CH640237A5 - 3-(2-(n-acetylamino)-vinylthio)-6-(hydroxyethyl)-7-oxo-1-azabicyclo-(3.2.0)hept-2-en-2-carbonsaeure und verfahren zu deren herstellung. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft N-Acetyl-dehydro-thienamycin Das neue erfindungsgemässe Antibiotikum N-Acetyl-d.h., 3-[2-(N-Acetylamino)-vinylthio]-6-(l -hydroxyethyl)-7- dehydro-thienamycin wird bei der der aeroben Fermentation oxo-1 -azabicyclo-[3.2.0]hept-2-en-2-carbonsäure und deren geeigneter wässriger Nährmedien unter gesteuerten Bedin-pharmazeutisch brauchbaren Salze. Diese antibiotisch wirk- 3$ gungen durch Inokulieren mit dem Organismus Strepto-same Verbindung ist sowohl gegen grampositive als auch myces cattleya produziert. Zur Herstellung des Antibioti-gegen gramnegative Bakterien wirksam. kums N-Acetyl-dehydro-thienamycin sind wässrige Medien, Die Entdeckung der wertvollen antibiotischen Eigen- wie die für die Herstellung anderer Antibiotika verwendeten Schäften des Penicillins führte zu einem bedeutenden Inter- geeignet. Derartige Medien enthalten Quellen für Kohlenesse an diesem Gebiet, was dazu führte, dass viele andere 40 stoff, Stickstoff und anorganische Salze, die durch den wertvolle antibiotische Substanzen gefunden wurden, wie Mikroorganismus assimilierbar sind.

Streptomycin, Bacitracin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin Im allgemeinen können Kohlenhydrate wie Zucker, bei-

und dgl. Im allgemeinen ist die Aktivität derartiger Antibio- spielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose bzw.

tika entweder auf die grampositiven oder die gramnegativen Sucrose, Xylose, Mannit und dgl. sowie Stärken wie Getrei-bakteriellen Pathogene begrenzt. Selbst in Fällen, wo ein 45 dekörner, beispielsweise Hafer, Roggen, Maisstärke, Maisbreiteres Spektrum einer antibiotischen Wirksamkeit erzielt mehl und dgl., entweder allein oder in Kombination als wird, bleiben gewisse pathogene Species entweder von sich Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährme-aus unempfindlich oder weisen eine erworbene Resistenz im dium verwendet werden. Die genaue Menge der verwendeten Verlaufe der intensiven Anwendung der gegenwärtigen Anti- Quelle oder Quellen für Kohlenhydrate in dem Medium biotika bei der Behandlung verschiedener Krankheiten auf. 50 hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums Daher führten die Unzulänglichkeiten der bekannten Anti- ab, jedoch variiert im allgemeinen die Menge an Kohlenhy-biotika zu weiteren Forschungen, um andere Antibiotika zu draten zwischen etwa 1 Gew.-% umd 6 Gew.-% des Mediums, finden, die über einen weiteren Bereich an Pathogenen bzw. Diese Kohlenstoffquellen können entweder einzeln verKrankheitserregern wie gegenüber resistenten Stämmen spe- wendet werden oder können mehrere derartiger Kohlenstoff-zieller Mikroorganismen wirksam sind. 35 quellen in dem Medium kombiniert werden. Im allgemeinen Die Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz, können viele proteinhaltige Materialien als Stickstoff quellen die hier als N-Acetyl-dehydro-thienamycin bezeichnet wird bei dem Fermantationsverfahren verwendet werden. Geeig-und die im Patentanspruch 1 angegebene Formel aufweist. nete Stickstoffquellen umfassen beispielsweise Hefe-Hydro-Die Erfindung betrifft auch eine antibakterielle Zusammen- lysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamensetzung, die eine wirksame Menge von N-Acetyl-dehydro- fi0 mehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellflüssigkeit, lösliche, thienamycin und einen nichttoxischen pharmazeutisch bzw. aufschlämmbare Schlempenanteile (Distillers solubles) brauchbaren Träger enthält. oder Tomatenpaste und dgl. Die Stickstoffquellen werden

Das neue und nützliche Antibiotikum ist bei der Inhibie- entweder allein oder in Kombination in Mengen verwendet,

rung des Wachstums verschiedener gramnegativer und gram- die von etwa 0,2 Gew.-% bis 6 Gew.-% des wässrigen positiver Mikroorganismen höchst wirksam. Ein weiterer 65 Mediums betragen.

Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturme-

antibiotischen Substanz gemäss Anspruch 2 durch die Kulti- dien- eingearbeitet werden können, befinden sich die üblichen vation des Mikroorganismus Streptomyces cattleya in einem Salze, die geeignet sind zur Lieferung von Natrium, Kalium,

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Ammonium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Carbonat und ähnlichen Ionen. Umfasst werden auch Spurenmetalle wie Cobalt, Mangan, Eisen und Magnesium.

Es sei festgestellt, dass die in den Beispielen beschriebenen Medien lediglich Beispiele für die Vielzahl von verwend- 5 baren Medien sind und keine Einschränkung darstellen sollen.

Man führt die Fermentation bei Temperaturen von etwa 20°C bis 37°C durch; jedoch ist es für optimale Ergebnisse bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 10 22°C bis 30°C durchzuführen. Der pH-Wert der Nährmedien, der für das Wachstum der Streptomyces cattleya Kultur und die Produktion des Antibiotikums N-Acetyl-dehydro-thienamycin geeignet ist, kann von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.

Zwar wird das Antibiotikum N-Acetyl-dehydro-thien- 15 amycin sowohl durch Oberflächenkultur als auch durch submerge Kultur bzw. Tauchkultur erzeugt, jedoch ist es bevorzugt, die Fermentation im submergen Zustand durchzuführen.

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Fermentation des Antibiotikums in geringem Masstab führt man zweckmässig durch, durch Animpfen eines geeigneten Nährmediums mit der, das Antibiotikum produzierenden Kultur und nach Übertragen auf ein Produktionsmedium die Fermentation bei einer konstanten Temperatur von 2$ etwa 25°C in einer Schüttelvorrichtung während mehrerer Tage fortschreiten zu lassen.

Man führt die Fermentation in einem sterilisierten Kolben durch, mittels einer ein-, zwei-, drei- oder vierstufigen Animpfungsentwicklung. Das Nährmedium für die Animp- 30 fungsstufe kann aus jeglicher geeigneten Kombination von Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff bestehen. Der Animp-fungskolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur von etwa 28°C während zwei Tagen oder bis zu einem zufriedenstellenden Wachstum geschüttelt und ein Anteil des 35 resultierenden Wachstums wird zur Inokulation von entweder einer zweiten Animpfungsstufe oder des Produktionsmediums verwendet. Gegebenenfalls verwendete Zwischen-stufen-Animpfungskolben werden in im wesentlichen gleicher Weise entwickelt; d.h. ein Teil des Inhalts der letzten 40 Animpfungskolben wird zur Inokulation des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt und am Ende der Inkubationszeit wird der Inhalt der Kolben zentri-fugiert oder filtriert. 45

Für Arbeiten im grossen Masstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Behältern durchzuführen, die mit einem Rührer und Einrichtungen zur Belüftung des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Nach dieser Verfahrensweise wird das Nährmedium in dem Tank bereitet und durch Erwärmen auf Temperaturen bis zu etwa 120°C sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit einer vorher gezogenen Animpfung der Produktionskultur inokuliert und man lässt die Fermentation während eines Zeitraums von wie beispielsweise 3 bis 5 Tagen unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums fortschreiten, wobei man die Temperatur bei etwa 25°C hält. Diese Verfahrensweise zur Herstellung des Antibiotikums N-Acetyl-dehydro-thienamycin ist besonders geeignet zur Herstellung grosser Mengen des Antibiotikums.

Im folgenden werden die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Antibiotikums N-Acetyl-dehydro-thienamycin angegeben.

N-Acetyl-dehydro-thienamycin weist die empirische Formel C13H16N2O5S auf. Die berechnete elementare Zusammensetzung, die dieser Formel entspricht ist; 49,99% Kohlenstoff, 5,16% Wasserstoff, 8,97% Stickstoff, 25,61% Sauerstoff und 10,26% Schwefel.

Das Kernmagnetische-Resonanz-Spektrum (NMR-Spek-trum) des N-Acetyl-dehydro-thienamycins zeigt bei 300 MHz in D2O folgende charakteristische Signale, in denen die chemischen Verschiebungen in Teilen pro Million (ppm) bezogen auf den internen Standard Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) und die Kopplungskonstanten in Hz angegeben sind:

1,29 (d, J = 6, CHa); 2,08 (S, CH3C0);

3,10 (d,d, J = 12,5,8,7,1H von CH2C);

3.21 (d,d, J = 12,5,9,5,1H von CH2C);

3,39 (d,d, J = 6,0,2,5, He);

4.22 (m, H5 und H?);

6,07 (d, J = 13,5, HC=);

7,19(d,J= 13,5, HC=).

Wurde das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von N-Acetyl-dehydro-thienamycin beim pH-Wert 7 in wässrigen Lösungen gemessen, so zeigte es einen Peak bei 307,5 nm und ein Wellental bei 262 nm.

N-Acetyl-dehydro-thienamycin weist folgende Molekülstruktur auf

Das Antibiotikum N-Acetyl-dehydro-thienamycin ist weiter durch das folgende antibiotische Profilspektrum gekennzeichnet. Die Untersuchung wurde unter Anwendung der Bauer-Kirby-Scheibendiffusionsmethode durchgeführt, dife lediglich in bezug auf die hier verwendete Agar-Tiefe von 2 mm modifiziert war. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser in Millimeter der Inhibierungszone sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

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Tabelle 1

Organismus

0,0025

HEAU+/Scheibe

Staphylococcus aureus

2985

15,5

Staphylococcus aureus

2314

13,0

Escherichia coli

2884

13,0

Escherichia coli

2891

10,5

Enterobacter cloacae

2646

8,5

Enterobacter cloacae

2647

11,0

+ HEAU wird nachstehend als durch «Hydroxylamin-Auslöschbare Absorptionseinheiten» definiert.

N-Acetyl-dehydro-thienamycin stellt ein wertvolles Antibiotikum dar, das wirksam ist gegen verschiedene grampositive und gramnegative Bakterien und dementsprechend Anwendung in der Human- und Veterinär-Medizin findet. Die erfindungsgemässe Verbindung kann als antibakterielles 20 Mittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch grampositive oder gramnegative Bakterien hervorgerufen werden, beispielsweise zur Bekämpfung von Staphy-lococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter cloacae. Das erfin- 2s dungsgemässe antibakterielle Material kann weiter als Zusatz zu Tierfuttermitteln, zur Konservierung von Nahrurigsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Beispielsweise kann es in wässrigen Zusammensetzungen in Konzentrationen von 0,1 bis 100 Teile Antibiotikum pro Mil- 30 lion Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum schädlicher Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Ausrüstungen zu zerstören und zu inhibieren und es kann auch als Bakterizid für industrielle Anwendungszwecke verwendet werden, beispielsweise in Anstrichmitteln bzw. -färben auf Wasserbasis und im Siebwasser von Papiermühlen zur Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien.

Das erfindungsgemässe Antibiotikum kann verwendet werden in einer Vielzahl von pharmazeutischen Präparaten als einziger aktiver Bestandteil oder in Kombination entweder mit einem oder mehreren anderen Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Substanzen. Als Beispiel für die erstgenannten kann ein Aminocyclitol-Antibiotikum wie Gentamicin mit verabreicht werden, um jegliche Möglichkeit, dass resistente Organismen auftreten auf ein Minimum herabzusetzen. Als ein Beispiel für die letztgenannten können Diphenoxylat und Atropin in Dosierungsformen kombiniert werden, die zur Therapie der Gastroenteritis bestimmt sind. Das Antibiotikum kann in Form so von Kapseln oder von Tabletten, Pulvern, flüssigen Lösungen oder in Form von Suspensionen oder Elixieren verwendet werden. Es kann oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.

Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung ss können in Dosiseinheitsformen vorliegen und können übliche Excipienten enthalten, wie Bindemittel, beispielsweise Sirup, Gummiarabicum, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Poly vinylpyrrolidon; Füllstoffe, beispielsweise Lactose,

Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; «0 Gleitmittel, beispielsweise Magnesiumstearat, Talkum, Poly-äthylenglykol, Siliciumdioxid; desintegrierende Mittel, z.B. Kartoffelstärke oder verträgliche Benetzungsmittel wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können in üblicher Weise überzogen sein. Orale flüssige Präparate können in Form von ® wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups, Elixieren usw. vorliegen oder können als trockene Produkte zur Wiederaufbereitung mit Wasser oder anderen geeigneten Vehikeln vor der Anwendung dargeboten werden. Derartige flüssige Präparate können übliche Zusätze enthalten, wie Suspendiermittel, beispielsweise Sorbit-Sirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxy-5 äthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstea-ratgel oder hydrierte essbare Fette; Emulgiermittel, beispielsweise Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummiarabikum; nichtwässrige Vehikel, die einschlissen können, essbare Öle, beispielsweise Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige 10 Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol; Konserviermittel, beispielsweise Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure. Suppositorien enthalten zweckmässig Supposi-torien-Grundlagen, z.B. Kakaobutter oder andere Glyceride. Zusammensetzungen zur Injektion können in Dosisein-ls heitsform in Ampullen vorliegen oder in Multidosis-Behäl-tern, bei Zusatz eines Konservierungsmittels. Die Zusammensetzungen können Formen annehmen wie Supensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln bzw. Medien und können Formulierungsmittel enthalten wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulverform vorliegen zur Wiederaufbereitung in einem geeigneten Medium, z.B. sterilem, pyrogen-freiem Wasser, vor der Anwendung.

Die Zusammensetzungen können auch in geeigneten Formen zur Absorption durch die mucösen Membranen der Nase, des Rachens oder der Bronchialgewebe hergestellt werden und können zweckmässig die Form von pulverför-migen oder flüssigen Sprays oder Inhalaten, Pastillen, Rachenpinselungen usw. einnehmen. Zur Medikation der Augen oder Ohren können die Präparate als Einzelkapseln in flüssiger oder halbflüssiger Form vorliegen oder können sie als Tropfen usw. verwendet werden. Für die topische Anwendung kann in hydrophoben oder hydrophilen Grundlagen formuliert werden, wie Salben, Cremes, Lotionen, Pinselungen, Pulver usw.

Zusätzlich zu einem Träger können die vorliegenden Zusammensetzungen auch andere Bestandteile enthalten, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxidantien, Konserviermittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, Viskositätsmittel oder Aromamittel und dgl.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Küken, Kühen, Schafen, Schweinen und dgl. können die Zusammensetzung beispielsweise als intramammare Präparat formuliert werden, entweder in langwirksamen oder schnell freisetzenden Grundlagen.

Die zu verabreichende Dosis hängt bis zu einem grossen Ausmass von den Bedingungen des zu behandelnden Patienten, dem Gewicht des Patienten und der Art der Infektion, dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung ab, wobei der parenterale Weg für allgemeine Infektionen und der orale Weg für intestinale Infektionen bevorzugt sind.

Von der Erfindung umfasst werden die nichttoxischen pharmazeutisch brauchbaren bzw. verträglichen Salze von N-Acetyl-dehydro-thienamycin, beispielsweise die pharmazeutisch verträglichen Salze, die mit anorganischen oder organischen Basen gebildet werden; einschliesslich beispielsweise Metallsalze, die sich ableiten von Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxiden, -carbonaten oder -bicarbonaten, wie die sich von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium herleitenden, sowie die Salze, die von primären, sekundären 'oder teritären Aminen stammen, wie Monoallcylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, niedrig-Alkanolaminen, Di-niedrig-Alkanolaminen, niedrig-Alkylendiaminen, N,N-Diaralkyl-niedrig-alkylendiaminen, Aralkylaminen, aminosubstituierten niedrig-Alkanolsn, N,N-Di-niedrig-Alkylamino-substituierten-niedrig-Alkanolen, Aminopolya-mino- und Guanidino-substituierten niedrig-Alkansäuren und Stickstoff enthaltenden heterocyclischen Aminen.

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Bei der Behandlung von Bakterieninfektionen beim Menschen wird die erfindungsgemässe Verbindung oral oder parenteral nach üblichen Verfahrensweisen für die Verabreichung von Antibiotika in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag und vorzugsweise etwa 2 bis 50 mg/kg/Tag in vorzugsweise aufgeteilten Dosierungen, z.B. während drei oder vier Malen am Tag verabreicht. Sie können in Dosiseinheitsformen verabreicht werden, die beispielsweise 25,250, 500 oder 1000 mg aktiven Bestandteil enthalten, zusammen mit geeigneten physiologisch brauchbaren Trägern oder Excipienten. Die Dosiseinheiten liegen in Form von flüssigen Präparaten vor, wie Lösungen oder Suspensionen oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln. Es versteht sich, dass die optimale Dosis in jedem Einzelfall von der Art und der Stärke der zu behandelnden Infektion abhängt und dass für pädiatrische Zwecke geringere Dosierungen angewendet werden, wobei derartige Änderungen sich im Bereich des fachmännischen Könnens bewegen.

Die Antibiotika enthaltenden Fermentationsbrühen, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden, weisen geschätzte Aktivitäten im Bereich von etwa 0,1 bis 2 jig pro ml auf. Antibiotische Präparate können gereinigt werden und das Antibiotikum kann gemäss verschiedenen Verfahrensweisen gewonnen werden.

Eine derartige Verfahrensweise besteht darin, die angesäuerten (z.B. HCl, H2SO4, Essigsäure) Fermentationsbrühen mit Äthylacetat, Isobutylketon, Amylacetat oder ähnlichen Lösungsmitteln zu extrahieren und die isolierte Lösungsmittelphase in eine wässrige Lösung rückzuextrahieren, die bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 gehalten wird.

Die weitere Reinigung kann dadurch erzielt werden, dass man einen derartigen Extrakt durch eine Säule mit Silicium-dioxidgelteilchen leitet, die eine gebundene Kohlenwasserstoffoberfläche, vorzugsweise Cis tragen. Wird eine weitere Reinigung gewünscht, so kann das Eluat durch eine Säule geleitet werden, die mit einem Polystyrol, nichtpolaren, hydrophoben, quervernetzten Divinylbenzol-Polymeren, wie XAD-1,2 und 4, vorzugsweise XAD 2 (Handelsprodukt der Rohm & Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsyl-vanien) gefüllt ist.

Eine Verfahrensweise zur Erzielung einer weiteren Reinigung besteht darin, das vorstehende Eluat in 50% Methanol durch eine Säule zu leiten, die ein stark basisches Anionen-austauscher-Harz enthält. Beispiele für derartige Harze sind Harze mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix, beispielsweise das Polystyrol-nukleare quaternäre Ammonium-Harz Dowex 1 x 4 (Handelsprodukt der Dow Chemical Co., Midland, Michigan), in der Chlorid-Form. Andere Beispiele für diese Klasse starkbasischer Ionenaustauscher-Harze umfassen: Duolite A-40, A-42, A-101, A-102 und A-l 14 (Handelsprodukte der Chemical Process Co., Redwood City, Kalifornien); Amberlite IRA-400, IRA-401 und IRA-410 (Handelsprodukte der Rohm & Haas, Washington Square, Philadelphias, Pennsylvanien).

Das in dem Eluat enthaltene Antibiotikum kann weiter gereinigt werden, durch Gelfiltration, durch ein Polyacryla-midgel mit einer Porengrösse, die Moleküle ausschliesst, die ein Molekulargewicht über 1800 aufweisen. Ein bevorzugtes Gel ist das Bio-Gel P-2 (Handelsprodukt der Bio Red, Richmond, Kalifornien).

Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung von reinem N-Acetyl-dehydro-thienamycin besteht darin, es aus angesäuerter Brühe zu extrahieren unter Anwendung von Äthylacetat, die abgetrennte Lösungsmittelphase rückzuextrahieren mit einer neutralen wässrigen Lösung und das wässrige Rück-extraktionsmittel durch eine Säule mit Siliciumdioxidgel-teilchen, die eine gebundene Cis-Oberfläche tragen, zu leiten. Das gewonnene Eluat kann weiter durch Chromatographie in 50% Methanol an Anionenaustauscher-Harzen des Poly-styrol-Trimethylammonium-Typs (z.B. Dowex 1 x 4 Cl bis etwa 0,037 mm - 400 mesh) und Gelpermeations-Harzen (z.B. Bio Gel P-2, etwa 0,074 bis etwa 0,037 mm,

200-400 mesh) gereinigt werden.

Die Untersuchung der biologischen Aktivität führt man nach der folgenden Scheibendiffusionsmethode durch unter Anwendung von entweder Staphylococcus aureus ATCC 6538P oder Vibro percolans ATCC 8461 als Testorganismus.

Ein Übernacht-Wachstum bei 37°C von Staphylococcus aureus ATCC 6538P in einer Nährbrühe plus 0,2% Hefeextrakt (NBYE) verdünnt man mit NBYE auf eine Suspension mit einer 40%igen Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 nm. Ein Anteil von 33,2 ml dieser verdünnten Suspension wird zu einem Liter NBYE gefügt, der 15 g Agar enthält und bei 47-48°C gehalten wird. 10 ml Anteile dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen und diese Platten werden gekühlt und bis zur Anwendung (maximal 5 Tage) bei 4°C gehalten.

Ein Übernacht-Wachstum bei 28°C von Vibrio percolans ATCC 8461 in einer Nährbrühe plus 0,2% Hefeextrakt (NBYE) verdünnt man mit NBYE auf eine Suspension mit einer 50%igen Durchlässigkeit bei 660 nm. Ein Anteil von 33,2 ml dieser verdünnten Kultur wird zu 11 NBYE gefügt, der 15 g Agar enthält und bei 46°C gehalten wird. 5 ml Anteile dieser Suspension giesst man in Petrischalen von 85 mm Durchmesser und diese Platten werden gekühlt und bei 4°C bis zur Anwendung (maximal 5 Tage) gehalten.

Proben des zu untersuchenden Antibiotikums werden auf eine geeignete Konzentration verdünnt und in Scheiben von 6,25 mm (1/4 inch) oder 12,5 mm (1/2 inch) aufgebracht, wobei 25 Lil auf eine 6,25 mm (1/4 inch) Scheibe und 100 |xl auf eine 12,5 mm (1/2 inch) Scheibe angewendet werden. Die Scheiben werden auf die Oberfläche der Untersuchungsplatte aufgelegt. Staphylococcus aureus-Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert; Vibrio percolans-Platten werden über Nacht bei 28°C inkubiert. Die Inhibierungszone wird als mm-Durchmesser gemessen und bestimmt den Antibiotika-Gehalt.

Mit Hydroxylamin auslöschbare Absorptions-Einheiten (HEAU):

Der Anteil der Absorption der nahe oder am UV-Absorp-tionsmaximum gemessen wird, der dem Antibiotika-Gehalt der Proben zugeordnet werden kann, wird durch die selektive Extinktion dieser Absorption (bei gleichzeitiger Inaktivie-rung der Aktivität des Antibiotikums) nach Reaktion mit verdünntem Hydroxylamin gemessen.

Frisch bereitetes, neutralisiertes Hydroxylamin (NH2OH.HCI plus NaOH auf einen endgültigen pH-Wert von 7) wird zu nichtgepufferten Proben des zu untersuchenden Antibiotikums gefügt; im Falle von gutgepufferten Lösungen mit neutralem pH-Wert wird nichtneutralisiertes NH2OH.HCI verwendet. Hydroxylamin wird auf eine Endkonzentration von 10 mMol zugesetzt und man lässt die Reaktion während mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur fortschreiten. Die resultierende Absorption in der umgesetzten Probe ergibt bei Subtraktion von der einer nicht umgesetzten Probe (nach Korrektur für die Verdünnung durch das zugesetzte Reagenz) die durch Hydroxylamin auslöschbare Absorption. Eine HEAU an Antibiotikum, vorhanden in 1 ml weist eine durch Hydroxylamin auslöschbare Absorption von 1,0 auf.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Verfahrensweisen, durch die die erfindungsgemässen Produkte erhalten werden können. Diese Beispiele dienen lediglich zur Veranschaulichung und sollen die Erfindung nicht beschränken.

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Beispiel 1

Ein Röhrchen einer lyophilisierten Kultur von Streptomyces cattleya MA-4297 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben mit Prallwänden suspendiert, der 50 ml des sterilen Mediums A der folgenden s Zusammensetzung enthält:

Medium A

Hefeautolysat

Glucose

Phosphatpuffer+

MgS04.7H20

CaCCb ++

destilliertes Wasser ph-Wert eingestellt mit NaOH auf 6,5

+Phosphatpufferlösung KH2PO4 Na2HP04 destilliertes Wasser

++ zugesetzt nach Einstellung des pH-Wertes

10,0 g 10,0 g 10 2,0 ml 0,05 g 2,0 g 1000 ml

15

91,0 g 95,0 g 1000 ml 20

Der inokulierte Kolben wird 30 Stunden bei 28°C mit 220 Upm geschüttelt (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite). 40 ml der vorstehenden 30-stündigen Brühe werden aseptisch entfernt und mit 40 ml sterilem Glycerin (20% Vol/Vol) vermischt. Mengen von 2 ml des Glycerin-Gemischs werden in sterile Fläschchen zum Einmal-Gebrauch pipettiert, die anschliessend gefroren und in der Dampfphase eines Gefriergerätes mit flüssigem Stickstoff gelagert werden.

Der Inhalt eines gefrorenen Fläschchens wird zur An-impfung eines 250 ml-Erlenmeyer-Kolbens mit Prallwänden verwendet, der 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthält:

25

30

35

Medium B

Hefeautolysat

Glucose

Phosphatpuffer+

MgS0z.7H20 destilliertes H2O

pH-Wert mit NaOH eingestellt auf 6,5

+ Phosphatpufferlösung: KH2PO4 Na2HP04 destilliertes H2O

10,0 g 10,0 g 2,0 ml 40 0,05 g 1000 ml

45

91,0 g 95,0 g 1000 ml

50

Dieser Animpfungskolben wird während 48 Stunden bei 28°C mit 220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. Aliquote Teile von 0,8 ml dieses Animpfungskolbens werden zur Inokulierung von 6 mit Prallwänden versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 40 ml Medium B ss der gleichen Zusammensetzung wie das vorstehende Medium B enthalten. Diese 6 mit Prallwänden versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben werden 24 Stunden bei 28°C mit 220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. 40 ml steriles Glycerin (20% Vol/Vol) werden in jeden Kolben gefügt. «0 Aliquote Teile von 2,5 ml der resultierenden Gemische werden in sterile Einwegfläschchen pipettiert, die zur Identifizierung beschriftet werden und bei — 87°C gelagert werden.

Eines der vorstehenden gefrorenen, beschriebenen-Fläschchen wird bei 37°C aufgetaut und 1 ml des Inhalts wird ® zur Inokulierung eines mit Prallwänden versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 40 ml Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium C ■

Saccharose (Sucrose) 30,0 g lösliche und suspendierbare Schlempenanteile

(Distillers Solubles) 15,0g

Hefeextrakt 5,0 g destilliertes H2O 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

Dieser Animpfungskolben wird 48 Stunden bei 28°C mit 220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. 1 ml Anteile aus diesem Animpfungskolben werden zur Animp-fung von 4 mit Prallwänden versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 40 ml der vorstehenden Medium-C-Zusammensetzung enthalten. Diese 4 Animpfungskolben der zweiten Stufe werden 24 Stunden bei 48°C mit 220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt.

8 ml Anteile dieser Animpfungskolben der zweiten Stufe werden verwendet zur Animpfung von 12 2-1-Erlenmeyer-Kolben, die 160 ml Medium D der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium D

Glycerin 1^,0 g

Maisquellflüssigkeit 15,0g

Geflügelmehl 10,0g lösliche und suspendierbare Schlempenanteile

(Distillers Solubles) , 15,0 g

C0CI2-6H2O ' 0,01g

CaCOs 3,0 g

Polyglykol 2000 0,25% Vol destilliertes H2O 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,5 eingestellt

Diese Produktionskolben werden 5 Tage lang bei 25°C mit 150 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt.

1 ml Anteile des Mediums C der Animpfungskolben der zweiten Stufe werden zur Animpfung von 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit Prallwänden verwendet, die 40 ml des vorstehend beschriebenen Mediums C enthalten. Diese Animpfungskolben der dritten Stufe werden 24 Stunden bei 28°C mit 220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) verwendet.

8 ml Anteile dieser dritten Animpfungskolben werden zur Animpfung von 7 2-1-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 160 ml des vorstehend beschriebenen Mediums D enthalten. Diese Produktionskolben werden 4 Tage bei 25°C mit 150 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) verwendet.

Die Brühen von 8 Kolben einer 5tägigen Fermentation werden vereint und der pH-Wert beträgt 6,75. Die vereinten Brühen werden auf 5-10°C gekühlt und 15 Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit Hilfe von Super-Cel filtriert und das Filtrat wird bei 0°C gehalten.

Die Brühen von 6 Kolben der 4tägigen Fermentation werden vereint und der pH-Wert beträgt 6,35. Diese vereinten Brühen werden auf 5-10°C gekühlt und 15 Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit Super-Cel filtriert. 780 ml der filtrierten 4tägigen Fermentationsbrühe werden mit 966 ml der filtrierten 5tägigen Fermentationsbrühe vereint. Das vereinte Filtrat wird in 7 Teile von 250 ml aufgeteilt und jeder Teil wird mit 2,5 n-HCl auf den pH-Wert 5 gebracht und bei 5°C mit 250 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphase wird abgetrennt und mit 6,65 ml0,Im-MES [2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure] rückextrahiert, der pH-Wert 7 wird mit einer ausreichenden Menge mit 2,5n-NaOH ergänzt, um den pH-Wert des wässrigen Rückextrakts auf 6,8-7,2 zu bringen. Der wässrige Rückextrakt wird abgetrennt und verbleibende

7

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Spuren von Äthylacetat werden entfernt durch Leiten eines Stickstoffstromes über die Oberfläche.

Die vereinten Rückextrakte weisen ein Gesamtvolumen von 42,5 ml, einen pH-Wert von 7,03 auf und enthalten 12,75 HEAU, gemessen bei 307 nm. s

Die vereinten Rückextrakte werden durch Rotationsver-dampfen auf 7,65 ml konzentriert. Ein Anteil von 0,1 ml wird zur Untersuchung entfernt und der Rest wird auf ein flüssiges Chromatographie-System aufgebracht, das wie folgt hergestellt wurde: io

2 Säulen aus rostfreiem Stahl von 2,54 x 91,44 cm (1 inch x 36 inch), gefüllt mit Bondapak Cis/Porasil B®, mit einem Teilchengrössenbereich von 37-75 |im (Mikron)

werden in Reihe über ein 0,076 cm (0,03-inch)-Rohr aus rostfreiem Stahl von 15,24 cm (6 inch) Länge gekoppelt. Die 15 Säulen werden in einen Wassermantel eingesetzt und auf 40°C erwärmtes Wasser wird kontinuierlich durch den Mantel zirkuliert. Die Säule wird vor der Anwendung mit 0,01 m-Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 5,6: Acetoni-tril, 95:5(Vol/Vol) equilibriert. Die Probe wird unter Anwen- 20 dung eines Altex Scientific, Inc. Model 202-00-Rotationsein-spritzventils, ausgerüstet mit einer 10 ml-Schleife eines Teflon-Schlauches aufgetragen.

Die Säule wird mit dem vorstehenden Puffer mit einer Geschwindigkeit von 8 ml pro 3 Minuten entwickelt und bei 25 307 nm überwacht unter Anwendung eines Ultraviolett-Absorptions-Monitors, ausgerüstet mit einer Fliesszelle von 1 cm Fliessweg (Laboratory Data Control Constametric II ®). Man sammelt Fraktionen von 8 ml und fügt einen Anteil von 20 jil von 0,11T1K2PO4 zu jeder Fraktion. Die Fraktionen 30 werden auf 0°C gekühlt und auf ihre biologische Aktivität an Untersuchungsplatten mit Staphylococcus aureus bewertet.

Die Aktivität des N-Acetyl-dehydro-thienamycins tritt bei 624 ml bis 688 ml Eluat auf. Diese Fraktionen werden vereint, mit 2,5 n-NaOH auf den pH-Wert 6,85 eingestellt und es 3s zeigt sich, dass sie bei 307 nm 9,2 HEAU enthalten. Die vereinten Fraktionen werden durch Rotationsverdampfen auf 1 ml konzentriert, den man auf eine Säule von 1,3 x 8 cm mit vorgewaschenem XAD-2 aufträgt. Das XAD-2 ist säulenweise nacheinander vorgewaschen mit 4 Säulenvolumina 40 von: 1) 0,001m EDTA; 2) ln-NaOH; 3) entionisiertem H2O; 4) ln-HCl; 5) entionisiertem H2O; 6) Methanol; 7) Aceton; und 8) entionisiertem Wasser. Nach Auftrag der Proben werden 1 ml destilliertes Wasser aufgetragen, bevor die Säule mit destilliertem Wasser entwickelt wird. Die Fraktionen 1-5 45 enthalten 5,56 ml; die restlichen Fraktionen 1 ml, gesammelt bei etwa 1 ml/Minute. Die Fraktionen werden auf die biologische Wirksamkeit auf Vibrio percolans-Untersuchungs-platten untersucht. Der Hauptanteil des N-Acetyl-dehydro-thienamycins befindet sich in den Fraktionen 9-30. Diese so Fraktionen enthalten 2,57 HEAU, gemessen bei 307 nm.

Beispiel 2

Ein gemäss Beispiel 1 hergestelltes, gefrorenes MA-4297- ss Fläschchen, das markiert ist, um anzuzeigen, dass es Streptomyces cattleya enthält, wird bei 37°C aufgetaut und 1 ml des Inhalts wird zur Animpfung eines mit Trennwänden versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 40 ml Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium C

Saccharose (Sucrose) 30,0 g lösliche und suspendierbare Schlempenanteile

(Distillers Solubles) 15,0g®

Hefeextrakt 5,0 g destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

Dieser Animpfungskolben wird 48 Stunden bei 28°C mit 220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. 1 ml Anteile aus diesem Animpfungskolben werden zur Animpfung von 5 mit Prallwänden versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 40 ml des vorstehend beschriebenen Mediums C enthalten. Diese Animpfungskolben werden 24 Stunden bei 28°C mit 22 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwing-weite) geschüttelt. 8 ml Anteile dieser 24stündigen Impfkolben werden zur Animpfung von 16 2-1-Erlenmeyer-Kolben verwendet die 160 ml Medium D der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium D

Glycerin 15,0g

Maisquellflüssigkeit 15,0g

Geflügelmehl 10,0g lösliche und suspendierbare Schlempenanteile

(Distillers Solubles) 15,0g

CoCl2-6H20 0,01g

CaCOs 3,0 g

Polyglykol 2000 0,25% Vol destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,5 eingestellt

Diese Produktionskolben werden 5 Tage bei 25°C und 150 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) inkubiert.

Die Brühen aus den 16 Produktionskolben werden vereint, auf 5-10°C gekühlt und 15 Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und mit Hilfe von Super-Cel filtriert. Die filtrierte Brühe wird in 250 ml Anteile aufgeteilt, von denen jeder mit 2,5nHCl auf den pH-Wert 2,5 eingestellt wird und bei 5°C mit zwei aufeinanderfolgenden 250 ml Anteilen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphase wird mit 6,65 ml 0,1 m-MES rückextrahiert, pH 7 plus ausreichend 2,5 n-NaOH (etwa 0,3 ml) um den pH-Wert des wässrigen Rückextrakts auf 6,8-7,2 zu bringen. Die wässrigen Rückextrakte von der ersten Extraktion jedes Brühenanteils mit Äthylacetat werden als «erste Extrakte» markiert; die der zweiten Lösungsmittelextraktion werden als «zweite Extrakte» bezeichnet. Restliches Äthylacetat in den Extrakten wird entfernt durch Leiten eines Stickstoffstromes über die Flüssigkeitsoberfläche. Die «ersten Extrakte» werden vereint, wobei man ein Volumen von 67 ml, einen pH-Wert von 7,05 und insgesamt 45,6 HEAU, gemessen bei 307 nm enthält. Die «zweiten Extrakte» werden vereint, wobei man ein Volumen von 62 ml, einen pH-Wert von 7,05 und insgesamt 23,6 HEAU, gemessen bei 307 nm erhält.

Die vereinten «ersten Extrakte» werden durch Rotationsverdampfung auf 7 ml konzentriert. Ein Anteil von 50 jxl wird zur Untersuchung entnommen und die restlichen 6,95 ml werden auf das flüssigkeitschromatographische Bondpak Cis/Porasil BR System aufgebracht, das in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Säule wird vor der Anwendung mit 0,01 m-Kaliumphosphatpuffer, pH 5,6 : Acetonitril, 95:5 (Vol/Vol) equilibriert und die Säule wird mit dem gleichen Puffer entwickelt.

Man gewinnt alle 3 Minuten Fraktionen von 10,5 ml, bis 640 ml Eluat gewonnen sind, wonach 5,25 ml Fraktionen alle 1,5 Minuten gesammelt werden. Ein Anteil von 20 ul 0, lm-K2HPO4 wird jeder Fraktion zugesetzt und die Fraktionen werden auf 0°C gekühlt und auf die biologische Aktivität an Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatten untersucht. Der Hauptanteil an N-Acetyl-dehydro-thienamycin ist in dem Elutionsvolumen 597-655 ml enthalten. Diese Fraktionen werden vereint, mit 2,5 n-NaOH auf den pH-Wert 7 gebracht und bei 0°C gehalten.

Die vereinten «zweiten Extrakte» wurden durch Rota-

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tionsverdampfen auf 6,3 ml konzentriert. Man entnimmt zur Untersuchung einen Anteil von 50 jxl und die restlichen 6,25 ml werden auf das flüssigkeits-chromatographische Bondpak Cis/Porasil BR System aufgebracht, das in Beispiel 1 beschrieben wurde. Vor der Anwendung wird die Säule mit 0,01 m-Kaliumphosphatpuffer, pH 5,6: Acetonitril, 95:5 (Vol/Vol) equilibriert und die Säule wird mit dem gleichen Puffer entwickelt.

Man entnimmt Fraktionen von etwa 9 ml alle 3 Minuten. Ein Anteil von 20 (il0,1 m-K2HPC>4 wird jeder Fraktion zugesetzt und die Fraktionen werden auf 0°C gekühlt und auf die biologische Aktivität an Staphylococcus aureus-Untersu-chungsplatten bewertet. Die aktiven Fraktionen, die eine N-Acetyl-dehydro-thienamycin-Aktivität zeigen, werden vereint und mit NaOH auf den pH-Wert 7 gebracht. Diese vereinten Fraktionen enthalten 3,74 HEAU, gemessen bei 307 nm.

Die vereinten Fraktionen werden durch Rotationsver-dampfen auf 0,5 ml konzentriert. 0,5 ml Methanol werden zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert, um eine gebildete Ausfällung abzutrennen. Die Ausfällung bildet eine untere Phase von 0,05-0,1 ml. Die obere Phase wird entfernt und auf eine Altex-Säule von 25 x 100 mm, gefüllt mit Bio-Gel P-2, bis 0,037 mm (-400 mesh) in 50% Methanol auf ein endgültiges Füllvolumen von 25 x 75 mm aufgebracht. Die Probe wird aufgebracht unter Anwendung eines Rotationsinjektionsventils (Altex Model 202-00) ausgerüstet mit einer 3 ml-Schleife eines Teflon-Rohres. Die Säule wird mit 50% Methanol in einer Geschwindigkeit von 3,3 ml/Minute entwickelt und Fraktionen von etwa 0,55 ml werden gewonnen. Die Fraktionen werden auf 0°C gekühlt und auf die biologische Aktivität an Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatten bewertet. Man findet eine N-Acetyl-dehydro-thienamycin Aktivität zwischen 65 ml und 100 ml Eluat. Die Fraktionen zwischen 65 ml Eluat und 67 ml Eluat werden mit den Fraktionen zwischen 90 ml Eluat und 100 ml Eluat vereint und durch Rotationsver-dampfen auf 3,4 ml konzentriert. Diese Fraktionen enthalten 0,4 HEAU bei 307 nm. Bio-Gel-Fraktionen von 67 ml Eluat bis 90 ml Eluat werden vereint und durch Rotationsver-dampfen auf 11,5 ml konzentriert. Diese Fraktionen enthalten 1,4 HEAU, gemessen bei 307 nm.

Die beiden Bio-Gel P-2-Fraktions-Kombinationen werden vereint und zu den kombinierten Fraktionen von N-Acetyl-thienamycin aus der Bondpak Cis/Porasil B ^Chromatographie der «ersten Extrakte» gefügt. Diese Lösung enthält 7,89 HEAU, gemessen bei 307 nm und weist ein Volumen von 68 ml auf. 68 ml Methanol werden zugesetzt und das resultierende Gemisch wird auf eine präparierte Dowex 1x4 Cl~, bis 0,037 mm (-400 mesh) von 1,55 cmx21 cm aufgebracht. Die Kolonne wird vor der Anwendung wie folgt präpariert: Das Harz wird durch Abdekantieren von Wasser abgegrenzt, in die Säule in 50% Methanol gefüllt und anschliessend mit 7-8 Säulenvolumina an 0,5 m-NaCl in 50% Methanol, gefolgt von 7-8 Säulenvolumina 50% Methanol gewaschen. Die vorstehende 50% Methanol-Lösung von N-Acetyl-dehydro-thienamycin wird auf die Säule in einer Geschwindigkeit von 1 ml/Minute aufgebracht, gefolgt von 2-3 ml 50% Methanol. Die Säule wird in einer Geschwindigkeit von 1 ml/Minute mit 0,09 m-NaCl plus 0,005 niNHiCl plus 0,0003 m-NH-tOH in 50% Methanol: pH = 7,5; entwickelt. Fraktionen von etwa 5 ml werden gewonnen und auf die biologische Aktivität an Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatten bewertet. Das N-Acetyl-dehydro-thienamycin findet sich in dem Elutions-volumen von 505-607 ml. Die Elutionsvolumina von 519-579 ml werden vereint und sie enthalten 4,4 HEAU, gemessen bei 307 nm. Diese Fraktionen werden durch Rota-tionsverdampfen auf 0,6 ml konzentriert. Ein Volumen von

0,6 ml Methanol wird zugefügt und das Gemisch wird 2 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wird von dem Salzpellet entfernt. Das Salzpellet wird mit 0,2 ml 50% Methanol gewaschen und das Gemisch 2 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Diese überstehende Flüssigkeit wird zu der ersten überstehenden Flüssigkeit gefügt. Diese Lösung, die gemessen bei 307 nm, 3,2 HEAU enthält, wird auf eine 1,65 x 37 cm-Säule von Bio-Gel P-2, etwa 0,074 bis etwa 0,037 mm (200-400 mesh) aufgetragen, die vorher unter Anwendung von 5 ml gesättigter NaCl in 50% Methanol, gefolgt von 2-3 Säulenvolumina 50% Methanol gewaschen worden war. Auf die Probe folgen 2-3 ml 50% Methanol. Die Säule wird mit 50% Methanol entwickelt und Fraktionen von 1,2 ml werden jede Minute entnommen. Die Fraktionen werden auf die Ultra-violett-Absorption bei 300 nm überwacht und man beobachtet einen Peak bei den Fraktionen 26-41. Die Fraktionen 28-37, mit einem Verhältnis von 307 nm/262 nm, das grösser als 1 ist, werden vereint und 10 ul Im-Kaliumphosphatpuffer, pH 7, werden zugesetzt. Diese vereinten Fraktionen werden durch Rotationsverdampfen auf etwa 1 ml konzentriert und anschliessend lyophilisiert und enthalten einen geschätzten HEAU-Wert von 2,28, gemessen bei 307 nm!

Beispiel 3

Ein Röhrchen einer lyophiliserten Kultur eines Isolats von Streptomyces cattleya MA-4297 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem mit Prallwänden versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben suspendiert, der 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium B

Hefeautolysat 10,0 g

Glucose 10,0g

Phosphatpuffer+ 2,0 ml

MgSo4.7H20 0,05 g destilliertes H2O 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt

+ Phosphatpuffer-Lösung

KH2PO4 91,0g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Der inokulierte Kolben wird 48 Stunden bei 28°C mit 150 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. 10 ml Anteile, dieses angeimpften Kolbens werden zur Animpfung von 3 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit Prallwänden verwendet, die 500 ml Medium B der gleichen Zusammensetzung wie das vorstehende Medium B enthalten. Diese Kolben werden 24 Stunden bei 28 °C mit 150 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwing-weite) geschüttelt. Das Wachstum dieser 2 1-Animpfungskolben wird zur Animpfung eines 756-1-Fermentiergefässes aus rostfreiem Stahl verwendet, das 4671 Medium E der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium E

Glycerin 10,0 g

Pharmamedia 5,0 g lösliche und suspendierbare Schlempenanteile

(Distillers Solubles) 10,0g

C0CI2.6H2O 0,01 g

CaCOs 3,0 g

Polyglykol 2000 0,25% Vol

Leitungswasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

Dieser Fermentiertank aus rostfreiem Stahl wird bei 28°C betrieben unter Anwendung einer Rotationsgeschwindigkeit von 130 Upm und eines Luftstromes von 0,28 m3 (10 cubic

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feet) pro Minute. Nach 48 Stunden, werden 4541 dieses ~ Dieser Tank wird bei 25°C betrieben unter Anwendung

Mediums verwendet zur Animpfung eines 5670-1-Fermentier- einer Rotationsgeschwindigkeit von 70 Upm und eines Luft-gefässes aus rostfreiem Stahl, das 40821 Medium F der fol- stromes von 1,54 m3 (54,3 cubic feet) pro Minute. Nach 100 genden Zusammensetzung enthält: Stunden wird ein Anteil von 100 ml entnommen, auf 5-10°C

5 gekühlt und 15 Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert. Die Medium F überstehende Flüssigkeit wird mit Hilfe von Super-Cel fil-

Maisquellflüssigkeit 15,0g triert. Ein Anteil von 25 ml des Filtrats wird mit 5 n-HCl auf

Glycerin 10,0 g den pH-Wert 2,2-2,4 eingestellt und bei 5°C mit 25 ml Äthyl-

Pharmamedia 5,0 g acetat extrahiert. Die Äthylacetatphase wird abgetrennt und lösliche und suspendierbare Schlempenanteile (Distillers io mit 2,5 ml 0,075 m-Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 Solubles) 10,0 g extrahiert. Die wässrige Phase, die 925As enthält, wird abge-

C0CI2.6H2O 0,01 g trennt und restliche Spuren Äthylacetat werden durch Leiten

CaCCh 3,0 g eines Stickstoffstroms über die Flüssigkeitsoberfläche ent-

Polyglykol 2000 0,25% Vol fernt. Eine 1,27-cm-Scheibe, die 100 ja.1 Rückextrakte enthält,

Leitungswasser 1000 ml 15 ergibt auf einer Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatte pH mit NaOH auf 7,3 eingestellt eine Zone von 24,3 mm.

B

Claims (4)

1. 640237

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. N-Acetyl-dehydro-thienamycin der Formel oder seine pharmazeutisch brauchbaren Salze. wässrigen Nähermedium, das assimilierbare Quellen für
2. 2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums N- Acetyl- Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter dehydro-thienamycin gemäss Anspruch 1, dadurch gekenn- 15 submergen aeroben Bedingungen.

   zeichnet, dass man Streptomyces cattleya in einem wässrigen Auf der Basis ausgedehnter taxonomischer Untersu-

   Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, chungen wurde aus einer Erdprobe isolierter Streptomyces

   Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submergen cattleya in der Kultursammlung der Merck & Co. Inc.,

   aeroben Bedingungen kultiviert und das Antibiotikum Rahway, New Jersey mit der Nummer MA-4297 bezeichnet,

   gewinnt. 20 Eine Probe hiervon wurde permanent in der Kultursamm-
3. 3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekenn- hing der Northern Regional Research Laboratories, North-zeichnet, dass man den Organismus Streptomyces cattleya ern Utilization Research and Development Division, Agri-NRRL 8057 kultiviert. cultural Research Service, U.S. Department of Agriculture,
4. 4. Antibakterielle Zusammensetzung, enthaltend eine Peoria, Illinois, hinterlegt und mit der Nummer NRRL 8057 wirksame Menge von N-Acetyl-dehydro-thienamycin der 25 bezeichnet.

   Formel nach Anspruch 1 und einen nichttoxischen pharma- Es ist bekannt, dass Streptomyces cattleya (NRRL 8057)

   zeutisch brauchbaren Träger dafür. das Antibiotikum Thienamycin produziert. Die Erzeugung,

   Isolierung und die Charakteristikades Antibiotikums Thien-

   amycin, sowie die morphologischen und Kulturcharakteri-

   30 stika von Streptomyces catteya sind in der US-PS 3 950 357 beschrieben.