SU581881A3 - Способ получени антибиотика, про вл ющего активность в отношении -лактамазы - Google Patents

Claims (2)

1. Отделение антибиотика от неорганических солей, а также других загр зн ющих веществ осуществл ют посредством его адсорбировани  на липофильную смолу, на которой не адсорбируютс  неорганические соли. Антибиотик удал ют из колонки элю ированием (водой или водным спиртом полученный раствор концентрируют вып риванием и сушкой с вымораживанием. Отделение антибиотика от неоргани ческих солей осуществл ют также хро матографией на колонке, состо щей кэ гель-фильтрующего агента, например поперечно-сшитого декстранового гел  например, Sepfiadex G -15 или по иактиламидного гел , например, Biog-eE Р2. . Последующую очистку антибиотика можно осуществл ть хроматографией на колонке на инертной твердой фазе (ей ликагель или целлюлоза), использу  водно-спиртовые растворительные системы (вода-изопропанол, вода-н-пропанол , вода-метанол-иэопропанол, вод г-бутанол, вода-этанол-бутанол и другие ). Предпочтительной  вл етс  пропанол-вода 4:1 в сочетании с целлюлозным носителем. Фракции, которые показывают ультрафиолетовый спектр, характерный дл  антибиотика, обладают ультрафиолетовым максимумом поглощени  приблизительно при 297 нм. Эти фракции собирают. Сушка с вымораживанием полученного раствора дает чистую соль антибиотика. П р им ер 1., Получение чистой соли антибиотика, Streptomyces otivaceus АТСС 31126 выращивают в течение 7 дней п температуре на пласте твердого агара в бутылке Рукса. Агарова  среда имеет следующий состав, г/л: Дрожжевой экстракт 10,0 Моногидрат глюкозы 10,0 Агар15,0 Водопроводна  вода до 1 л Перед стерилизацией рН среды довод т до 6,8.50 мл стерильной деиони зованной воды, содержащей 0,02% твина-80 , добавл ют в одну бутылку Рукса и споры суспендируют встр хиванием . Эту споровую суспензию затем добавл ют в качестве прививочного материала к 75мл стерилизованной среды дл  высевани  в 100 л ферментато ре из нержавеющей стали. Состав среды дл  высевани  еледуюШий , г/л: Мука соевых бобов 10,0 Моногидрат глюкозы 20,0 Водопроводна  вода до 1л Дл  уменьшени  вспенивани  к ферментационной среде добавл ют в масле соевых бобов 50 мл 10%-ного раствора Pturqnit L- 81 перед стерилизацией . Среду стерилизуют паром в ферментаторе в течение 20 мин при . Высеваемую культуру перемешивают при 140 об/мин мешалкой и подают стерильный воздух со скоростью 75 л/мин. Сосуд дл  выращивани  снабжен отражательными перегородками. Температуру поддерзкивают 28с и после инкубировани  при таких услови х в течение 45 час 7,5 л этой посевной культуры добавл ют в качестве посевного материала к 150 л стерильной ферментационной среды в 300 л ферментаторе из нержавеющей стали. Ферментационна  среда имеет следующий состав, г/л: Мука соевых бобов 10,0 Моногидрат глюкозы 20,0 Мел (осажденный карбонат кальци )0,2 Сульфат натри 10,0 Хлористый кобальт ( CoClj. )0,001 Водопроводна  вода До 1 л 300 .мл 10%-ного раствора Р игопГс в масле соевых бобов добавл ют дл  предотвращени  вспенивани . Ферментацию заканчивают через 48 час затем провод т центрифугирование. Очищенный бульон имеет активность 340 ед/мл. Очищенный бульон при 10°С и рН 6,8 экстрагируют дихлорметаном при температуре , содержащем хлорид цетилдиметилбензиламмони , посредством прокачки двух жидкостей с заранее определенными скорост ми через линейный смеситель. Фазы раздел ют на непрерывной центрифуге Шарплеза после дополнительного перемешивани  в течение 2 мин. Дихлорметановую фазу экстрагируют водным йодистым натрием. Обратное экстрагирование осуществл ют четырьм  загрузками, использу  общее количество воды 7 л, в которой содержитс  210 г йодистого натри . Фазы отдел ют при помощи гравитации. рН водной фазы довод т от 7,7 до 7,С с помощью сол ной кислоты и отфильтровывают . Экстракт йодистого натри  содержит 21900 ед/мл. Ионообменную колонку подготавливают посредством набивки Q;A Septia dex А -25 в фосфатном буфере при рН 7, содержащем хлористый натрий, в стекл нную колонку диаметром 10 см до высоты 40 см. Экстракт йодистого натри  (7 л) при температуре пропускают через Q.AS Sepfiaden со скоростью 50 мл/мин. Колонку элюируют NaCf в ,05 М фосфатном буфере при рН 7 и емпературе 5С со скоростью 25 мл/мин л элюата выливают, а 90 фракций ( 100 мл) собирают. Фракции сканируют на ультрафиолетовом спектрофотометре и те, в которых наблюдают максимум поглощени  приблизительно при 285 нм и которые  вл ютс  смес антиСиоти-. ка и примеси, объедин ют, а значение рН довод т до 7 (число фракций 25-35) объединенный объем 1230 мл при активности 8450 ед/мл. Хлористый натрий ( 5 г/100 мл) добавл ют к объединенной фракции, которую затем пропускают при через колонку диаметром 6,3 см, набитую смо лой Ataberlite V ад-4 до высоты 30 см, при скорости потока 20 мл/мин. Антибиотик при этих услови х адсор бируетс  на смоле, а неорганические примеси не адсорбируютс . Антибиотик злюируют при комнатной температуре /дистиллированной водой (200 мл), затем 50%-ным водным метанолом. Элюат (1 л) выпаривают при температуре ниже 30°С при пониженном давлении до 70 мл довод т рН до значени  7 и высушивают вымораживанием до коричневого твердого вещества (2,18 г) при активности 5000 ед/мг. Друга  порци  антибиотика немного чище и имеет активность 5700 ед/мл. Это твердое вещество хроматографируют на целлюлозной колонк, уравновешиваемой н-пропанолом-водой 4:1. Колонку элюируют, первые 135 мл элюата выливают, а:затем собирают 15-миллилитровые фракции. Эти фракции имеющие ультрафиолетовое поглощение, характерное дл  антибиотика, выпаривают при пониженном давлении, чтобы удалить н-пропанол, а затем высушивают вымораживанием, чтобы получить желтое твердое вещество. Это вещество согласно анализу, обладает активностью 1600 ед/мг. П р и м е р
2. 2. Ферментацию и выделение провод т, как в примере 1 до стадии элюировани  из Amberfite VAfl-4 включа  ее. Элюат из колонки концентрируют при пониженном давлении цо объема 20 мл. Этот раствор вливают в колонку с Septiadex А-25 в О, IBM NaCt. Колонку элюируют сначала при экспоненциальном градиенте хлористого натри  от 0,18 до 0,28 М при полном объеме 2 л, затем элюируют при посто нном содержании хлористого натри  0,28 М. Колонку элюируют при со скоростью 3 мл/мин и собирают 25 мл фракций. Фракции с ультрафиолетовым спектров поглощени , характерным дл  антибиотика, объедин ют. Смешанные фракции выпаривают при пониженном давлении приблизительно до 10 мл и загружают в колонку 3,8x28 см из Biogf-ef Р2, уравновешиваемой в 1%-ном бутаноле. Колонку элюируют 1%-ным бутанолом со скоростью 2 мл/мин и собирают 5 мл фракции . Фракции с ультрафиолетовым спектром поглощени , характерным дл  антибиотика , и имеющие отрицательною ре:акцию на нитрат серебра при определении хлорида, смешивают. Смешанные фракции выпаривают в вакууме, чтобы удалить бутанол, и высушивают; вымораживанием , получают амфотерное твердое вещество. Твердое вещество раствор ют в минимальном количестве н-пропаиол-вода (4:1) и разгон ют на целлюлозной колонке , уравновешенной в той же самой растворительной смеси. Колонку элюируют смесью н-пропанол-вода (4:1) со скоростью 1 мл/мин, при этом собирают 6 мл фракции. Фракции провер ют на ультрафиолетовое поглощение и те из них, которые имеют спектр, характерный дл  антибиотика, смешивают, выпаривают при пониженном давлении, чтобы удалить пропанол, и высушивают вымораживанием , получа  светло-коричневое аморфное твердое вещество. Антибиотик  вл етс  двухкислотным твердым веществом, которое в виде чистой двухнатриевой соли обладает характерным инфракрасным спектром, имеет характерный спектр  дерного магнитного резонанса, облетает характерным ультрафиолетовым спектром, который в воде имеет максимум поглощени  около 297 нм. В чистом состо нии антибиотик в виде двунатриевой соли имеет значени  RJ дл  тонкослойной хроматографии, приведенные в таблице. Элементарный анализ, проведенный на образце двунатриевой соли антибио тика, дает следующие результаты: С 31,9%; Н 4,2% N 5,4%; S 13,2%; NCI 11,6%. Антибиотик имеет мол,в. между 300 и 500. В чистом виде антибиотик в виде двунатриевой соли обладает хорошим уровнем антибактериальной активности против определенных грамположительных и грамотрицательных организмов, например против штаммов Bacittus subtitU, finterobacter tftoacae, ЙвйКеricJhia coli, Ktebstetla aerofenes , Proteus , mtrabUiS, Satmoaee a typKimurium , Serratia merce&cens , stapKy foeiiceu6 ciureut. В чистом виде антибиотик в виде двунатриевой соли способен к синерги стическому действию на антибактериальную активность р -лактамных антибиотиков (ампициллин и амоксицилли и против некоторых бактерий, включа  определенные f-лактамазнопродуцируювще штаммы Staphytococcus и KUpsietta a-erofftnes. Двухосновньми сол ми антибиотика  вл ютс  фармацевтически допустимые соли таких катионов, как натри , ка ли , кальци , магни , алюмини , обы ного аммони  или соли замещенного аммони . . Наиболее предпочтительно использовать фармацевтически допустимые соли щелочных металлов антибиотика, например двунатриевую соль или двукалиевую соль. Фармацевтические композиции, которые содержат антибиотик или его фар мацевтически допустимую ссшь, приме н ют дл  борьбы с бактериальной инфекцией или дл  профилактики у млекопитающих , включа  челотвека. Эти композиции используют дл  лечени  з болеваний дыхательных путей, мочепо ловых путей, м гких тканей, кожи. Композиции могут иметь форму дл  орального , парентерального,внутриполостноо , инъекционного применени . Эти композиции обычно содержат от 10 мг до 5 г антибиотика или его соли, чаще всего содержат от 50 мг до 1,25 г соли антибиотика, например от 150 мг до 1,0 г. Композиции могут содержать антибиотик или его соль в виде единственного терапевтического агента, или могут содержать антибиотик или его соль вместе с другими терапевтическими агентами , например, с пенициллином или с цефалеспорином, такими, как ампициллин , амоксициллин, карбенициллин, бензилпенициллин , с гидролизуемыми irt vivo сложными эфирами вышеуказанных пенициллинов, с феноксиметилпенициллином , цефалоридином, цефалотином, фефалоглицином, цемандолом, цефазолином , с ацетонными или формальдегидными адцуктами любых из вышеуказанных пенициллинов или цефалоспоринов, которые содержат -амино группу в ациламино боковой цепи с клоксациллином , диклоксациллином, флуклосациллином или с другими известными -лактамными антибиотиками. Предлагаемый способ обеспечивает получениенового антибиотика, про вл юще о активность в отношении -лактамазы . Формула изобретени  Способ получени  антибиотика, про вл ющего активность в отношении 3 -лактамазы, отличающийс   .тем, что, шатмм StreptoTnijuts otivaceus АТСС 31126 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта в виде свободной кислоты либо в виде ее солей.