzt. Der Inhalt des Reagenzglases wurde weitere 30 Minuten bei 300C gehalten und dann mit 5 ml Reagenz D und unmittelbar danach mit 0,5 ml Reagenz A vermischt. Die Mischung ließ man 10 Minuten stehen und danach wurde die Absorption der entstandenen Reaktionslösung bei 490 nm bestimmt und als Wert (ausgedrückt. Zur Bestimmung der Hemmwirkung der Substanz SF-2050 B wurden 0,5 ml Reagenz B und Reagenz C, welches eine Lösung der Substanz SF-2050 B (als Penicillinase-Inhibitor) in der richtigen Hemmkonzentration in Reagenz C darstellt, zusammen in ein Reagenzglas gegeben und die Mischung wurde 5 Minuten auf 300C erhitzt. Der Inhalt des Reagenzglases wurde dann mit 0,5 ml Reagenz A und 5 ml Reagenz D in derselben Weise wie beim Kontrolltest umgesetzt. Die Adsorption der Reagenzlösung wurde bei 490 nm bestimmt und als Wert rausgedrückt. Der Blindversuch für diesen Hemmtest wurde in derselben Weise durchgeführt, wie dies bei dem Kontrolltest beschrieben worden ist, wobei jedoch Reagenz C anstelle von Reagenz C verwendet wurde. Die Adsorption der Reaktionslösung bei 490 mn wurde bestimmt und als Wert b' ausgedrückt.
Die vorstehend beschriebenen Tests wurden gleichzeitig durchgerührt. Die Hemmung der>Lactamase durch den Hemmstoff wurde nach folgenden Gleichungen berechnet:
« Hemmung (%) - (\ - Χ 100.
\ O~ Ο /
Wie eingangs bereits gesagt, ist die Substanz SF-2050 B nicht nur gegen gram-positive und gram-negative Bakterien wirksam, sondern wirkt auch gegen resistente Bakterien, die die Fähigkeit zur Bildung von jS-Lactamase haben. Sie ist infolgedessen zur Behandlung bakterieller Infektionen bei Menschen und Haustieren verwcndbar. Darüber hinaus kann die Substanz SF-2050 B als antibakterielles Mittel oder als Desinfektionsmittel zum Sterilisieren von Nahrungsmitteln sowie von chirurgischen und medizinischen Instrumenten verwendet werden. Die Substanz SF-2050 B kann allein oder in Mischung mit beliebigen Antibiotika von jff-Lactam-Typ, beispielsweise Ampicillin, eingesetzt werden.
Die Substanz SF-2050 B gemäß vorliegender Erfindung kann sowohl in Form der freien Säure als auch in Form ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze, beispielsweise des Natriumsalzes und des Kaliumsalzes zu injizierbaren Lösungen verarbeitet werden, indem man sie in geeigneter Konzentration in einer physiologischen Salzlösung oder in einem anderen üblichen pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Trägermaterial löst, beispielsweise in wäßrigen Vehikeln wie Ringers-lnjektionslösung oder Dextrose-Injektionslösung. Sie läßt sich auch zu anderen Verabreichungsformen verarbeiten, indem man sie mit festen, pharmazeutisch akzeptablen Trägermateria-
so lien wie Talcum, Stärke oder Calciumcarbonat vermischt. Die injizierbaren Lösungen der Substanz SF-2050 B können intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht werden. Als antibaktcrielles Mittel kann die Substanz SF-2050 B in Dosen von 50 bis 1500 mg, insbesondere 100 bis 1000 mg bei Erwachsenen verabreicht werden, und zwar zwei-, drei- oder viermal pro Tag. Eine geeignete Dosierung liegt bei etwa 2 mg bis 500 mg/ kg/Tag.
SS In dem erfindungsgemäß in Betracht gezogenen antibakteriellen Mittel soll die Menge an aktiver Substanz, d. h. an Substanz SF-2050 B oder an pharmazeutisch akzeptablen Salzen dieser Verbindung neben einem pharmazeutisch akzeptablen flüssigen oder festen Trägermaterial zwischen 5 und 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtpräparat, liegen.
Die nun folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
60
(α)'ύ = -46° (c-=0,1, H:O).
Beispiel 1
Herstellung der Substanz SF-2050 B (1) Bebrütung des Stammes SF-2050
Es wurde eine Vorratskultur von Strcptomyces sp. Stamm SF-2050 (H interlegungsnummer ATCC 31450) verwendet. Eine Schlinge voll dieser Vorratskultur wurde zum Impfen von 10 ml eines sterilisierten Impfkuiiur-
[mediums verwendet, welches aus 1,0 % löslicher Stärke und 3,0 % Sojabohnenmehl bestand und vor dem Sterili-Isieren einen pH-Wert von 7,0 aufwies. Das Medium befand sich in einem weiten Reagenzglas mit einem Fassungsvermögen von 50 ml. Die Beratung erfolgte während 48 Stunden bei 23°C. 1-ml-Portionen dieser so I gewonnenen Impfkultur wurden dazu verwendet, fünf Sakaguchi-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 1500 ml, die jeweils 100 ml des genannten Impfkulturmediums enthielten, zu impfen; die Kolben wurden 24 Stunden bei 28°C bebrütet. Die zweite so gewonnene Impfkultur (SOO ml) wurde zum Impfen von 201 des Impfkulturmediums der bereits genannten Zusammensetzung in einem 30-1-Gärbehälter verwendet. Das I geimpfte Medium wurde 24 Stunden unter Belüftung und Schütteln bei 28°C bebrütet. Die dritte so gewonnene Impfkultur (IS Liter) wurde zum Impfen von 2001 eines Produktions-Kulturmediums in einem 3001-Gärbehälter verwendet. Das benutzte Produktions-Kulturmedium enthielt 2,0% Glucose, 1,0 V· Sojabohnenmehl, 0,1 % K2HPO4,0,02% CaCO3 und 0,0001 % CoCl2 - 6 H2O (pH 6,5 vor dem Sterilisieren). Die Bebrütung erfolgte unter Belüftung und Schütteln während 44 Stunden bei 28°C. Nach der Bebrütung wurde die Kulturbrühe mit Hilfe von Diatomeenerde nitriert; auf diese Weise erhielt man 1701 Brühenfiltrat.
(2) Gewinnung der Substanz SF-2050 B
Das gewonnene Brühenfiltrat (1701) wurde durch eine 10-l-Kolonne mit Aktivkohle geleitet, um die aktiven Substanzen zu adsorbieren. Die Kohlekolonne wurde zweimal mit je 121 Wasser gewaschen und dann mit 5OVoigem wäßrigen Aceton eluiert. Das Eluat wurde in 8-l-Fraktioncn aufgefangen und die vier Fraktionen Nr. 1, 2,3 und 4 wurden verwendet. Die Fraktionen Nr. 2 und 3 wurden vereinigt und auf ein Volumen von 71 eingeengt, indem man das Aceton bei 380C unter vermindertem Druck abdestillierte. Die entstandene konzentrierte Lösung wurde mit 7 1 Dichlormcthan, welches 0,2% (Gewicht/Volumen) Benzyldimethylcetylammoniumchlorid enthielt, unter Schütteln vermischt, um die aktiven Substanzen tu extrahieren. Die Dichlormethanschicht wurde nochmals mit 700 ml Wasser, welches 1 % (Gewicht/Volumen) Natriumiodid enthielt, extrahiert, um den Übergang der aktiven Substanzen in die wäßrige Phase zu erreichen. Der entstandene wäßrige Extrakt wurde durch Abdestilliercn des Dichlormethan unter vermindertem Druck eingeengt. Der konzentrierte wäßrige Extrakt wurde durch eine 1-1-Kolonne geleitet, die einen Anionenaustauscher (Diäthylaminoäthyldextran) enthielt, der durch Behandlung mit einer gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) abgepuffert worden war. Auf diese Weise wurden die aktiven Substanzen an dem AnionenausUuscher adsorbiert. Die Kolonne wurde anschließend mit 3 1 einer 20 millimolaren gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) gewaschen und dann mit 61 einer Lösung eluiert, die 0,1 m Natriumchlorid gelöst in 20 millimolarer gepufferter Ptiosphatlösung (pH 7,2) enthielt. Zum Eluieren der aktiven Substanz aus der Kolonne wurde eine Lösung verwendet, die 0,14 m Natriumchlorid gelöst in einer weiteren Menge derselben gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) enthielt. Das Eluieren der aktiven Substanz von der Anionenaustauscherkolonne wurde so lange fortgesetzt, bis die etwa 12-bis 14fache Menge des Kolonnenvolumens an Lösungsmittel durchgeleitet worden war. Das Eluat wurde in 150-ml-Frakttonen aufgefangen; das Natriumsalz der Substanz SF-20S0 B war in den aktiven Fraktionen Nr. 78 bis 98 (etwa 2,11 insgesamt) enthalten.
Die aktiven Fraktionen Nr. 78 bis 98 wurden vereinigt und durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 30 ml entsprechende Menge Aktivkohle zum Adsorbieren der aktiven Substanz (Natriumsalz der Substanz SF-2050 B) enthielt. Die Aktivkohlekolonne wurde zweimal mit je SO ml Wasser gewaschen und dann mit 120 ml 50%igem wäßrigen Aceton eluiert, um die aktive Substanz zu isolieren. Das Eluat wurde durch Verdampfen des Wassers und des Acetons unter vermindertem Druck eingeengt. Die entstandene konzentrierte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei man 62 mg des Natriumsalzes der Substanz SF-20S0 B als farbloses pulverförmiges Rohprodukt erhielt.
(3) Reinigung der Substanz SF-2050 B
Das pulvcrförmigc Rohprodukt, welches die Substanz SF-20S0 B (62 mg) darstellte, wurde in 2 ml einer 20 millimolaren gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) aufgenommen; die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 120 ml entsprechende Menge des Antionenaustauschers (Diäthylaminoäthyldextrun) enthielt, die durch Behandlung mit einer gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) abgepuffert war, so daß die aktive Substanz an der Kolonne adsorbiert wurde. Die Kolonne wurde anschließend mit 600 ml der 20 millimolaren gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) gewaschen und dann mit einer Lösung eluiert, die 0,1 m Natriumchlorid, gelöst in einer weiteren Menge der gleichen 20 millimolaren gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) enthielt. Die aktive Substanz \ά. h. das Natriumsalz der Substanz SF-2050 B) wurde aus der Kolonne eluiert, indem man solange Eluierungsmittel durch die Kolonne schickte, bis etwa die 18- bis 22fache Volumenmenge der Kolonne desselben verbraucht waren. Während des Eluierungsvorganges wurde das Eluat in 18-ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 118 bis 146 (etwa480 ml insgesamt) enthielten das Natriumsalz der Substanz SF-20S0 B. Diese aktiven Fraktionen wurden vereinigt und über eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 10 ml entsprechende Menge Aktivkohle enthielt, an welcher die Adsorption der aktiven Substanz erfolgte.
Diese Aktivkohlekolonne wurde mit 40 ml Wasser gewaschen und mit SO ml 50%igem wäßrigen Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf ein Volumen von etwa 3 ml eingeengt, indem man das Aceton unter vermindertem Druck abdestillierte. Die konzentrierte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei man ein reines farbloses Pulver erhielt, welches aus dem Natriumsalz der Substanz SF-2050 B bestand. Ausbeute 2,2 mg.
vs 20 2s 30
40 4S
so
SS
60
65
Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Antibiotikum SF-2O5OB einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Salze desselben, gekennzeichnet durch
a) Summenformel (nachgereicht): CuH16
b) Strukturformel (nachgereicht):
HOjSO
c) in Form der freien dibasigen Säure bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese bei pH 6,4 Wanderung zur Anode, wobei ihre Mobilität 1,58 beträgt, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 ansetzt, und
d) in Form des Dinatriumsalzes ein farbloses Pulver, das in Wasser löslich, in Methanol weniger löslich und in Äthylacetat, Chloroform und Benzol nur ganz geringfügig löslich ist, und folgende weitere Kenndaten aufweist:
einen charakteristischen Adsorptions-Peak bei 228 mm sowie einen weiteren Peak bei 305 mm im
Ultraviolett-Adsorptionsspektrum in wäßriger Lösung;
das Infrarot-Adsorptionsspektrum des Dinatriumsalzes, tablettiert in Kaliumbromid, wie aus der Fig. 2 ersichtlich;
Das kernmagnetische Wasserstoff-Adsorptionsspektrum in Dcuterowasscr entsprechend der
Fig. 3;
das kreisförmige Kristallspektrum wie aus Fig. 4 ersichtlich;
Gewichtsanalyse: C 33,5%, H 3,9%, N 5,7% und S 13,8%;
bei der Hochleistungs-FIUssigkeitschromatographie an einer Kolonne mit einer Größe von 4 mm y· 30 cm, die mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen behandeltem Silikagel gefüllt ist, eine
Verweildauer von 22 Minuten und 20 Sekunden bei der Entwicklung mit 0,3 ml pro Minute einer
auf 0,01 m gepuderten Phosphatlösung bei pH 6,5;
einen Einzelfleck bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose bei Rf = 0,42, wenn n-Butanol-Propanol-Wasser (7:7:6) als Laufmittel verwendet wird, bzw. bei Rr = 0,32 bei Verwendung von 80%igem wäßrigem Propanol (d. h. einer Mischung aus Wasser und Propanol im Volumenverhältnis von 8:2) und bei Rf = 0,65 bei Verwendung von Acetonitril-Wasscr (7:3) als Laufmittel;
Verlust der antibakteriellen Wirkung bei der Behandlung mit Hydroxylamin;
eine Hemmwirkung gegenüber >Lactamase,
wobei die Figuren 2, 3 und 4 Bestandteil dieses Anspruchs sind.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-2050 B des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. SF-2050 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31450 in einem wäßrigem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffqucllen in assimilierbarer Form enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 22°C und 3O0C über einen Zeitraum von 1 bis 4 Tagen züchtet und daß man anschließend zur Gewinnung und Reinigung des gebildeten Antibiotikums SF-2050 B
a) das Gärbrühennitrat mit Aktivkohle versetzt, die das Antibiotikum SF-2050 B aus der Gärbrühe adsorbiert,
b) die Aktivkohle mit 50%igem wäßrigem Aceton eluiert, das Eluat in Fraktionen auffängt und die aktiven Fraktionen, die das Antibiotikum SF-2050 B enthalten, vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trocknung einengt,
c) den so gewonnenen trockenen Rückstand mit einem flüssigen Halogenalkan, welchem ein quaternäres Ammoniumsalz zugesetzt worden ist, extrahiert, den organischen Extrakt wiederum mit natriumiodidhaltigem Wasser extrahiert und den so gewonnenen wäßrigen Extrakt der Gefriertrocknung unterwirft und
d) das so erhaltene pulverformige Rohprodukt des Antibiotikums SF-2050 B über einen Anionen-Austauscher, der aus Diäthylaminoäthy !dextran besteht, ein Gel-Filtralionsmittcl auf der Basis von Polyacrylamiden oder ein synthetisches Adsorberharz, welches aus einem mikroporösen Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol besteht, chromntographiert, so daß schließlich die reine Substanz SF-2050 B vorliegt.
3. Antibakterielles Mittel, bestehend aus einer antibakteriell wirksamen Menge des Antibiotikums SF-
2050B gemäß Anspruch ! einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Salze desselben in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial.
Die Erfindung betrifft ein neues wertvolles Antibiotikum, welches die Bezeichnung SF-2O5OB trägt Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung dieses neuen Antibiotikums durch Züchtung eines bestimmten Stammes der Gattung Streptomyces. Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind antibakterielle Mittel, die das Antibiotikum SF-2050B als aktiven Bestandteil enthalten (vgl. die Patentansprüche 1 bis 3).
Es ist bereits eine Reihe wertvoller Antibiotika mit verschiedenen Stämmen der Gattung Streptomyces hergestellt und aus den jeweiligen Kulturbrühen isoliert worden. Bei dem Versuch, neue und wertvolle Antibiotika zu finden, die gegen gram-negative und gram-positive Bakterien sowie gegen verschiedene Bakterienstämme, die bekannten Antibiotika gegenüber resistent sind, aktiv sind, wurde jetzt auch die Gärbrühe eines neuen Mikroorganismus untersucht, der die Bezeichnung Streptomyces sp. SF-2050 trägt. Dabei wurde gefunden, daß bei der Züchtung von Streptomyces sp. SF-2050 in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Nährstoffe enthält, ein neues Antibiotikum gewonnen werden kann. Die aktive Substanz wurde aus der Kulturbrühe isoliert und als Antibiotikum SF-2050 B bezeichnet. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des neuen Antibiotikums wurden bestimmt. Dabei konnte auch festgestellt werden, daß das neue Antibiotikum eine inhibierende Wirkung gegenüberjB-Lactamase aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist infolgedessen das Antibiotikum SF-2050 B gemäß Anspruch 1, das als antibakterielles Mittel wirksam ist und gegenüber jö-Lactamase inhibierend wirkt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin das Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums SF-2050B, welches im Anspruch 2 beansprucht und gekennzeichnet ist.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Stamm SF-2050, der aus einer Bodenprobe isoliert worden ist, die in Ibaragi-Prefecture, Japan gesammelt worden ist und der jetzt die Bezeichnung Streptomyces sp. SF-2050 trägt, eingesetzt. Dieser Stamm SF-2050 ist bei der »American Type Culture Collection«, Washington, D. C, U.S.A. unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31450 am 9. November 1978 hinterlegt worden.
Der Stamm SF-2050 weist folgende mikrobiologische Kennwerte auf:
1. Morphologische Charakterislika
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