DK145381B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotisk stof,kaldet n-acetyldehydrothienamycin,eller farmaceutisk acceptable salte deraf - Google Patents

Description

i 145381

Opdagelsen af penicillinets bemærkelsesværdige antibiotiske egenskaber stimulerede interessen inden for dette område, hvilket resulterede i fundet af en hel række værdifulde antibiotiske forbindelser som f.eks.: streptomycin, bacitracin, chlortetracyclin, oxytetracyclin og lignende. Sædvanligvis er sådanne, antibiotikas aktivitet begrænset til enten gram-positive eller gram-negative pathogene bakterier.

Selv i de tilfælde hvor et bredere antibiotisk virkningsspektrum er opnået, forbliver visse pathogene arter enten reelt ufølsomme eller har opnået resistens i løbet af den intensitive brug af de eksisterende antibiotika ved behandling af forskellige sygdomme.

Disse uheldige egenskaber ved kendte antibiotika har derfor stimuleret yderligere undersøgelser for at finde andre antibiotika, der vil være aktive over for et bredere område af pathogene såvel som over for resistente stammer af særlige mikroorganismer.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibiotisk stof kaldet N-acetyldehydrothien-amycin med den i krav 1 angivne formel og 5R,6S,8R-kon£igura-tion, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Det fremstillede antibiotikum er højeffektivt til at hæmme væksten af forskellige gram-negative og gram-positive mikroorganismer.

Det omhandlede antibiotiske stof fremstilles ifølge en fore-trukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved dyrkning af Streptomyces cattleya NRRL 8057.

En kultur af Streptomyces cattleya er placeret permanent i kultursamlingen i Northern Regional Research Laboratories,

Northern Utilization Research and Development Division, A-gricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 145381 2

Peoria, Illinois, og er blevet givet registreringsnummeret NRRL nr. 8057.

Streptomyces cattleya (NRRL 8057) vides at producere det antibiotiske stof thienamycin. Fremstillingen, isoleringen og karakteristika af det antibiotiske stof thienamycin såvel som de morfologiske og dyrkningsmæssige karakteristika af Streptomyces cattleya er beskrevet i U.S.A. patentskrift nr. 3 950 357.

Sædvanligvis kan kulhydrater som f.eks. sukkerarter som glucose, fructose, maltose, saccharose, xylose, mannitol og lignende og stivelsesarter som kornstivelse f.eks. fra hvede, rug, majsstivelse, majsmel og lignende anvendes enten alene eller sammen som kilder for assimilerbar carbon i næringssubstratet. Den nøjagtige mængde kulhydratkilde eller -kilder, der anvendes i substratet, afhænger dels af de andre ingredienser i substratet, men sædvanligvis anvendes en mængde kulhydrat mellem 1 og 6 vægtprocent af substratet. Disse carbonkilder kan anvendes individuelt, eller flere carbio der kan kombineres i substratet. Sædvanligvis kan mange pro-teinholdige materialer anvendes som nitrogenkilder ved forgæringsprocessen. Velegnede nitrogenkilder omfatter f.eks. gærhydrolysater, primært gær, soyabønnemel, bomuldsfrømel, hydrolysater af casein, majsstøbevæske, bærme eller tomatpasta og lignende. Nitrogenkilderne anvendt enten alene eller flere sammen anvendes i mængder, der strækker sig fra ca. 0,2 til 6 vægtprocent i det vandige substrat.

Blandt de næringssalte af uorganisk oprindelse, der kan inkorporeres i dyrkningssubstratet, er sædvanlige salte der er i stand til at afgive natrium, kalium, ammonium, calcium, phosphat, sulfat, chlorid, carbonat og lignende ioner. Også spormetaller som cobalt, mangan, jern og magnesium er indbefattet.

145381 3

Forgæringen udføres ved temperaturer fra ca. 20°C til ca.

37°C; for at opnå de bedste resultater foretrækkes det at udføre forgæringen ved temperaturer på fra ca. 22°C til 30°C. Nærings sub strat et s pH-værdi, der er velegnet til dyrkning af Streptomyces cattleya kulturer og til at producere det antibiotiske stof N-acetyldehydrothienamycin, kan variere fra ca. 6,0 til 8,0.

Skønt det antibiotiske stof N-acetyldehyrothienamycin fremstilles ved både overflade- og neddyppede kulturer, udføres forgæringen i neddyppet tilstand.

En mindre dyrkning af det antibiotiske stof udføres bekvemt ved at pode et passende næringssubstrat med den antibiotikumproducerende kultur og efter overførsel til produktionssubstrat at lade forgæringen forJLøbe ved konstante temperaturer på ca. 25°C på et rysteapparat i flere dage.

Forgæringen udføres i en steril kolbe via en udvikling af podningsmængden på 1, 2, 3 eller 4 trin. Næringssubstratet til podningsstadiet kan være en,vilkårlig kombination af carbon- og nitrogenkilder. Podekolben rystes i en thermostat ved ca. 28 °C i to dage indtil væsken er tilfredsstillende, og noget af den herved fremkomne vækst anvendes til podning enten af et andet podetrin eller til produktionssubstratet.

Kolber fra de mellemliggende podetrin, der anvendes, udvikles på væsentligt samme måde. Dvs. en del af indholdet af den sidste podningskolbe anvendes til at pode produktionssubstratet. De dyrkede kolber rystes ved en konstant temperatur i flere dage, og efter afslutningen af inkubationstiden centrifugeres indholdet af kolberne eller filtreres.

Når man skal arbejde i stor målestok, foretrækkes det at udføre forgæringen i velegnede tanke, der er udstyret med en omrører og midler til at gennemlufte forgæringssubstratet.

Når man anvender denne metode, fremstilles næringssubstratet 145331 4 i tanken og steriliseres ved opvarmning til temperaturer indtil ca. 120 °C. Efter afkøling podes det steriliserede substrat med en forud udvokset podemængde af den producerende kultur, og forgæringen foregår i et tidsrum i f. eks. fra 3 til 5 dage under omrøring og/eller gennemluftning af næringssubstratet, idet man opretholder en temperatur på ca.

25°C. Denne fremgangsmåde til fremstilling af det antibiotiske stof N-acetyl-dehydrothienamycin er specielt velegnet til fremstilling af store mængder af det antibiotiske stof.

FYSISKE OG KEMISKE EGENSKABER AF DET ANTIBIOTISKE STOF N-ACETYLDEHYDROTHTEN AMYCIN. _ N-acetyldehydrothienamycin har en empirisk formel på C-^H^g N^Op-S. Den beregnede elementar- sammensætning svarende til denne empiriske formel er: 49>99% carbon, 5,16% hydrogen, 8,97% nitrogen, 25,61% oxygen og 10,26% svovl.

Det kernemagnetiske resonans spektrum (NMR) af N-acetyldehydrothienamycin ved 300 MHz i DgO afslører følgende karakteristiske signal, hvori de kemiske skift er givet i dele pr. million (ppm) i forhold til den indre standard natrium 2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) og koblingskonstanter i Hz: 1,29 (d, J=6, CH3); 2^08 (S, CH^0); 3,10 (d,d, J=12.5> 8,7, IH af CHgC); . 3,21 (d,d, J=12.5, 9,5, IH af CH2C); 3,39 (d,d, J=6.0, 2,5, Hg); 4,22 (m, H5 og Hy); 6,07 (d, J=13,5, HC=); 7,19 (d, J-13,5, HC=).

Dersom det ultraviolette absorptionsspektrum af N-acetyldehydrothienamycin måles ved pH 7 i vandige opløsninger, af- 145331 5 sløres et maximum ved 307,5 nm og en skulder ved 262 nm. N-acetyldehydrothienamycin har formlen; CB3-CH (OH) Y^N\_s-ch=ch-nhLch:,

COOH

Det antibiotiske stof N-acetyldehydrothienamycin er yderligere karakteriseret ved følgende antibiotiske spektrumsprofil. Forsøget anvender Bauer-Kirby plade diffusionsmetode kun modificeret på den måde, at 2 mm agar dybde er anvendt her. Resultaterne, der er udtrykt som hæmningszonens diameter i millimeter, er angivet i tabel 1.

Tabel 1

Organisme 0,0025 HEUA^/plade

Staphylococcus aureus 2985 15,5

Staphylococcus aureus 2314 13,0

Escherichia coll 2884 13,0

Escherichia coli 2891 10,5

Enterobacter cloacae 2646 8»5

Enterobacter cloacae 2647 11Ό *HEUA beskrevet i afsnittet benævnt "Hydroxylamin-ekstink-tionsbare absorbans enheder", se det følgende.

N-acetyldehydrothienamycin er et værdifuldt antibiotisk stof aktivt over for forskellige gram-positive og gram-negative bakterier og kan derfor finde anvendelse inden for human og veterinær medicin. Forbindelsen og dens salte kan anvendes som anti-bakterielle lægemidler til behandling af infektioner forårsaget af gram-positive eller gram-negative bakterier f.eks. over for Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, 145381 6

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae og Enterobacter cloacae. Det omhandlede anti-bakterielle materiale kan yderligere anvendes som tilsætningsstof til dyrefoder, til konservering af foder og som desinfektionsmiddel. F.eks. kan det anvendes i vandige kompositioner i koncentrationer fra 0,1 til 100 dele antibiotisk stof pr. million dele opløsning for at ødelægge eller hæmme væksten af skadelige bakterier på medicinsk og dentalt udstyr og som baktericider inden for industrielle anvendelsesområder f.eks. til vandbaserede malinger og i vand fra papirmøller for at haamme væksten af skadelige bakterier.

Det omhandlede antibiotiske stof kan anvendes i en hel række farmaceutiske præparater som eneste aktive ingrediens eller sammen med en eller flere farmakologisk aktive forbindelser.

For eksempel kan man administrere en aminocyclitol antibiotisk forbindelse, som f.eks. gentamycin, samtidig for at formindske enhver chance for, at resistente organismer dukker, og eller forbindelsen kan forenes med phenoxylat og atropin i doseringsformer, der skal anvendes til behandling af gastroenteritis. Det antibiotiske stof kan anvendes i kapselform eller som tabletter, pulvere eller flydende opløsninger eller som suspensioner eller eleksir. Det kan administreres peroral, topisk, intravenøst eller intramus-kulært.

De ikke-toxiske, farmaceutisk acceptable salte af N-acetyl-dehydrothienamycin dannes med uorganiske og organiske baser, herunder f.eks. metalsalte, der kommer fra alkalimetal eller jordalkalimetalhydroxider, carbonater eller bicarbo-nater f.eks. sådanne, der stammer fra natrium, kalium, ammonium og calcium, og salte af primære, sekundære eller tertiære aminer, som f.eks. monoalkylaminer, dialkylaminer, trialkylaminer, lavere-alkanolaminer, dilaverealkanolaminer, lavere-alkylendiaminer, N,N-diaralkyl-lavere-alkylendiaminer, aralkylaminer, amino-substituerede lavere alkanoler, N,N-di- 145381 7 lavere-alkylamino-substituerede lavere alkanoler, amino-, polyamino- og guanidino-substituerede lavere-alkansyrer og nitrogenholdige heterocycliske aminer.

Ved behandlingen af bakterielle infektioner hos mennesket administreres den omhandlede forbindelse peroral eller parenteral i overensstemmelse med almindelige anvendte fremgangsmåder til administrering af antibiotika i en mængde på fra ca. 2 til 600 mg/kg/dag og fortrinsvis ca. 2 til 50 mg/kg/ dag fortrinsvis i opdelte doser f.eks. tre til fire gange om dagen. De kan administreres i dosisenheder indeholdende f.eks.

25, 250, 500 eller 1000 mg aktivt ingrediens med velegnede fysiologiske acceptable bærestoffer eller hjælpestoffer. Dosisenhederne er i form af flydende præparater sont f.eks. opløsninger eller suspensioner eller som faste stoffer i tabletter eller kapsler. Det skal naturligvis være underforstået, at optimumdosis i ethvert givent tilfælde vil afhænge af typen og sværhedsgraden af den infektion, der skal behandles, og af mindre doser anvendes til pediatrisk formål, idet alle disse tilpasninger falder inden for den praktiserende læges erfaringsområde.

Forgæringsbouillonen indeholdende det antibiotiske stof fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har omtrentlige aktiviteter i området fra ca. o,l til 2^ig pr. ml. Antibiotiske præparater kan renses og det antibiotidke stof udvindes på forskellig måde.

En af -disse fremgangsmåder omfatter ekstraktion af den syrnede (f.eks. HC1, E^SO^, eddikesyre) forgæringsbouillon med ethylacetat, isobutylketon, amylacetat eller lignende opløsningsmidler og tilbage-ekstrahering af den isolerede opløsningsmiddelfase i en vandig opløsning, der holdes ved pH værdien mellem 5,5 og 7,5.

Yderligere rensning kan opnås ved at lede et sådant ekstrakt gennem en søjle med silicagel-partikler, der bærer en bunden carbonhydrid~overflade, fortrinvis C-^g. Dersom man øn- 145331 8 sker yderligere rensning, kan eluatet ledes gennem en søjle pakket med en polystyren, ikke-polær hydrophobisk tværbunden divinylbenzenpolymer som f.eks. "XAD"-1, 2 og 4, fortrinsvis ,,XAD"-2 (fremstillet af Rohm & Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania).

En metode til at opnå yderligere rensning er at lede det ovenfor omtalte eluat i 50% methanol gennem en søjle, der indeholder en stærkt basisk anionbytterharpiks. Eksempler på sådanne harpikser er de, der har en styren-divinylbenzenmatrix, f.eks. den polystyren-kernékvarternære ammoniumharpiks "Dowex" 1x4 (fremstillet af Dow Chemical Co., Midland, Michigan) i chlorid-cyklen. Andre repræsentative medlemmer af denne gruppe stærkt basiske ioribytterharpikser omfatter følgende: "Duolite" A-40, A-42, A-101, A-102 og A-114 (fremstillet af Chemical Process Co., Redwood City, California); "Amberlite" IRA-400, IRA-401 og IRA-410 (fremstillet af Rohm & Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania).

Det antibiotiske stof indeholdt i eluatet kan yderligere renses ved gel-filtrering gennem en polyacrylamidgel, der har en porestørrelse, der udelukker molekyler, der har en molekylvægt større end 1800. En foretrukken gel er "Bio-Gel” P-2 (fremstillet af Bio*Rad, Richmond, California).

En foretrukken metode til at udvinde det rene N-acetyldehydro-thienamycin er at ekstrahere det fra den syrnede bouillon, idet man anvender ethylacetat, ekstraherer tilbage med adskilt opløsningsmiddelfase med en neutral vandig opløsning, hvorefter man leder den vandige tilbage-ekstraherede opløsning gennem en søjle bestående af silicagel-partikler, der bærer en bunden C-^g overflade. Det op samlede eluat kan y-derligere renses ved kromatografi i 50% methanol på anionbytterharpiks bestående af polystyren-trimethylammonium typen (f.eks. "Dowex" 1x4 Cl-400 mesh) og gelpermentations-harpiks (f.eks. "Bio-Gel P-2, 200-400 mesh).

145381 9

Forsøg:

Forsøgene med biologisk aktivitet udføres efter følgende plade-diffusionsmetode, idet man anvender enten Staphylococcus aureus ATCC 6538P eller Vibrio percolans ATCC 8461 som prøveorganisme.

En bouillonkultur tilsat 0,2% gærekstrakt (NBYE) dyrket natten over ved 37 °C med Staphylococcus aureus ATCC 6538P fortyndes med NBYE, hvorved man får en suspension med 40%'s gennemskinnelighed ved en bølgelængde på 660 nm. En 33,2 ml portion af denne fortyndede suspension sættes til 1 liter NBYE indeholdende 15 g agar og holdes ved 47-48 °C. Ti ml portioner af denne suspension udhældes i petriskåle 85 mm diameter, og disse plader afkøles og opbevares ved 4 °C, indtil de skal anvendes (maximum fem dage).

En bouillonkultur tilsat 0,2% gærekstrakt (NBYE) dyrket natten over ved 28 °C med Vibrio percolans ATCC 8461 fortyndes med NBYE til en suspension, der har 50# gennemskinnelighed ved 660 nm. En 33,2 ml portion af denne fortyndede kultur sættes til en liter NBYE indeholdende 15 9 agar, der holdes ved 46°C. Fem ml portioner af denne suspension udhældes i petriskåle på 85 mm diameter, og disse plader afkøles og holdes ved 4°C, indtil de skal anvendes (maximum fem dage).

Prøver af det antibiotiske stof, der skal undersøges, fortyndes til en passende koncentration og påføres 6,25 mm eller 12,5 mm diameter skiver, idet 25 pi påføres 6,25 iran skiver og 100 pi påføres en 12,5 mm skive. Skiverne anbringes på overfladen af forsøgespladen. Staphylococcus aureus pladerne dyrkes ved 37 °C natten over; Vibrio percolans pladerne dyrkes ved 28 °C natten over. Hæmningszonen måles som mm diameter og bestemmer det antibiotiske indhold.

U5301 ίο

Hydroxylamin-ekstinktionsbar absorbans enheder (HEAU).

Den del af absorbansen målt nær eller ved UV-absorptionsmaxi-mum, der kan skyldes det antibiotiske indhold af prøven, bestemmes ved selektiv ekstinktion af denne absorbans (sammen med sammenhørende inaktivering af den antibiotiske aktivitet) efter omsætning med fortyndet hydroxylamin.

Fri skt fremstillede, neutraliserede hydroxylamin (Μ^ΟΗ,ΗΟΙ plus NaOH til et slut-pH på 7) sættes til upuf rede prøver af det antibiotiske stof, der skal undersøges; dersom det drejer sig om velpufrede neutrale pH-opløsninger, anvendes u-neutraliserede nh2OH,HC1. Hydroxylaminen sættes til en slut-koncentration på 10 mM, og man lader reaktionen ske ved stuetemperatur i mindst 30 minutter. Den fremkomne absorption af den omsatte prøve, når den trækkes fra den uomsatte prøves absorption (efter korrektion for fortynding af tilsat reagens), giver den hydroxylaminekstinktionsbare absorbans.

En HEAU af det antibiotiske stof, dersom det er til stede i 1 ml, har en hydroxylamin-ekstinktionsbar absorbans på 1,0.

De følgende eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen yderligere.

Eksempel 1

Et rør med lyofiliseret kultur af Streptomyces cattleya NRRL 8057 åbnes aseptisk, og indholdet opslæmmes i en 250 ml Erlenmeyerkolbe, der er udstyret med ledeplader, indeholden 50 ml steril substrat A med følgende sammensætning: 145331 11

Substrat A

Gær-autolysat 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphat-puffer1 2,0 ml

MgS04,7H20 0,05 g

CaC03 2,0 g

Destilleret H20 1000 ml *Phosphat-puffer opløsning: KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g ^Destilleret H20 1000 ml tilsat efter pH-indstilling.

Den podede kolbe rystes ved 28 °C ved 220 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i 30 timer. Fyrre (40) ml af den ovenfor omtalte 30-timers bouillon fjernes aseptisk og blandes med 40 ml steril 20% (volumen/volumen) glycerol. To ml prøver af glycerolblandingen pipetteres ud i sterile prøveglas, der herefter fryses og lagres i dampfasen af en fryser med flydende nitrogen.

Indholdet af de frosne prøveglas anvendes til at pode en 250 ml Erlenmeyerkolbe, der er udstyret med ledeplader, indeholdende 50 ml substrat B med følgende sammensætning:

Substrat B

Gær-autolysat 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphat-puffer1 2,0 ml

MgS04,7H20 0,05 g

Destilleret H20 1000 ml

pH indstillet til 6,5 med NaOH

Phosphat-puffer opløsning; KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H2<0 1000 ml 145381 12

Denne podekolbe rystes ved 28 °C med 220 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i 48 timer. Prøver på 0,8 ml af denne podekolbe anvendes til at pode seks 250 ml Erlenmeyerkolber, der er udstyret med ledeplader, indeholdende 40 ml af substrat B, der har samme sammensætning som det o-venfor nævnte substrat B. Disse seks 250 ml Erlenmeyerkolber udstyret med ledeplader rystes ved 28°C ved 220 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i 24 timer. Fyrre ml 20% (rumfang/ rumfang) steril glycerol sættes til hver kolbe. Prøver på 2,5 ml af den herved fremkomne blanding afpippeteres i sterile prøveglas, der mærkes for identifikation og lagres ved -87 °C.

En af de ovenfor omtalte frosne mærkede prøveglas optøs ved 37 °C, og 1 ml af indholdet anvendes til at pode en 250 ml Erlenmeyerkolbe, der er udstyret med ledeplader, indeholdende 40 ml substrat C med følgende sammensætning:

Substrat C

Saccharose 30,0 g

Distiller's solubles 15,0 g Gær-ekstrakt 5,0 g

Destilleret H^0 1000 ml

pH indstillet til 7,3 med NaOH

Denne podekolbe rystes ved 28 °C ved 220 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i 48 timer. 1 ml portioner fra denne podekolbe anvendes til at pode fire 250 ml Erlenmeyerkolber udstyret med ledeplader, der indeholder 40 ml af det ovenfor nævnte substrat C. Disse fire andentrins-podekolber rystes ved 28 °C ved 220 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i 24 timer.

8-ml portioner fra disse andentrins podekolber anvendes til at pode 12 to-liters Erlenmeyerkolber indeholdende 160 ml substrat D med følgende sammensætning: 145301 13

Substrat D

Glycerol 15»0 g

Majsstøbevæske 15,0 g

Fjerkræmel 10,0 g

Distiller’s solubles 15,0 g

CoC12,6H20 0,01 g

CaC03 3,0 g

Polyglycol 2000 0,25 vol.% .

Destilleret HgO 1000 ml pH indstillet til 7,5 med NaOH

Disse produktionekolber rystes ved 25°C med 150 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i fem dage.

1 ml portioner fra andentrinssubstrat C podekolberne anvendes til at pode to 250 ml Erlenmeyerkolber udstyret med ledeplader indeholdende 40 ml af det ovenfor beskrevne substrat C. Disse tredietrinspodekolber rystes ved 28 °C ved 220 omdrejninger pr. minut (5 cm udsving) i 24 timer.

8 ml portioner fra disse tredie podekolber anvendes til at pode 7 toliters Erlenmeyerkolber indeholdende 160 ml af det ovenfor beskrevne substrat D. Disse produktionskolber rystes ved 25°C ved 150 omdrejninger pr. minut C5 cm udsving) i fire dage.

Bouillonen fra otte kolber af fem-dagsforgæringen slås sammen, og pH-værdien er 6,75· De forenede bouilloner afkøles til 5-10 °C og centrifugeres i 15 minutter med 6000 omdrejninger pr. minut. Supernatanten filtreres fra ved hjælp af "Su-per-Cel", og filtratet opbevares ved 0°C.

Bouillonen fra seks kolber fra fire-dagsforgæringen slås sam-sammen, og pH-værdien er 6,35. Disse forenede bouilloner afkøles til 5-10°C og centrifugeres i 15 minutter ved 6000 omdrejninger pr. minut. Supernatanten filtreres ved hjælp af "Super-Cel". 780 ml af den filtrerede 14 U5331 fire-dages forgæringsbouillon slås sammen med 966 ml af den filtrerede fem-dages forgæringsbouillon. Det forenede filtrat deles i syv portioner på 250 ml, og hver portion indstilles til pH 2,5 med 2,5 N HC1 og ekstraheres ved 5 °C med 250 ml ethylacetat. Ethylacetatfasen fraskilles og ekstraheres tilbage med 6,65 ml 0,1 M MES £2-(N-morpholino)ethansul-fonsyrej, pH 7 suppleret med en mængde på 2,5’N.NaOH tilstrækkelig til at bringe pH-værdien af den vandige bag-ekstraktion til pH 6,8-7,2. Den vandige bag-ekstraktion fraskilles, og de tiloversblevne spor af ethylacetat fjernes ved at lede en strøm af nitrogen hen over overfladen.

De sammenslåede bag-ekstraktioner har et totalt rumfang på 42,5 ml, en pH-værdi på 7,05 og indeholder 12,75 HEAU målt ved 507 nm.

De sammenslåede bag-ekstraktioner koncentreres ved roterende inddampning ved 7,65 ml. En 0,1-ml portion fjernes til undersøgelse, og resten påføres et væskekromatografisk system fremstillet på følgende måde:

To rustfri stålsøjler på ca. 2,5 cm x 91,4 cm pakkes med "Bondapak" C^g/"Porazil®B", 37-75 mikron-partikkelstørrel-sesområde, kobles i serier ved hjælp af et stykke ca. 15,2 cm langt 0,76 mm rustfrit stålrør. Søjlerne dyppes i en vandkappe, og vandet opvarmes til 40 °C, idet man cirkulerer kontinuert gennem kappen. Søjlerne bringes i ligevægt inden anvendelsen med 0,01 M kaliumphosphatpuffer, pH 5,6:aceto-nitril, 95:5 (rumfang/rumfang). Prøven påføres under anvendelse af en Altex Scientific, Inc. Model 202-00 roterende injektionsventil udstyret med et 10-ml øje af teflon rør.

Søjlen fremkaldes med den ovenfor nævnte puffer med en hastighed på 8 ml pr. tre minutter og styres ved 307 nm under anvendelse af et "Laboratory Data Control Constametric II(R)” ultraviolet absorbans monitor udstyret med en gennemstrømningscelle af 1-cms gennemstrømningslængde. Fraktioner på 15 U5381 8 ml opsamles, og en 20-^1 portion af 0,1. m k2po4 sættes til hver fraktion. Fraktionerne afkøles til 0υ0 og prøves for biologisk aktivitet på staphylococcus aureus prøveplader.

N-acetyldehydrothienamycin-aktiviteten dukker op mellem 624 ml og 688 ml af eluatet. Disse fraktioner slås sammen, indstilles til pH 6,85 med 2,5 N NaOH, og man finder et indhold på 9»2 HEAU målt ved 307 nm. De sammenslåede fraktioner koncentreres ved roterende inddampning til 1 ml, der påføres en 1,3 cm x 8 cm søjle, der først er vasket med XAD-2. XAD-2 vaskes først søjle for søjle med fire søjle rumfang: 1) ; 0,001. M EDTA; 2) 1 N NaOH; 3) af ioniseret H20; 4) 1 N HC1; 5) afioniseret H20; 6) methanol; 7) acetone; 8) afioniseret h2o. Efter prøven er påført tilsætter man 1 ml destilleret HgO inden søjlen fremkaldes med destilleret H^O. Fraktionerne 1-5 indeholder 5,56 ml; de øvrige fraktioner opsamles på 1 ml med ca. 1 ml/minut. Fraktionerne prøves for biologisk aktivitet på Vibrio percolans forsøgsplader. Størstedelen af N-acetyldehydrothienamycinet findes i fraktionerne 9-30. Disse fraktioner indeholder 2,57 HEAU målt ved 307 nm.

Eksempel 2

Et frossent NRRL 8057 prøveglas indeholdende Streptomyces catt-leya og mærket for at identificere det som sådant fremstilles som beskrevet i eksempel 1 optøs ved 37 °c, og 1 ml af indholdet anvendes til at pode en 250 ral Erlenmeyerkolbe udstyret med ledeplader indeholdende 40 ml substrat C med følgende sammensætning:

Substrat C

Saccharose 30,0 g

Distiller's solubles 15,0 g Gær-ekstrakt 5,0 g

Destilleret H20 1000 ml

pH indstillet til 7,3 med NaOH

16 1453 δ 1

Denne podekolbe rystes ved 28 °C med 220 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i 48 timer. 1 ml portioner fra denne podekolbe anvendes til at pode fem 250 ml Erlenmeyer-kolber udstyret med ledeplader indeholdende 40 ml af det ovenfor beskrevne substrat C. Disse podekolber rystes ved 28 °C ved 220 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i 24 timer. 8 ml portioner fra disse 24-timers podekolber anvendes til at pode seksten 2 ml Erlenmeyerkolber indeholdende 160 ml substrat D med følgende sammensætning:

Substrat D

Glycerol 15,0 g

Majsstøbevæske 15,0 g

Fjerkræsmel 10,0 g

Distiller’s solubles 15,0 g

CoC12,6H20 0,01 g

CaC03 3,0 g

Polyglycol 2000 0,25 vol.%

Destilleret H20 1000 ml

pH indstillet til 7,5 med NaOH

Disse produktionskolber dyrkes ved 25°C med 150 omdrejninger pr. minut (5cm .udsving) i fem dage.

Bouillonen fra de 16 produktionskolber slås sammen, afkøles til 5-10°C og centrifugeres 15 minutter ved 6000 omdrejninger pr. minut. Supernatanten fjernes og filtreres ved hjælp af "Super-Cel". Den filtrerede bouillon deles i 250-ml portioner, der hver indstilles til pH 2,5 med 2,5 N HC1 og ekstraheres ved 5°C med to portioner på 250 ml ethylacetat.

Hver ethylacetatfase ekstraheres tilbage med 6,65 ml 0,1 M MES, pH 7 plus nok 2,5 N NaOH (ca. 0,3 ml) til at bringe pH-værdien af den vandige bag-ekstraktion til pH 6,8-7,2.

De vandige bag-ekstraktioner, der stammer fra den første ekstraktion af hver portion bouillon med ethylacetat, mærkes "første ekstraktion", de, der stammer fra anden opløsnings-middelekstraktion* mærkes "anden ekstraktion". Rest-ethylace- 17 145331 taten i ekstrakterne fjernes ved at lede en strøm af nitrogen over væskeoverfladen. De "første ekstraktioner" slås sammen til i alt 67 ml, pH 7,05 og en totalværdi på 45»6 HEAU målt ved 307 nm. De "anden ekstraktioner" slås sammen med et totalt volumen på 62 ml, pH 7,05og en totalværdi af HEAU på 23,6 målt ved 307 nm.

De forenede "første ekstraktioner" koncentreres ved roterende inddampning til 7 ml. En 50-jul portion fjernes til undersøgelse, og de tiloversblevne 6,95 ml påføres et væskekromatografisk "Bondapak" c18/"Porasil®B" system beskrevet i eksempel 1. Søjlen bringes i ligevægt inden anvendelsen med 0,01 M calciumphosphatpuffer, pH 5,6: acetonitril, 95:5 (rumfang/rumfang ) , og søjlen fremkaldes med samme puffer.

Fraktioner på 10,5 ml opsamles hvert tredie minut, indtil 640 ml eluat er opsamlet, på hvilket tidspunkt 5,25 ml fraktioner opsamles hver 1,5 minut. En 20-jal portion af 0,1M KpHPO^ sættes til hver fraktion, og fraktionerne afkøles til 0°C og afprøves for biologisk aktivitet på Staphylococcus aureus forsøgsplader. Størstedelen af N-acetyldehydrothie-namycin findes i elueringsrumfang 597-655 ml. Disse fraktioner slås sammen, pH-værdien indstilles til 7 med 2,5 N WaOH og opbevares ved 0°C.

De forenede "anden ekstraktioner" koncentreres ved roterende inddampning til 6,3 ml. fn 50-^1 portion fjernes til undersøgelse, og de tilbageblevne 6,25 ml påføres det væske-kromatografiske "Bondapak" C^g/"Porasil™B" system beskrevet i eksempel 1. Søjlen bringes i ligevægt inden anvendelsen med 0,01 M kaliumphosphatpuffer, pH 5,6: acetonitril, 95:5 (rumfang/rumfang), og søjlen fremkaldes med samme puffer.

Fraktioner på ca. 9 ml opsamles hvert tredie minut. En 20 jil portion : o,l M I^HPO^ sættes til hver fraktion, og fraktionerne afkøles til 0 °C og afprøves for biologisk aktivitet på Sthaphylococcus aureus forsøgsplader. De aktive fraktioner, der udviser N-acetyldehydrothienamycin aktivitet, slås sammen og indstilles til pH 7 med NaOH. De forenede fraktioner indeholder 3,74 HEAU målt ved 307 nm.

145381 18

De forenede fraktioner koncentreres ved roterende inddamp-ning til 0,5 ml. En 0,5-ml methanol tilsættes. Blandingen centrifugeres to minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut for at fraskille det bundfald, som er dannet. Bundfaldet udgør en 0,05-0,1 ml nedre fase. Den øvre fase fjernes og påføres en "Altex" 25 mm x 100 mm søjle pakket med ’'Bio-Gel" P-2, minus 400 mesh i 50% methanol til et slutpakkevolumen på 25 mm x 75 mm. prøven påføres under anvendelse af en "Altex model" 202-00 roterende injektionsventil udstyret med et 3-ml øje bestående af teflon rør. Søjlen fremkaldes med 50% methanol med en hastighed på 3,3 ml/minut, og fraktioner på ca. Q,55 ml opsamles. Fraktionerne afkøles til 0°C og afprøves for biologisk aktivitet på staphylococcus aureus forsøgsplader. N-acetyldehydrothienamycin aktivitet findes mellem 65 ml og 100 ml af eluatet. Fraktionerne mellem 65 ml eluat og 67 ml eluat slås sammen med fraktionerne mellem 90 ml eluat og 100 ml eluat, og der koncentreres til 3,4 ml ved roterende inddampning. Disse fraktioner indeholder 0,4 HEAU ved 307 nm. "Bio-Gel" fraktionerne mellem 67 ml eluat og 90 ml eluat slås sammen og koncentreres til 11,5 ml ved roterende inddampning. Disse fraktioner indeholder 1,4 HEAU målt ved 307 nm.

De to samlede fraktioner fra "Bio-Gel" P-2 slås sammen og sættes til de samlede N-aqetylthienamycin fraktioner fra "Bondapak"C^g/"Porasil®B" kromatografien af de "første ekstraktioner". Denne opløsning indeholder 7,89 HEAU målt ved 307 nm og har et rumfang på 68 ml. 68 ml methanol tilsættes, og den herved fremkomne blanding påføres en "Dowex" 1 -x 4 Cl , minus 400 mesh søjle, 1,55 cm x 21 cm. Søjlen er inden brugen fremstillet på følgende måde: Harpiksen fås ved dekantering fra vand, pakkes i søjlen i 50% methanol og vaskes herefter med 7-8 søjlerumfang 0,5'M NaCl i 50% methanol efterfulgt af 7-8 søjlerumfang 50% methanol. Opløsningen på 50% methanol i N-acetyldehydrothienamycin fra ovenfor påføres søjlen med en hastighed på 1 ml/minut efterfulgt af 2-3 ml 50% methanol. Søjlen fremkaldes med en hastighed på 1 ml/minut med 0,09 M NaCl + 0,005 M NH4C1 + 0,0003 M

145381 19 NH^OH i 50% methanol; pH = 7,5. Fraktioner på ca. 5 ml opsamles og undersøges for biologisk aktivitet på Staphylococcus aureus forsøgsplader. N-acetyldehydrothienamycin findes fra elueringsrumfang 505 ml til og med 607 ml. Eluerings-rumfanget 519 ml til og med 579 ml slås sammen og indeholder 4,4 HEAU målt ved 307 nm. Disse fraktioner koncentreres ved roterende inddampning til 0,6 ml. Et rumfang på 0,6 ml methanol sættes til, og blandingen centrifugeres i to minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut.

Supernatanten fjernes fra saltbundfaldet. Saltbundfaldet vaskes ved 0,2 ml 50% methanol, og blandingen centrifugeres ved 3000 omdrejninger pr. minut. Supernatanten sættes til den første supematante væske. Denne opløsning indeholder 3,2 HEAU målt ved 307 nm, påføres en 1,65 cm x 37 cm "Bio-Gel" P-2, 200-400 mesh søjle, der er vasket inden anvendelsen med 5 ml mættet NaCl i 50% methanol efterfulgt af 2-3 søjlerumfang 50% methanol. Prøven efterfølges af 2-3 ml 50% methanol. Søjlen fremkaldes med 50% methanol, og fraktioner på 1,2 ml opsamles hvert minut. Fraktionerne kontrolleres ved ultraviolet absorbtion ved 300 nm, og en top mellem fraktionerne 26 og 41 observeres. Fraktionerne 28-37, der har et 307 nm/262 nm forhold på mere end en, slås sammen, og 10 )il 1 M kaliumphosphatpuffer, pH 7 tilsættes. De forenede fraktioner koncentreres ved roterende inddampning til ca. 1 ml inden lyophilisering, og man finder en HEAU-værdi på 2,28 målt ved 307 nm.

Eksempel 3

Et rør med lyofiliseret kultur af isolat af Streptomyces cattleya NRRL 8057 åbnes aseptisk, og indholdet opslæmmes i en 250 ml Erlenmeyerkolbe udstyret med ledeplader indeholdende 50 ml substrat B med følgende sammensætning; 145381 20

Substrat B

Gserautolysat 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer 2,0 ml

MgS04,7H 20 0,05 g

Destilleret H^O 1000 ml pH indstillet til 6,5 med NaOH

* Phosphatpuffer opløsning: KH2po4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret HgO 1000 ml

Den podede kolbe rystes ved 28 °C med 150 omdrejninger pr. minut (5 cm udsving) i 48 timer. 10 ml portioner af denne podekolbe anvendes til at pode 2-liters Erlenmeyer-kolber udstyret med ledeplader indeholdende 500 ml substrat B, der har samme sammensætning som det ovenfor nævnte substrat B. Disse kolber rystes ved 28 °C med 150 omdrejninger pr. minut (5cm udsving) i 24 timer. Væksten fra disse 2-liters podekolber anvendes til at pode fermatorer på 756 liter af rustfrit stål indeholdende 467 liter substrat E med følgende sammensætning:

Substrat E

Glycerol 10,0 g

Pharmamedia 5,0 g

Distiller’s solubles 10,0 g

CoC12,6H20 0,01 g

CaC03 3,0 g

Polyglycol 2000 0,25 vol.%

Postevand 1000 ml

pH indstillet til 7,3 med NaOH

Denne fermentatortank af rustfrit stål arbejder ved 28 °C under en 145381 21 omrøringshastighed på 130 omdrejninger pr. minut og en gen-nemluftning på o,28 pr. minut. Efter 48 timers forløb anvendes 454 liter af dette substrat til at pode en 5670-liter rustfri stål fermentator indeholdende 4082 substrat F med følgende sammensætning:

Substrat F

Majsstøbevæske 15,0 g

Glycerol 10,0 g

Pharmamedia 5,0 g

Distiller's solubles 10,0 g

CoC12,6H20 0,01 g

CaC03 3,0 g

Polyglycol 2000 0,25 vol.%

Postevand 1000 ml

pH indstillet til 7,3 med NaOH

Denne tank arbejder ved 25°C under omrøring med en hastighed på 70 omdrejninger pr, minut og en gennemluftning på 1,5 m pr. minut. Efter 100 timers forløb fjernes 100 ml portioner, der afkøles til 5-10°C og centrifugeres ved 6000 omdrejninger pr. minut i 15 minutter. Den supernatante væske filtreres ved hjælp af "Super- Cel". En 25-ml portion af filtratet indstilles til pH 2,2-2,4 med 5 N HCl og ekstraheres ved 5°C med 25 ml ethylacetat. Ethylacetat-fcsen fraskilles og ekstraheres tilbage med 2,5 ml 0,075 M kaliumphosphat-puffer pH 7,0. Den vandige fase fraskilles, og de tilbageblevne spor af ethylacetat fjernes ved af lede en strøm af nitrogen over væskeoverfladen. En 1,25 cm plade indeholdende 100 pi af bagekstrakten giver 24,3 nm zone på en Staphylococcus aureus forsøgsplade.