DK145504B - Fremgangsmaade til fremstilling af det antibiotiske stof 890a2og eller det antibiotiske stof 890a5 og farmaceutisk acceptable salte deraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK (Φ)

® (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ud 145504 B

DIREKTORATET FOR PATENT· OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1639/77 (51) IntCl.3 C 12 P 17/18 (22) Indleveringsdag 15· apr. 1977 C 07 D 487/04 (24) Løbedag 15· apr. 1977 (41) Aim. tilgængelig 29. okt. 1977 (44) Fremlagt 29· nov. 1982 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 28. apr. 1976, 680831, US

(71) Ansøger MERCK & CO. INC., Rahway, US.

(72) Opfinder Patrick Joseph Ciaseidy, US: Robert Thomas Goegelman, US: Edward Olley Stapley, US: Sebastian Hernandez, ES.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Bout ard.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af det antibiotiske stof 89OA2 og/eller det antibiotiske stof 89OA5 og farmaceutisk acceptable salte deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte antibiotiske stoffer 890A2 og/eller 890A^ med den i krav 1 angivne almene formel eller farmaceutisk acceptable salte deraf, hvilke forbindelser er effektive til at inhi-bere væksten af forskellige gram-negative og gram-positive mikro- 0 organismer.

f 0 D Opdagelsen af penicillinets bemærkelsesværdige antibiotiske egen- ^ skaber har stimuleret forskningen på dette område, hvorved der er ~ fundet mange andre værdifulde antibiotiske stoffer, såsom andre ^ penicilliner, cephalosporiner, streptomycin, bacitracin, tetra- 5 eyeliner, chloramphenicol og erythromyciner. I almindelighed 2 145504 er den antibakterielle aktivitet åf hvert af disse antibiotiske stoffer begrænset, således at visse klinisk vigtige pathogene bakterier ikke hæmmes. F.eks. er nogle principielt kun aktive over for gram-positive bakterier. Erhvervet resistens under den omfattende anvendelse af eksisterende antibiotiske stoffer til behandling af bakterieinfektioner har endvidere forårsaget alvorlige resistensproblemer.

Som følge af manglerne ved de hidtil kendte antibiotiske stoffer har man søgt at finde andre antibiotika, som vil være aktive over for et større område af pathogener samt over for resistente stammer af særlige mikroorganismer.

Under denne forskning har man opdaget antibiotiske stoffer tilhørende thienamycin-gruppen, hvortil de ifølge opfindelsen fremstillede antibiotiske stoffer hører. Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 5280/75 kendes således en fremgangsmåde til fremstilling af det antibiotiske stof thienamycin med formlen ch3 -CH(OH) v ^ j’ r*^-S-CH2- CH2-NH2 ved dyrkning af en stamme af Streptomyces Cattleya. Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 4971/76 kendes en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum 890A1 og/eller antibiotikum 890A,, som er isomere forbindelser med formlen

CH,-CH(0H) --S

y I -S-CH2-CH2-M-C-CH3

c/~NY

COOH

Ved dyrkning af en stamme af Streptomyces flavogriseus.

Det har nu vist sig, at stammer af arten Streptomyces flavogriseus danner ovennævnte hidtil ukendte antibiotiske stoffer 89OA^ og 890A^ i og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte. Anvendelige stammer er deponeret uden restriktioner for tilgængelighed i kultursamlingen tilhørende Northern Regional Laboratories, 3 U 5504

Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111. og er registreret under henholdsvis nr. NRRL 8139 og 8140. Strep-tomyces flavogriseus NRRL 8139 og NRRL 8140 producerer begge antibiotika 89OA2 og 890A^, som er isoleret i praktisk taget ren form fra gæringsvæsken.

De morphologiske og dyrkningsmæssige egenskaber for Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 fremgår af efterfølgende tabel.

Morphologi - Sporophorer er forgrenede, lige til buede kæder af sporer, danner totter. Kæderne er mere end 10 sporer i længde. Sporerne er sfæriske til ovale - 0,9 μ x 1,2 μ (970x).

Dyrkningsmæs sige egenskaber

Hvedemel agar

Vegetativ vækst - Bagside gullig tan, petgamentiignende vækst;1 Luftmycelium - Lysegråt kantet med medium gråt Opløseligt pigment - Intet,

Czapek Dox agar (saccharose nitrat agar)

Vegetativ vækst - Bagside brun kantet med mørkebrun;

Luftmycelium - Medium gråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af medium.

Æg albumin agar

Vegetativ vækst - Bagside gullig tan kantet med brunt;

Luftmycelium - Medium gråt blandet med gulliggråt (2dc) og gtå-gult (2db);

Opløseligt pigment - Lyst gullig tan.

Glycerol asparagin agar

Vegetativ vækst - Bagside gullig tan, flad, spredt;

Luftmycelium - Fløjlsagtig, lysegråt med stærk gullig tone til gråt (2dc);

Opløseligt pigment - Intet.

Uorganiske salte-stivelse agar 145504 4

Vegetativ vækst - Bagside - brun;

Luftmycelium - Medium gråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Lyst gullig tan.

Gærekstrakt-dextrose + salte agar

Vegetativ vækst - Bagside brun kantet med meget mørkebrunt; Luftmycelium - Mørkegråt blandet med lysegråt, fløjlsagtigt; Opløseligt pigment - Intet.

Gærekstrakt-maltekstrakt agar

Vegetativ vækst - Bagside-mørkebrun:

Luftmycelium - Mørkegråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Intet.

Skummet mælk agar

Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Sparsomt, gråligt;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af medium;

Hydrolyse af casein - God.

Lakmusmælk

Vegetativ vækst - Moderat vækstring, mørk tan;

Luftmycelium - Intet;

Farve - Purpur;

Koagulation og/eller peptonisation - Komplet peptonisation; bliver alkalisk, pH = 8,2.

Skummet mælk

Vegetativ vækst - Moderat vækstring, tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Tan;

Koagulation og/eller peptonisation - Komplet peptonisation, bliver alkalisk, pH = 8,0.

Tyrosin agar

Vegetativ vækst - Bagside mørkebrun;

Luftmycelium - Mørkegråt;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af medium;

Dekomponering af tyrosin - Ingen.

Pepton-jern-gærekstrakt agar Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Sparsomt, gråligt;

Opløseligt pigment - Intet;

Melanin - Intet; H2S-produktion - Ingen.

5 145504 Næringsagar

Vegetativ vækst - Bagside lysegrålig brunkantet med mørkere gråbrunt;

Luftmycelium - Lysegråt kantet med mørkegråt;

Opløseligt pigment - Intet.

Næringsstivelseagar

Vegetativ vækst - Tan kantet med gråt Luftmycelium - Medium gråt kantet med mørkegråt;

Opløseligt pigment - Intet;

Hydrolyse af stivelse - God Næringsgelatineagar

Vegetativ vækst - Farveløs kantet med mørkegråt;

Luftmycelium - Grålig-hvidt;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning af gelatine - God.

Kartoffelstykker

Vegetativ vækst - God vækst, kraftig rynket;

Luftmycelium - Gråt til grønlig-gråt;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af medium.

Loefflers blodserum

Vegetativ vækst - cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning - Ingen.

Gelatinestik N

Vegetativ vækst - cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning af gelatine - God.

Alle de ovenfor rapporterede observationer blev taget efter tre ugers dyrkning ved 28° C, med mindre andet er anført. pH-værdiérne af medierne, som anvendtes ved disse studier, var tilnærmelsesvis . neutrale, nemlig pH = 6,8 - 7,2. De anvendte farvebetegnelser er i overensstemmelse med definitionerne i Color Harmony Manual, 4. udgave (1958), Container Corporation of America, Chicago,.Illinois.

Streptomyces flavogriseus NRRL 8159 blev også prøvet for evnen til at udnytte eller assimilere forskellige carbonhydrater. Til dette formål blev mikroorganismen dyrket på et basalt syntetisk medium 145504 6 (Pridham and. Gottlieb) indeholdende 1% af carbonhydratet ved 28° C i tre uger. pH-værdien af de anvendte medier var tilnærmelsesvis neutral (6,8 - 7,2). Tabel I viser udnyttelsen af disse carbon-hydratkilder af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139, idet + angiver god vækst, - dårlig vækst og - ingen vækst på det pågældende car-bonhydrat.

TABEL I

Glucose + Maltose +

Arabinose + Mannitol +

Cellulose - Mannose +

Fructose + Raffinose

Inositol - Rhamnose +

Lactose + Saccharose -

Xylose + Mængden af vækst ved forskellige temperaturer og oxygenbehovet af mikroorganismen er følgende:

Temperaturområde (Gærekstrakt-dextrose + saltagar); 28° C - God 37° C - God vegetativ vækst; ikke lufthyfer 50° C - Ingen vækst

Oxygen-behov (Stikkultur i gærekstrakt-dextrose + saltagar);

Aerob

De morphologiske og dyrkningsmæssige egenskaber for Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 fremgår af efterfølgende tabel.

Morphologi - Sporophorer er forgrenede, lige til buede kæder af sporer, -danner totter. Kæderne er mere end 10 sporer i længden. Sporerne er sfæriske til ovale - 0,9 p x 1,2 p (970x).

Dyrkningsmæssige egenskaber

Havremelagar

Vegetativ vækst - Bagside gullig tan kantet med mørkebrunt; Luftmycelium - Lysegråt kantet med medium gråt;

Opløseligt pigment - Intet.

Czapek Dox agar (saccharose nitrat agar)

Vegetativ vækst - Bagside brun kantet med mørkebrunt; 7 145504

Luftmycelium - Medium gråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Intet.

Æg albumin agar

Vegetativ vækst - Bagside grålig tan med sektioner af kraftig gullig tan;

Luftmycelium - Sektioner af medium gråt, grålig hvidt og gullig gråt (2dc);

Opløseligt pigment - Meget lys tan.

Glycerol asparagin agar

Vegetativ vækst - Gullig tan;

Luftmycelium - Sparsomt, gråligt;

Opløseligt pigment - Intet.

Uorganiske salte-stivelse agar

Vegetativ vækst - Bagside gråligt cremefarvet;

Luftmycelium - Medium gråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Intet.

Gærekstrak-dextrose + salte agar ;

Vegetativ vækst - Bagside - mørkebrun;

Luftmycelium - Mørkegråt blandet med lysegråt, fløjlsagtigt; Opløseligt pigment - Intet.

Gærekstrakt-maltekstrakt agar

Vegetativ vækst - Bagside mørkebrun;

Luftmycelium - Mørkegråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Intet.

Pepton-jern-gærekstrakt agar Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Melanin - Intet;

HgS-produktion - Ingen.

Næringsagar

Vegetativ vækst - Lys tan;

Luftmycelium - Intet.

Opløseligt pigment - Intet.

Næringsstivelseagar

Vegetativ vækst - Cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Hydrolyse af stivelse - God.

8 145504 Næringsgelatine agar

Vegetativ vækst - Cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning af gelatine - God.

Gelatinestik

Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning af gelatine - komplet.

Skummetmælk agar

Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Hydrolyse af casein - God.

Lakmusmælk

Vegetativ vækst - Tan vækstring;

Luftmycelium - Intet;

Farve brunlig purpur;

Koagulation og/eller peptonisation - Komplet peptonisation, bliver alkalisk, pH = 8,0.

Skummetmælk

Vegetativ vækst - Tan, moderat vækstring;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Lysebrunt;

Koagulation og/eller peptonisation - Komplet peptonisation, bliver alkalisk pH = 8,5.

Kartoffelstykker

Vegetativ vækst - God, tanfarvet;

Luftmycelium - Meget sparsomt, hvidligt;

Opløseligt pigment - Intet.

Loefflers blodserum

Vegetativ vækst - Cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning - Ingen.

Tyrosinagar

Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af mediet; 9 145504

Dekomponering af tyrosin - Meget svag.

Alle ovennævnte observationer blev gjort efter tre ugers dyrkning ved 28° C, medmindre andet er anført. pH-værdien' af medierne var tilnærmelsesvis neutral, nemlig 6,8 - 7,2. De anvendte farvebetegnelser er i overensstemmelse med definitionerne i Color Harmony Manual, 4. udgave (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois. ;

Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 blev også prøvet for evne til at udnytte eller assimilere forskellige carbonhydrater. Til dette fonnål blev mikroorganismen dyrket i et basalt syntetisk medium (Pridham and Gottlieb) indeholdende 1% af carbonhydratet ved 28° C i tre uger. pH-værdien af de anvendte medier var tilnærmelsesvis neutral (6,8 - 7,2). Tabel II viser udnyttelsen af disse carbon-hydratkilder af Streptomyces flavogriseus NRRL 8140, idet + angiver god vækst, - dårlig vækst og - ingen vækst på det pågældende car-bonhydrat.

TABEL II

Glucose + Maltose +

Arabinose + Mannitol +

Cellulose - Mannose +

Fructose + Raffinose i J.

Inositol - Rhamnose +

Lactose + Saccharose i

Xylose + Mængden af vækst ved forskellige temperaturer og oxygenbehovet for mikroorganismen fremgår af følgende:

Temperaturområde (Gærekstrakt-dextrose + saltagar); 28° C - God 37° C - Moderat vegetativ vækst, ikke lufthyfer 50° C - Ingen vækst

Oxygen-behov (Stikkultur i gærekstrakt-dextrose + saltagar);

Aerob 10 145504

Som carbonkilde i næringsmediet anvendes i almindelighed carbonhy-drater, såsom f.eks. dextrose, glucose, fructose, maltose, saccharose, xylose og mannitol, samt stivelse, f.eks. dextrin, korn, f. eks. havre, rug, majsstivelse, majsmel og lignende, alene eller i kombination. Den nøjagtige mængde carbonhydratkilde i det anvendte medium afhænger delvis af mediets øvrige bestanddele, men i almindelighed er det hensigtsmæssigt at anvende carbonhydrat i en mængde mellem 1% og 6% efter vægt af mediet. Disse carbonkilder kan anvendes enkeltvis, eller flere sådanne carbonkilder kan forenes i mediet. I almindelighed kan benyttes mange proteinholdige stoffer som nitrogenkilde ved gæringsprocessen. Egnede nitrogenkilder omfatter f.eks. gærhydrolysater, primær gær, sojabønnemel, bomuldsfrømel, hydrolysater af casein, majsstøbevæske, distiller's solubles eller tomatpasta. Kilderne for nitrogen, enten alene eller i kombination, anvendes i mængder mellem 0,2% og 6% efter vægt af det vandige medium.

Blandt uorganiske næringssalte, som kan forekomme i dyrkningsmediet, er de sædvanlige salte, som kan give ioner af natrim, kalium, ammonium, calcium, magnesium, phosphat, sulfat, chlorid og carbonat. Også spormetaller, såsom cobalt, mangan og Jern, bør være til stede.

Gæringen udføres ved temperaturer mellem 20° og 37° C; for optimale resultater foretrækkes det dog at udføre gæringen ved temperaturer mellem 23° og 28° C. Begyndelses-pH-værdien af næringsmediet ved dyrkning af Streptomyces flavogriseus til fremstilling af antibiotika 890A2 og 890A^ kan variere fra 6,0 til 8,0.

Selv om de antibiotiske stoffer 890A2 og 890A^ produceres både ved overfladekulturer og neddykkede kulturer, udføres gæringen i neddykket tilstand.

Ved gæring i lille målestok er det hensigtsmæssigt at pode et egnet næringsmedium med den udvalgte kultur, som derefter overføres til et produktionsmedium, hvorpå gæringsprocessen bringes til at forløbe ved konstant temperatur på ca. 28° C i et rysteapparat i flere dage.

Gæringen indledes i en steril kolbe af næringsmedium ved et eller flere podningstrin. Næringsmediet til podning kan være enhver eg 11 145504 net kombination af carbon- og nitrogenkilder. Podeflasken rystes ved konstant temperatur ved ca. 28° C i en dag, eller indtil væksten er tilfredsstillende, og en del af den dannede vækst anvendes til podning enten af næste podningstrin eller af produktionsmediet. : Hvis der anvendes flere podetrin, udvikles de i det væsentlige på samme måde, d.v.s. indholdet af kolben frå sidste podningstrin anvendes til podning af produktionsmediet. De podede kolber rystes ved konstant temperatur i flere dage, og efter afslutningen af dyrkningsperioden bliver kolbeindholdet centrifugeret eller filtreret .

Ved arbejde i stor målestok foretrækkes det at udføre gæringen i en egnet tank, der er udstyret med omrører' og luftningsorganer fbr gæringsmediet. Ved denne metode indføres næringsmediet i en-tank, som steriliseres ved opvarmning til temperaturer op til 120° C.

Efter afkøling bliver det steriliserede medium podet med en fonid dyrket podekultur, og gæringen bringes til at forløbe i et tidsrum på f.eks. 1-6 dage under omrøring og/eller luftning af næringsmediet, medens temperaturen opretholdes ved 24° til 28° C. Denne metode til fremstilling af antibiotika 89OA2 og 890A^ er særlig egnet til fremstilling af store mængder antibiotika.

Fysiske og kemiske egenskaber for antibiotika 890A2 og 890A^

Egenskaber af antibiotikum 890A2

Antibiotikum 890A2 er et surt stof, som bevæger sig mod den positive pol ved elektroforese ved neutralt pH.

Natriumsaltet af antibiotikum 890A2 er et hvidt pulver, som lyo-philiseres fra vandig opløsning, og som er let opløseligt i vand.

Det ultraviolette absorptionsspektrum har maxima ved 308 og 228 nm og et minimum ved 262 nm. E% ved 308 nm af natriumsaltet af antibiotikum 890A2 i vand ved neutral pH er vurderet til større end 490. Forholdet mellem absorptionsværdierne, A^qq/A^q, er 1,91» og A308^A228 er 1,02 for de ^edst opnåede prøver; tegn på små mængder urenheder, som resterer i disse prøver, antyder at forhol- 12 145504 dene kan være en smule højere for en prøve af særlig renhed.

Mere end 80% af absorptionen ved 308 nm kan fjernes ved omsætning med hydroxylamin, og en tilsvarende formindskelse observeres ved reaktion med cystein. Absorptionen ved 260 nm efter sådanne reaktioner forøges med ca. en fjerdedel af størrelsen af A^Qg-formind-skelsen. Under betingelserne beskrevet i sektionen med overskriften Bioforsøg III til bestemmelse af HAEA^gg-værdier viser reaktionskinetikken sig at være af første orden med en halveringstid ved stuetemperatur mellem 0,5 og 1,5 minutter.

I efterfølgende tabel er anført 100 MHz-NMR-signaler for 890A2-natriumsalt i D20 i forhold til den interne standard, natrium-2, 2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat, i det efterfølgende anført som DSS; kemiske skift er angivet i ppm, og koblingskonstanten i Hz; den tilsyneladende multiplicitet er anført.

1,33 (d, J=6, CH3-CH); 2,07 (S, CH3C=0); - 3,15 (m, C-CH2-C7f 3,69 (m, >0Η-0=ϋΤ; ~4,3 (>CHN og”~?CH-0H), 6,09 og 7,12 (dubletter, J= 13,5, S-CH=CH-N).

Den antibiotiske aktivitet for 890A2, målt på Vibrio percolans ATCC 8461 som beskrevet i sektionen med overskriften Bioforsøg I, er ca. 180 enheder pr. HAEA30g-enhed

Egenskaber for antibiotikum 890A5

Antibiotikum 890A3 er et surt stof, som bevæger sig mod den positive pol ved elektroførese ved neutral pH.

Natriumsaltet er et hvidt pulver, når det lyophiliseres af en vandig opløsning.

Det ultraviolette absorptionsspektrum har maxima ved 308,5 og 228 nm og et minimum ved 262 nm. Έ.% ved 308,5 nm af en opløsning af natriumsaltet af antibiotikum 890A3 i vand ved neutral pH er bedømt til 490 for en ren prøve. Forholdet mellem absorptionerne A308/A260 er 2>°> og forholdet A3oq^A228 er 1»^· Mere end af absorptionen ved 308 nm kan fjernes ved omsætning med hydroxylamin, 145504 hvorved fås et produkt med forøget absorption ved 260 nm. Størrelsen af A2g0-forøgelsen er ca. en fjerdedel af A^g-formindskelsen. Kinetikken af A^g-formindskelsen under de beskrevne betingelser for måling af HAEA^qq viser sig at være af første orden, idet halveringstiden ved stuetemperatur ligger mellem 1 og 3 minutter.

Det cirkulære dichroisme-spektrum af 890A^ har et positivt maximum ved 304 nm med en specifik ellipticitet på 7189 grader-ml pr. decimeter-gram, et nulpunkt for ellipticitet ved 257,5 nm og et negativt minimum ved 220 nm med en specifik ellipticitet på -21,218 grader-ml pr. decimeter-gram. Ved beregning af disse værdier blev koncentrationen af 890A^ bedømt ud fra absorptionen ved 308 nm under anvendelse af en E#-værdi på 490 ved den nævnte bølgelængde.

I efterfølgende tabel er anført 100 MHz-NMR-signaler for 890A^-natriumsalt i D20 i forhold til den interne standard DSS; kemiske skift er angivet i ppm, og koblingskonstanterne i Hz; de tilsyneladende multipliciteter er angivet.

1,29 (d, J= 6,2, CH^-CH); 2,05 (S, 0^0=0); 3,09 (app. d af d, C-CHo-C); 3,41 (d af d, J= 5,0, 3,0, >CH-C=0); 4,16 (mpCH-N og >CH-0H); 6,00 og 7,11 (dubletter, J= 13,8, S-CH=CH-N),

1 1' J

Den antibiotiske aktivitet af 890A^, målt på Vibrio percolans ATCC 8461, er 12 enheder pr. HAEA^Qg-enhed.

Massespektral-Analyse af 890A2 og 890A^

Massespektraldata for 890A^ er opnået på trimethylsilyl-derivater T fremstillet af ammoniumsalte af det antibiotiske stof med bis-trimethylsilyltrifluoracetamid i dimethylformamid. Omdannelse af natriumsaltet af det antibiotiske stof til ammoniumsaltene udføres ved anvendelse af ammoniumsaltet af en sur ionbytterharpiks. ' '

Trimethyl-silylering af 890A2 og 890A^ resulterer i tre forskellige derivater: et di- og et tri-methylsilyl-derivat (M.V. 456 og 528, respektivt) og en lille mængde tetra-trimethylsilyl-deri vat af et -· ' * 14 145504 hydrolyseret produkt (M.V. 618), hvori β-lactam-ringen er åben.

Værdierne for de vigtigste massespektrale fragmenter er givet nedenfor: di-trimethylsilyl-derivat: 44l; 229; 298 og 84; tri-trimethylsilyl-derivat: 513; 371 og 156; tetra-trimethylsilyl-derivat (kun signal med lav resolution observeret): 618 og 603.

Antibiotika egOAg og 890A^ er isomere med molekylstrukturen:

CH,-CH(0H)-rA S

- s)-S-CH=CH-NH-C-CH, Λγ

C00H

Antibiotika 89OA2 og 890A^ karakteriseres yderligere ved de følgende antibiotiske spektrum-profiler.

Prøven til bestemmelse af den antibiotiske spektrum-profil for antibiotikum 890A2 udføres ved mætning af papirskiver med en diameter på 6,35 mm i en opløsning af antibiotikum. 890A^ i 5% methanol ved en koncentration på 5 pg/ml, lufttørring af de mættede papirskiver og anbringelsen af disse på overfladen af 100 x 15 mm petri-plader indeholdende 5 ml podet næringsagar plus 0, 2% gærekstrakt.

Prøven til bestemmelse af den antibiotiske spektrum-profil for antibiotikum 890A^ udføres ved anvendelse af en 0,015 ml dråbe af en 33yUg/ml vandig opløsning af det antibiotiske stof på overfladen af en 100 x 15 mm petriplade indeholdende 5 ml podet næringsagar plus 0,2% gærekstrakt. Resultaterne, udtrykt som diameter i millimeter af inhiberingszonen, fremgår af tabel III,

Spektrene for antibiotikum 89OA2 og 890A^ er næsten ens, bortset fra resistensen af 890A^ mod en inaktivering med Difco penicilli- 15 14550Λ nase og med lactamase(r) produceret af en cephalosporin C-resis-tent stamme af Vibrio percolans (MB-2566). Resultaterne angiver også, at antibiotikum 890A2 er væsentligt mere aktivt end 890A^.

Η· 145504 16 $ • θ' α η η icocnooi'Pt-'Oinoin οί νο γί ο Η ΟΊ MfOCS^fO CN (Ν ΟΊ ΓΟ ΟΊ ir < ο S σ' ε co, ** ΙΠ · < ε η 0 nj ε σι . ·Η "Ν.

οο Ο · &> Μ e ^ ° Ο m Ν CM 1 (Sj · Ο ja r^Oi-IOM'S'fJCSOC^'a'Cri η rH <Τι σ> ·Η pC ^ Η c\)fon*^i<roHnc\jni*ieNi co j3 ο . C σι 3 Η £0 Ημ •Η ν +> ο •Η Λ ·Γ*Ι · Ρ Ο ag ft fd _1 υ ι I ι ο 00 m 5 mt'- Η 6. υι I ισιηπα.' ΙΗΗ ! νο ι

- & σι in ό oJ I I ν w I ·ρτ I

™ ^ »19 -=ρ 03 ft

Ui Η rtj Η --- Η *4 Γΐ Η ·Η · Β ι« ο 2 ο g <μ S a m Η σι οο η co ιη η ο f' cn in cn η

1 ο νο Η σι I I I Ι ΙΟΓ'Ι I H 1 CO

% g 1 1 1 1 1 1 1 ^ ^ 1 1 Pj’ffj £ <u ft w fl)

•H

n 0 ^ ni aj RI 10 X Π} TO Ό

trt TOM TO-H-HgP

<3 03 3HTO-3P0 ίΙ CTOCJ (UTO-HftM +» η *H C! J-) JJOHOnJ ιβ h bifljpm portae o

3. TO d O Hi *H (dnJO-rf-HTO-H

-H 5-1 TO Η Ή Q) J5 H a TO

O 5-1 Q) Q) TO Ή TO nJOHnJd) }j ddUp+iddMii-i« d H > +> *1 tn yujaaiod ocno

•rl aJHWrtOd-UOOTOM OTO

> .-. raldnsgOTOpoodi^i d M d <13 >a ο η o o a hoc

d I g TO OdOTO Ο O <D «5 H ft| Q

h| radrag'WHdnJHOtJ’rH a _ g

·ΗΗ3θΡ>ιΗβ>ι+;·ΗΗ gOO

CH (DO ΠίΛΗΉΛ ft.H 0) 0·ΗΛ

d-rijJdPft*rioft<i>dO ε P -P

ooooPnsoMnjpod h ja a

HdPW<D-Pdd-P-PHM d -H d omftfttQtQWcQwtn«a;m w>n 145504 17 i i I β m η o f) o vo i p cd

CM CM H CM CM CM nCM CM n^JCM r-i 00 I >> <H

I B H

I O 3 i +3 ra I ft I Φ 60

I β O

I P I ra H

r B

I 60 < I O 60 ! β.4 i ·η m

I O CM I

i s »cd r~ <-3. 1 ¢) ft ocMcr>r-ir'-vocnina>cMCM h rn cm rj ncoHcocMCMHcocMCMcn Hcnoj h IJtJ o

I -H

I - p i H at I o u

I O -P

I -Η β +3 I β ©., ra Λ β p I ft ¢)

U \ Β X

Ο O Γ- VO CM £ , I ! ? M

<HO O VO rpCO . . . , ! I β β wHIVOIl'tfll'-coJI ( { { ! I O 0)

Η I Η I I rp I <Λ σι 1 I III I I H

H CM . H ! .β τ) H IQ© H j ^ > pi . i a β

μ I ·Η P

CQ I Η O

<5 I O t>>

&H CM CM J '>» S

3 Sen S gSS3S3§§ g. § nn 00 CO CO mH H σ>Η ΓΓ* } P> ^ Η H £ CM CMCM tMCMCO « A . i ^ « tii^gigiigg ggi Is § j ^ ° ! o 's I S < I 60 ! 2 =l ' i β M I CD o

_ ......- © I -p CM

. at P i μ jfi P Q I P °a( α β © m S 1 M; ft P © «3 6 2 οι n 1 Φ Ο © P Ο Η © Ο I β £

«30 *H W W w2m· O

© MO 6 P P P “ X © © I β Ή •rl ret CO 0 3 30© ft 3 J*** i © p Μ P © © β © Τ* ** 2 *2 2 +Η + ! > 03 © β β Ο Ρ © Ο Η β „ 3 "Ρ + ϋ! + Γ Ρ β Ν Ο © Ρ θ' ft © © „ η,232 Bild to I 60 pi m P P S &ι P 3 P © Φ ^ •'«IS» S I £ * 3 ϊβ 33 jl· ! § 8 ·

S0“gSo“w°3So Soo'domo I 3 g J

«i la i * 8 i i s i I ?! §|iB I i :11 Π Jiiif tHisf Ufc iMii | * £ - -g § 8 *8 8 * 3 MO Μ μ λ “ 8 8-5 8 5 β a 8 I ^ * tj rn rn _j rt\ Jj tø O W +) jj Ή Ο Μ ^*^^ιΓ;5κΖϊ !,ρ 145504 18

Antibiotikum 890A2 udviser in vivo aktivitet mod gram-negative og gram-positive organismer og er derfor velegnet til bekæmpelse af bakterieinfektioner på dyr og mennesker. Ved bestemmelse af in vivo aktiviteten opløses antibiotikum 890a2 i 0,15 M NaCl, 0,01 M natriumphosphat, pH = 7,0, og fortyndes med vand til opnåelse af fem firdobbelte koncentrationer af lægemiddel for afprøvning.

Hvide schweiziske hunmus med en middelvægt på 21 g blev inficeret intraperitonealt med prøveorganismen suspenderet i væsken. Antallet af injicerede organismer blev bestemt ved standard pladetælling. På infektionstidspunktet og 6 timer senere blev nogle af musene behandlet intraperitonealt med det antibiotiske stof. Fem mus blev anvendt for hver koncentration af lægemidlet. Yderligere to mus, ikke inficerede, blev behandlet med det antibiotiske stof til bestemmelse af/ hvorvidt mængden af injiceret stof var giftigt. Kontroller på fem mus hver med flere fortyndinger af den inficerede kultur blev benyttet ved hver prøve for at beregne det antal organismer, som var dødelig for 50 % af de inficerede, ikke-be-handlede mus (LD^q). Denne beregning blev foretaget med overlevelsesdata den syvende dag efter infektion, på hvilket tidspunkt mængden af lægemiddel, som beskytter 50 % af de inficerede mus (ED^q) også blev beregnet.

Alle dyr, som blev inficeret på denne måde og ikke blev behandlet med antibiotikum, døde inden for 48 timer efter infektionen. Effektiviteten af det antibiotiske stof 890A2 med en aktivitet på 59 enheder/ml over for Salmonella schottmuellari MB-2837 fremgår af det efterfølgende:

Euh/ml. a Rute ΕΒ50^ο8ΘΓ 59 ip 19 al enh/ml er defineret under overskriften Bioforsøg I.

Antibiotika 890A2 og 890A^ er værdifulde antibiotiske stoffer, som er aktive over for forskellige gram-positive og gram-negative bakterier og derfor finder anvendelse i den humane og veterinære medicin. Forbindelserne anvendes alene eller i kombination med hinanden som antibakterielt lægemiddel for be- 145504 19 handling af infektioner forårsaget af gram-positive eller gram-negative bakterier, f.eks. over for Staphylococcus aureus, Proteus mira-bilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae og Salmonella schott-muellari, De omhandlede antibakterielle stoffer kan også anvendes som tilsætningsmidler til dyrefoder, til konservering af foderstoffer . og som desinfektionsmidler. F.eks. kan de anvendes i vandige præparater i koncentrationer fra 0,1 til 100 dele af antibiotikum pr. milliondel opløsning eller fortrinsvis i koncentrationer fra 1 til 10 dele antibiotikum pr. million del opløsning for at ødelægge og inhibere væksten af skadelige bakterier på medicinske og dentale instrumenter og som baktericider til industriel anvendelse f.eks. i vandholdige malinger og i industrivand til papirmøller til inhibe-ring af væksten af de skadelige bakterier.

De antibiotiske stoffer, som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan anvendes i forskellige farmaceutiske præparater som eneste aktive bestanddel eller i kombination enten med et eller flere antibiotiske stoffer eller med et eller flere farmakologisk aktive stoffer. Som eksempel på det førstnævnte kan nævnes et amino-cyclitol-antibiotikum, såsom gentamycin, der kan indføres for at formindske fremkomsten af resistente organismer. Som eksempel på sidstnævnte kan diphenoxylat og atropin kombineres i dosisform til behandling af gastroenteritis. De antibiotiske stoffer kan anvendes i kap-selform eller som tabletter, pulvere eller flydende opløsninger eller som suspensioner eller eliksirer. De kan indgives oralt, topisk, intravenøst eller intramuskulært. Yderligere kan antibiotika S^OAg og 890A^ anvendes i indbyrdes kombination.

Dosisstørrelsen afhænger af sådanne forhold som patientens vægt, infektionens art, indgiftsmåden og hyppigheden, idet den parent'e-rale indgift foretrækkes ved almindelige infektioner, medens den orale indgift foretrækkes ved infektioner i fordøjelsesorgahérne.

Ved behandling af bakterieinfektioner på mennesker indgives forbindelserne oralt eller parenteralt på i og for sig kendt måde i mængder fra 2 til 600 mg/kg/dag og fortrinsvis fra 5 til 100 mg/ kg/dag, fortrinsvis opdelt i flere doser, f.eks. tre til fire gange daglig. De kan indgives i enhedsdoser, f.eks. 100, 330, 400 eller 1000 mg aktiv bestanddel med passende fysiologisk acceptable bæremedier eller fortyndingsmidler. Doserne har form af flydende præ- 20 145504 parater, såsom opløsninger eller suspensioner, eller i fast form, såsom tabletter eller kapsler.

De ugiftige farmaceutisk acceptable salte af 89OA2 og 890Apj, er f.eks. farmakologisk acceptable salte dannet af uorganiske og organiske baser, herunder f.eks. metalsalte afledt af alkalimetal- eller jordalkalimetalhydroxider, carbonater eller bicarbonater, såsom afledt af natrium, kalium, ammonium og calcium, samt salte afledt af primære, sekundære eller tertiære aminer, såsom monoalkylaminer, dialkylaminer, trialkylaminer, lavere alkanolaminer, di-lavere-alkanolaminer, lavere alkylendi-aminer, Ν,Ν-diaralkyl-lavere-alkylendiaminer, aralkylaminer, amino-substituerede lavere alkanoler, N,N-di-lavere alkylamino-substituerede lavere alkanoler, amino-, polyamino- og guanidino-substituerede lavere alkansyrer og nitrogen-holdige heterocycliske aminer. Repræsentative eksempler omfatter salte afledt af natriumhydroxid, ammoniumhydroxid, natriumcarbonat, natriumbicarbonat, kaliumcarbo-nat, kaliumhydroxid, calciumcarbonat, trimethylamin, triethylamin, piperidin, N-ethylpiper'idin, morpholin, quinin, lysin, protamin, arginin, procain, ethanolamin, morphin, benzylamin, ethylendiamin, N,N'-dibenzylethylendiamin, diethanolamin, piperazin, dimethyl-aminoethanol, 2-amino-2-methyl-l-propanol, theophyllin og N-methyl-glucamin.

Saltene af de omhandlede forbindelser fremstilles på i og for sig kendt måde. F.eks. kan monosaltene, såsom mononatriumsaltet, fås ved behandling af et ækvivalent natriumhydroxid med et ækvivalent af produktet (i) i et egnet opløsningsmiddel. Også blandede salte med divalente kationer kan fremstilles ved at kombinere et mol af en divalent base med et mol af produktet (I) plus et ækvivalent af endnu en syre. I stedet kan salte fås ved behandling af et ækvivalent af en base med en divalent kation, såsom calciumhydroxid, med et ækvivalent af produktet (I). Saltene er farmakologisk acceptable ikke-giftige derivater, som kan anvendes som aktiv bestanddel i passende enhedsdoser. Disse kan også forenes med andre lægemidler til fremstilling af præparater med et bredt aktivitetsspektrum.

Gæringsvæsker indeholdende antibiotika 890Ap, og 890A^ fremstillet ved den beskrevne dyrkning har aktiviteter fra 21 U5504 2 til 170 enheder pr. ml, når de prøves ved skive-diffusionsprøven under anvendelse af Vibrio percolans (ATCC 8461). De i disse gæringsvæsker indeholdte antibiotiske stoffer 890A2 og 890A^ kan udvindes og renses på flere måder. En sådan fremgangsmåde omfatter adsorption af antibiotika 89OA2 og 890A^ på en stærkt basisk anion-bytterharpiks. Typisk for sådanne stærkt basiske anionbytterhar-pikser er sådanne, som har en styren-divinyl-benzen-matrix, f.eks. polystyren-nucleær kvaternær ammonium-harpiks Dowex 1x2 (fremstillet af Dow Chemical Co., Midland, Michigan) på chlorid-cyclus. Andre repræsentative medlemmer af denne klasse af stærkt basiske ionbytterharpikser omfatter følgende: Duolite A-40, A-42, A-101, A-102 og A-114 (fremstillet af Chemical Process Co., Redwood City, California). Amberlite IRA-400, IRA-401 og IRA-410. I stedet kan anvendes en svagt basisk anionbytterharpiks, såsom Amberlite IRA-68. (Amberlite fremstilles af Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania).

Det adsorberede antibiotikum elueres let fra anionbytterharpiksen med saltopløsninger i 50 % (v/v) vandig methanol. Det således opnåede eluat kan om ønsket renses yderligere ved andre rensningsprocedurer. Således kan eluatet renses ved inddampning og gennem-ledning gennem en kolonne, der er pakket med en acrylester-polymer af intermediær polaritet, såsom XAD-7 eller 8, eller gennem en kolonne pakket med en polystyren, ikke-polær, hydrophob tvferbundet divinyl-benzen-polymer, såsom XAD-1, 2 og 4, fortrinsvis XAD-2.

(XAD-1, 2, 4, 7 og 8 fremstilles af Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia 5» Pennsylvania). Ved denne proces sker en delvis adskillelse af antibiotikum 890A2 og 890A^. Fraktioner med højt indhold af 890A2 og fraktioner med højt indhold af 890A^ opsamles hver for sig. Disse opsamlede fraktioner renses yderligere.

En metode til at opnå yderligere renset antibiotikum 890A2 og 890A^ består i anvendelsen af gel-filtrering gennem polyacrylamid-gel med en porestørrelse, som udelukker molekyler med en molekylvægt større end 1800, såsom Bio-Gel P-2 (fremstillet af Bio.Rad, Richmond, California). Andre geler, såsom Sephadex G-10, kan også anvendes til afsaltning.

Den foretrukne procedure, hvorved antibiotika 890A2 og 890A^ kan 22 145504 fås af høj renhed ud fra gæringsvæskerne, omfatter en centrifugering eller filtrering af væsken til fjernelse af faste stoffer; en adsorption af filtratet på en anionbytterharpiks, såsom Dowex-1 x 2 på chlorid-cyclus, og eluering med 3 % NaCl i 50 % (v/v) vandig methanol, som både koncentrerer og delvis renser de antibiotiske stoffer; passage over en kolonne af passende præpareret XAD-2, der tilbageholder de antibiotiske stoffer, hvorved Dowex-1 x 2 eluatet renses og afsaltes. Yderligere vil antibiotikum 890A^ holdes mere tilbage end antibiotikum 890A2, således at de to antibiotika delvis adskilles. Fraktionerne med højt indhold af 890A2 og 89OA^ samles og renses yderligere. Chromatografi på en Dowex-1 x 2 minus 400 mesh harpiks under eluering med natriumchlorid og/eller ammoniumchlorid i 50 % vandig methanol, giver et produkt befriet for de fleste UV-absorberende urenheder (ammoniumchlorid anvendes til at opnå nogen puf ringskapacitet i elueringsmidlet); og en afsaltning på Bio-Gel P-2 eller Sephadex G-10 fjerner hovedparten af saltet indført ved Dowex-1 x 2 chro-matografi.

Når væske med lav aktivitet behandles ved ovennævnte procedure, kan slutmaterialet have en betydelig mængde (mere end 50%) af tilbageværende urenheder. Disse urenheder kan reduceres ved endnu en cyclus af chromatografi på Dowex-1 x 2, minus 400 mesh, med eluering med en opløsning indeholdende natriumchlorid og 50% iso-propanol. Det er tilrådeligt ved isolering af antibiotisk stof fra væsker med lav aktivitet at udføre endnu en chromatografi med XAD-2. Derved opnås en yderligere rensning, fjernelse af resterende salt og delvis adskillelse af antibiotikum 890A2 fra 890A^. 890A^ eluerer senere end 890A2, og de to kan adskilles ved deres forskellige forhold af bioaktivitet til HAEA^qq. Sådanne fraktioner, som demonstrerer et forhold af bioaktivitet mod Vibrio percolans ATCC 8461 til HAEA^og på 180 bioaktivitet senheder pr. HAEA^qq-enhed indeholder antibiotikum 890A2, og sådanne fraktioner, som udviser et forhold for bioaktivitet mod Vibrio percolans ATCC 8461 til HAEA^qq på 12 bioaktivitetsenheder pr. HAEAj0g-enheder indeholder antibiotikum 890A^.

Ved rensning ved søjlechromatografi bliver i almindelighed kun de fraktioner af de eluerede rumfang, som indeholder antibiotikum - I. ' ' 23 145504 på mindst 30% af renheden for den reneste fraktion, kombineret til yderligere rensning. Kriterier for renhed er forholdet bioaktivitet/ Α220» A308^A260 HAEA^o8/A22o» °S> ved afsaltnings procedurer, ledningsevne. Ved hvert chromatografisk trin måles således Α220» ^260’ ^308 kioaktiviteten af de pågældende fraktioner. Om muligt måles også HAEA^qq, og ved afsaltning måles ledningsevnen. Kriterier for afgørelse af hvilke fraktioner, der skal forenes i de efterfølgende operationer, kan reguleres noget til opnåelse af større udbytte på bekostning af renheden eller omvendt kan der opnås højere renhed på bekostning af udbyttet.

I laboratorieskala (mindre end 20 liter prøverumfang) udføres alle chromatografiske trin med undtagelse af XAD-2 chromatografien i et koldt miljø ved 2-5°C. XAD-2 chromatografi udføres ved stuetemperatur, med mindre andet er angivet. pH-værdien af antibiotiske opløsninger, som skal opbevares, indstilles på 7-8 ved forsigtig tilsætning af fortyndet natriumhydroxidopløsning eller saltsyre. Vandige opløsninger opbevares i køleskab eller fortrinsvis i isvand, og 50% methanolopløsninger opbevares ved -20°C.

Ved rensning forud for et XAD-2 chromatografi indstilles opløs·? ninger sædvanligvis til 25 yuM i EDTA ved tilsætning af en 1/4000 rumfang af en opløsning af 0,1 m Na2EDTA, som er neutraliseret til pH-værdi på 7,0 ved tilsætning af natriumhydroxid (0,1 M "neutral EDTA").

I det efterfølgende er vist et diagram over rensningsproceduren for opnåelse af antibiotika 89OA2 og 890A^.

i§ 145504 24 Η

O

s ft -g O) o 3

ΪΗ W

ω , d^S.

U UO (DO

-p <dh eia - CP i

0) GO GtP O O <D ........."I

C »i X 3 mo

cM ΟΌιιιΗΪ H

< 3d dd dg 1 g «2 — - “

® *? £ S

S ÆO .2 ► Ό 3 røpq H S cd-μ

O U inn Λ S

«j B g + X O -P Q. H

-P B £9 2 ω h

OO^C^ 5"?^ CO W

H O . 5 * Γ3 ,-h p Hin s* Q^W 0

•Η I CM P, .............—I C

-p o , j cd c in + α <2 ^ HH Λ| o

H OO W M

p W £3 _ u , i Oh

0 I SC I ro β> _ + O

CnHIwi OWO

w Gi ΉΪ d ω ω hojhJ

C3 wH P <D 0^ W S iS9 Q) k &-* s Ό0 X Θ <J <» "o W&* S» oSS h

1 *5 SR I »i S83S.H SS

1 3°. 0·- c°i ‘h«°. isa .5 ® +c - ®£ -sg^g * £3 G Η Μ 3 Ε Pd iin.

m o HG ® a ω £ Gags £ g1 2 qh ow s to c fl«^e £ g, m Od OHM > G P I H S .5*

’ G ffl SH P 3c hP.G'HGO

* pigfl ί P (AD G Ρ Ρ Οι I (DO

vi j 3d< > 3 GGdrH30

η .p3E.d?AP do ο Go fio'DUH

PhO^H ΠίΉ Φ O

_p 'do fo co ·η 4h d) i to icddofi -- !Ci s 0) ω CD ε Η H CM ΙΙΛ S DEE S <'---' i'-'

W 03333 d ^ I

CQ CO W 3 1 Ό Cd Cd H in I 1 ,

(d > p> d) CM

jd u I CM w x ^ d) HC\JNW d) i , ,¾

bn a) —'w'n^/W S HO

33d a pcmp i» (H (0 ΗΟΟ ω i d ke+J >s.

ft ί> XHSP c5h T g^3 C

P (Did <|XH T OOH O

SP £OS&3 _— I s Qina (j\

CD (D OlAOH I „ “> __J Leo J

O G O'-'inH I oT1 8 o hr1 j ·* B ° a.

Μ'-' H + H

P 33+0 -H i«i O

Cel CM ω HWOH tfi I I 'c ΙΟΗΟΟΙΛ 3d q q locMXSo-dg «ώ

3 a 1 p -a! ® d O a a 33P

^ X I posios , f>* ο o 1 3<ίσιο oo_ + ss <d a

H CM H CM I dCO <DQ-i2 H CO H W

GC PE PSC I ti S C-HOOO *. r, 0)Em SiP BP .PdHlOOOG-OH Ho jo ,¾

hop (Dd dd dd-H3 - s+d Ο Ο Ο P ir\£ ” S

30 u U (D BB® 1 Bn G (DP dO£33_ -Q t*+>^S g dp poe pda idoapaPOodd ti ijl d-HP 33 33 iGdGadddEBiGdg p □

PbI dGG ®bb i PHdowdsa a+p pgsl §d

-μ-Ρω ood ood I 3 0 33 Bin d GP„cm g S

BBH B®3 G(03 I 033^.^-^ OSBHa d B BO 2 g1

Odd OdH O d H |ddPOl3xiOCdO OOd- gp chop Xdd 3idd . BdBBria pa 3 -JS5. fi ω 3 ο H fy

OGOdOdO HEO OdH * P

3d p P d—' > HdgiA3ddd+ ^

HCMIA HCMIA HCMtA | H CM

^ I H CM IA <f IA HCMIA

/·---CMP I P

s \ i d I d /l I 60 \ q3 ---- K3

/ Μ Η O \ <(H dH

/hoo \ xh i d&a _ I 3 1)3 11) (VIIA U > d I -H 3d d d <3 <3 I " d -Η d 30

\ GradGOO / PPP ftH

\ (B SB G dCTiCTi / H d 3 d I

\ O >Pd&co/ <BB COO

—I 25 145504 CM -P O cd _MO? _

-► H

H W i ra

M O

® gxi Η cm £ ·η tø i ο S ω ϋ

«2+5η LårU T

H W H O O ΗΦ JA P' i mood 9¾¾ xsmoS £ ^ ® s *p

i o o o Λ PS V

CMP-cTN+P ® wg UJOO S O 'Tjv> H tø **H tø _H*> P ^ ΐτΙ30ϋ·Η -ti-HO ® _ ^ Q)+5fj<J· dl Φ -P R B S 2 a-H'dffi^. ®a ^ -p φ iA s „85§§s 11¾¾ £,£-, i, IRh S &t c 8 g » s c SSinSS« S£3SS ,. .2¾¾

^ PlCd-®og .««Η cd Φ a 1- 25 S

i S3 $ lo^- S cd H Cd ί 13 a PtCSH jr g φ w f I ra i T- k s s« i I-TI Ah •S I P. „„ S« " t ,i° S« o o p cdq Ω <n ^a-^ ^ i— o x ., p w widi ^ Φ di CM 1 , S d o h°o d * |n|g S §*£ -'s* |p|.s § ρ,^ίΗ it- ®HC0(l S oHtøfco M oin e$H° ej Iffij -Η ·Η ^ + ·Η tf ^ d o k tø <! Φ*ΗΗ HH ^ ro mm § assi si a§ i^sIh ts u »a». Il-&E alUSa| ch +3 o X! s* s Φ £>-P di di 3 ® x! m øpw*H ο-Ρμοφχ! op •Η Θ ΦΗΟ ^ ^ Td tø p -P 30

Jj Ha "O OOfl-dH® o {* φ __ tdH OO ,¾ <H ·Η Cd Φ Β ΛΗ

a “ d®-PO

^ φ I 2 M®°H H CM ΙΑ<Τ H CM

CQ S PH -PtJ Φ a + o ^ ^ -w — 0 o dd-pg, ,g •Η · Φ !>,di 3 diH 3 r .-.0--.

-p im o-p o ΰ ®ud Λί<!·Η f|f(«Tld # -i ,.

cdosn o ord BHpd Φ fnC^ Λ Ή Λ'-' ®S a M yS.

'H 00 H tø , > 1 φ H <! P Φ f5 O HCMIA <1· I o ^τ) Φ o ------- ^ _ KP Si

>< G -O dr --► ® ® V® S

® p > 3 N/ Φ H tj Od

C) Η Φ Φ AH

® o > d dl x! F Φ Φ -P H dl τ3 Φ &0 O £ocd £ fcrd d Cd 26 145504

Prøveprocedure for Antibiotika 89OA2 og 890A^ 1. Bioforsøg

En agar-plade skive-diffusionsmetode anvendes med enten Vibrio percolans ATCC 8461 eller Salmonella gallinarum MB-1287 som prøve-organisme. En renset prøve af antibiotikum 890A-^ anvendes som standard. Antibiotikum 89(^ fremstilles ved proceduren nedenfor.

Plader indeholdende Vibrio percolans ATCC 8461 fremstilles på følgende måde:

En lyophiliseret kultur af Vibrio percolans ATCC 8461 suspenderes i 15 ml af et steriliseret medium indeholdende 8 g/liter Difco næringsvæske og 2 g/liter gærextrakt i destilleret vand "næringsvæske-gærextrakt" (i det efterfølgende betegnet NBYE).

Kulturen dyrkes i 18 timer i et roterende rysteapparat ved 28°C.

Denne kultur anvendes til podning af overfladen af skråkulturer indeholdende 1,5% agar i NBYE, og de podede skråkulturer dyrkes i 18 timer ved 28°C og opbevares derpå i et køleskab.

De afkølede skråkulturer fremstilles ud fra en enkelt lyophiliseret kultur og anvendes i op til fire uger fra fremstillingen på følgende måde: En podenål med podemateriale fra skråkulturen dispergeres i 50 ml NBYE indeholdt i en 250 ml Erlenmeyer kolbe. Kulturen dyrkes i 18 timer i et roterende rysteapparat ved 28°C og fortyndes herefter til en koncentration, som giver 50% transmission ved 66Ό nm. En 33,2 ml portion af denne fortyndede kultur sættes til 1 liter NBYE indeholdende 15 g agar og opretholdt ved 46°C.

Det podede agarholdige medium hældes i 100 x 15 mm petriskåle af plast, 5 ml pr. skål, afkøles og opretholdes ved 2-4°C i op til fem dage forud for anvendelsen.

Plader indeholdende Salmonella gallinarum MB-1287 fremstilles på følgende måde:

Et tilsmeltet prøverør indeholdende celler af Salmonella gallinarum MB-1287 i skummet mælk, som er blevet frosset og lyophiliseret og 27 1A 5 5 Ο Λ tilsmeltet under vacuum, åbnes og podes i 15 ml hjerne-hjerte-infussionsvæske. Cellerne bringes til at vokse uden rystning ved 37°C i 18 timer, og kulturen podes på skråkultur af 0,8% BBL næringsvæske +0,2% Difco gærextrakt +1,5% agar. Efter vækst i 18 timer ved 37°C overføres en podenål af kulturen fra skråkulturen til en kolbe indeholdede 50 ml 0,8% næringsvæske + 0,2% gærextrakt. Kolben rystes i 18 timer, og 20 ml af denne kultur podes i 1 liter 0,8% næringsvæske +0,2% gærextrakt + 1,5% agar, som er steriliseret og afkølet til 48°C. Den podede NBYE-agar hældes straks i 100 x 15 mm petriskåle af plast, 5 ml pr. skål, og pladerne opretholdes ved 2-4°C indtil anvendelsen.

Skiver af filtrerpapir med en diameter på 12,7 mm dyppes i opløsningen, som skal prøves, og anbringes på agarpladen* I stedet kan skiverne vædes ved påføring med en pipette af 1/10 ml af opløsningen på en tør skive, som derefter anbringes på agarpladen. Diameteren for inhiberlngszonen måles efter en passende dyrkning (9-18 timer ved 37°C for Salmonella gallinarum MB-1287 eller 12-24 timer ved 25°C for Vibrio percolans ATCC 8461). Om fornødent foretages fortynding af opløsningerne, som skal afprøves, i 0,05 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 "kaliumphosphatpuffer" (i det efterfølgende omtalt som KPB), eller i afioniseret vand.

Beregninger af aktiviteten udføres på følgende måde: en hældning bestemmes ved måling af zonediametrene af en opløsning af antibiotikum 89OA2 eller 890A^ og en firdobbelt fortynding (i KPB) af denne opløsning. To skiver af hver koncentration prøves på en enkelt plade, og den gennemsnitlige zonestørrelse ved hver koncentration måles. Hældningen er lig med halvdelen af forskellen mellem middelzonestørrelserne. Aktiviteterne beregnes derefter af følgende formel: Aktivitet (enh./ml) - /[D-D ] log 2Λ (Aktivitet af Standard) x fortynding x 10 y rfn-Tng-) * hvor D er middeldiameteren af zoner dannet af den tikendte, Dg er middeldiameteren af standardzonen, og "fortynding" er den grad, hvortil den tikendte blev fortyndet før prøven. Hvis der ikke anvendes nogen standard, antages D_ at være 25 mm, og (aktivitet af standard) tages som 1 enhed/ml, når målingen udføres på Vibrio percolans ATCC 8461. Rent egOA-^ er defineret til en aktivitet på 250 enheder 28 145504 pr. hydroxylamin-udslukkelig absorptionsenheder ved 300 nm, anvendt som standard.

For prøve på Salmonella gallinarum MB-1287 plader bestemmes en hældning på samme måde som for Vibrio percolans ATCC 8461 plader.

Når der ikke anvendes nogen standard, beregnes kun relative aktiviteter. Hvis ingen hældning er målt, antages en værdi på 2,3 mm. Beregning af aktiviteten udføres som for Vibrio percolans ATCC 8461 prøver. Hvis ingen 890A1 standard anvendes, kan benyttes en kontrol af penicillin G ved 250 ^ug/ml for at verificere, at sensitiviteten af organismen ligger i det normale område.

Rystekolbeproduktion af antibiotikum 890A^

Et prøverør af en lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogri-seus NRRL 8140 åbnes separat, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 1,5 ml sterilt medium A med følgende sammensætning;

Medium A

Gærekstrakt 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgS04;7H20 0,05 g

Phosphatpuffer 2 ml

Destilleret H20 1000 ml

Phosphatpufferopløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Denne suspension anvendes til podning af en 250 ml triple-luftet Erlenmeyer podekolbe med 54 ml podemedium B med følgende sammensætning : 29 145504

Medium B

Autolyseret gær (Ardamine +) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer 2 ml

Destilleret E^O 1000 ml pH: indstilles til 6,5 med NaOH + Ardamine: Yeast Products Corporation

Phosphatpufferopløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret I^O 1000 ml

Podekolben tilproppes med bomuld og rystes i 30 timer ved 28°C + 1°C i en gyrotorisk ryster ved 220 omdrejninger pr. minut (50 mm slaglængde).

Halvtreds 250 ml ikke-luftede koniske produktionskolber, hver indeholdende 40 ml produktionsmedium C, podes med 1 ml væsken fra hovedkolben. Produktionskolben tilproppes med vat.

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoCl2.6H20 5,0 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstilles til 7,2-7,4 med NaOH

Efter podning dyrkes produktionskolberne ved 28°C + 1°C under omrystning i en gyrotorisk ryster ved 220 omdrejninger pr. minut (50 mm slaglængde) i 3 dage. Kolberne prøves for aktivitet over for standard Vibrio percolans ATCC 846l prøveplader ved hjælp af 12,7 145504 , - ·-' 30 mm prøveskiver dyppet i centrifugeret gæringsvæskeprøver. Prøver blev fortyndet med 0,05 M phosphatpuffer, pH = 7,4. Resultaterne er angivet i det efterfølgende:

Dyrkningens varighed, timer 72 pH 6,4

Vibrio percolans (1/100 fortynding) prøve 23 mm 890 prøve, erih./ml 103

De 890A enheder/ml bestemmes som angivet i sektionen under overskriften "II. Prøveprocedure for bestemmelse af 890 prøveenheder".

Hele gæringsvæsken centrifugeres i 200 ml portioner i polycarbonat-flasker ved 9000 omdrejninger pr. minut i 15 minutter til opnåelse af l600 ml forenet væske med en aktivitet på 104 enh./ml. Hertil sættes 0,5 ml 0,1 M neutral EDTA.

Den centrifugerede gæringsvæske adsorberes på en Dowex-1 x 2 (C1-), 50-100 mesh kolonne, dimensioner af laget 3,8 x 22 cm, ved en strømningshastighed på 6 til 20 ml/min. Kolonnen skylles med 100 ml afioniseret vand og elueres med 1 liter afioniseret vand indeholdende 50 g natriumchlorid, 0,02 M Tris HCl-puffer, pH = 7,0 og 25 pM neutralt EDTA, ved en strømningshastighed på 6 ml/min. Der opsamles fraktioner på 10 ml.

Antibiotikum 890A^ fremkommer i fraktionerne 13 til 81 med et maximum i fraktionerne 25 til 33, talt fra første påføring af salteluat. Fraktionerne 24 til 4l med det højeste forhold for bioaktivitet/A22Q forenes til yderligere forarbejdning. De forenede fraktioner har i alt 29.000 enheder eller 17% af den påførte bioaktivitet.

Dowex-eluatet koncentreres til 10 ml, pH værdien indstilles på 6,5 med fortyndet saltsyre, og koncentratet påføres en kolonne af XAD-2, dimensioner af laget 3,3 x 36 cm, som forud er vasket med 2 liter af hver af 60% vandig acetone, afioniseret vand og 5% (w/v) natriumchlorid i afioniseret vand. Prøven elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 6 ml/min. Fraktioner på 40 til 260 ml opsamles. Den antibiotiske aktivitet fremkommer i fraktionerne

31 US50A

6 til 14, der strækker sig fra 220 til 2560 ml elueret rumfang. Maximum forekommer i fraktionerne 9 og 10, der strækker sig fra 370 til 590 ml elueret rumfang. Fraktionerne 9 til 12, svarende til 370 til 1060 ml elueret rumfang, har det højeste forhold HAEA^qq/ A220, og disse forenes til yderligere forarbejdning. Disse fraktioner har 36.600 enheder, svarende til 12$9é af den tilsyneladende påførte aktivitet.

De forenede fraktioner 9 til 12 inddampes til 100 ml, og koncentratet påføres en kolonne af Dowex-1 x 4 (C1-), minus 400 mesh, di-, mensioner af laget 2,2 x 41 cm, ved en strømningshastighed på 2 ml/ min. Kolonnen skylles med 60 ml afioniseret vand og elueres med 3 liter 0,07 M NaCl + 0,005 M NH^Cl + 0,0001 M NH^ i afioniseret vand ved en strømningshastighed på 2 ml/min. Der opsamles fraktioner på 10,8 ml, begyndende fra den første påføring af eluent.

Hovedtoppen af antibiotikum 890A^ findes i fraktionerne 181 til 217 med et maximum i fraktion 198. Fraktionerne 186 til 210, indeholdende i alt 114 absorptionsenheder ved 300 nm, opsamles.

De samlede fraktioner inddampes til 4,0 ml, og pH værdien indstilles på 7,3 ved tilsætning af 16 pliter 1 M NaOH. Koncentratet påføres ; en kolonne af Bio-Gel P-2, 200-400 mesh, dimensioner af laget 2,15 x 70 cm, og det vaskes med 3 x 1 ml afioniseret vand og elueres med afioniseret vand ved 0,96 ml/min. Der opsamles fraktioner på 3,85 ml.

Hovedtoppen af antibiotikum 890A-^ fremkommer i fraktionerne 24 til 44 med et maximum ved fraktionerne 33 og 34. Fraktionerne 27 til 38, der har det højeste forhold A3oo/A245’ forenes lyophilisering. Disse forenede fraktioner har i alt 72 A^QQ-enheder.

For at udføre lyophiliseringen inddampes de koncentrerede fraktioner til 3,0 ml, og pH værdien af koncentratet indstilles på 7,5 ved tilsætning af 10 pliter 0,1 M NaOH. Prøven opdeles i to fraktioner på hver 1,50 ml, og portionerne hurtigfryses separat og lyophiliseres fra 14 ml glasampuller med skruelåg. Hver prøve indeholder 1,73 mg 890A-^ svarende til 35,8 A^gg-enheder.

32 145504 II. Prøveprocedure for bestemmelse af "890 prøveenheder11 " En konventionel agarpladeskive-diffusionsmetode anvendes med Vibrio percolans ATCC 8461 som prøveorganisme. Cephaloridin anvendes som standard. Plader indeholdende Vibrio percolans ATCC 8461 fremstilles på følgende måde. En kultur af Vibrio percolans ATCC 8461 inkuberes i en næringsvæske-gærextrakt i 18 timer i et roterende rysteapparat ved 28°C og fortyndes derefter til en tæthed på 60% transmission ved 660 nm. En 33>2 ml portion af denne fortyndede kultur sættes til 1 liter af et medium sammensat af næringsagar +0,2% gærextrakt opretholdt ved 46°C. Det podede agarholdige medium hældes i 100 x 15 mm petriskåle af plast, 10 ml pr. skål, afkøles og opretholdes ved 2-4°C i op til fem dage forud for anvendelsen.

Koncentrationen af cephaloridin, som er ækvivalent med 1 enhed/ml af 890A bestemmes ved prøve på plader fremstillet som ovenfor angivet, men indeholdende 5 ml podet medium pr. plade på følgende måde. Fire koncentrationer af cephaloridin udgør standarden -3,12, 6,25, 12,5 og 25 mcg pr. ml med 12,5 mcg pr. ml som referenceopløsning. Zonediametrene på en 5 ml plade for standarden er følgende:

Kone, (mcg/ml) Zone-diameter (mm) 3,12 16,8 6,25 22,3 12,5 25,0 '25 29,6

En enhed defineres som mængden af antibiotisk stof pr. ml, der producerer en 25 mm inhiberingszone på en 5 ml plade som beskrevet i ovennævnte sektion I. Ved denne prøve betragtes derfor en koncentration på 12,5 mcg pr. ml cephaloridin som ækvivalent med 1 enhed 890A pr. ml. Da hældningen af linien for cephaloridin er 4,0, udføres beregninger af aktiviteten af en prøve ved hjælp af en hældning på 4,0.

33 U5504 III. Hydroxvlamin-reaktion

Begge antibiotika 89OA2 og 890A^ reagerer med hydroxylamin og producerer et stof med stærkt formindsket absorption ved 308 nm. Dette giver basis for en kvantitativ prøve af antibiotika 890A2 og 890A^.

Opløsningen, som skal prøves, indstilles på 0,05 M kaliumphosphat, pH = 7,4 ved tilsætning af 1/20 rumfang af en opløsning indeholdende 0,8 M K2HP04 og 0,2 M KH2P04. Ti 1/100 rumfang af 1 M hydroxyl-aminhydrochlorid tilsættes, og absorptionen ved 308 nm måles med intervallet på 1/2 til 2 minutter. Reaktionen udføres ved stuetemperatur. Kinetisk reaktion af første orden antages, og en halveringstid er bedømt for absorptionsformindskelsen i løbet af de første 10 minutter. Ud fra denne halveringstid er der beregnet den tid, efter hvilken ingen yderligere absorptionsformindskelse vil kunne iagttages, og observationerne fortsættes ud over den tid.

Hvis der ikke iagttages nogen formindskelse ud over denne tid, bliver den totale absorptionsformindskelse (korrigeret for fortyndingseffekt og absorption af hydroxylaminen) taget som "Hydroxylamin-udslukkelig absorption ved 308 nm (HAEA^qq)". Hvis absorptionsformindskelse iagttages efter denne tid, beregnes størrelsen af baggrundsabsorptionsformindskelsen, og den iagttagne formindskelse på dette tidspunkt korrigeres for baggrundsformindskelse, idet man antager, at baggrundsformindskelsen er lineær med tiden. Den korrigerede værdi angives derefter som HAEA^qq.

Værdien for HEAE^qq-enheder er lig med HAEA^qq multipliceret med rumfanget i ml.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle udførelseseksempler.

EKSEMPEL 1

Produktion af blanding indeholdende Antibiotika 890A2 og 890Ag Et prøverør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus 34 145504 NRRL 8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml steril Davis-salt-opløsning med følgende sammensætning :

Davis-salte

Natriumcitrat 0,5 g k2hpo4 7,0 g kh2fo4 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04 * 7H20 0,1 g

Destilleret H20 1000 ml

Denne suspension anvendes til at pode 4 skråkulturer af sterilt medium A med følgende sammensætning:

Medium A

. Dextrose 10,0 g

Pepton 5,0 g Gærextrakt 3,0 g

NaCl 12,705 g KC1 0,72 g

FeS04(NH4)2S04.6H20 0,0351 g

MgCl2*6H20 5,32 g

CaCl2-2H20 0,728 g

Destilleret HgO 1000 ml pH = 7,4 (før sterilisation)

Agar 25,0 g

De podede skråkulturer dyrkes i 1 uge ved 27-28°C og opretholdes ved 4-6°C indtil anvendelsen 10 dage senere. En halv portion af overfladevæksten af en af disse skråkulturer anvendes til podning af luftede 250 ml koniske kolber indeholdende 50 ml medium B med' følgende sammensætning:

35 1455 OA

Medium B

Gær-autolysat (+Ardamine) 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer x 2,0 ml

MgS04*7H20 50 mg

Destilleret H^O 1000 ml

pH: indstilles på 6,5 med HC1 eller NaOH

+Ardamine: Yeast Products Corporation KPhosphatpufferopløsning kh2po4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Tre podekolber podes for at give tilstrækkeligt podemateriale til tolv 2-liters produktkolber, som anvendtes til denne portion. Podekolberne rystes i 1 dag ved 28°C i et rysteapparat ved 220 omdr./ min. (50 mm slaglængde). Kolberne fjernedes fra rysteren og opbevaredes i en dag ved 4°C. Indholdet af disse podekolber anvendes til podning af tolv 2 liter ikke-luftede koniske produktionskolber (7 ml podemateriale pr. kolbe) indeholdende 250 ml af produktionsmedium C med følgende sammensætning:

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

Afioniseret H20 1000 ml pH-værdien indstilles på 7,3 ved hjælp af natriumhydroxid 56 145504

Efter podning dyrkes produktionskoblerne ved 24°C under omrystning i et rysteapparat ved 220 orndr./min. (50 mm slaglængde) i fire dage og fem timer. Efter dette tidsrum indhøstes kolberne og materialet prøves for aktivitet ved hjælp af standard Salmonella gallinarum mb 1287 og Vibrio percolans ATCC 8461 forsøgsplader under anvendelse af 12,7 mm prøveskiver dyppet i de centrifugerede væskeprøver. Resultaterne er anført i efterfølgende tabel:

Prøve på dvrkningsvæske

Dyrkningens varighed (timer) 101 pH 7,1

Salmonella gallinarum (mm zone) 31

Vibrio percolans (mm zone) 43 Gæringsvæsken centrifugeres. Til det klare centrifugat, 2,2 liter ved pH = 6,8, sættes 22 mg (ethylendinitrilo)tetraeddikesyre, og pH-værdien indstilles på 7,2. Det således indstillede centrifugat a'dsorberes på 150 ml Dowex 1x2 harpiks på Cl“-cyclus ved 15 ml/-min., idet afløbsstrømmen opsamles som én fraktion. Adsorbatet vaskes med 150 ml afioniseret vand indeholdende 10 yug/ml (ethylen-dinitrilo)tetraeddikesyre og vaskes derefter med 5% natriumchlorid-opløsning indeholdende 10 yug/ml (ethylendinitrilo)tetraeddike-syre, idet der opsamles 5 x 75 ml fraktioner.

Den 5% natriumchlorid-elueringsopløsning efterfølges af en 60 ml fortrængningsvask med afioniseret vand, hvorefter-antibiotika 890^2 og 890A^ elueres med 90% (v/v) methanol; 3% ammoniumchlorid (w/v/); 10% vand (v/v) indeholdende 10 yug/ml (ethylendinitrilo)-tetraeddikesyre, idet der opsamles 5 x 75 ml fraktioner. Fraktionerne prøvedes over for Vibrio percolans, ATCC 8461, og resultaterne er anført nedenfor som procent af udgangs-bioaktivitet:

Fraktion Udbytte

Tilførsel 100%

Afløb 0

Vandfortrængningsvask 1%

Me0H/NH,Cl eluat-fraktioner H 1 til 3 24% 37 U5504 EKSEMPEL 2

Rystekolbe-produktion af antibiotikum 89 oa,.

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml sterile Davis-salte med følgende sammensætning:

Davis-salte

Natriumcitrat 0,5 g K2HP04 7,0 g KH2P04 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04.7H20 0,1 g

Destilleret H20 1000 ml

Denne suspension anvendes til podning af fire skråkulturer af sterilt medium A med følgende sammensætning:

Medium A

Glycerol 20,0 g

Primær gær 5,0 g

Fiskemel 15,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Agar 20,0 g

pH: indstilles på 7,2 med NaOH

De podede skråkulturer dyrkes i en uge ved 27-28°C og opbevares derefter ved 4-6°C indtil anvendelsen (ikke længere end 21 dage).

En 1/3 portion af væksten fra en skråkultur anvendes til podning af en luftet 250 ml konisk kolbe. Ialt fire skråkulturer anvendes til podning af tolv kolber. Hver kolbe indeholdende 50 ml medium B har følgende sammensætning: - 38 145506

Medium B

Gær-autolysat (+Ardamine) 10,0 g

Glucose 10,0 g

PhosphatpufferK 2,0 ml

MgS04.7H20 50,0 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstilles til 6,5 med HC1 eller NaOH

+Ardamine: Yeast Products Corporation KPhos~phatpuf fer-opløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Podekolberne rystes i en dag ved 27-28°C i et rysteapparat ved 220 omdr./min. (50 mm slaglængde). Kolberne og indholdet opbevaredes stationært i en dag ved 4°C.

Fireogfyrre 2 liters koniske produktionskolber, hver indeholdende 200 ml medium C, podes med 8 ml pr. kolbe af væksten af podekolberne. Medium C har følgende sammensætning:

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoC12-6H20 5>0 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstilles på 7,2-7,4 med NaOH

Efter podning dyrkes produktionskolberne ved 24°C tinder opryst-ning på et rysteapparat ved 212 omdr./min. (50 mm slaglængde) i fire dage og fem timer. Kolberne indhøstes og prøves for aktivitet under anvendelse af standard Salmonella gallinarum MB 1287 og Vibrio percolans ATCC 8461 prøveplader med 12,7 mm prøveskiver dyppet i centrifugerede væskeprøver. Prøverne fortyndes om nødvendigt med 0,02 M phosphatpuffer, pH = 7,0. Resultaterne er følgende: 39 145504

Dyrkningens varighed (timer) 101 pH 7,2

Salmonella gallinarum (mm zone) 35

Vibrio percolans 1/10 dil (mm zone) 25 890 prøve-enhed 121

Ialt 7,0 1 af den samlede gæringsvæske fra denne gæring afkøles til 3°C og centrifugeres i 200 ml portioner ved 9000 omdr./min. i 15 minutter hver. Til den forenede ovenstående væske sættes 1.7 ml 0,1 M neutralt EDTA, og portionen opretholdes ved 3 °C.

Ovennævnte gæring gentages under identiske betingelser med den ændring, at de fireogfyrre 2 liter koniske kolber podes med 7 ml pr. kolbe med vækst fra podekolberne. pH-værdien og prøveresultaterne er følgende:

Dyrkningens varighed (timer) 101 pH 7,3

Salmonella gallinarum (mm zone) 38

Vibrio percolans 1/10 dil (mm zone) 27 890 prøve-enh, 92,8

Ialt 7,4 1 af den samlede gæringsvæske fra denne gæring afkøles til 3°C og centrifugeres i 200 ml portioner ved 9000 omdr./min. i 15 minutter hver. Til den forenede ovenstående væske sættes 1.8 ml 0,1 M neutralt EDTA. Den ovenstående væske fra de centrifugerede gæringsvæsker, stammende fra de to ovennævnte gæringer i dette eksempel, forenes til et totalt rumfang på 13 1 og en aktivitet på 80 enheder/ml ved prøve på Vibrio percolans ATGC 8461.

Den forenede væske føres gennem en kolonne af Dowex-1 x 2 (Cl“), 50-100 mesh, med lagdimensioner 4,7 cm x 50 cm, ved en strømningshastighed på 60 ml pr. minut. Kolonnen vaskes med 1 liter afioniseret vand og elueres med 5 liter 5% (vr/v) natriumchlorid-opløsning indeholdende 0,01 m Tris-HCl-puffer, pH=7,0, og 25 jiM neutral EDTA, ved en strømningshastighed på 50 ml pr. minut.

40 145504

Kolonnen vaskes med 500 ml af Ioniseret vand, og antibiotika 890A2 og 890A^ elueres med 2 liter 3% natriumchlorid + 0,01 M tris-HCl, pH=7,0, + 25 yuM neutral EDTA i 50% methanol ved en strømningshastighed på 40 ml/minut. Fraktioner på 220 ml opsamles.

Den antibiotiske aktivitet, bedømt ved en prøve på Salmonella gallinarum MB 1287, viser sig i fraktionerne 4 til 8 med et maximum 1 fraktion 5. Fraktionerne 4 til 8 indeholder 9% af den oprindelige i gæringsvæsken tilstedeværende aktivitet.

Fraktionerne 4 til 7 forenes, inddampes til 150 ml ved rotationsfordampning under reduceret tryk og fortyndes til 250 ml ved tilsætning af 200 ml afioniseret vand. Prøven påføres en kolonne ( 5 cm x 25 cm) af XAD-2, som var vasket forud med 3 liter hver af 30% (v/v) acetone, afioniseret vand og 5% (w/v) natriumchlorid. Kolonnen elueres med 500 ml afioniseret vand ved 20 ml/min. efterfulgt af 500 ml 60% (v/v) vandig acetone. Fraktioner på hver 160 ml opsamles. Antibiotisk aktivitet, bestemt ved prøven på Salmonella gallinarum MB 1287, ses i fraktionerne 1 til 5 med et maximum ved fraktionerne 3 og 4.

Fraktion 4, den første acetoneholdige fraktion, inddampes til 10 ml under reduceret tryk og fortyndes med 90 ml afioniseret vand. Denne prøve påføres en kolonne (5 cm x 25 cm) XAD-2, som var vasket forud med 3 liter hver af 60% (v/v) acetone, afioniseret vand og 5% (w/v) natriumchlorid. Kolonnen elueres med af ioniseret vand med en strømningshastighed på 20 ml pr. minut. Der opsamles fraktioner fra 140 til 190 ml. Antibiotisk aktivitet, bestemt ved prøven på Salmonella gallinarum mb 1287, påvises i fraktionerne 2 til 7 med et maximum i fraktion 4. Fraktionerne 3» 4 og 5 forenes og sættes til fraktion 3 fra den i det foregående afsnit beskrevne XAD-kolonne. De forenede fraktioner indeholder 26 400 bioprøve-enheder, bestemt ved prøve på Vibrio percolans ATCC 8461, lig med 2,5% af udgangsaktiviteten.

De forenede XAD-2 fraktioner 3 fra første XAD-kolonne og fraktionerne 3,4 og 5 fra den anden XAD-kolonne inddampes under reduceret tryk til 25 ml, og derpå tilsættes 25 ml afioniseret vand, og 50 ml methanol tilsættes. Den methanoliske opløsning adsorberes på en 41 145504 kolonne (2,15 x 26,4 cm) af Dowex-1 x 4 (ci“), minus 400 mesh, som er indstillet på ligevægt med 50% vandig methanol (v/v).

Kolonnen elueres med 1,44 liter 0,07 M natriumchlorid + 0,005 M ammoniumchlorid + 0,0001 M ammoniak i 50% methanol ved en strømningshastighed på 2 ml pr. minut. Fraktioner på 12,1 ml opsamles. Elueringen fortsættes med 2 liter 0,08 M natriumchlorid + 0,005 M ammoniumchlorid + 0,0001 M ammoniak i 50% methanol, idet der opsamles fraktioner på hver 11,7 ml.

En top for UV absorption ved 300 nm påvises i fraktionerne 138 til 162 med et maximum i fraktionerne 149-150. Absorptionen ved 305 nm observeres som udslukkelig i en grad på 77% ved reaktion med L-cystein ved et neutralt pH. Fraktionerne 145 til 155, indeholdende antibiotikum 89OA2, opsamles og inddampes til 2,4 ml, indeholdende ialt 70,5 A^00-enheder.

Den koncentrerede prøve påføres en kolonne (2,2 x 70 cm) af Bio-Gel P-2, 200-400 mesh, som er vasket med 1 liter afioniseret vand. Prøven henstilles til afdrypning til lagets niveau, og remanensen vaskes med 2 skylninger på hver 1 ml afioniseret vand. Kolonnen elueres med afioniseret vand med en hastighed på 1 ml pr. minut. Fraktioner på 2 til 3,5 ml opsamles.

Hovedtoppen for absorption ved 308 nm påvises i fraktionerne 64 til 72, umiddelbart forud for og ikke fuldstændig adskilt fra natriumchloridet. Fraktionerne 66 og 67 forenes, indeholdende 27 absorptionsenheder af antibiotikum 89OA2 ved 308 nm og fra..

29 til 43 mg natriumchlorid (bedømt ved ledningsevnen). Disse forenede fraktioner inddampes til 1,5 ml under reduceret tryk og lyophiliseres til opnåelse af 43,7 mg faste stoffer.

EKSEMPEL 3

Præparation af antibiotika 890A2 og 890Ag

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL8139 åbnes aseptisk og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml sterile Davis salte med følgende sammensætning: 42 145504

Davis-salte

Natriumcitrat 0,5 g K2HP04 7,0 g kh2p°4 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04..7H20 0,1 g

Destilleret H20 1000 ml

Denne suspension anvendes til podning af fire skråkulturer af medium A med følgende sammensætning:

„ Medium A

Glycerol 20,0 g

Primær gær 5,0 g

Fiskemel 15,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Agar 20,0 g

pH: indstilles på 7,2 med NaOH

De podede skråkulturer dyrkes i en uge ved 27-28°C og opbevares ved 4-6°C, indtil de anvendes (ikke længere end 21 dage).

10 ml af medium B med følgende sammensætning:

Medium B

Gær-autolysat (+Ardamine) 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer K 2,0 ml

MgS04-7H20 50 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstilles på 6,5 med HC1 eller NaOH

+Ardamine: Yeast Products Corporation

X

- Phosphatpufferopløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H20 1000 ml 43 ^ 145504 overføres aseptisk til en af disse skråkulturer, sporene og luftmycelium skrabes over i suspensionen, og 3,3 ml af denne suspension anvendes til podning af 2 liter luftede koniske kolber indeholdende 500 ml medium B. Denne podekolbe rystes ved 28°C i et rysteapparat ved 160 omdr./minut (50 mm slaglængde) i 36 timer, i hvilket tidsrum væksten er tilfredsstillende.

Væksten fra disse podekolber anvendes til podning af en 189 liter podetank af rustfrit stål indeholdende 160 liter medium B. Denne tank drives ved 28 °C under en omrøringshastighed på 150 omdr./ min. og en luftstrøm på 85 liter pr. minut i 24 timer. Anti-skummemiddel, polyglycol 2000 (Dow Chemical Corp.), anvendes om nødvendigt, men højst i en mængde på 0,1#. Der gennemføres følgende pH-bestemmelse:

Alder, timer 0 12 pH 6,3 6,35 43 liter af væksten i denne podetank anvendes til podning af en 756 liter gæringstank af rustfrit stål indeholdende 467 liter medium C med følgende sammensætning:

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoC12-6H20 5,0 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstilles på 7,2-7,4 med NaOH

Denne tank drives ved 25°C under en omrøringshastighed på 250 liter pr. minut i 92 timer. Mere antiskummemiddel, polyglycol 2000, tilsættes om nødvendigt, men højst i en mængde på 0,1#. Antibakterielle prøver udføres på Salmonella gallinarum mb 1287, Vibrio percolans ATCC 8461, og følgende data opnås: 44 145504

Alder, timer: O 12 24 48 60 2E 84 92 pH 6,6 6,7 6,65 6,3 6,0 6,4 6,15 6,5 6,5 MB-1287 mm — -- — S — 19 26 28 32 ATCC 8461 mm (1-10) — — S — 21 24 26 30 890A enh./ml NA NA 6,8 13,5 24,9 24,3 890A-enheder/ml bestemmes som angivet i sektionen med overskriften "II. Prøveprocedure for bestemmelse af 890 prøveenheder".

470 liter væske afkøles til 5°C og centrifugeres gennem en Titan P-9 centrifuge. 22 kg Celite sættes til 378 liter fracentrifugeret væske, og suspensionen filtreres gennem en Shriver 46 cm filterpresse. 344 liter filtrat adsorberes til kolonnen indeholdende 26,5 liter Dowex-1 x 2 (Cl”), 50-100 mesh, og kolonnen vaskes med 37,8 liter afioniseret vand efterfulgt af .114 liter 5% natriumchlorid + o,01 M Tris-HCl puffer, pH = 7,0 + 25 jiM. neutralt EDTA i afioniseret vand. Efter en yderligere vask med 18,7 liter afioniseret vand elueres antibiotika 890A2 og 890A^ med 95 liter 3% natriumchlorid + 0,01m Tris-HCl puffer, pH = 7,0 + 25 yuM neutralt EDTA i 50% (v/v) vandig· methanol. 18,7 liter fraktioner opsamles.

Den antibiotiske aktivitet bestemmes ved prøve over for Salmonella gallinarum MB 1287 og påvises i fraktionerne 1 til 5 med et maximum i fraktion 3. Fraktionerne 2 og 3 indeholdende 10,9% af aktiviteten i den påførte gæringsvæske forenes og inddampes til 7,6 liter under reduceret tryk. Den koncentrerede prøve fortyndes med 30 liter afioniseret vand og inddampes igen til 7,6 liter under reduceret tryk til fjernelse af resterende methanol.

De 7,6 liter koncentrat påføres en kolonne indeholdende 37,8 liter XAD-2, som forud er vasket med 190 liter 60% vandig acetone efterfulgt af 190 liter afioniseret vand og 190 liter 5% natriumchlorid-opløshing. Kolonnen elueres med 142 liter afioniseret vand. Tre fraktioner på hver 9,5 liter efterfulgt af seks fraktioner på 19 liter opsamles. Aktiviteten bestemt ved prøve på Salmonella gallinarum mb 1287 plader påvises i fraktionerne 1 til 6 med maximal aktivitet i fraktion 2. Fraktionerne 2 til 5, indeholdende 64% af den aktivitet, som påførtes XAD-kolonnen eller 520 000 enheder, opsamles.

45 145504

Fraktionerne 2 til 5 inddampes til 120 ml ved inddampning under reduceret tryk. pH-værdien indstilles på 6,5, og koncentratet påføres en kolonne (7 x 50 cm) XAD-2, som er vasket med 8 liter 60% vandig acetone efterfulgt af 4 liter afioniseret vand og 8 liter 5% natriumchlorid i afioniseret vand. Prøven henstilles til afdrypning til lagets niveau, og kolonnen skylles med tre 20 ml portioner afioniseret vand, idet der henstilles hver gang til afdrypning. Det antibiotiske stof elueres med 6 liter afioniseret vand med en strømningshastighed på 40 ml pr. minut. Otte fraktioner på 200 ml efterfulgt af elleve fraktioner på 400 ml opsamles. Den antibiotiske aktivitet, bestemt ved prøve med Salmonella gallinarum MB 1287 plader, påvises i fraktionerne 3 til 18 med et maximum af aktivitet i fraktion 8.

Fraktion 8 til 12 med det højeste forhold af bioaktivitet/Aggø og med 225 000 bioaktivitetsenheder, bestemmes ved en prøve over for Salmonella gallinarum MB 1287 og forenes for yderligere béhand-ling. ,

De forenede fraktioner inddampes under reduceret tryk til 50 ml, og 50 ml methanol tilsættes. Prøven påføres en kolonne af Dowex-1 " x 4 (Cl"), minus 400 mesh, lagdimensioner 2,2 x 40 cm, som forud er vasket med 50% methanol. Kolonnen elueres med 2 liter 0,07 M natriumchlorid + 0,005 M ammoniumchlorid + 0,0001 M ammoniak i 50% vandigt methanol med en strømningshastighed på'2 ml pr. minut. Der opsamles fraktioner på 12 ml.

To ulige toppe af bioaktivitet, bestemt ved prøve over for Salmonella gallinarum MB 1287 iagttages i afløbet, svarende til-to toppe af materialet med et absorptionsmaximum ved 308 nm. Hovedparten af absorptionen ved 308 nm i begge toppe er udslukkelig ved reaktion med hydroxylamin.

Den første top, indeholdende 89OA2, påvises i fraktionerne 98 til 136, og den anden top, indeholdende 890A^, påvises i fraktionerne 136 til 158. Fraktionerne 112 til 130 forenes til opnåelse af 89OA2 Dowex-koncentrat, og fraktionerne 138 til 148 forenes til opnåelse af 890A^ Dowex-koncentrat. 890A2-portionen renses yder- ; ligere ved afsaltning på Sephadex G-10.

46 145504

Fraktionerne 112 til 130 indeholdende 890A2 inddampes under reduceret tryk til 5,5 ml, og koncentratet påføres en kolonne (2,15 x 70 cm) Sephadex G-10 og elueres med afioniseret vand ved en strømningshastighed på 1 ml pr. minut. Der opsamles fraktioner på hver 2,85 ml. Bioaktiviteten bestemt ved prøve over for Salmonella gallinarum MB 1287 fremkommer i fraktionerne 60 til 98. Fraktionerne 78 til 90 har det højeste forhold ^308^260» °£ ^sse samles til lyophilise-ring. pH-værdien af de samlede fraktioner er 4,1, og der indstilles til 7,8 ved tilsætning af 8 ^ul l m ammoniak. Portionen indeholder 52 AjQg-enheder med et forhold A^gg/A^Q ^ ^»76, hvilket viser en væsentlig nedbrydning af det antibiotiske stof under denne procedure .

De samlede fraktioner 78 til 90 inddampes til 1,69 ml under reduceret tryk. To 0,1 ml prøver udtages og lyophiliseres separat i små koniske reaktionsampuller af glas. Resten lyophiliseres i en 14 ml med skruelåg forsynet ampul af glas, hvorved opnås 1,29 mg faste stoffer indeholdende 890A2· EKSEMPEL 4

Præparation af 890Α^

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml sterile Davis-salte med følgende sammensætning:

Davis -salte

Natriumcitrat 0,5 g K2HP04 7,0 g KH2P04 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g •MgS04.7H20 0,1 g

Destilleret HgO 1000 ml

Denne suspension anvendes til podning af fire skråkulturer af medium A med følgende sammensætning: 145504 47

Medium A

Glycerol 20,0 g

Primær gær 5,0 g

Fiskemel 15,0 g

Destilleret E^O 1000 ml

Agar 20,0 g

pH: indstilles til 7,2 med NaOH

De podede skråkulturer dyrkes i 1 uge ved 27-28 °C og opbevares derefter ved 4-6 °C indtil anvendelsen (ikke længere end 21 dage).

10 ml medium B med følgende sammensætning:

Medium B

Gær-autolysat ( Ardamine) 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer * 2,0 ml

MgS04.7H20 50 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstilles til 6,5 med HC1 eller NaOH

+Ardamine: Yeast Products Corporation * Phosphatpuffer-opløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H20 1000 ml overføres aseptisk til en af disse skråkulturer, sporerne og luft myceliet skrabes over i suspensionen, og denne suspension anvendes til podning af tre 2 liter luftede koniske kolber indeholdende 500 ml medium B i en mængde på 3,3 ml pr. kolbe. Disse podekolber rystes ved 28 °C i et rysteapparat ved 160 omdr./min. (50 mm slag længde) i 36 timer, efter hvilket tidsrum væksten er tilfredsstillende.

500 ml væksten fra disse podede kolber anvendes til podning af en 189 liter podetank af rustfrit stål indeholdende 160 liter 48 145504 medium B. Denne tank drives ved 28 °C med' en omrøringshastighed på 150 omdr./min. og en luftstrøm på 85 liter pr. minut i 24 timer. Der anvendes et antiskummemiddel, polyglycol 2000 (Dow Chemical Corp.) om nødvendigt, men højst i en mængde på 0,1%.

Der udføres følgende pH-bestemmelser:

Alder, timer 0 24 pH 6,1 5,6 43 liter af dyrkningsmediet i denne podetarik anvendes til podning af en 756 liter gæringsbeholder af rustfrit stål indeholdende 460 liter medium C, der har følgende sammensætning:

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoC12-6H20 5,0 mg

Destilleret H20 1000 ml pH: indstilles på 7,2-7,4 med NaOH, som er steriliseret 60 minutter ved 120°C. Denne tank drives ved 25°C med en omrystningshastighed på 160 omdr./min. og en luftstrøm på 283 liter pr. minut i 144 timer. Mere antiskummemiddel, polyglycol 2000,. tilsættes om nødvendigt, dog i en mængde "på højst 0,1%. Antibakterielle prøver udføres på Salmonella galli-narum MB 1287. Vibrio percolans ATCC 8461 med følgende data:

Alder i timer pH 6,2 6,2 6,3 7,0 7,3 7,7 8,2 MB 1287 mm T 26,5 28 33,5 32,5 31,5 MB 1272 mm (1-10 dil.) - 0 21,5 26,5 35 31,5 33 890A enh./ml - NA 6,4 16,5 16,7 22,5 19,5

De 890A enh./ml bestemmes som angivet i sektionen med overskriften "II. Prøveprocedure for bestemmelse af "890 prøveenheder".

387 liter gæringsvæske afkøles til 5°C og centrifugeres gennem en Titan P-9 centrifuge. 18 liter Celite sættes til 290 liter af den 49 145504 centrifugerede væske, og suspensionen filtreres gennem en Shriver 45 cm filterpresse. 234 liter af filtratet adsorberes til en kolonne indeholdende 27 liter Dowex-1 x 2 (Cl“), 16-100 mesh, og kolonnen vaskes med 38 liter afioniseret vand efterfulgt af 114 liter 5% natriumchlorid + 0,01 M Tris-HCl-puffer, pH = 7,0 + 25 ^iM neu tralt EDTA.

Efter endnu en vask med 19 liter afioniseret vand eluerers antibio-jia 89OA2 og 890A^ med 133 liter 3% natriumchlorid + 0,01 M tris-HC1, pH = 7,0 + 25/uM netrait EDTA i 50% methanol. Fraktioner på hver 19 liter opsamles.

Bioaktiviteten, bestemt ved prøve over for Salmonella gallinarum MB 1287, fremkommer i fraktionerne 1 til 7 med et maximum i fraktion 3.

Fraktionerne 3 til 7 indeholdende 18% af den påførte aktivitet koncentreres under reduceret tryk til 9,5 liter, og koncentratet påføres en kolonne indeholdende 38 liter XAD-2, som forud er vasket med 380 ml af hver af 60% (v/v) vandig acetone, afioniseret vand og 5% natriumchlorid i afioniseret vand. Antibiotika 890A2 og 890A^ elueres med 133 liter 25 yuM neutralt EDTA i afioniseret vand.

En fraktion på 19 liter efterfulgt af 4 fraktioner på 9,5 liter og 4 fraktioner på 19 liter opsamles. Bioaktiviteten, bestemt ved prøve over for Salmonella gallinarum MB 1287, fremkommer i fraktionerne 3 til 9 med et maximum i fraktion 4. .

Fraktionerne 3 til 6 indeholdende 18% af aktiviteten af filtreret væske forenes og inddampes under reduceret tryk til 122 ml, og koncentratet indstilles på en pH-værdi på 6,45 ved tilsætning af 5 ml 1 M saltsyre. Koncentratet påføres en kolonne (7,9 x 60 cm) af XAD-2, som fortid er vasket med 16 liter af hver af 60% vandig acetone, afioniseret vand og 5% natriumchlorid i afioniseret vand. abtibiotika 890A2 og 890A^ elueres med 8 liter afioniseret vand med en strømningshastighed på 50 ml pr. minut. Fraktioner på 200 til 1000 ml opsamles.

Bioaktiviteten, bestemt ved prøve over for Salmonella gallinarum MB 1287, fremkommer i fraktionerne 5 til 20, der er fra 1900 til 7700 ml elueret rumfang. Værdierne for A220 og HAEA^q^ måles ligeledes på fraktionerne 9 til 20. Fraktionerne 9 til 12 har 261 til ' ' 50 ' 145504 286 bioaktivitetsenheder pr. HAEA^g^-enhed, og fraktionerne 16 til 20 har 23-28 enheder/HAEA^Q^-erihed, og fraktionerne 13 til 16 har mellemliggende værdier, hvilket viser en væsentlig separation af antibiotika 890A2 og 890A^ på denne kolonne. Fraktionerne 15 til 19» indeholdende hovedparten af 890A^, opsamles til yderligere rensning.

De opsamlede fraktioner 15 til 19 inddampes under reduceret tryk til 250 ml. Til koncentratet sættes 250 ml methanol, og prøven påføres ved en strømningshastighed på 2 ml pr. minut på en kolonne (3,4 x 50 cm) Dowex-1 x 4 (C1-) minus 400 mesh, som var vasket med 50% methanol. Kolonnen elueres med 8 liter 0,1M NaCl + 0,005 M NH^Cl + Ο,ΟΟΟΙΜ NH^ i 50% methanol med en strømningshastighed på 2 ml per minut. Der opsamles fraktioner på 10 ml.

Antibiotikum 890A^ elueres i fraktioner 505 til 605 med et maximum i fraktion 550. Fraktionerne 520 til 580 samles, og en 300 ml portion heraf inddampes til 4 ml under reduceret tryk. Til koncentratet sættes 6 ml methanol og 25 /ul 1 M NaOH til opnåelse af en endelig pH værdi på 7,3-

Det således indstillede koncentrat påføres en kolonne (2,2 x 70 cm) af SephadeX G-10, som er indstillet på ligevægt med 0,02 mM i 50% methanol. Kolonnen elueres med 0,02 mM NH^ i 50% methanol med en strømningshastighed på 1 ml pr. minut.

890Aj- elueres i fraktionerne 38 til 88 med et maximum i fraktionerne 39 og 40. Fraktionerne 40 til 68 forenes, og pH indstilles fra 6;3 til 6,8 med 1 M NaOH. De opsamlede fraktioner 40 til 68 inddampes til 4 ml under reduceret tryk, og 80 ^ul af 1 M NaOH tilsættes lander inddampning til opretholdelse af pH på mellem 7,0 og 7,3. Til de dannede 4 ml koncentrat sættes 20 ^ul 1 M NaOH, hvorved pH-værdien blev 7,4.

Koncentratet renses yderligere ved påføring på en kolonne (3,4 x 46 cm) Dowex-50 x 2 (Na+), 200-400 mesh, som er vasket med 4 liter 0,2 mM NaOH efterfulgt af 800 ml afioniseret vand. Det antibiotiske stof elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 4,1 ml pr. minut. Der opsamles fraktioner på 8,2 ml.

51 U5504

Antibiotiket fremkommer i fraktionerne 22 til 27 med et maximum i fraktion 23. Fraktionerne 23 til 25 opsamles, og de indeholder 152 A308-eriheder med et forhold &30Q/k260 på 2»00· LedninSsmålinSerne angiver tilstedeværelsen af 70 yumol NaCl i de opsamlede fraktioner.

En 4 ml portion af de opsamlede Dowex-50 fraktioner 23-25 omdannes til ammonium-formen ved gennemledning over en kolonne (0,7 cm x 12 cm) Dowex-50 x 2 (NH^+), 200-400 mesh, som er vasket i 100 ml 0,1 mM NH^ efterfulgt af 10 ml afioniseret vand. Prøven elueres med afioniseret vand, idet der opsamles fraktioner på 1 til 2 ml. Alle fraktioner med A^qø større end 1 forenes til opnåelse af i alt 6 ml med A^qq = 30. Denne prøve inddampes under reduceret tryk til 0,725 ml og to 50 μΐ portioner pi'petteres separat i 2 koniske o,5 ml reaktions-ampuler og lyophiliseres.

Trimethyl-silylering af antibiotika 890A^ resulterer i 3 forskellige derivater: et di- og et tri-methylsilyl-derivat (molvægt henholdsvis 456 og 528) og en lille mængde af et tetra-trimethylsilyl-derivat af et hydrolyseret produkt (molvægt 618), hvor β-lactam-ringen er åbnet.

Værdierne for de vigtigste massespektrale fragmenter er angivet i det efterfølgende: di-trimethylsilyl-derivat: 441; 299; 298 og 84 tri-trimethylsilyl-dcrivat: 513; 371 og 156; tetra-trimethylsilyl-derivat (kun signal med lav resolution observeret) : 618 og 603·

En 18,6 ml portion af de samlede Dowex-50 fraktioner 23-25 inddampes til 3 ml under reduceret tryk, og en 1,96 ml portion fryses og lyophiliseres i en 14 ml glas-ampul til opnåelse af 2,73 mg faste stoffer indeholdende en blanding af antibiotikum· 890A^ og natriumchlorid. Da ledningsevnen af fraktionerne 23-25 angiver, at 45?é af de faste stoffer bestod af natr iumchlorid, kan E% af 490 ved 308 nm beregnes for en saltfri prøve af 890A^ ud fra et observeret EJé af 272. De 1,0 ml rest fra 3,0 ml koncentrat lyophiliseres separat for NMR analyse.